Sunteți pe pagina 1din 30

B i l e t u l nr.

__1______

1.Etapele de pregătire a frotiului. Morfologia formelor alungite şi sferice de bacterii. De desenat.

Prepararea frotiului
1.Etalarea materialului microbian (produs patologic, culturămicrobiană) în strat subţire pe
suprafaţa unei lame de sticlă degresată
2. Uscarea
3. Fixarea (termică, chimică). Omoarămicrobii şi mareşte afinitatea lor pentru coloranţi
4. Colorarea. Asigură contrastul dintre microbi şi fondul preparatului
5. Examinarea frotiului la microscopul optic cu imersie

Formele alungite (bastonaşe)


1.Bacterium –bastonaşe cu capetele rotunjite, nu formează spori
(Mycobacterium,Corynebacterium, enterobacterii, etc)
2. Bacillus –bastonaşe mari cu capetele retezate, formează spori ce nu depăşesc diametrul celulei
(ex.: Bacillus anthracis). Posibilă aranjarea în lanţuri - streptobacili
3. Clostridium –bastonaşe cu capetele rotunjite, formează spori ce depăşesc diametrul celulei
(ex.: Clostridium tetani, Clostridium botulinum,C. perfringens, etc)

Formele sferice (coccus)


- Micrococi (Micrococcus)–celule izolate
- Diplococi (Diplococcus)–perechi (neisserii -bob de cafea, pneumococi - lanceolati)
- Streptococi (Streptococcus) - lanţuri
- Tetracoci (Tetracoccus) –câte 4 celule
- Sarcine –(Sarcina) –pachete din 8-16-32 coci
- Stafilococi –(Staphylococcus) –grămezi neregulate de coci

2.Studierea caracterelor enzimatice ale bacteriilor (zaharolitice, proteolitice).


Activitatea zaharolitică (şirul Hiss, coagularea laptelui, etc)
Activitatea proteolitică
- Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea
laptelui, etc)
- Evidenţierea enzimelor ce intervin in degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze,
desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele finale ale descompunerii AA: H2S, NH3, indol, etc…
Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fier de culoare neagră in mediile multitest –
Kligler, Olkeniţki, etc; plasarea unei benzi de hârtie de filtru imbibată cu acetat de Pb deasupra
BP in care creşte cultura studiată (formarea sulfurii de Pb innegreşte hârtia)
Depistarea indolului (produs al hidrolizei triptofanului) – benzi de hârtie imbibate cu acid
oxalic. In prezenţa indolului indicatorul virează in roz.
Depistarea amoniacului (ureaza) – hârtia de turnesol se colorează in albastru.

3.Noţiuni de biotop şi microbiocenoză. Microflora normală a organismului uman. Rolul ei în

fiziologia umană. Relaţiile între mi/o în biocenoze.

BIOTOP –spaţiu cu condiţii de viaţă particulare(conjunctiva, mucoasa intestinală, orofaringe,


vagin, tegument, etc), populat şi transformat de asociaţii de fiinţe vii.
MICROBIOCENOZĂ (comunitate microbiană) –asociaţii microbiene ce populează un biotop.
 Microorganismele prezente într-un biotop particular constituie microflora acestui habitat (m/f cutanată,
intestinală, etc)
 Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană ulterioară, actionând prin
următoarele mecanisme:
•competiţia pentru aceiaşi nutrienţi;
• competiţia pentru aceiaşi receptori de pe
celulele gazdei;
• producţia de bacteriocine; vitamine;
• producerea de acizi graşi volatili sau alţi
metaboliţi;
• stimularea continuă a sistemului imun;
• stimularea producerii unor factori imuni de
protecţie (anticorpii naturali).

 • Între microorganismele unui biotop


se pot stabili relaţii:
I. Indiferente (neutralism)
II. Favorabile (comensalism/satelitism,
simbioză/mutualism, sinergism)
III. Defavorabile (parazitism, antagonism)

B i l e t u l nr. __2______
1.
1.Aparatul nuclear al bacteriilor. Funcţiile biologice. Metodele de evidenţiere.

NUCLEOIDUL BACTERIAN
- Constituit din ADN bicatenar circular, uneori liniar, plasat liber în citoplasmă. ADN este repliat
în bucle şi stabilizat prin ARN şi proteine. Fiecare buclă este hiperspiralizată sub acţiunea ADN-girazei
şi topoizomerazei IV (se întâlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sinteză (ADN - ,
ARN – polimeraze)
Funcţii: dirijază activitatea celulei (procesele de sinteză, creşterea, multiplicarea, diferenţierea celulei,
replicarea proprie, etc)

Evidenţierea:
- Microscopia electronică
- Metode speciale de colorare (Feulgen)
Feulgen: HCl….aldehida….react. Shiff….culoare rosie

2.Mecanismele de obţinere a energiei la bacteriile chemoorganotrofe. Clasificarea

bacteriilor în funcţie de necesităţile în oxigen.

Mecanismele de obţinere a energiei la chemoorganotrofe în funcţie de acceptorul final de H :


 Respiraţie aerobă. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implică lanţul respirator de transport al
electronilor asociat MCP. Produs final – H2O sau H2O2 .
 Respiraţie anaerobă. Acceptori finali – compuşi anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de
electroni prin lanţul respirator. Produse finale – nitritul, amoniacul, sulfura (în prezenţa O – H2O2).
 Fermentaţie. Substratul organic este metabolizat fără intervenţia unui agent oxidant extern.
Constă în procese de ox-red care realizează numai o oxidare parţială a substratului, donorul şi acceptorul
de H+ fiind substanţe organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o moleculă mai oxidată (ex.:
fermentare lactică, fermentare alcoolică, acidă mixtă, acetoinică, etc). Fermentaţia se poate desfăşura în
prezenţa O2, dar fără intervenţia acestuia.

Oxigenul
 Bacterii strict aerobe – cresc doar оn prezenţa O2. Obţin energia prin respiraţie aerobă
 Bacterii microaerofile – necesită concentraţii reduse de O2 şi 2-10% CO2. Obţin energia
prin respiraţie sau fermentaţie (Neisseria, Brucella, Campylobacter)
 Bacterii strict anaerobe – cresc doar in absenţa O2. Obţin energia prin fermentaţie sau
uneori respiraţie anaerobă. Toxicitatea O2 – formarea H2O2, a radicalilor superoxizi O2-, sau
peroxizi O22- pe care anaerobii nu le pot descompune (absenţa catalazei, superoxid dismutazei,
peroxidazei) – Clostridium, Bacteroides
 Bacterii anaerobe aerotolerante – pot creşte оn prezenţa O2, obţin energia prin
fermentaţie, posedă peroxidază (Lactobacillus, streptococi)

3. Acţiunea factorilor fizici (temperaturi înalte şi joase, desicarea, radiaţii, ultrasunet)

asupra microorganismelor. Utilizarea practică.

Factorii de mediu (ecologici) sunt factori abiotici care influen ează dezvoltarea,activitatea fiziologică şi înmulţirea
microorganismelor.
Cunoaşterea relaţiei microorganism – factori de mediu conferă oportunitate în
dirijarea activităţii lor fiziologice → activităţi dorite/stoparea activităţii lor.
Fiecare factor de mediu declanşează un răspuns specific reprezentat grafic printr-o
valoare optimă, o valoare minimă şi una maximă.
Clasificarea factorilor de mediu:
- factori fizici: temperatura, umiditatea, radiaţiile, presiunea atmosferică
- factori chimici: pH, potenţialul de oxidoreducere, efectul faţă de substanţele Chimice
1. Temperatura – microorganismele au exigenţe diferite cuprinse între 10 şi 105oC.
Tipuri de microorganisme:
 psihrofile – tє optimă 10-20 grade C. Cresc şi la 0 gr C. (criofile, frigofile) – au un conţinut ridicat în lipide,
capsula de natură poliglucidică (colonii mucilaginoase) mobile, pot prezenta pigmenţi, biotopul este constituit din
sol, ape reci şi aer. Ex. bacterii – (Pseudomonas, Achrobacter, Aerobacter, Alcaligenes )+ fungi – (Candida,
Rhodotorula, Cladosporium, Penicillum, Geotrichum)
 mezofile, optimum 30-37 grade C (limite 15-45 grє C) sunt numeroase, în sol, apă, sunt macroorganisme
homeotrofe, conduc la putrefacţie şi sumt patogene.
 termofile, – optimum 50-60 grade C (până la 95 grC) au un metabolism foarte rapid, modificări structurale la
proteine şi enzime termostabile, în structura lor sunt prezente complexe termostabile (poliamide) formate din acizi
nucleici cu procent ridicat în citozină, timină, Mg, Ca. Biotopul este constituit din izvoare termale, gunoi de grajd,
sol (bacteriile Streptomyces thermophille, B. sthearothermophyllus, Cl. nigricans; fungi Candida tropicalis,
Aspergillus fumigatus)
Bacterii hipertermofile (cresc la 70–110 gr C)

2. Umiditatea- cea din sol are cea mai mare importanţă, umiditatea redusă determină dezvoltarea mare a
actinomicetelor şi fungilor; inhibă dezvoltarea microorganismelor (bacterii foarte sensibile – celulozolitice,
nitrificatoare, fixatoare de azot). Seceta mare determină dezvoltarea redusă a microorganismelor, favorizând apari
ia formelor de rezistenţă (chişti/spori) ex.actinomicetele – genuri eliminate; ex. Rhizobium, beijerinkia.
3. Radiaţiile -influenţa lor este corelată cu lungimea de undă.
→radiaţiile ionizante, alfa, beta, gamma au fluxuri de electroni rapide, radicali
liberi în funcţie de doza de iradiere, au efecte letale, mutagene, de adaptare.
→radiaţiile gamma au putere mare de penetrare, sunt utilizate în sterilizarea la
rece. Prezenţa oxigenului micşorează rezisten a microorganismelor la iradiereț
 tratamentele termice micşorează rezistenţa microorganismelor la iradiere
 bacteriile sunt mai sensibile decât fungii
 bacteriile Gram+ sunt mai rezistente decât cele Gram-. Expl.
Achromobacter este specia cea mai rezistentă Micrococcus radiodurans
→ radiaţiile X – putere de penetrare mică, sterilizarea aerului
→ radiaţiile UV – lungimea de undă = 136-4000Å, efectul antimicrobian maxim =
254nm întrucât distrug structura bicatenară a ADN – penetraţie mică în apă – 1cm –
utilizate la sterilizarea apei potabile şi a aerului.
→ radiaţiile luminoase – lungimea de undă mai mare de 4000Å – efect pozitiv la
fototrofe şi negativ la chimiotrofe.
→ultrasunetele au efect distructiv la mai mult de 16000Hz prin erupţia structurii
celulare – sterilizarea lichidelor şi obţinerea produşilor intracelulari (enzime, toxine,
proteine).

4. Presiunea hidrostatică este relevantă în mediul marin populat cu microorganisme barofile denitrificatoare, prin
care nitraţii sunt reduşi în nitriţi în condiţii de anaerobioză
5. Presiunea osmotică influen ează microorganismele în func ie de cantitatea de substanţă dizolvată în mediul
celular şi mediul de cultură.
Tipuri de microorganisme:
 normale, cale care adoptă presiuni osmotice reduse
 osmofile, adoptă presiuni osmotice ridicate (concentraţii mari în glucide, ex. bacteriile 15-40%, mucegaiurile şi
drojdiile 70%
 halofile, adoptă presiuni osmotice ridicate (concentraţii mari de sare, ex. Micrococcus, Diplococcus, Sarcina,
Bacillus; bacterii nitrificatoare, denitrficatoare, protolitice, sulfobacterii în mări şi oceane)
 osmotolerante, acceptă în general presiuni osmotice ridicate.Microorganismele au dezvoltare optimă la presiune
osmotică intracelulară egală cu presiunea osmotică a mediului.
Mucegaiurile au sensibilitate mare, excepţie făcând Aspergillus şi Penicillum.

B i l e t u l nr. ___3_____

1. Sporii bacteriilor. Compoziţia chimică, funcţiile biologice, metodele de evidenţiere.

SPORUL BACTERIAN
- Reprezintă o diferenţiere celulară care asigură supravieţuirea bacteriei în condiţii nefavorabile ale
mediului
extern.
 Bacterii sporogene – Bacillus, Clostridium. Aceste mi/o se prezintă sau sub formă vegetativă,
metabolic activă, sau sub formă inertă metabolic – sporul.
 Procesul de formare a sporului este numit sporogeneză, sporulare. Este declanşat în special de carenţe
nutritive sau condiţii nefavorabile ale mediului extern.
Stadiile sporogenezei (durata 36-72 ore)
Stadiul I – se formează filamentul axial, compus din ADN
Stadiul II – divizarea asimetrică a citoplasmei printr-un sept, formarea presporului, care conţine un filament de
ADN. MCP înglobează presporul.
Stadiul III – înglobarea completă a presporului, care este limitat de 2 membrane
Stadiul IV – formarea cortexului de PG între cele 2 membrane
Stadiile V-VI – formarea tunicii proteice la exterior şi maturarea sporului. Uneori se formează un înveliş extern
suplimentar - exosporiu
Stadiul VII – sporul matur este eliberat iar celula-mamă se dezintegrează

Proprietăţile sporului
- Inactiv metabolic
- Conţinut scăzut de apă liberă
- Conţinut mare (până la 10%) în dipicolinat de calciu
- Rezistent la temperaturi şi pH extreme, desicare, radiaţii, agenţi chimici şi fizici
În condiţii favorabile sporul germinează, dezvoltându-se forma vegetativă.
Forma sporului (sferică, ovală) şi poziţia în celulă (centrală, subterminală, terminală) sunt caractere utile în
identificarea bacteriilor.
Evidenţierea sporilor: colorarea după AUJESZKY (sporul se colorează оn roşu, iar citoplasma оn albastru)

2. Sterilizarea mecanică, principiul metodei, aplicarea practică.

Filtrarea este trecerea unui fluid printr-un corp poros – filtru.Filtrele cu porozitati convenabile
pot debarasa de microorganism fluidul filtrate, acestea fiind retinute mecanic si electrostatic in
porii filtrului.
Se aplica pentru sterilizarea aerului, a unor medii de cultura pentru microbe, a medicamentelor
care nu suporta incalzirea.
Tipuri de filtre: Clasice din portelan, sau pamant de infuzorii cu forma unor lumanari goale pe
dinauntru si inchise la un capat (bujii filtrante) placi filtrante din azbest impregnate cu caolin
(filter Seitz sau sticla poroasa (filter Schott). Sau membrane filtrante din acetat de celuloza cu
porozitati intre 8 si 0,025 µm. Filtrarea se face prin aspiratie sau presiune pozitiva(adaptata la o
seringa). Pentru a evita colmatarea porilor suspensiile cu densitate mare a particulelor sunt
prefiltrate printr-un material fibros sau granular.

3. Antagonismul microbian. Tipurile. Mecanismele. Metodele de studiere. Importanţa


practică.
Antagonism –o specie inhibă sau omoară altă specie prin mecanisme specifice sau nespecifice.
Mi/o care manifestă activitate inhibitoare –antagonist (A), mi/o care suferă –concurent (C).
Antagonism nespecific:
- Antagonistul este mai activ, utilizând nutrienţii, oxigenul
- Antagonistul produce metaboliţi toxici (acizi, indol, H2S, amoniac, peroxid, etc)
Antagonism specific –antagonistul produce substanţe cu acţiune specifică asupra unui sau mai multor concurenţi
(antibiotice, bacteriocine).
Efectul acţiunii unui antagonist asupra concurentului poate fi bacteriostatic sau bactericid (uneori bacteriolitic).

METODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI


1. În mediu solid(metoda tranşeei) –antagonistul se însămânţează în centrul cutiei, concurenţii –
perpendicular. Termostat 24h. Aprecierea –după dimensiunea zonei de inhibiţie a creşterii culturii
concurentului.
2. În mediu semisolid –I strat –antagonistul, II strat –concurentul. Termostat 24h. Aprecierea –zonă clară
între straturi.
3. Însămânţarea în mediu lichid(BP) a unui număr egal de A şi C. După 24 h de incubaţie se reînsămânţează
0,1 ml pe placa cu geloză. Se compară numărul coloniilor de A şi C.
Utilizarea practică a antagonismului microbian:
1. Pentru depistarea mi/o –producenţi de antibiotice (micete, actinomicete, bacterii)
2. Pentru obţinerea produselor biologice curative de origine microbiană (probiotice, eubiotice/sinbiotice):
Lactobacterina, Colibacterina, Bifidumbacterina, Bificol, etc
3. Crearea biocenozelor favorabile organismului

B i l e t u l nr. ___4_____

1. Membrana citoplasmatică a bacteriilor. Compoziţia chimică. Funcţiile biologice.


Metodele de studiere.

MEMBRANA CITOPLASMATICĂ (MCP)

Prezintă o structură membranară clasică: dublu strat fosfolipidic în care sunt înserate proteine şi
glicoproteine. Lipsesc sterolii.
La bacteriile gram-pozitive MCP formează invaginaţii, mezosomi (septali, laterali), în care se
conţin enzime, citocromi şi proteine ale sistemului transportor de electroni.

Proteinele MCP:
 PFP (Proteine Fixatoare de Penicilină), enzime ce catalizează legăturile dintre catenele
peptidice din PG – reacţia de transpeptidare (sunt inactivate de penicilină şi antibiotice beta-
lactamice)
 Componente ale sistemului de transport (permeaze)
 Proteine ale sistemelor de secreţie (I – VI)- la bacterii gram negative. Reprezintă cilindre
proteice ce traversează învelişurile celulei bacteriene. Asigură transportul proteinelor din
interiorul celulei bacteriene spre exterior
 Proteine – receptori
 Enzime ale lanţului respirator

Funcţiile membranei citoplasmatice


 Barieră osmotică şi de permeabilitate selectivă
 Asigură transportul activ prin intermediul permeazelor
 Excreţia enzimelor hidrolitice, toxinelor, etc
 Sediul metabolismului energetic (mezosomi)
 Intervine în diviziunea celulară (mezosomi)
 Implicare în sinteza PG şi a fosfolipidelor
 Implicare în chemotaxie prin receptori specifici
 Asigură transmiterea informaţiei din mediul înconjurător spre interiorul celulei bacteriene

Evidenţierea MCP
 Microscopia electronică
 Fenomene de plasmoliză (în mediu hipertonic – retracţia citoplasmei) sau plasmoptiză (în
mediu hipotonic – liza celulei, desprinderea MCP de peretele celular)
2. Creşterea şi multiplicarea bacteriilor. Fazele multiplicării bacteriilor în culturi
discontinue şi caracteristica lor.

Dinamica multiplicării bacteriilor in culturi

In funcţie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:


- Culturi discontinue/periodice
- Culturi continue
- Culturi sincrone

Culturile discontinue se obţin la cultivarea bacteriilor оn volum limitat de mediu. Astfel de


culturi sunt obţinute şi utilizate оn laboratorul microbiologic

Fazele dezvoltării unei culturi discontinue


I. Faza de lag – faza de adaptare la condiţiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc in
dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabilă (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiţiile
mediului, etc
II. Faza logaritmică – bacteriile cresc şi se divid cu viteză maximală constantă, curba evoluează
exponenţial. Bacteriile sunt foarte sensibile la agenţi antimicrobieni (culturi utile pentru testarea
sensibilităţii la antibiotice). Durata – 8-10 ore
III. Faza staţionară – rata celulelor care se multiplică scade treptat, numărul celulelor vii rămâne
constant mai multe ore. Cauza – consumarea nutrienţilor, acumularea metaboliţilor toxici.
Morfologia bacteriilor este tipică speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare).
Sensibilitatea la agenţii antimicrobieni scade. Durata – 10-12 ore
IV. Faza de declin (letalitate) – bacteriile mor progresiv

Cultura continuă – se realizează când mediul de cultură este continuu reоnnoit şi imbogăţit cu
oxigen cu evacuarea unei cantităţi de cultură. Se realizează in chemostate sau turbidostate,
cultura aflându-se permanent in faza exponenţială. Se utilizează in microbiologia industrială.
In intestin – culturi continue.
Culturi sincrone – culturi in care bacteriile se divid in acelaşi timp

3. Noţiune de CMI, CMB. De definit noţiunile de tulpină sensibilă, intermediară şi


rezistentă.

la Metoda diluţiilor


Concentraţia Minimă Bactericidă (CMB)–cantitatea minimă de AB care omoară 99,9% din inoculum după
18h de incubare.Determinarea CMB –din ultimele tuburi fără placa cu geloză. După 24h se compară
numărul celulelor ce au supravieţuit cu nr iniţial de bacterii (105/ml).
Concentraţia Minimă de Inhibiţie (CMI)a AB pentru tulpina testată.CMI măsoară efectul bacteriostatic.

 Tulpini Sensibile –CMI/CT <1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzuale
 Tulpini Rezistente –CMI/CT>1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil
 Tulpini Intermediare –CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau
administrarea lor localăTestarea CMI / CMB este indicată în tratamentul infecţiilor grave : meningite,
septicemii, endocardite, infecţii cronice sau la persoane cu imunosupresie.
B i l e t u l nr. __5______

1. Flagelii. Natura. Funcţiile. Metodele de studiere. Clasificarea bacteriilor cu flageli.

FLAGELII
– structuri filamentoase proteice, întâlnite la bacterii, bacili, spirili şi spirochete.
 Funcţii: intervin în mobilitatea bacteriană, reprezintă Ag H al bacteriilor.

 Structura flagelului:
- Filamentul, structură helicoidală constituită din fibrile proteice (flagelină) răsucite
- Cârligul de articulaţie
- Corpul bazal, constituit dintr-un ax rigid şi mai multe inele ce servesc la fixarea flagelului
(la MCP şi PC).
Mobilitatea bacteriei este asigurată de rotaţia flagelului (30 – 70 micrometri/s).

Tipurile de bacterii după dispoziţia flagelilor


 Bacterii monotriche
 Bacterii lofotriche (un mănunchi de flageli la o extremitate)
 Bacterii amfitriche (câte un flagel sau un mănunchi de flageli la fiecare extremitate)
 Bacterii peritriche (flageli pe toată suprafaţa celulei)
La spirochete flagelii se plasează în spaţiul periplasmic – flageli interni, periplasmatici.

Evidenţierea flagelilor
I - metode directe
- Microscopia electronică
-Coloraţia specială Loeffler (mordansarea cu tanină, săruri de aluminiu, Fe, apoi colorarea cu
fucsină sau albastru de metilen)

II – metode indirecte (studierea mobilităţii bacteriilor)


- Studierea preparatelor native “picătură suspendată” sau “între lamă şi lamelă”
(microscopia cu contrast de fază sau pe fond negru)
- Însămânţarea culturii\bacteriene în medii semisolide (se observă turbiditate)
- Creşterea culturii “în văl” pe suprafaţa mediului solid

2. Mediile de cultură diferenţial diagnostice. Componenţa. Destinaţia. Utilizarea

practică.

III. Medii diferenţial-diagnostice (DD) – permit diferenţierea speciilor bacteriene in baza activităţii lor
biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere…)
Sunt construite după următoarea schemă:
Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietăţilor zaharolitice
Endo (geloză+lactoză+fucsină+hiposulfit de Na)
Levin (geloză+lactoză+eozină+albastru metilen)
Ploskirev (geloză+lactoză+roşu neutru+săruri de acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roşii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)
Studierea proprietăţilor de oxido-reducere
Mediul cu sulfit de Bi – pentru Salmonella (colonii negre – reducerea sulfitului оn sulfura de Bi)
Mediul Klauberg (geloză-sânge cu telurit de K) –pentru Corynebacterium diphtheriae (colonii negre)

Studierea proprietăţilor lipolitice


Geloza cu gălbenuş de ou – bacteriile cu lecitinază formează un halou opac оn jurul coloniei

Studierea proprietăţilor hemolitice


Geloza-sânge (geloza+5-15% sânge defibrinat)
In cazul hemolizei оn jurul coloniilor apare o zonă clară

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminară


Russel –geloză+1% lactoză, 0,1% glucoză, indicator
Kligler – identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)
Olkeniţki – identic Kligler+1% zaharoză+uree
Indicatorul Andrede – fucsină+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la modificarea pH şi virajul culorii mediului din roşu in
galben.
In pantă se apreciază lactoza/zaharoza (oxidare), in coloană-glucoza (fermentare).
Producerea H2S – innegrirea mediului

Medii DD pentru identificarea finală a culturii pure


- Şirul pestriţ Hiss (lichid sau semi-solid)– un şir de tuburi ce conţin soluţii 0,5% de diferite glucide şi
indicator.
Aprecierea – după modificarea culorii (acid - A) şi apariţia bulelor de gaz (acid şi gaz - AG)
- Medii cu AA (lizină, arginină, ornitină) şi indicatori

3. Determinarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice prin metoda diluţiilor succesive.


Interpretarea rezultatelor.
 Metoda diluţiilor
Într-un şir de tuburi cu 1 ml BP se efectuează diluţia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se
adaugă în fiecare tub (cu excepţia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacteriană 105/ml. Termostat - 24h.

Lectura –cea mai mică doză de AB care inhibă creşterea culturii după 24h de incubare (mediu clar) constituie.

B i l e t u l nr. ____6____

1. Structura peretelui celular la bacteriile grampozitive. Funcţiile.

PERETELE CELULAR AL BACTERIILOR GRAM-POZITIVE


- Uniform, cu pori mici
- Grosimea 20-80 nm (până la 300 nm)
-
- Componentul major (40-80%) reprezintă PG (structură reticulată tridimensională)

- Componente minore:
1. Acizii teichoici (polimeri de glicerol sau ribitol fosfat), fixaţi de N-AGA. Traversează PG şi
crează sarcină electrică negativă la suprafaţa bacteriei, asigură transferul de ioni şi fixarea unor
proteine, funcţie antigenică. Pot activa complementul pe cale alternativă şi stimula secreţia
citokinelor de către macrofage.
2. Acizii lipoteichoici: se fixează de MCP şi depăşesc stratul de PG.
Funcţii: identic cu acizii teichoici, intervin în adeziunea la celule şi au un efect toxic slab.
3. Proteine asociate peretelui celular: proteina A, coagulaza legată (“clumping factor”) şi
proteina fixatoare de fibronectină la Staphylococcus aureus, proteina M la Streptococcus
pyogenes (rol în adeziune la substrate, protecţie de fagocitoză)
4. La unele bacterii G+ (de exemplu: Mycobacterium, Nocardia) peretele conţine o cantitate
importantă de lipide sau ceruri, la altele (ex.: streptococi) peretele conţine multe glucide.

2. Nutriţia bacteriilor. Tipul nutriţiei şi mecanismele transportului nutrienţilor.


Clasificarea bacteriilor în raport cu sursa de carbon.

NUTRIŢIA BACTERIANĂ
 Nutriţia – modalităţile prin care bacteriile asimilează din mediu substanţele necesare pentru
metabolism.
 Modul (tipul) de nutriţie la bacterii este absorbtiv.
 Nutrienţi – substanţe, soluţiile cărora pot traversa MCP pentru a fi antrenate în metabolismul
celulei. Se obţin din alimente prin solvire (săruri minerale, CO2, O2) sau după o digestie prealabilă (proteine,
polizaharide, lipide).
La bacterii digestia este extracelulară (la bacteriile G- în spaţiul periplasmic)
Nutrienţii servesc în calitate de material de construcţie şi sursă de energie pentru sinteza compuşilor şi
menţinerea vieţii bacteriei.

Transportul transmembranar
1. Difuzie simplă (conform gradientului de concentraţie, fără utilizarea energiei): O2, CO2, acizi graşi,
nutrienţi liposolubili
2. Difuzie facilitată (conform gradientului de concentraţie) – permite transportul transmembranar al
moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport specifice - permeaze.
3. Transport activ (contra gradientului de concentraţie, necesită energie). Participă permeazele şi alte
proteine de transport specifice. Nutrienţii nu suportă modificări.
4. Translocaţie – substratul este modificat (ex.: fosforilat) în timpul transportului membranar; necesită
energie

 Substanţele care au pătruns în citoplasmă sunt descompuse de către enzimele bacteriene conform
căilor metabolice proprii fiecărei specii bacteriene (ex.: Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul
pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obţine energie şi precursori care vor fi antrenaţi în biosinteză
(anabolism).
 Excreţia metaboliţilor – difuzie, proteine de transport, liza bacteriei

Necesităţile nutritive ale bacteriilor


- Necesităţi elementare, de bază: C, H, O, N în cantităţi importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K în
cantităţi mici şi urme de Co, Cu, Zn, Mo.
Bacteriile prototrofe sunt capabile a-şi realiza integral sinteza metaboliţilor esenţiali.
- Necesităţi specifice. Bacteriile auxotrofe solicită suplimentar compuşi organici preformaţi (factori de
creştere), care nu pot fi sintetizaţi de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezenţa lor în
mediul de cultură este indispensabilă creşterii acestor bacterii.

Clasificarea bacteriilor după sursa de carbon


 Bacterii autotrofe – utilizează CO2 ca unică sursă de carbon (nepatogene)
 Bacterii heterotrofe – utilizează carbonul din compuşii organici (glucide, acizi graşi, alcooli,
etc)
- Bacteriile care utilizează materia organică moartă sunt saprofite (reciclarea materiei organice)
- Bacteriile parazite (obligate, facultative) trăiesc pe contul organismelor vii, aducându-le
prejudicii
- Bacteriile patogene reprezintă parazite care afectează grav gazda, provocând maladie sau moarte.

3. Acţiunea factorilor chimici asupra microorganismelor. Utilizarea practică

B i l e t u l nr. ____7____

1. Structura peretelui celular la bacteriile gramnegative. Funcţiile.

PERETELE CELULAR AL BACTERIILOR GRAM-NEGATIVE


- Grosimea 10-12 nm
- Neomogen, format din straturi distincte:\

1.PG, stratul intern, constituie 1-10% din masa uscată a peretelui celular. Acizii teichoici lipsesc.
Nu exista punţi interpeptidice (structură bidimensională).
2.Membrana externă (ME) – dublu strat lipidic cu proteine înserate (proteine majore – 70%,
minore – 30%).
Unele proteine majore - porine, unindu-se în triplete, participă la formarea porilor, altele
(nonporine) – au funcţie de receptor pentru bacteriofagi şi pili sau asigură adeziunea la receptorii
celulelor-gazde.
Proteinele minore sunt enzime implicate in captarea unor substanţe şi transportul specific
transmembranar.
ME este permeabilă pentru ioni şi mici molecule hidrofile şi impermeabilă pentru molecule
hidrofobe sau amfipatice
3. Lipoproteinele asigură legătura dintre ME şi PG
4. Lipopolizaharidul (LPZ) – stratul extern al peretelui gram-negativ. Este format din:
- Lipidul A (endotoxină), glicolipid ancorat în ME. Stimulează formarea şi secreţia
citokinelor. Determină efectul toxic al bacteriilor G- manifestat în urma lizei celulare.
- Polizaharide complexe, fixate pe lipidul A. Participă în procese de penetrare şi transport
a unor substanţe, conferă specificitate de gen (antigenul R)
- La exterior, subunităţi oligozaharidice liniare sau ramificate. Crează sarcină negativă la
suprafaţa bacteriei (împiedică fagocitoza, accesul moleculelor toxice), conferă specificitate de
specie sau tip (antigenul O)

Spaţiul periplasmic este regiunea dintre ME şi


MCP. Conţine PG şi proteine-enzime implicate în transport, digestia nutrienţilor, protecţia
contra substanţelor toxice (ex.: beta-lactamazele, care distrug antibioticele beta-lactamice).
La bacteriile G+ aceste enzime sunt secretate în mediul extern.
Evidenţierea peretelui celular: microscopia electronică, metode speciale de colorare, plasmoliză
(în mediu hipertonic), plasmoptiză (în mediu hipotonic).

FUNCŢIILE PERETELUI CELULAR


 Conferă forma bacteriilor
 Barieră osmotică şi mecanică
 Barieră de permeabilitate selectivă
 Funcţie antigenică (Ag O şi R)
 Participă la procesele de creştere şi diviziune celulară
 Funcţie de receptor
 Responsabil de aderenţa specifică la substrate
 Componente ale peretelui celular (lipidul A, acizii lipoteichoici, fragmente de PG)
contribuie la producerea citokinelor şi activarea complementului pe cale alternativă cu
manifestarea şocului septic (endotoxinic)
 Reprezintă ţinta de atac a unor enzime şi antibiotice

2. Cultivarea bacteriilor. Condiţiile necesare pentru cultivare. Noţiuni de cultură


pură, cultură mixtă, tulpină.
 Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mică de material ce conţine bacterii (inoculum)
se introduce intr-un mediu de cultură (insămânţare, inoculare), care ulterior va fi incubat in
termostat (pentru asigurarea temperaturii optime).
 In timpul incubării (18-24-48 ore…..) bacteriile cresc şi se divid, formând o cultură
bacteriană (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis – 3-5 săptămâni
V.cholerae – 6-12 ore

Cerinţele faţă de mediile de cultură


- Să asigure necesităţile nutritive şi energetice ale bacteriilor
- Umiditate optimală
- pH optimal (7,2-7,4) şi constant (caracter de tampon)
- Potenţial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi – rH2>10)
- Să fie izotonice (0,5% NaCl)
- Să fie sterile şi transparente

 Cultură pură – formată din bacterii de aceeaşi specie (indispensabilă identificării)


 Cultură mixtă – compusă din bacterii de specii diferite
 Tulpină – populaţie microbiană constituită din descendenţii unei singure izolări оn
cultură pură, care va fi studiată ulterior.
 Clonă – populaţie care rezultă din multiplicarea unei singure celule

3. Noţiuni de sterilizare, dezinfecţie, aseptică, antiseptică. Principalele dezinfectante şi


antiseptice utilizate în medicină.

Asepsia inseamna manipularea la adapost de microorganism.


Antisepsia inseamna distrugerea microorganismelor de pe instrumentele de manipulare.
Sterilitate este distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor, inclusiv al sporilor.
Obiect steril- obiect care a fost prelucrat special si au fost distruse sau indepartate toate
microorganismele(inclusiv sporii) de pe el si la insamantare prezinta lipsa cresterii.
Obiect nesteril- obiect care a intrat in contact cu mediul inconjurator sau cu bolnavul si care la
insamantare prezita prezenta crestii
"Dezinfectia" este metoda de decontaminare prin care se urmareste distrugerea in mediul fizic inconjurator a
formelor vegetale ale microorganismelor in scopul prevenirii si combaterii infectiilor si in particular a bolilor
transmisibile.
B i l e t u l nr. ____8____

1. Coloraţia Gram. Tehnica şi mecanismele colorării. Importanţa practică.

COLORAŢIA GRAM (condiţionată de structura şi compoziţia chimică a peretelui celular)


 Colorarea frotiului fixat cu violet de genţiană (citoplasma bacteriilor se colorează în violet)
 Spălarea cu apă apoi tratarea cu soluţie Lugol (I2 +KI) – fixează colorantul în celule prin
formarea complexului insolubil violet-iodin
 Decolorarea cu alcool 95%. Bacteriile G+ păstrează colorantul, cele G- se decolorează.
 Recolorarea bacteriilor G- cu fucsină apoasă
Rezultat: bacteriile G+ apar colorate în violet, bacteriile G- în roşu.

 Mecanismul: Peretele G- este subţire,conţine multe lipide (20%), care sunt dizolvate de alcool,
porii au diametrul mare, pH citoplasmei este slab acid (se decolorează cu alcool);
Peretele G+ este gros, nu conţine lipide sau foarte puţine, alcoolul deshidratează peretele şi reduce
diametrul porilor, pH acid
(colorantul nu este spălat din citoplasmă)
Utilizarea practică a coloraţiei Gram:
 Diagnostic
 Orientare оn tratament (sensibilitate diferită la antibiotice)

2. Sterilizarea cu vapori sub presiune. Obiectele şi regimul sterilizării. Controlul


eficienţei sterilizării.
Sterilizarea prin caldura umeda,se face cu ajutorul autoclavului prin vapori sub presiune,care
realizeaza

- 110C,la 0,5atmosfere,(10 minute) si fractionat 100C 30 minute 3 zile


(medii de cultura cu glucide,lapte)
Control:vapori fluenti
-120C la 1 atmosfera.(20 minute)
(medii de cultura simple,halate,tampoane,instrumente)
Control:acid boric
-134c la 2 atmosfere.(30minute)
(obiecte contaminate cu m.o patogene sporulate)
Control:test biologic(spori),fenacetina

3. Metabolismul microbian, particularităţile. Enzimele bacteriene, clasificarea.

 Metabolismul bacterian reprezintă ansamblul de reacţii biochimice care au loc în celula


vie.
- Catabolism – reacţii chimice de descompunere a substanţelor complexe în elemente
simple, însoţită de degajarea energiei (metabolism energetic)
- Anabolism – reacţii chimice de sinteză a substanţelor complexe din elemente simple,
necesită energie (metabolism constructiv, de sinteză)
Particularităţile metabolismului bacterian:
 Este un metabolism necompartimentat , toate procesele metabolice se desfăşoară intr-o
singură celulă
 Este foarte flexibil, realizându-se prin diverse căi metabolice (bacteriile se adaptează
rapid la condiţiile mediului)
 Este foarte intens (viteza reacţiilor este mare)
 Produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct în calitate de
precursori pentru reacţiile anabolice (amfibolism)
În toate reacţiile metabolice intervin catalizatori proteici specifici - enzimele

Enzimele bacteriene. Caractere generale:


- Substanţe proteice
- Active în limite largi de temperaturi (0-65°C) şi de pH (2-9)
- Specificitate de substrat şi de acţiune (reacţionează cu un substrat catalizând un tip de
reacţie)
- Specificitatea este determinată de centrul activ al enzimei, complementar cu receptorul de
pe substrat
- Nu se modifică în cursul reacţiei

Clasificarea enzimelor
 Constitutive (permanente)
 Inductive (adaptive), se sintetizează în prezenţa substratului (ex.: lactaza)
 Represive, sinteza lor este inhibată de acumularea în exces a produsului reacţiei
catalizate
 După locul de acţiune (exoenzime, endoenzime)
 După tipul reacţiei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze,
ligaze)
 După impactul asupra ma/o
- Enzime metabolice
- Enzime de patogenitate, responsabile de modificări patologice ale ţesuturilor, celulelor
ma/o : hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza,
proteaze, etc.

B i l e t u l nr. ____9____

1. Capsula bacteriilor. Compoziţia chimică. Funcţiile biologice. Metodele de


evidenţiere.

CAPSULA
- învelişul extern al unor bacterii.
Reprezintă polimeri organici sintetizaţi în mediul natural de viaţă al bacteriilor (exemplu: în
macroorganism).
Se disting:
- Capsula adevărată (peste 0,2µm), vizibilă la microscopul optic
- Microcapsula, detectată la microscopul electronic
- Capsula flexibilă (slime, glicocalix), o reţea laxă de fibre polizaharidice, care difuzează în
mediu. Nu se evidenţiază microscopic. Asigură formarea biofilmelor bacteriene – ansamblu
structurat de celule bacteriene înglobate întro matrice de polimeri de origine bacteriană, care
poate adera la suprafeţe inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sonde de intubare,
etc) sau ţesuturi vii.
Compoziţia chimică a capsulei: apă şi substanţe organice (polizaharide, mucopolizaharide,
peptide)
 Bacillus anthracis – acid glutamic
 Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae – polizaharide
 Streptococcus pyogenes – acid hialuronic

Funcţiile capsulei:
- Impiedică desicarea bacteriei
- Barieră de permeabilitate pentru substanţe toxice (antibiotice, ioni metalici)
- Barieră protectoare faţa de factori antiinfecţioşi (complement, fagocite), bacteriofagi,
protozoare
- Rezervă nutritivă
- Asigură aderarea bacteriei la substrate – ţesuturi sau suporturi inerte (placa dentară,
biofilm pe catetere, proteze, instrumente, etc)
- Specificitate antigenică de specie sau tip (Ag K)

Evidenţierea capsulei
Coloraţia Burri-Hins (metodă negativă)
- Pe lamă se amestecă suspensia bacteriană cu tuş de China, se etalează, se usucă
- Frotiul se fixează cu alcool
- Se colorează frotiul cu fucsină apoasă
Rezultatul: capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma bacteriilor se
colorează în roşu.
Coloraţia Romanovski – Giemsa (capsula se colorează în roz) – coloraţie pozitivă a capsulei

2. Sterilizarea cu vapori fluenţi. Tindalizarea. Pasteurizarea. Obiectele şi regimul


sterilizării. Aplicarea păractică.

Conservarea prin agenti fizici:


Pasteurizarea – (lapte) 60-65C 30 minute
(lapte)70-75C 45 secunde
(sucuri,vinuri)85C 2 minute cu racier brusca
(lapte) 92C secunde cu racier brusca
-Tindalizarea(seruri)
60C
60 minute
5-6 zile
Control:termometru

3. Determinarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice prin metoda difuzimetrică.


Interpretarea.
Testarea sensibilităţii bacteriilor la AB
Metoda difuzimetrică(rondelelor). Utilizată uzual în infecţii banale.
Condiţii: mediu standard, concentraţie standardă de mi/o (105/ml), rondele/discuri (comprimate) cu %
standarde de AB, condiţii standarde.
Mediul este inoculat cu suspensia bacteriană. După uscare în termostat se aplică rondelele –24h, 37 C.
Lectura –diametrul zonei de inhibiţie a creşterii culturii bacteriene este comparat cu diametrele standarde
pentru fiecare AB. Valori sub acest diametru –tulpina este R, dacă este depăşit –S.
B i l e t u l nr.__10___

1. Citoplasma bacteriilor. Compoziţia chimică. Funcţiile biologice. Metodele de


studiere.

CITOPLASMA
- Necompartimentată
- Lipsesc organitele celulare
- Formată din apă (80%), conţine nucleoidul, ribosomi (apr. 20 000 per celulă), incluziuni,
plasmide, ioni, enzime, deşeuri, etc.
- Consistenţa densă (stare de gel) asigură permanenţa mediului intern
- pH acid
Funcţii: sediul tuturor proceselor metabolice
Evidenţierea: prin orice metodă de colorare

2. Mediile de cultură selective şi de îmbogăţire. Compoziţia. Aplicarea practică.

Medii complexe

Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condiţii fizico-chimice particulare
care stimulează creşterea unor specii şi inhibă creşterea altor specii (geloza salină - stafilococi,
geloza alcalină - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

Mediile de imbogăţire reprezintă medii selective lichide, utilizate pentru imbogăţirea florei
patogene şi inhibarea florei de asociaţie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale).
Etapă premergătoare insămânţării pe medii selective.
- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )
- Mediul Kauffmann (mediul Muller+bilă+verde de briliant) – Salmonella
- Bulion cu selenit – Shigella, Salmonella
- Apă peptonată alcalină (pH=8) –Vibrio cholerae
- Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat) – pentru anaerobi

3. Rezistenţa microorganismelor la antibiotice. Tipurile. Mecanismele. Căile de


combatere.
Rezistenţa mi/o la antibiotice
Cauzele:
1. Factori genetici, proprii bacteriilor
2. Factori ce favorizează selecţia şi difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente
Tipurile de rezistenţă:
1. Naturală, ereditară, de specie, prezentă la toţi membrii unei specii sau gen
- lipsa ţintei–ex.: micoplasme, micete;
- imposibilitatea de a atinge ţinta–ex.:
Mycobacterium (cerurile, lipidele împiedică
pătrunderea AB în citoplasmă);
- bacteriile nu efectuează procesul inhibat de AB–
ex.: acidul folic este preluat din mediu –rezistenţă
la sulfamide

2. Achiziţionată, dobândită, afectează tulpinile unei specii sensibile. Depinde de acţiunea de selecţie exercitată
de AB utilizate în tratament, urmată de răspândirea ei (între bacterii, interuman, transmisie de origine
animală).

Mecanismele rezistenţei dobândite:


- Diminuarea permeabilităţii membranare
- Modificarea ţintei moleculare
- Eliminarea excesivă a AB
- Inactivarea enzimatică a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinază, cefalosporinază) sau modificat structural
(acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc.

Rezistenţa dobândită se poate manifesta fenotipic (bacteriile în faza de repaos, formele “L” de bacterii) sau
genetic (genotipic)
Rezistenţa genetică poate fi:
- Cromozomială, determinată de mutaţii (10%)
Mecanisme: modificarea ţintei moleculare, diminuarea permeabilităţii membranare
- Plasmidică, epidemică, realizată prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fi rezistenţă
multiplă).
Mecanisme: inactivarea enzimatică, modificarea ţintei, substituţia sau supraproducţia ţintei, excreţie excesivă
a AB.
Prevenirea rezistenţei
1. Supravegherea epidemiologică a tulpinilor rezistente
2. Politică strictă de prescriere a AB
3. Respectarea dozelor terapeutice corecte şi a timpului de tratament necesar
4. Asocierea AB cu mecanisme de acţiune diferite
5. Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utilizând inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul,
tazobactamul). Ex.: augmentina –amoxicilina+acid clavulanic
6. Reciclarea AB
7. Producerea AB noi

B i l e t u l nr.__11___

1. Acidorezistenţa microorganismelor. Coloraţia Ziehl-Neelsen. Tehnica de colorare şi


mecanismul.

Acidorezistenţa bacteriilor
Unele bacterii G+ (Mycobacterium, Nocardia) conţin în componenţa peretelui multe lipide, acizi
graşi şi ceruri (70% din greutatea peretelui). Aceasta le conferă rezistenţă marcantă în mediul
extern şi sensibilitate distinctă la antibiotice.
Coloraţia Ziehl-Neelsen permite diferenţierea acestor bacterii după proprietatea lor de acido-
alcoolo-rezistenţă
METODA DE COLORARE ZIEHL-NEELSEN
Principiul: bacteriile acido-rezistente colorate cu fucsină fenicată încălzită nu pot fi decolorate
de acizi sau alcool.
 Frotiul se colorează cu fucsină fenicată, încălzind lama până la apariţia vaporilor (2 - 3
ori)
 Se clăteşte cu apă, apoi se tratează cu soluţie de acid sulfuric de 5%
 După spălare frotiul se recolorează cu albastru de metilen
Rezultatul: bacteriile acido-rezistente rămân colorate în roşu, cele acido-nerezistente se
decolorează, apoi se recolorează în albastru

2. Sterilizarea cu căldură uscată. Obiectele şi regimul sterilizării.

Sterilizarea cu aer fierbinte(cald):Pupinel (vesela,uleiuri,pulberi


Indicatii: Obiecte din sticla (eprubete, flacoane, pipete) sau din portelan (mojare, pistile),
seringi Luer din sticla, instrument chirurgical, substante grase, pulberi termostabile.
Se realizeaza in etuva la temperature de 160-180 grade Celsius timp de o ora.
Suplimentar inca o ora in cazul ambalajelor voluminoase sau obiectelor care se incalzesc
greu. Etuva e o incinta cilindrica cu pereti dubli din table termoizolati.Un thermostat care
mentine temperature. Un sistem de ventilare care uniformizeaza temperature.
Procedura: Obiectele sterilizarii se pun pe rafturi cu spatii intre ele pentru libera circulatie
al aerului cald. Se inchide etuva. Se deschid orificiile de ventilare si se conecteaza la retea.
Se marcheaza timpul de sterilizare. Obiectele se scot numai dupa racirea aparatului.
Controlul eficientei sterilizarii: 3 tipuri de indicatori; fizici (manometru, termometru),
chimici (floare de sulf (autoclave) se topeste la 115 grade C, acid benzoic(autoclava) se
topeste la 121-122 grade C, tiouree (etuva) se topeste la 180 grade) si biologici: tuburi cu
fire de bumbac cu spori, dupa sterilizare se insemanteaza.

3. Antibioticele. Clasificarea după caracterul acţiunii, spectrul de activitate şi


producent. Cerinţele faţă de antibiotice.

 ANTIBIOTICE (AB)–produse de origine naturală (microbiană, animală sau vegetală), derivaţi semi-
sintetici sau produse sintetice care inhibă sau omoară selectiv unele mi/o sau/şi celule tumorale, fără a exercita
ca regulă efecte toxice asupra macroorganismului.
 Clasificarea AB
I. După efectul asupra celulei
- Bacteriostatic (tetraciclina, cloramfenicol…)
- Bactericid (streptomicina, polimixina)
- Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine)
II. După spectrul de acţiune
- AB cu spectru restrâns (îngust) de acţiune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase,
anti-micotice, anti-tumorale, etc)
- AB cu spectru larg de acţiune (G+ şi G-)
III. După producent (origine)
1. De origine fungică (peniciline, cefalosporine,...)
2. Din actinomicete (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc)
3. De origine microbiană (bacitracina din Bacillus subtilis, gramicidina din Bacillus brevis, polimixina din
Bacillus polimyxa)
4. De origine vegetală –fitoncidele (alicina, rafanină, imanină)
5. De origine animală (lizozimul –din albuş de ou, ecmolina –din oase de peşte, eritrina –din masă
eritrocitară, splenocitina –din splină)
IV. După compoziţia chimică(beta-lactamice, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, polipeptide, poliene,
sulfamide, chinolone şi fluorochinolone, nitrofurani, etc)

Cerinţele faţă de AB:


- Toxicitate selectivă
- Efect terapeutic cu doze minime - Să nu se dezvolte rezistenţa contra AB
- Activitate de lungă durată - Să fie ieftine
- Spectru restrâns de acţiune
- Să fie solubile şi absorbite uşor
- Să nu provoace efecte secundare
B i l e t u l nr._12___

1. Studierea bacteriilor vii. Pregătirea preparatelor „picătură suspendată” şi „între


lamă şi lamelă”. Metodele de studiere şi utilizarea practică.

Studierea preparatelor native “pică tură suspendată ” sau “între lamă şi lamelă ”
(microscopia cu contrast de fază sau pe fond negru).
Însă mâ nţarea culturii bacteriene în medii semisolide (se
(se observă
observă turbiditate) .
Creşterea culturii “în vă l” pe suprafaţa mediului solid.

2.Clasificarea mediilor de cultură după provenienţă, consistenţă şi complexitate.


Exemple.

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ


După provenienţă
 Empirice, naturale. Au la bază produse de origine animală sau vegetală (sânge, ser, lapte,
ouă, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, peşte, levuri, etc). Compoziţia lor chimică
precisă nu poate fi controlată
 Sintetice – includ ingrediente chimice pure, compoziţia chimică este cunoscută cu
exactitate
 Semisintetice

După consistenţă
 Medii lichide (bulion)– utilizate pentru obţinerea biomasei bacteriene şi a produselor
lor (antibiotice, enzime, toxine)
 Medii solide – conţin 10-15% gelatină sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge
roşii, t° topire 80-100°C, solidificare 42°C). Placa de geloză оn cutii Petri este utilizată pentru
izolarea culturilor pure, geloza оnclinată (оn pantă) – pentru acumularea culturilor pure
 Medii semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-agar. Se utilizează pentru studierea activităţii
biochimice sau a mobilităţii bacteriilor.

După compoziţia chimică (complexitate) şi destinaţie

A. Medii uzuale (universale, simple)


 Apă peptonată (apă+1% peptonă+0,5% NaCl)
 Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% peptonă+0,5% NaCl)
 Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar)
 Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină)
Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120°C, 20 min

B. Medii complexe
I. Medii elective – formate din medii simple cu adaos de componente care permit creşterea mi/o
exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloză-sânge – streptococi, neisserii; ser coagulat
– corinebacterii, etc)
II. Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condiţii fizico-chimice
particulare care stimulează creşterea unor specii şi inhibă creşterea altor specii (geloza salină -
stafilococi, geloza alcalină - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

3.Mecanismele de acţiune a antibioticelor. Exemple.

Mecanismul de acţiune al AB
1. AB cu acţiune asupra sintezei peretelui celular (dereglarea sintezei peptidoglicanului)- Beta-lactamice
(peniciline, cefalosporine). Dereglează procesul de sinteză a PG, inhibând transpeptidazele (ţinta - PFP)
- Vancomicina, teicoplanina (blochează transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular)
- Bacitracina (blochează reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol)
- Fosfomicina (blochează piruviltransferaza, implicată în sinteza acidului N-acetil muramic)
Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorâte.Nu afectează celulele
eucariote (lipsa PG).
2. AB cu acţiune asupra ME şi a MCP
- AB polipeptidice (polimixina, colistina). Se fixează pe membrane bacteriene (în special pe lipidul A (ME la
bacterii G-), provocând dezorganizarea lor. Efect bactericid.
- AB polienice (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixează pe sterolii MCP ale micetelor, perturbând
respiraţia şi dezorganizând MCP (permeabilitate excesivă şi moartea celulei).Aceste AB acţionează şi asupra
celulelor în repaos. Relativ toxice, în special nefro.
3. AB cu acţiune asupra ribozomilor
- 30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline)
- 50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide: clindamicina,
lincomicina).Se leagă pe receptori specifici de pe subunităţile 30S sau 50S, perturbând sinteza proteică
(inhibiţia transpeptidazei, a translocaţiei peptidelor, etc). Rezultă inhibiţia sintezei proteice sau sinteza
proteinelor nefuncţionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele –bactericid), doar asupra celulelor active
metabolic.
4. AB cu acţiune asupra acizilor nucleici
- Rifampicina –inhibă ARN-polimeraza ADN-dependentă. Rezultă stoparea sintezei ARNm
- Novobiocina , Chinolonele (acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) –blochează activitatea topo-
izomerazelor, intervenind în conformaţia ADN-ului. Efect bactericid.

B i l e t u l nr.__13___

1. Fimbriile bacteriene. Tipurile, funcţiile biologice. Metodele de evidenţiere.

Pilii comuni (fimbriile)– elemente proteice fine, rigide, scurte repartizate pe suprafaţa celulei
bacteriene G - în special. Sunt formate din subunităţi proteice identice (pilina), implantate în ME.
 Numărul fimbriilor per celulă: 1 – sute
 Funcţii: asigură adeziunea bacteriilor la suprafeţe inerte, la celule sau alte bacterii,
reprezintă antigenul F

Pilii conjugativi – structuri capiliforme de natură proteică, prezenţi în număr de 1-10 per celulă
(numai la bacteriile ce găzduiesc plasmide conjugative F).
 Funcţii: transferul de ADN prin conjugare, receptori pentru unii bacteriofagi
 Evidenţierea pililor: microscopia electronică

2. Manifestarea culturii bacteriene în medii lichide şi solide. Colonia bacteriană.


Tipurile de colonii şi caracteristica lor.

Manifestarea creşterii şi multiplicării bacteriilor


 In mediu lichid
- Turbiditate uniformă
- Formarea unei pelicule la suprafaţa mediului (vibrioni, yersinia)
- Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe pereţi (streptococi, Bacillus anthracis)

 In mediu solid – formarea coloniilor


Colonie – o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau un grup de celule
(UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafaţa unui mediu solid
 Fiecare specie bacteriană formează colonii specifice (caracter util in identificare)

Caracteristica coloniilor
Dimensiuni – colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)
Contur (margini) – neted, ondulat, zimţat, lobat, etc
Suprafaţă – plată, bombată, convexă, ombilicată, etc
Formă – punctiformă, circulară, filamentoasă, neregulată
Culoare (pigmentaţie) – albă, galbenă, aurie, etc
Densitate – opacă, transparentă, etc
Consistenţă – cremoasă, untoasă, uscată, mucoidă

 Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede, lucioase
Colonii R (rough) – margini neregulate, suprafaţa uscată, rugoasă
Caracterele de cultură ale bacteriilor reprezintă exigenţele nutritive (medii, temperatură, pH,
aerare, etc), timpul apariţiei culturii şi manifestarea creşterii pe medii lichide şi solide

3.Determinarea concentraţiei antibioticului în umorile organismului. Utilizarea practică.


Monitorizatea (supravegherea) tratamentului cu AB. Verificarea eficacităţii antibioterapiei.
1. Determinarea concentraţiilor umorale sau tisulare ale AB
Indicaţii:
- Utilizarea unui AB toxic
- În caz când bolnavul suferă de deficienţe metabolice sau excretoare (renale, hepatice)
Se compară concentraţiile obţinute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT).
B i l e t u l nr.___14__

1. Granulaţiile de volutină. Compoziţia chimică. Rolul biologic. Metodele de


evidenţiere.

GRANULAŢIILE DE VOLUTINĂ
Reprezintă polimeri anorganici de polimetafosfat. Servesc în calitate de rezervă de fosfaţi şi pot
interveni în metabolismul energetic.
Interesul medical: la agentul difteriei, Corynebacterium diphtheriae, granulele de volutină se
localizează la extremităţile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate neuniform în
citoplasmă.
La tratarea cu unii coloranţi bazici granulele de volutină se colorează în altă culoare, de ex. în
roşu-violet la colorarea cu albastru de metilen – fenomenul metacromaziei.
Evidenţierea: metoda Loeffler, metoda Neisser

2. Etapele examenului bacteriologic pentru culturile anaerobe (metoda Zeissler)

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE


(clostridiene, neclostridiene)
Condiţia principală –cultivare în absenţa oxigenului
1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100ºC, 20 min, răcit, acoperit cu
vazelină; însămânţarea în geloză în coloană)
2. Crearea condiţiilor de anaerobioză
- Metoda fizică–utilizarea anaerostatului
- Metoda chimică–în exicator se întroduc substanţe ce fixează oxigenul
(pirogalol+bază);utilizarea gas-pachetelor
- Metoda biologicăFortner –cultivarea concomitentă a aerobilor şi anaerobilor

Recoltarea –cu precauţie, evitând contactul cu aerul (în seringi, utilizând medii speciale)

I etapă –ÎMBOGĂŢIREA ANAEROBILOR


- Însămânţarea prelevatului în 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat
- Încălzirea unui tub la 80ºC, 20 min –distrugerea florei nesporogene
- Incubarea la 37ºC, 24-48 h (va avea loc înmulţirea anaerobilor)

II etapă - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI


- Studierea caracterelor de cultură –tulburarea mediului, descompunerea bucăţilor de ficat, etc
- Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (însămânţarea a 0,1 ml din mediul K-T
pe 3 cutii cu geloză-sânge glucozată consecutiv). Incubarea în anaerostat/exicator/gas-pack, 24-
48 h
- Metoda Weinberg –diluţii succesive ale culturii în geloză glucozată lichefiată şi aspirarea în tuburi lungi şi
înguste, închise ermetic. Incubarea în termostat, 24 h
III etapă - ACUMULAREA CULTURII PURE
- Studierea macroscopică a coloniilor
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte
- Repicarea în mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure
- Incubarea în termostat, 24 h

IV etapă - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI


- Verificarea purităţii culturii pure (frotiu Gram)
- Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiţiilor de anaerobioză)
V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA ŞI ELIBERAREA
RĂSPUNSULUI

3. Metodele de obţinere a antibioticelor. Cerinţele faţă de antibiotice.

 Producerea AB
1. Metoda biologică
2. Metoda sintetică
3. Metoda semi-sintetică

Cerinţele faţă de AB:


- Toxicitate selectivă
- Efect terapeutic cu doze minime
- Activitate de lungă durată
- Spectru restrâns de acţiune
- Să fie solubile şi absorbite uşor
- Să nu provoace efecte secundare
- Să nu se dezvolte rezistenţa contra AB
- Să fie ieftine

B i l e t u l nr.__15___
1. Noţiune de microorganisme. Deosebirile dintre celulele eucariote şi procariote.

Celule eucariote Celule procariote


Aparatul nuclear – nucleu cu nucleoli, Moleculă de ADN circular,
înconjurat de membranănucleară lipsa membranei nucleare

Cromozomi cu structură complexă, Structură cromozomică


histone asociate, set diploid simplă,set haploid

Celula se divide prin mitoză sau meioză Diviziune binară

Lipsa peretelui celular (în caz de Prezenţa peretelui celular ce conţine obligator
prezenţăconţine chitina sau celuloza) peptidoglican

Prezenţa organitelor celulare Absenţa organitelor celulare,


citoplasma omogenă, ne-
compartimentată

2 tipuri de ribosomi –în citoplasmăşi în Toţi ribosomii sunt identici


mitocondrii sau cloroplaste
Coeficientul de sedimentare al
ribosomului
80 S (citoplasma) 70 S (50S , 30 S)
70 S (mitocondrii)

Microorganismele sunt organisme microscopice cu dimensiuni de ordinul µm


(10-6 m) sau nm (10-9 m), de obicei unicelulare, ce fac parte din regnurile Monera, Protista,
și, parțial, din regnul Fungi. Ele fac parte din toate cele trei domenii ale vietii, și anume
Archaea (Procariote), Bacteria (Procariote) și Eukarya (Eucariote). Reprezintă un grup
extrem de eterogen de organisme și deosebit de important pentru biosferă.

2. Etapele examenului bacteriologic pentru culturile aerobe. Scopul şi volumul de


lucru la fiecare etapă.
 EXAMENUL BACTERIOLOGICPENTRU CULTURILE AEROBE
- Prelevatul este supus examenuluimacroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) -
orientare îndiagnostic
- După necesitate, probele sunt supuse pregătirii pentru investigaţie (diluare, omogenizare,
centrifugare, etc)
- Examinarea microscopică(preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) –prezenţa
mi/o, forma, cantitatea, G+/-.

I etapă –IZOLAREA CULTURILOR PURE


Scopul izolării- de a obţine o culturăpurădintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un
produs patologic. O colonie separatăconstituie o culturăpură.
Tehnici utilizate:
1. Prin epuizarea inoculului pe suprafaţa gelozei din cutia Petri (însămânţareîn striuri
paralele, însămânţareîn cadrane, etalarea consecutivăpe trei cutii).
2. Metoda diluţiilor logaritmice a inoculului în geloză topită şi răcită la 50ºC (10-1, 10-2,...),
apoi turnate în cutii Petri sau eprubete.Incubare în termostat la 37ºC, 18-24 h (în funcţie de
TG).
II etapă –ACUMULAREA CULTURII PURE
- Examinarea macroscopică a coloniilor crescute (formă, culoare, dimensiuni, etc)
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea purităţii culturii
- Repicarea coloniilor suspecte pe geloză în pantă (înclinată) pentru acumularea culturii pure
- Termostat, 37ºC, 18-24 ore
III etapă –IDENTIFICAREA CULTURII PURE
- Verificarea purităţii culturii (frotiu Gram)
- Identificarea culturii pure constă în evidenţierea unor caractere specifice ale acestei culturi
pentru a o include într-o familie, gen, specie, variantă
Se studiază caracterele:
- Morfologice
- Tinctoriale
- De cultură
- Biochimice
- Antigenice (seroidentificarea)
- De patogenitate
- Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)
- Sensibilitatea la antibiotice
IV etapă –EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA
RĂSPUNSULUI
- Compararea rezultatelor obţinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a găsi
asemănări.
- Exemplu de răspuns: Din proba examinată a fost izolată tulpina de
Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibilă la ...., rezistentă la
.....
3. Noţiuni de CMI, CMB. Corelaţia CMI/CT şi semnificaţia ei în prescrierea
antibioticelor.
Concentraţia Minimă Bactericidă (CMB)–cantitatea minimă de AB care omoară 99,9% din inoculum
după 18h de incubare.Determinarea CMB –din ultimele tuburi fără placa cu geloză. După 24h se
compară
numărul celulelor ce au supravieţuit cu nr iniţial de bacterii (105/ml).
Concentraţia Minimă de Inhibiţie (CMI)a AB pentru tulpina testată.CMI măsoară efectul
bacteriostatic.
Corelaţia dintre studii in vitroşi rezultate in vivo
În studii in vitro parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentraţia AB, etc) nu se
modifică în timp. In vivo, la pacienţi, concentraţia AB variază în timp şi în funcţie de
ţesut.
Pentru a stabili dacă tulpina izolată este sensibilă sau rezistentă la un AB se cere
cunoaşterea Concentraţiei Terapeutice(CT)(cantitatea de AB prezent în focarul
infecţios în cursul tratamentului cu doze terapeutice) a fiecărui AB testat.
 Tulpini Sensibile –CMI/CT <1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzuale
 Tulpini Rezistente –CMI/CT>1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil
 Tulpini Intermediare –CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze
maxime de AB sau administrarea lor locală

B i l e t u l nr._16____

1. Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Coloranţii principali utilizaţi în practica


microbiologică. Mecanismele coloraţiei.
Caracter tinctorial –capacitatea bacteriilor de a fixa diferiţi coloranţi

Coloranţii bazici (violetul de genţianăsau de metil, fucsina bazică, albastrul de metilen,


vezuvina, chrizoidina, etc) au afinitate pentru structurile acide ale celulei bacteriene
Tipuri de coloraţii: simple, complexe
(diferenţiale, speciale)

2. Principiile de cultivarea a bacteriilor. Particularităţile de izolare a culturilor pure


de bacterii în dependenţă de unele caractere biologice ale lor.

3. Rezistenţa bacteriilor la antibiotice. Tipurile. Mecanismele rezistenţei. Combaterea.

Rezistenţa mi/o la antibiotice


Cauzele:
1. Factori genetici, proprii bacteriilor
2. Factori ce favorizează selecţia şi difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente
Tipurile de rezistenţă:
1. Naturală, ereditară, de specie, prezentă la toţi membrii unei specii sau gen
- lipsa ţintei–ex.: micoplasme, micete;
- imposibilitatea de a atinge ţinta–ex.:
Mycobacterium (cerurile, lipidele împiedică
pătrunderea AB în citoplasmă);
- bacteriile nu efectuează procesul inhibat de AB–
ex.: acidul folic este preluat din mediu –rezistenţă
la sulfamide

2. Achiziţionată, dobândită, afectează tulpinile unei specii sensibile. Depinde de acţiunea de selecţie exercitată
de AB utilizate în tratament, urmată de răspândirea ei (între bacterii, interuman, transmisie de origine
animală).

Mecanismele rezistenţei dobândite:


- Diminuarea permeabilităţii membranare
- Modificarea ţintei moleculare
- Eliminarea excesivă a AB
- Inactivarea enzimatică a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinază, cefalosporinază) sau modificat structural
(acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc.

Rezistenţa dobândită se poate manifesta fenotipic (bacteriile în faza de repaos, formele “L” de bacterii) sau
genetic (genotipic)
Rezistenţa genetică poate fi:
- Cromozomială, determinată de mutaţii (10%)
Mecanisme: modificarea ţintei moleculare, diminuarea permeabilităţii membranare
- Plasmidică, epidemică, realizată prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fi rezistenţă
multiplă).
Mecanisme: inactivarea enzimatică, modificarea ţintei, substituţia sau supraproducţia ţintei, excreţie excesivă
a AB.
Prevenirea rezistenţei
1. Supravegherea epidemiologică a tulpinilor rezistente
2. Politică strictă de prescriere a AB
3. Respectarea dozelor terapeutice corecte şi a timpului de tratament necesar
4. Asocierea AB cu mecanisme de acţiune diferite
5. Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utilizând inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul,
tazobactamul). Ex.: augmentina –amoxicilina+acid clavulanic
6. Reciclarea AB
7. Producerea AB noi

B i l e t u l nr.__17___

1. Protoplaştii. Sferoplaştii. Formele L de bacterii.

Sub influenţa unor substanţe (lizozim, antibiotice) PG poate fi deteriorat, iar bacteria
“explodează” din cauza presiunii osmotice ridicate (5-20 atm). În mediu echilibrat osmotic pot fi
obţinute forme particulare:
 Protoplastul - reprezintă o structură sferică totalmente lipsită de perete celular. El este
obţinut din bacterii G+
 Sferoplastul - structură sferică sau neregulată parţial lipsită de perete celular. Este o
bacterie G- lipsită de peptidoglican şi înconjurată de ME şi MCP
 Bacteriile care prezintă un deficit în PG sunt numite forme L (descoperite la institutul
Lister). Ele se pot forma sub influenţa antibioticelor betalactamice. Sunt instabile faţă de variaţii
osmotice şi rezistente la betalactamine. Pot fi reversibile sau ireversibile

2. Metodele de creare a condiţiilor de anaerobioză, mediile utilizate pentru cultivarea


anaerobilor.

Condiţia principală –cultivare în absenţa oxigenului


1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100ºC, 20 min, răcit, acoperit cu
vazelină; însămânţarea în geloză în coloană)
2. Crearea condiţiilor de anaerobioză
- Metoda fizică–utilizarea anaerostatului
- Metoda chimică–în exicator se întroduc substanţe ce fixează oxigenul
(pirogalol+bază);utilizarea gas-pachetelor
- Metoda biologicăFortner –cultivarea concomitentă a aerobilor şi anaerobilor

3. Metodele microbiologice de diagnostic. Esenţa lor.

METODELE MICROBIOLOGICE DE DIAGNOSTIC


 DIAGNOSTICUL DIRECT
Constă în detectarea agentului patogen, a componentelor lui sau a unui produs (ex. toxina)
în prelevate de la bolnav sau din mediul extern
1. Examenul microscopic - studierea mi/o în stare vie/nativăsau în frotiuri colorate. Este o
metodăde orientare. Informeaza despre prezenţa bacteriilor, forma lor, structura, numărul.
2. Depistarea antigenelor microbiene solubile în lichide biologice (ser sangvin, LCR,
urină…)
3. Examenul bacteriologic –izolarea pe medii nutritive a culturilor pure de bacterii, care vor
fi identificate şi testate la sensibilitate faţăde antibiotice
4. Examenul biologic (metoda experimentală) –inocularea directa a produsului patologic la
animale de laborator receptive. Mi/o se multiplicăprovocând maladia tipică. Din lichide
biologice sau ţesuturi afectate bacteria poate fi izolatăşi identificată.
5. Identificarea ADN sau ARN microbian prin tehnici de biologie moleculară

 DIAGNOSTICUL INDIRECT (imunologic)


1. Serodiagnosticul –depistarea şi titrareaanticorpilor specifici în serul bolnavului. Ei
apar peste 7-10 zile de la debutul maladiei si persistădeseori dupăvindecare
2. Intradermoreacţiile (metoda alergică) –întroducerea pe cale epidermicăsau
intradermicăa alergenului microbian şi apariţia, peste 2-4 zile, a unei reacţii celulare
locale (eritem, infiltrat). Reacţia pozitivă semnificăo stare de hipersensibilitate
specifică(întâlnire repetatăcu acest agent)

B i l e t u l nr._18____

1. Microscopia cu contrast de fază. Microscopia cu fond negru. Principiul. Aplicarea


practică.

Microscopia optică prin contrast de fază (descrisă pentru prima dată în 1934 de
fizicianul olandez Frits Zernike) este o tehnică optică de îmbunătăţire a contrastului care poate
fi utilizată pentru obţinerea de imagini cu contrast înalt ale unor probe transparente cum ar fi:
celule vii (de obicei, în culturi biologice), microorganisme, probe subţiri de ţesuturi, profile
litografice, fibre, dispersii, particule subcelulare (inclusiv nuclee şi alte organite).

În esenţă, tehnica contrastului de fază foloseşte un mecanism optic pentru a “transforma”


variaţiile de fază ale undei luminoase după ce a trecut prin probă, în variaţii ale amplitudinii
acesteia. Variaţiile de amplitudine pot fi vizualizate ca diferenţe ale contrastului imaginii.
Unul din avantajele majore ale microscopiei prin contrast de fază este acela că celulele vii pot
fi examinate în starea lor naturală, fără ca, în prealabil, să fie omorâte, marcate cu coloranţi şi
fixate în probă. Ca rezultat, dinamica proceselor biologice aflate în desfăşurare poate fi
observată şi înregistrată în condiţii foarte bune de claritate şi contrast.

2. Mediile de cultură uzuale. Clasificarea, componentele. Metodele de sterilizare.


Aplicarea practică.

După compoziţia chimică (complexitate) şi destinaţie

Medii uzuale (universale, simple)


 Apă peptonată (apă+1% peptonă+0,5% NaCl)
 Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% peptonă+0,5% NaCl)
 Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar)
 Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină)
Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120°C, 20 min
AGENTII FIZICI UTILIZATI LA STERILIZARE:
Sunt reprezentati de:
temperatura prin caldura uscata si umeda;
 filtrarea;
 radiatiile UV si gamma;
 ultrasunetele.

Utilizarea calduri ca agent de sterilizare se bazeaza pe capacitatea ei de a degrada proteinele


cu carbonizarea materialului biologic.
Cu ajutorul caldurii se sterilizeaza diverse materiale prin distrugerea microorganismelor la
temperaturi precum:
 50C - 60C 30 de minute
 75C - 90C 20 de minute
Caldura uscata este utilizata la:
 incinerare;
 incalzire la rosu;
 flambare;
 etuvare.
Caldura umeda este utilizata la:
 fierbere;
 pasteurizare;
 tindalizare;
 autoclavare.
Incinerarea presupune arderea pana la carbonizare la temperaturi de peste 400C in crematorii a
produselor ce nu mai pot fi utilizate: tampoane de vata, mase plastice utilizate, cadavre animale.
Incalzirea la rosu se realizeaza prin trecerea obiectului de sterilizat prin flacara unui bec de
gaz la temperaturi de 300C - 400C. Prin aceasta metoda se sterilizeaza ansa bacteriologica.
Flambrea consta in trecerea de cateva ori prin flacara unui bec de gaz a materialului de
sterilizat. Prin aceasta metoda se sterilizeaza: portansa, pipete gradate, pipete Pasteur, gtul
flaconelor Erlenmayer, gura tuburilor de sticla. Se sterilizeaza inainte si dupa fiecare
utilizare.Flambarea este o sterilizare incompleta.
Etuvarea (sterilizare cu ajutorul aerului cald) prin aceasta metoda se sterilizeaz obiecte de
sticla, pipete gradate la temperturi de 180C timp de 1 ora. Etuvarea este o sterilizare completa
care se realizeaza in etuva.
Fierberea nu asigura o sterlizare perfecta pentru ca sporii sau microorganismele pot ramane
viabile. Prin fierbere se sterilizeaza instrumentarul chirurgical. Sterilizarea se realizeaza la 120C
20 de minute. Pentru a evita depunerea sarurilor pe materialele supuse sterilizarii si pentru a
creste punctul de fierbere al apei, in baia de apa se adauga solutie de borax 4% - 5%. Materialele
sterilizate prin fierbere se utilizeaza imediat.
Pasteurizarea este o sterilizare ce se desfasoara la 56C - 90C timp de 5 – 30 minute.Se
utilizeza la distrugerea microorganismelor din produsele alimentare: lapte, suc de fructe, bere.
Nu este o sterilizare perfecta.
Tindalizarea este o pasteurizre repetat de trei ori la interval de 24 de ore. Prin aceasta
metoda se sterilizeaza produse sau medii cre au in compozitie substante organice de tip ser
sangvin, lapte, si care ar fi degradate la temperaturi mai mari. In intervalul de 24 de ore
produsele supuse sterilizarii sunt mentinute la temperatura camerei pentru a permite dezvoltarea
germenilor sau sporilor rezistenti termic ce vor fi distrusi la urmatoarea pasteurizare.
Tindalizarea este o sterilizare completa.
Autoclavare este cea mai eficenta si mai des folosita metoda de sterilizare care utilizeaza
vapori de apa sub presiune. Cu ajutorul vaporilor se pot obtine temperaturi de 115C(0,5
atmosfere) – 30 de minute; 121C(1 atmosfera) – 20 de minute; 134C(2 atmosfere) – 15 minute.
Filtrarea presupune trecerea lichidului de filtrat printr-o substanta poroasa si se bazeaza pe
retinerea microorganismelor in spatiile mterialului poros. Este o metoda ce se aplica mediilor ce
nu pot fi sterilizate pe cale termica de tip: ser sangvin, solutie de oligoelemente, de vitamine, de
glucide. Filtrare se realizeza prin doua tipuri de filtre:
 filtre de sticla sunt placi de sticla poroasa fixate intr-o palnie de sticla termorezistenta.
In functie de diametrul porilor, filtrele pot fi de urmatoarele tipuri: G,M,
F. Cele de tip G se noteaza de la 1 – 5 si sunt utilizate in bacteriologie
la retinerea microorganismelor precum: drojdii si bacterii.
 membranele filtrante sunt alcatuite din esteri ai celulozei sau din diverse mase
plastice. Cele utilizate in bacteriologie au diametrul de 0,45m,
iar cele utilizate in virologie 0,22m.
Ambele tipuri de filtre prezinta o serie de avantaje de utilizare care se refera la:
 pastrarea constanta a compozitiei filtratului;
 viteza si volum mare de filtrare;
 rezistenta la agenti fizici si chimici.
Diferentele intre cele doua filtre sunt:
 filtrele de sticla se pot reutiliza, caz in care sporii se
decolmateaza in acid oxalic 100%.
 membranele filtrante sunt de unica folosinta.

Filtrarea presupune existenta unei diferente de presiune intre cele doua fete ale
filtrului.
Radiatiile UV sunt radiatii neionizante ce pot determina distrugerea
microorganismelor prin reactii fotochimice primare si secundare pe care le genereaza la nivelul
substratului concomitent cu alterarea structurii acizilor nucleici – ADN si ARN.
Radiatiile UV au putere scazuta de penetrare, motiv penrtu care sunt utilizate la
sterilizare mediilor transparente (aerul din labortor, sali de operatie, suprafete plane, mese de
lucru).
Radiatiile gamma sunt unde emise cu viteza si energie foarte mare care produc
radiatii ionizante la nivelul substratului. Sursa de raditii gamma sunt izotopii de cobalt 60 si
cesiu 137.
Sterilizarea prin intermediul radiatiilor se foloseste pe scara industriala.
Ultrasunetele sunt utilizate in asa numita metoda de sonicare care asigura o
sterilizare complet. Sonicarea are la baza ruperea peretelui celular prin fenomenul de cavitatie.
Ultrasunetele sunt generate prin trecerea unui curent alternativ de frecventa inalta printr-un
cristal de cuart care va genera vibratii. Metoda se foloseste la sterilizarea sucului de fructe,
mustului, laptelui, produselor farmaceuti, si nu modifica compozitia.
AGENTII CHIMICI UTILIZATI LA STERILIZARE:
Sunt reprezentati de o serie de substante care au capacitatea de a inhiba sau distruge
microorganismele, motiv pentru care poarta denumirea de substante antimicrobiene care au
urmatoarele efecte:
 efect microbiostaic – cand este inhibata cresterea si multiplicarea
microorganismelor;
 efect microbicid – cand sunt distruse microorganismele.
Tipul de efect depinde de natura, concentratia, timpul de actiune al agentului.
1. Antisepticele sunt substante cu actiune microbiostatica precum apa oxigenata 3%,
tinctur de iod, etanolul, permanganatul de potasiu trei la mie. In concentrtii scazute si
timp scur, antisepticele pot fi aplicate pe tesuturi vii.
2. Dezinfectantele sunt substante cu actiune microbicida precum: fenol, formol,
cloramina, amestec sulfocromic. Datorita efectului nociv asupra tesuturilor vii sunt
utilizate la sterilizarea obiectelor neanimate.
3. Gazele de tip formaldehida si oxid de etilena sunt utilizate ca agenti chimici. Sunt
agenti alchilanti cu proprietatea de a induce modificari in structura tridimensionla a
acizilor nucleici si proteinelor.

3. Determinarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice prin metoda diluţiilor. Noţiuni


de CMI, CMB.

Concentraţia Minimă Bactericidă (CMB)–cantitatea minimă de AB care omoară 99,9% din inoculum
după 18h de incubare.Determinarea CMB –din ultimele tuburi fără placa cu geloză. După 24h se
compară
numărul celulelor ce au supravieţuit cu nr iniţial de bacterii (105/ml).
Concentraţia Minimă de Inhibiţie (CMI)a AB pentru tulpina testată.CMI măsoară efectul
bacteriostatic.
 Metoda diluţiilor
Într-un şir de tuburi cu 1 ml BP se efectuează diluţia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4,
2, 1, 0,5, etc). Se adaugă în fiecare tub (cu excepţia celui martor) 0,1 ml de suspensie
bacteriană 105/ml. Termostat - 24h.
Lectura –cea mai mică doză de AB care inhibă creşterea culturii după 24h de incubare
(mediu clar) constituie