Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Con el fin de salvaguardar la salud del personal del laboratorio, es esencial que la totalidad de este
método sea ejecutado por personal entrenado, utilizando buenas prácticas de laboratorio y, de
preferencia, trabajando en una instalación de contención. Se debe cumplir los reglamentos de
salud y seguridad relacionados con este organismo.
Esta norma específica un método horizontal para la detección de Escherichia coli serogrupo
O157.
Esta norma es aplicable a los productos destinados al consumo humano o para productos de
alimentación animal.
2. REFERENCIAS NORMATIVAS.
NTC 4092, microbiology of food and Animal stuffs. General Rules for Microbiological
Examinations (ISO 7218)
NTC 4491-1. Microbiology of food and Animal Feeding Stuffs. Preparation of test Samples,
Initial suspensión and Decimal Dilutions for microbiological Examination. Part 1: General Rules
for the Preparation of the initial Suspension and Decimal Dilutions (ISO 6887-1).
3. TERMINOS Y DEFINICIONES
Para los propósitos de esta norma, se aplican los siguientes términos y definiciones.
E. coli O157. Microorganismo que forma colonias típicas sobre la superficie del medio, colocado
en una placa, usado en esta norma y que produce indol y se aglutina específicamente con el
antisuero contra el antígeno O157.
Nota 1. Las cepas de E. coli O157 positivas para sorbitol no son detectadas en el medio CT-SMAC (Véase numeral 5.2)
Para la detección de Escherichia coli O157 se necesitan cuatro etapas sucesivas (véase el anexo A).
d) Confirmación de las colonias negativas para sorbitol provenientes del medio CT-SMAC y
las colonias típicas de E. coli O157 en el segundo agar de aislamiento, por medio de la
producción de indol y la aglutinación con antisuero para E. coli O157.
NOTA se puede lograr una caracterización adicional por ejemplo marcadores patogénicos, de los aislados positivos
enviándolos a un laboratorio de referencia adecuado.
Agua 1 000 ml
5.1.1.2 Preparación
Esterilice durante 15 min en el autoclave véase el numeral (6.1) ajustado a 121 °C.
5.1.2.1 composiciones
Cefxima 5,0 mg
Agua 100 ml
5.1.2.2. Preparación
Inmediatamente antes del uso, adicione 1ml o 4ml de la solución de novobiocina (véase el
numeral 5.1.2), a 225 ml o 900ml de caldo mTSB enfriado (véase el numeral 5.1.1)
5.2. PRIMER MEDIO DE AISLAMIENTO SELECTIVO: agar Macconkey de sorbitol con telurito y
cefixima.
Sorbitol 10,0 g
Agar 9g a 18 g1
Agua 1 000 g
5.2.1.2 Preparación
Disuelva los componentes básicos o la base deshidratada completa en el agua mediante ebullición.
Ajuste el pH (véase el numeral 6.6), si es necesario, después de la esterilización se encuentre en
7,1 ± 0,2 a 25 °C.
5.2.2.1 Composición
Agua 100 ml
5.2.2.2 Preparación
Esta solución se puede almacenar en temperatura ambiente hasta por un mes. Pero se debe
desechar si se forma un precipitado blanco.
5.2.3.1 Composición
Cefixima 5,0 mg
Agua 100,0 ml
5.2.3.2 Preparación
5.2.4.1 Composición
5.2.4.2 Preparación
Enfrié el medio básico recién esterilizado (véase el numeral 5.2.1) hasta una temperatura entre 44
°C y 47 °C (véase el numeral 6.5), o derrita el medio mediante aplicación de vapor al medio básico
previamente esterilizado y solidificado, enfrié después hasta una temperatura entre 44 °C y 47 °C.
Inmediatamente antes de la utilización, seque las placas de agar, preferiblemente sin las tapas y
con las superficies del agar hacia abajo, en un horno ajustado a una temperatura entre 25 °C y 50
°C (véase el numeral 6.2) hasta que las gotas hayan desaparecido de la superficie del medio. No las
seque por más tiempo. Las placas de agar también se pueden secar en una cabina de seguridad de
flujo laminar durante 30 min y las tapas medio abiertas, o de un día para otro con las tapas en su
lugar.
Si se preparan con anticipación, las placas sin secar se pueden almacenar en bolsas plásticas
oscuras o en otros recipientes que retengan la humedad, en un refrigerador a 3°C más o menos
2°C hasta por dos semanas.
Utilice cualquier otro medio selectivo sólido, a elección de laboratorio complementario para el
agar de CT-SMAC y que sea especialmente adecuado para el aislamiento de Escherichia coli O157.
Inmediatamente antes de la utilización, seque las placas de agar preferiblemente sin las tapas y
con las superficies del agar hacia abajo, en un horno ajustado a una temperatura entre 25°C y 50°C
(véase numeral 6.2) hasta que las gotas hayan desaparecido de la superficie del medio. No las
seque por más tiempo. Las placas de agar también se pueden secar en una cabina de seguridad de
flujo laminar durante 30 min y las tapas medio abiertas, de un día para otro con las tapas en su
lugar.
Si se preparan con anticipación las placas sin secar se puede almacenar en bolsas plásticas oscuras
o en otros recipientes que retengan la humedad, en un refrigerador a 3°C durante un tiempo que
no ocasione cambios en un su desempeño.
5.4.1 Composición
Peptona 5,0 g
Agar 9g a 18 g2
Agua 1000 ml
5.4.2 Preparación
Esterilice durante 15 min en el autoclave (véase el numeral 6,1) ajustado a 121 °C.
Transfiera aproximadamente 15 ml del medio derretido y enfriado (véase numeral 5.4.2) a una
temperatura entre 44°C y 47°C (véase el numeral 6.5) a las cajas de Petri y deje solidificar.
Inmediatamente antes de la utilización, seque las placas de agar, preferiblemente sin las tapas y
con las superficies del agar hacia abajo, en un horno ajustado a una temperatura entre 25°C y 50°C
(véase numeral 6.2), hasta las gotas hayan desaparecido de la superficie del medio. No las seque
por más tiempo. Las placas de agar también se pueden secar en una cabina de seguridad de flujo
laminar durante 30 min y las tapas medio abiertas, o de un día para otro con las tapas en su lugar.
Si se preparan con anticipación, las placas sin secar se pueden almacenar en oscuridad, en bolsas
plásticas o en otros recipientes que retengan la humedad, en un refrigerador a 3 °C ± 2 °C hasta
por dos semanas.
5.5.1 Composición
Triptona 10,0 g
Agua 1000 ml
5.5.2 Preparación
Esterilice durante 15 min en autoclave (véase el numeral 6.1). Ajustado a 121 °C.
5.6.1 Composición
4-dimetilaminobelzaldehido 5,0 g
2-metibutanol 75,0 ml
5.6.2 Preparación
El reactivo debe ser entre amarillo claro y marrón claro y estar libre de precipitado.
Estas son partículas inmunomagneticas recubiertas con anticuerpos específicos contra E. coli
O157, para la concentración y la separación de estos microorganismo.
NOTA están disponibles en el comercio. Se recomienda cumplir con precisión las instrucciones del fabricante con
respecto a su preparación para el uso.
Agua 1000 ml
5.8.2 Preparación
Disuelva los componentes en agua. Ajuste el pH (véase el numeral 6.6) si es necesario hasta 7,2 ±
0,2 a 25°C.
Dispense en botellas o matreces (véase el numeral 6.7) el volúmenes adecuados para el uso.
Esterilice durante 15 minutos en el autoclave (véase el numeral 6.1) ajustado a 121 °C. La solución
puede aparecer turbia pero se toma clara con reposo.
5.9.1 Composición
Agua 1000 ml
5.9.2 Preparación
5.10 Anti suero para Escherichia coli O157, disponible bien sea en laboratorios especializados o en
fuentes comerciales como O 157 somático separado.
El antisuero se debe someter a ensayo con controles positivos y negativos antes de utilizarlos en
aislados desconocidos.
6. EQUIPO Y CRISTALERIA.
6.2. Gabinete de secado o incubadora, con capacidad para mantener una temperatura entre 25°C
y 50°C.
6.3 Incubadora, con capacidad para mantener una temperatura entre 37 ° C ± 1°C.
6.4 Incubadora, con capacidad para mantener una temperatura entre 41,5 °C ± 1°C
6.5 Baño de agua, con capacidad para mantener una temperatura entre 44°C y 47°C.
6.6 Medidores de pH, que pueda leer con aproximación 0,01 unidades de pH a 25°C, que permita
hacer mediciones con exactitud hasta ± 0,1 unidades de pH.
6.8 Cilindros de medición, de capacidad adecuada, para la preparación de las diluciones y medios
completos.
6.9 Pipetas graduadas de descarga total, con capacidad normal de 1ml y 10ml, graduadas con
divisiones de 0,1 ml y 0,5 ml respectivamente.
6.11 Pipetas mecánicas de desplazamiento de aire, estériles con un rango de operación desde
20ul hasta 200 ul con divisiones de 10 ul o similares.
6.13 Tubos de plástico de tipo Eppendorf, con tapa de rosca, esteriles, desechables, para
centrifuga, con capacidad de 1,5 ml para adaptarse a la rejilla magnética.
6.14 Mezclador rotativo (de tipo molino de viento, mezclador para la muestra de sangre). Con
capacidad de rotación de 15r/min a 20 r/min.
7. MUESTREO
Es importante que en el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y
que esta no ha sufrido daños ni cambios durante el transporte o el almacenamiento.
El muestreo no es parte del método que se especifica en esta norma. Si no existe norma específica
que trate de muestreo del producto en cuestión, se recomienda que las partes interesadas lleguen
a un acuerdo sobre este tema.
Prepare la muestra ensayo de acuerdo con la norma específica adecuada para el producto en
cuestión. Si no existe norma específica se recomienda que las partes interesadas lleguen a un
acuerdo sobre este tema.
Véase la NTC 4491-1 y toda norma específica adecuada para el producto en cuestión.
NOTA otras partes ISO 6887 están en proceso de elaboración, véase la bibliografía.
Se recomienda utilizar bolsa de digestor con insertos de malla para reducir la interferencia de las
partículas de alimento con kits de inmunocaptura (véase el numeral 9,3).
9.2 ENRIQUECIMIENTO
Incube (véase el numeral 6,4) la suspensión inicial, preparada según el numeral 9.1, a 41,5 °C
durante 6h y posteriormente 12h a 18h adicionales (es decir un tiempo total transcurrido entre
18h y 24h.
Una incubación de 6h seguidas por la separación inmunogenetica y la aplicación en placa sobre los
agares selectivos puede producir un resultado positivo presuntivo que se puede tomar negativo
después de la incubación adicional de 18h.
9.3 SEPARACION INMUNOMAGNETICA
9.3.1 Generalidades
Las siguientes instrucciones son una guía general y pueden no estar completas en todo detalle. Por
lo tanto, se recomienda seguir las instrucciones del fabricante con respecto al procedimiento y el
método para utilizar los kits de inmunocaptura y el equipo necesario.
9.3.2 Inmunocaptura.
Mezcle el cultivo de enriquecimiento (véase el numeral 9.2) y permita que los materiales gruesos
de los alimentos se sedimente. Adicione 20 µl de las partículas inmunomagneticas preparadas
(véase numeral 5.7) a un tubo de plástico tipo Eppendorf, a temperatura ambiente. Tome 1 ml del
líquido de la parte superior proveniente del cultivo de enriquecimiento. Evitando si es posible la
transferencia de partículas de alimentos o de materiales grasos y transfiera al tubo plástico
Eppendorf.
9.3.3 Separación
Coloque cada tubo de plástico (véase el numeral 9.3.2) en la rejilla magnética (véase el numeral
6.12) y permita que las partículas magnéticas se congreguen contra el imán balanceando
suavemente la rejilla e un Angulo de 180 grados. Abra la tapa cuidadosamente sin perturbar las
partículas que están en la pared del tubo. Utilizando una pipeta Pasteur estéril ( véase el numeral
6.10) para cada muestra y con todo tubo todavía en la rejilla magnética, retire el líquido
succionando suavemente desde el fondo del tubo. Adicione 1 ml de amortiguador de lavado
estéril (véase el numeral 5.8) y vuelva a colocar la tapa. Retire el imán de la rejilla. Mezcle el
contenido de los tubos mediante inversión suave de la rejilla en un ángulo de 180° y luego vuelva a
colocar el imán en la rejilla.
Retírelo del separador magnético y adicione 100 µl del amortiguador de lavado estéril (véase el
numeral 5.8) al tubo y vuelva a suspender las partículas magnéticas.
NOTA este procedimiento puede ser difícil de aplicar a productos grasos o queso fresco.
Usando una pipeta mecánica (véase el numeral 6.11) transfiera 50 µl de las partículas magnéticas
lavadas y resuspendidas (véase el numeral 9.3.3) a una placa previamente secada de agar de
Macconkey de sorbitol con telurita y cefixima (véase el numeral 5.2) y también 50 µl a una placa
previamente secada del segundo medio de aislamiento (véase el numeral 5.3).
Frote las partículas utilizando un asa estéril (véase el numeral 6.10) para obtener muchas colonias
bien aisladas sobre el agar.
Incube (véase el numeral 6.3) el medio CT-SMAC (véase el numeral 5.2) a temperatura de 37°C
durante 18h y 24h e incube el segundo agar selectivo a su temperatura recomendada y durante el
tiempo especificado.
Dependiendo del tipo de la muestra de alimento y su flora microbiana, la incubación del caldo de
enriquecimiento durante 20h y 24h puede dar origen a un crecimiento denso de otras bacterias en
las placas de agar selectivo de tal modo que las colonias de E. coli O157 son difíciles de encontrar.
La incubación de los agares selectivos con diluciones de la preparación de separación
inmunomagneticas o con volúmenes inferiores a 50 µl por cada placa puede incrementar la
oportunidad de obtener colonias separadas de E. coli O157, pero se observa que esto también
puede incrementar el límite de detección.
Sobre el agar CT-SMAC las colonias típicas son transparentes y casi incoloras con una apariencia de
color amarillento-marrón pálido y un diámetro aproximado de 1 mm.
Examine el segundo agar de aislamiento selectivo para determinar las colonias típicas de E. coli
O157 siguiendo las instrucciones del fabricante.
9.5 CONFIRMACION.
Tome cinco colonias típicas de cada placa, selecciónela según el numeral 9.4. Si una placa de agar
contiene menos de cinco colonias típicas, se deben de examinar todas las colonias.
Frote la colonia seleccionada sobre una placa de agar nutritivo (véase el numeral 5.4) para permitir
el desarrollo de colonias bien separadas.
Incube (véase el numeral 6.3) las placas durante 18h a 24h a una temperatura de 37°C.
Utilice únicamente cultivos puros provenientes de la placa de agar nutritivo para los ensayos que
se describen en los numerales 9.5.2 y 9.5.3.
Inocule una colonia proveniente de cultivo puro sobre agar nutritivo (véase el numeral 9.5.1) en un
tubo que contenga medio triptona/triptófano (véase el numeral 5.5).
La formación de un color rojo indica una reacción positiva. Un color amarillo/marrón indica una
reacción negativa.
9.5.3.1 Generalidades
Solamente examine las colonias positivas para indol, con el fin de determinar su reacción
serológica al antisuero para E. coli O157.
Ponga una gota de solución salina (véase el numeral 5.9) sobre una lámina de vidrio limpia.
Utilizando un asa (véase el numeral 6.10) mezcle en esta gota una colonia proveniente de la placa
de agar nutritivo (véase el numeral 9.5.1) para obtener una suspensión turbia y homogénea.
Utilizando una colonia pura proveniente del agar nutritivo (véase el numeral 9.5.1) suspéndala en
una gota fresca de solución salina tal como se hizo en el numeral 9.5.3.2 y adicione una gota
pequeñas de antisuero para E. coli O157 (véase el numeral 5.10).
Considere como aislados positivos aquellos que son positivos para indol y reaccionan bien sea con
el antisuero O157 o los antisueros O157 mas H7, si están disponibles.
Para la identificación adicional de las colonias positivas para la detección de antígenos flagelares y
para características patógenas, los cultivos deberían enviar a un laboratorio de referencia.
Las cepas E. coli O157 si no porta los factores de virulencia atribuidos a la patogenicidad están
disponibles en colecciones de cultivos nacionales o internacionales. Estas cepas se recomiendan
para ensayo de aseguramiento de la calidad de los medios y antisuero.
Para verificar la capacidad del laboratorio y del medio para detectar cantidades pequeñas de
Escherichia coli O157 en las muestras de alimentos que se someten a ensayos mediante el método
prescrito en esta norma, las muestras de referencia con un inoculo bajo de E. coli O157 no
patógena y un inóculo grande de otra cepa de E. coli O157 se deberían ensayar en paralelo con la
muestra de ensayo.
El informe de ensayo también debe establecer si se deben llevar a cabo ensayos adicionales por
parte de un laboratorio de referencia o si se realizaron cuáles fueron los resultados.
ANEXO A
(Normativo)
Homogenización e incubación durante 6h, luego 12h a 18h adicionales a 41.5°C ( véase numeral 9.2)
Para identificación adicional, los cultivos deberían ser enviados a laboratorios de referencia
(véase numeral 9.6)