C PCR y Enzimas de Restriccion

Página 1 Unidad didáctica: tecnología del DNA recombinante para la enseñanza de biología molecular
Unidad temática 2
Corte con enzima Eco321, ima- Enzimas de restricción
gen tomada de SnapGene (2013)
Contenido
Pág.
Esquema sobre enzimas de restricción 37
Introducción 38
1. Objetivo 38
2. Contenidos 38
2.1 ¿Qué son las enzimas de restricción? 38
2.2 ¿Cómo actúan las enzimas de restricción? 39
2.3 ¿Qué utilidad tienen las enzimas de restricción? 40
3. Actividades 40
3.1 Actividad de introducción 40
3.2 Actividad de estructuración 51
3.3. Actividad de aplicación 52
4. Formato de evaluación 53
Bibliografía 54
Glosario 54
E squema sobre E nzimas de restricción

Objetivos:
Introducción
Comprender En 1952 Luria y Weigle en distintos laboratorios descubren los sistemas de restric-
la función de ción utilizados por las bacterias para destruir el DNA viral capaz de penetrar a la
las enzimas célula, restringiendo su potencial de crecimiento. Las bacterias protegen su ADN de
de la acción de sus sistemas de restricción mediante la metilación en algunos de sus
nucleótidos. (Claros, 2003 y Karp, 2008)
restricción y
algunas de Posteriormente durante inicios de 1970 se observó que las bacterias contienen nu-
sus cleasas capaces de reconocer secuencias cortas de nucleótidos muy especificas en la
aplicaciones cadena doble del DNA; estas recibieron el nombre de nucleasas de restricción o en-
zimas de restricción FIGURA 12 (Claros, 2003 y Karp, 2008)
practicas.
FIGURA 12. .Enzima de restricción EcoR124I
2. C ontenidos tomado de ProteinDataBank (2013)
2.1 ¿Qué son la enzimas de restricción?

Son proteínas que tiene la capacidad de reconocer y romper
el DNA de doble cadena en sitios específicos que presentan
simetría binaria alrededor de un punto dado, llamados se-
cuencias palindromicas. (Madigan, M., Martinko, J. & Par-
cker, J. 2004).
Nomenclatura
Las tres primeras letras que se escriben en cursiva, corresponden al nombre científico del microorganis-
mo del cual fue aislado y la cuarta letra corresponde a la cepa si la hay. Posteriormente se escribe en nú-
mero romano un número para distinguir si hay más de una endonucleasas aislada de esa misma especie.
(Lodish, H., Berk, A., Matsudaira P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Matthew P., Lawrence, S., Zipursky. &
Darnell, J. 2005).
Ejemplo de la nomenclatura:
Enzima Especie Genero Cepa Orden de identificación

La primera enzima
EcoRI Escherichia coli RY13
identificada de esa cepa
2.2 ¿C ómo actúan las enzimas de

FIGURA 13. Cortes con enzima de restricción
restricción? EcoRI (Karp, 2008)
Muchas de las enzimas de restricción están conforma-

das por dos subunidades de péptidos iguales, cada
subunidad reconoce la secuencia de una de las bandas,
con alta especificidad denominado este como sitio o
diana de restricción, donde corta los enlaces fosfodies-
ter, puesto que las secuencias reconocidas por las enzi-
mas de restricción son relativamente cortas, y frecuen-
temente palindromicas, tales enzimas producen siem-
pre cortes en las dos bandas del DNA (Madigan, M.,
Martinko. et al. 2004). (FIGURA 13)
La mayor parte de las enzimas de restricción separan
las moléculas de la doble cadena de DNA por secuen-
cias generalmente de cuatro a ocho nucleótidos especí-
ficos. Cuando se ilustran las secuencias reconocidas
por varias de estas enzimas junto con el sitio sobre
cada cadena donde se efectúa el corte (se indica con
flechas). Las enzimas hacen dos tipos de cortes 1.
cuando corta el DNA en dos posiciones diferentes es-
calonadas, quedan extremos libres denominadas, pega-
josos o cohesivos (Sticky) y 2. cuando las enzimas
rompen en un mismo punto son denominados romos
(Blunt). (Madigan, M., Martinko. et al. 2004).
FIGURA 14
FIGURA 14 enzimas de restricción y respectivos cortes sobre las secuencias de cadena doble del DNA
(Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R. & Gelbart, W. 1998).
Ingrese a la siguiente URL: http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es/ para ver un ejemplo grafico de cómo

funcionan las enzimas de restricción. La presentación se encuentra titulada Computer exercise: De-
sign of PCR and PCR-RFLP experiments; diseñado por la Universidad del País Vasco/Euskal Herriko
Unibertsitatea. (EUV/EHU 2013)
2.3 ¿Qué utilidad tienen las enzimas de restricción?

Son varios los usos de las enzimas de restricción entre los cuales tenemos: comparaciones entre geno-
mas, mapas genéticos, cortar o digerir el ADN para clonación, hacer biblioteca genómica (colección de
clones de ADN recombinante que en forma colectiva, contiene el genoma de un organismo), huella ge-
nómica, confirmar clones recombinantes, en el proceso de la realización de algunas técnicas de hibrida-
ción (southern blot y northern blot) y de algunos marcadores moleculares como AFLP y RFLP.
(Madigan, M., Martinko. et al. 2004 y Lodish, H., Berk, A. et al. 2005).
3. Actividades
3.1 Actividad de introducción mapas de restricción.
Los mapas de restricción son secuencias de DNA obtenidas a partir de un fragmento, un gen, incluso
genomas, que se corta con varias enzimas de restricción, para determinar el número de sitios de corte y
sus posiciones relativas sobre un DNA. A partir de los mapas de restricción se pueden realizan estudios
comparativos entre genomas, huella genómica entre otros. (Griffiths, A., Miller, J. et al. 2005).
Para realizar la actividad revise el Anexo 1. Guía para realizar mapas de restricción a través de bioinfor-
mática (base de datos GenBank del NCBI y el Software SnapGene) y diseño manual.
1. Objetivo:
Realizar mapas de restricción utilizando bioinformática (bases de datos GenBank del NCBI y
programa de bioinformática SnapGene)
A. Actividad de bioinformática
1. Identificación de secuencia:
1.1 Seleccione una secuencia de interés de la tabla 2 y búsquela en las bases de datos GenBank del NCBI
2. Importar datos en el programa SnapGene:
2.1 Instale el programa SnapGene y ejecútelo.
2.2 Introduzca el código del LOCUS de la secuencia de interés que quiere trabajar en la sección, import from GenBank
3. Identificación de enzimas de restricción:
3.1 Seleccione una enzima de restricción con corte único.
3.2 Identifique la posición de corte y la zona de reconocimiento de la enzima seleccionada,
3.3 Seleccione dos enzimas con Ctrl sostenido para obtener la longitud de los fragmentos.
3.4 Complete la información de las tablas 6, 7 y 8.
B. Actividad de diseño manual de mapas de restricción.
3.5 Realice el calculo de las diferencias para las tablas 7.1 y 8.1 para determinar la longitud de los fragmentos obtenidos
3.6 Complete los gráficos de diseño manual de mapas de restricción 6, 6,1, 7, 7,1, 8 y 8,1.
*Recuerde revisar el anexo que contiene la guía para trabajar mapas de restricción.
Tabla 2: Listado de plásmidos, y genomas eucariotas con accesos para trabajar en bases de datos GenBank
y programa de bioinformática SnapGene.
Locus: Titulo de referencia en GenBank
Secuencia Organismo:
SnapGene Nucleotide
Agrobacterium tumefa- Agrobacterium tumefaciens plasmid Ti,
Plasmid Ti NC_002377
ciens complete sequence
Escherichia coli Escherichia coli K-12 plasmid F DNA,
Plasmid F NC_002483
K-12 complete sequence
Citrobacter freundii plasmid pCTX-M3,
Plasmid pCTX-M3 NC_004464 Citrobacter freundii
complete sequence
Arthrobacter Arthrobacter arilaitensis Re117 plasmid
Plasmid pRE117-1 NC_014549
arilaitensis Re117 pRE117-1, complete sequence
Salmonella enterica subsp. enterica se-

Salmonella typhi
Plasmid pHCM2 NC_003385 rovar Typhi str. CT18 plasmid pHCM2,
CT18
complete sequence
Shigella sonnei plasmid P9 DNA, com-
Plasmid P9 NC_002122 Shigella sonnei
plete sequence
Streptomyces sp. F11 plasmid pFP11, com-
Plasmid pFP11 NC_006911 Streptomyces sp. F11
plete sequence
Sulfolobus Sulfolobus tengchongensis plasmid pTC,
Plasmid pTC NC_005969
tengchongensis complete sequence
Escherichia coli plasmid pO86A1, com-
Plasmid pO86A1 NC_008460 Escherichia coli
plete sequence
Drosophila Drosophila melanogaster chromosome 4
Chromosome 4 AE014135
melanogaster complete sequence
Homo sapiens genomic DNA, chromo-
Chromosome 21q BA000005 Homo sapiens (Human)
some 21q
Genome AM270983 Aspergillus niger Aspergillus niger supercontig An04
Penicillium digitatum PHI26 unplaced

Genome JH993736 Penicillium digitatum genomic scaffold Scaffold_50, whole ge-
nome shotgun sequence
Tabla 6. Resultados de fragmentos de la secuencia ___________ obtenidos tras el tratamiento con

1 enzima de restricción que realiza un corte en esta secuencia circular.
Locus: Longitud: Secuencia: Organismo:
Fragmento longitud pb Enzima de restricción
Nombre de la enzima, posición de corte y

zona de reconocimiento
UNICO
NOTA 1. Cuando se trabaja con secuencias de DNA circular como los plásmidos al realizar solo un corte con
una enzima de restricción se obtiene un fragmento con igual longitud que la inicial de la secuencia, pasando
de DNA circular a DNA linear.
NOTA 2. Para trabajar con secuencias de DNA linear, hay que tener en cuenta que si la enzima de restric-
ción reconoce una posición de corte en la secuencia se obtienen dos fragmentos; sin embargo cuando se re-
conocen dos posiciones de corte se obtienen tres fragmentos, cuando se reconocen tres posiciones de corte
se obtienen cuatro fragmentos y así sucesivamente. El programa SnapGene trabaja secuencias lineares y
circulares de la misma manera permitiendo efectuar todos los ejercicios con diferentes tipos de secuencias.
NOTA 3. Al trabajar las graficas con secuencias de DNA linear se tiene en cuenta que el inicio y el final de la
secuencia no están unidos por lo que se recomienda trabajar una grafica lineal, en este caso se trabaja la
grafica 9. para realizar los mapas de restricción.
Grafica 6. Realice el diseño manual del mapa de restricción utiliza un circulo que representa la secuencia
____________ y a partir del peso total se presenta una escala aproximada. Ubicando la posición de corte de 1 enzima
de restricción que realiza un corte en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por bioinformática de la tabla 6.
Plásmido _____
_________ pb
Grafica 6.1 Realice el diseño manual del mapa de restricción posterior al corte representa la secuencia
____________ tras el corte con 1 enzima de restricción que realiza un corte en esta secuencia; Utilizando los da-
tos obtenidos por bioinformática de la tabla 6. La grafica es una línea que representa el fragmento obtenido a par-
tir del corte y su escala aproximada partiendo de la longitud del plásmido.
Tabla 7. Resultados de fragmentos de la Secuencia__________ obtenidos tras el tratamiento

con 2 enzimas de restricción que realizan cada una un corte en esta secuencia circular.
Enzimas de restricción
Fragmento longitud pb Nombre de la enzima, Nombre de la enzima,
posición de corte y zona posición de corte y zona
de reconocimiento de reconocimiento
*final de secuencia
*El DNA plásmido es circular y no tiene extremos, por lo que al extremo

∑= (1+2) ∑= final se le suman las pb desde el punto cero hasta dónde llega el primer
corte.
Tabla 7.1 Resultados de fragmentos de la secuencia __________ obtenidos tras el calculo manual utilizando
las 2 enzimas de restricción trabajadas en la tabla 7. que realizan cada una un corte en esta secuencia circular.
Locus Longitud: Organismo:
A. Nombre de la enzima y B. Nombre de la enzima * Nº y longitud del

C. Diferencia (A-B)
Posición de corte y Posición de corte Fragmento
1.
D. Diferencia (Tamaño de la * Nº y longitud del

Tamaño del plásmido ∑(Diferencia C) secuencia - ∑(Diferencias C)) Fragmento
2.
∑ (fragmentos 1+2) = (Tamaño de la secuencia) =
*para establecer la longitud de los fragmentos: se toma el valor de las diferencias obtenidas sin tener en cuenta
los signos.
____________ y a partir del peso total se presenta una escala aproximada. Ubicando la posición de corte de 2
enzimas de restricción que realizan cada una un corte en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por bioin-
formática de la tabla 7.1
Plásmido _____
_________ pb
____________ tras el corte con 2 enzimas de restricción que realizan cada una un corte en esta secuencia; Utili-
zando los datos obtenidos por bioinformática de la tabla 7.1. La grafica es una línea que representa los fragmentos
obtenidos a partir de los cortes y su escala aproximada partiendo de la longitud del plásmido.
Tabla 8. Resultados de Fragmentos de la secuencia_____________ obtenidos tras el tratamiento con

4 enzimas de restricción que realizan uno y dos cortes en esta secuencia circular.
Nombre de la enzima, Nombre de la enzima,
Fragmento longitud pb

∑= (1+2+3+4+5+6) ∑= final se le suman las pb desde el punto cero hasta dónde llega el primer
corte.
Tabla 8.1 Resultados de fragmentos de la secuencia __________ obtenidos tras el calculo manual utilizando las
4 enzimas de restricción que realizan uno y dos cortes en esta secuencia circular trabajadas en la tabla 8.
Locus Longitud: Organismo:

C. Diferencia (A-B)
1.
2.
3.
4.
5.

6.
∑ (fragmentos 1+2+3+4+5+6) = (Tamaño de la secuencia) =
los signos.
____________ y a partir del peso total se presenta una escala aproximada. Ubicando la posición de corte de 4
enzimas de restricción que realizan uno y dos cortes en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por bioin-
formática de la tabla 8.1
Plásmido _____
_________ pb
____________ tras el corte con 4 enzimas de restricción que realizan uno y dos cortes en esta secuencia; Utili-
zando los datos obtenidos por bioinformática de la tabla 8.1. La grafica es una línea que representa los fragmentos
obtenidos a partir de los cortes y su escala aproximada partiendo de la longitud del plásmido.
Grafica 9. Diseño manual de mapa de restricción de la secuencia____________ de DNA linear tras el

corte con Nº______ enzimas de restricción que realizan __________cortes en esta secuencia linear.
Grafica 9.1 Diseño manual de mapa de restricción con longitud de fragmentos obtenidos, de la secuen-
cia____________ de DNA linear tras el corte con ______________enzimas de restricción que realizan
___________cortes en esta secuencia linear.
3.2 Ac ti vida d de Es tructuración: cor te del plásmido pUB -GFP con en zimas de r es tr icc ión
Las enzimas de restricción de utilizan frecuentemente para realizar cortes en moléculas de DNA circular
como los plásmidos que son secuencias conocidas muy útiles para formar DNA recombinante, puede esta-
blecer específicamente la posición de corte de las enzimas dada por la zona de reconocimiento, por lo que
se puede establecer la posición y la enzima que corta específicamente en un determinado plásmido como se
muestra a continuación.
Plásmido pUB-GFP tomado de addgene.org (2013)
En base a lo anterior responda:

1. ¿Cuáles son las longitudes obtenidas si se corta el plásmido pUB-GFP con las enzimas Sacl
y NotI ?
2. ¿Cuáles son las longitudes obtenidas si se corta el plásmido pUB-GFP con las enzimas Fspl,
NotI y AfIII?
3. ¿Cuáles son las longitudes obtenidas si se corta el plásmido pUB-GFP con las enzimas Aatll,
EcoRI y AfIII?
Nota: El peso del plásmido es de 5122pb

3.3. Ac ti vida d de a plicación: los polimor fismos de la longitud de fra gmentos de res tr icción (RFLP )
c on aplicac ión en pruebas de pa ter nida d utili za ndo RFLP
En Colombia a través del Instituto Colombiano de Bienestar Familiar ICBF en el 2013 se realizaron 620
pruebas de parentesco al mes haciendo esfuerzos en pro de la protección de la familia Colombiana. usted
se encuentra resolviendo los casos de parentesco en esta institución y le piden realizar un a prueba utilizan-
do RFLP. Usted cuenta con la muestra de la madre biológica, la muestra del niño, y la muestra de 3 pre-
suntos padres. Esta en su obligación determinar quien es el padre del niño.
Una vez obtenido el DNA usted lo sometió a digestión con enzimas de restricción y posteriormente lo puso
a correr en una electroforesis obteniendo los siguientes resultados:
Electroforesis en agarosa 1,5% TE

Po zo 1 Marcador de peso molecular 1Kb plus Po zo 5 VACIO
Po zo 2 DNA de la madre Po zo 6 Corte C. Presunto padre 1
Po zo 3 VACIO Po zo 7 Corte D. Presunto padre 2
Po zo 4 DNA hijo Po zo 8 Corte E. Presunto padre 3
RFLP. Es una técnica que se

20kb basa en las enzimas de res-
10kb tricción que reconoce posi-
7kb ciones de corte especificas
5kb dentro de una secuencia y
4kb debido a que hay variación
3kb por efecto de la mutación
entre individuos se presen-
2kb tan diferencias. Por lo que
usualmente genera patrones
1.5kb de distancia, longitud y dis-
posición diferentes en el
1kb ADN de diferentes indivi-
duos de una población.
0.7kb (Lodish, H., Berk, A., Mat-
sudaira P. et al. 2005).
0.5kb
0.4kb
0.3kb Nota: Las unidades del marcador
de peso molecular (MPM) esta
0.2kb dado en kilo bases (Kpb), recuer-
0.075kb de que 1 Kpb es igual a 1000pb.
En base a lo anterior argumente sus respuestas:

1. ¿Quien tiene mayor probabilidad de ser el papa del Niño?
2. ¿Cómo se puede obtener una mayor fidelidad de los resultados para establecer quien es el verdade-
ro padre el niño?
3. ¿Qué otra información puedo obtener a partir de los resultados?
3.3.2 Socialización: socialice con los compañeros del curso
1. ¿Usted como docente como abordaría la temática enzimas de restricción ?

2. ¿Qué habilidades usted desarrollaría en sus estudiantes con este tema y qué habilidades le aporta
esta unidad a usted como docente en formación?
Bibliografía:
Claros, Gonzalo. (2003). Aproximación histórica a la biología molecular a través de sus protagonistas, los
conceptos y la terminología fundamental. Panace@, 4(12), 168-179. Recuperado de http://
www.medtrad.org/pana.htm.
Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. (1998). Genética. Madrid: McGraw Hill in-
teramericana.
Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. (2005). Genética. Sexta edición en español.
Madrid: McGraw Hill interamericana.
Karp, Gerald. (2006). Biología celular y molecular, conceptos y experimentos. Cuarta edición. McGraw
Hill interamericana.
Lodish, H., Berk, A., Matsudaira P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Matthew P., Lawrence, S., Zipursky., Dar-
nell, J. (2005). Molecular Cell Biology. Quinta edición. New York: Médica Panamericana. Recuperado de
http://bcs.whfreeman.com/lodish5e.
Madigan, M., Martinko, J., Parcker, J. (2004). Brock Biología de los Microorganismos. Décima Edición.
Madrid: Pearson Prntice Hall.
NCBI. (2013). National Center for Biotechnology Information. Recuperado de http://

www.ncbi.nlm.nih.gov/
Protein Data Bank. (2013). © RCSB Protein Data. Recuperado de http://www.rcsb.org/pdb /home/
home.do
SnapGene. (2013). Software for everyday molecular biology. Copyright © 2013 GSL Biotech LLC. Recu-
perado de http://www.snapgene.com/
Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (2013). Computer exercise: Design of PCR and
PCR-RFLP experiments. Recuperado de http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es
Glosario
Uso de computadoras para analizar, guardar y acceder a secuen-
Es una secuencia de caracteres que dice lo mismo cuando se lee
Bioinformática cias de DNA, proteínas t demás datos de información, y programas Palíndromo
en ambas direcciones
que se basan en construcciones algorítmicas
Cód ig o de Código estándar de letras que se utilizan para identificar secuencias
Plásmido Elemento genético extracromosomal formado por DNA circular
let ra s de DNA y aminoácidos
Plásmido conjugativo presente en la bacteria Agrobacterium
CD S CDS anotación en secuencia de longitud completa de cDNA Plásmido Ti
tumefaciens que puede transferir genes a las plantas
Enzima de Enzima que reconoce y rompe DNA de doble cadena en sitios especí- Un polipéptido o grupo de polipéptidos que forman una molécula
Proteína
restricción ficos de la secuencia de DNA. con una función biológica especifica
Una proteína que tiene la capacidad de acelerar (catalizar) una polimorfismo por restricción de la longitud de fragmentos, obteni-
Enzima RFLP
reacción química especifica dos tras el tratamiento con enzimas de restricción
es la base de datos de secuencias, una colección comentada de Es un software que permite a los biólogos moleculares crear,
NCBI SnapGene
todas las secuencias de ADN disponibles al público. explorar y compartir archivos de ADN
Unidad temática 3
PCR
To ma d o de NC IB (2 01 3)
Contenido
Pág.
Esquema sobre PCR 56
Introducción 57
1. Objetivos 57
2. Contenidos 57
2.1 ¿Qué es la PCR? 57
2.2 ¿Cuáles son las etapas de una PCR? 60
2.3 ¿Qué utilidad tiene la PCR? 63
3. Actividades 64
3.1 Actividad de introducción 64
3.2 Actividad de estructuración 67
3.3 Actividad de aplicación 68
4 Formato de evaluación 69
Bibliografía 70
Glosario 70
E squema sobre P CR
Introducción
Kary Mullis
En 1983, Kary Mullis, desarrolló la técnica que hizo Imagen tomada de Sánchez P. &
posible la síntesis de grandes cantidades de un frag- Saldaña, H. (2004).
Objetivos:
mento de ADN sin tener que clonarlo: la reacción en
Reconocer los cadena de la polimerasa conocida como PCR por sus
siglas en inglés (polymerase chain reaction) y a partir
fundamentos
de esta se consigue copiar millones de veces, en un
teóricos y la par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de
importancia una mezcla de ADN tan compleja como el propio ge-
de la PCR. noma humano, donde la secuencia de interés repre-
senta tan sólo una diezmillonésima parte. Este descu-
brimiento lo hizo acreedor del Premio Nobel en 1993.
(Sánchez P. & Saldaña, H. 2004).
2. C ontenidos FIGURA 15.

DNA polimerasa termoestable
(ProteinDataBank 2013)
2.1 ¿Qué es la P CR?
La PCR es un método de síntesis de ADN in vitro en donde
un segmento particular de éste es específicamente amplificado
al ser delimitado por un par de cebadores (primers, oligonu-
cleótidos o iniciadores) que lo flanquean. Su copiado se logra
en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes
periodos y temperaturas de incubación en presencia de una
enzima ADN polimerasa termoestable (Sánchez P. & Saldaña,
H. 2004).
FIGURA 16. Termociclador

La automatización total del proceso se dio gracias al descubri-
miento de una ADN polimerasa FIGURA 15 que funcionaba
bien a altas temperaturas encontrada en una bacteria Thermus
aquaticus que vive en aguas termales a 75°C, e incluso es esta-
ble a 94°C, supuso un gran avance ya que sólo tenía que ser
añadida al principio y se mantenía activa durante todo el pro-
ceso. Posteriormente se diseño los termocicladores o aparatos
que consisten en un bloque que puede ser programado para
calentarse y enfriarse rápidamente en determinados tiempos
FIGURA 16. (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004).
La PCR requiere una mezcla de componentes para la reacción:

1. Cebadores: 0,4µM ± 0,1µM de cada uno.
2. Buffer PCR 1X: 50mM de KCl, 10mM de Tris-HCl, 3,0mM de MgCl2
3. ddH2O: completa el volumen final.
4. DNA molde: entre 10-500ng
5. dNTPs: 200µM de cada uno de los cuatro dNTPs
6. Taq Polimerasa: 1U. (Hernández, J., Mariño, L., Orozco, C. & Naváez, J. 1997).
1. Cebadores: son los componentes más sensibles que determinan el éxito de un ensayo de PCR, su longi-
tud suele estar entre 18 y 24 nucleótidos, y su contenido en G+C entre 40-75%. (Sánchez P. & Saldaña, H.
2004).
Se diseñan para ser exactamente complementarios a un fragmento del DNA molde. Ellos deben tener una
temperatura de fusión (Tm) similar por ende, un contenido semejante en G+C. Una de las formas para cal-
cular la Tm es la fórmula simplificada de Wallace que dice: Tm = 2(A+T) + 4(G+C); usualmente se utiliza
la Tm –5ºC (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004).
La distancia que separa los sitios donde se aparean los 2 cebadores dentro del ADN molde determina el
tamaño del producto de amplificación. El tamaño ideal depende de la aplicación: los productos largos se
amplifican con menor eficiencia, mientras que los productos muy cortos pueden confundirse con dímeros
de los cebadores que limitan mucho la posibilidad de caracterizarlos posteriormente.
Algunos programas computacionales disponibles en la red ayudan en el diseño de cebadores, y cálculo de

sus respectivas Tm, ya que si la temperatura de fusión de ambos no es parecida, la amplificación será nula,
cuando se utilizan Tm muy por debajo de la de los cebadores aparecen bandas inespecíficas, por lo cual
para tener mayor especificidad se recomienda trabajar Tm iguales a las del cebador (Sánchez P. & Salda-
ña, H. 2004 y Hernández, J., Mariño, L. et al. 1997).
Se debe procurar en lo posible que las últimas bases del extremo sean G o C, para que le brinden mayor
estabilidad al punto de inicio de la etapa de extensión. Así como evitar la complementariedad entre la pa-
reja de cebadores para minimizar la posibilidad de que se creen dímeros. El tamaño que se recomienda
trabajar es entre 18-30 nucleótidos siendo similar para ambos cebadores (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004).
Una vez diseñados se sintetizan en el laboratorio mediante un proceso escalonado en el que se van aña-
diendo nucleótidos libres al extremo de la cadena en crecimiento. El extremo 3´ del nucleótido iniciador
de la futura cadena se fija a un soporte sólido como una partícula de gel de sílice. Un sintetizador de ADN
o «máquina de genes» realiza la síntesis en fase sólida, añadiendo paso a paso cada nucleótido en una serie
de etapas (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004).
2. Solución amortiguadora: la solución amortiguadora que se utiliza en PCR es el buffer

PCR 1X (50mM KCl, 10mM Tris-HCl, pH 8,3 y 3,0 mM MgCl2). Existen otros componenetes adi-
cionales que pueden ser utilizados como el dimetilsulfóxido (DMSO), añadido para disminuir la es-
tructura secundaria del ADN, detergentes como el tween 20 o el Tritón X-100, que ayudan a estabi-
lizar la enzima, o glicerol cuando los termocicladores antiguos para evitar que se evapore la reacción
(Sánchez, 2004). Tanto el ión magnesio como el manganeso tienen una función crítica en la reac-
ción, requiriéndose a una concentración que oscila regularmente entre 2,5 y 3,0mM. En general,
concentraciones insuficientes de Mg+2 dan lugar a bajo rendimiento, mientras que en exceso se ob-
tienen amplificaciones inespecíficas. (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004 y Hernández, J., Mariño, L. et
al. 1997).
3. Agua: el agua se usa como solvente del resto de los ingredientes y se requiere al menos
destilada, pero lo ideal es utilizar agua destilada-desionizada. ddH2O. (Sánchez P. & Saldaña, H.
2004).
4. DNA molde: la cantidad puede ser de tan sólo 1ng en el caso de material genético clonado
(en virus o plásmidos), cuando se utiliza DNA genómico se pueden trabajar valores entre 10-500ng,
se recomienda utilizar un buen protocolo de extracción ya que la presencia de proteínas o carbohi-
dratos, puede generar bandas inespecíficas. (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004 y Hernández, J., Mari-
ño, L. et al. 1997).
5. Desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs): se requiere 200µM de cada uno de los

cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y dGTP; distinguibles por sus bases nitrogenadas) son los ladri-
llos con los que se construyen las nuevas cadenas de ADN. (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004).
6. Enzima: sólo pueden utilizarse polimerasas que sean capaces de actuar a las altas tempe-
raturas actualmente las mas utilizada son la ADN polimerasa Taq, proveniente de la bacteria termo-
fílica Thermus aquaticus y la Vent de la bacteria Thermococcus litoralis. Sus temperaturas óptimas
de catálisis oscilan alrededor de los 72ºC, temperatura a la cual incorporan aproximadamente 100
nucleótidos por segundo, siendo estables a altas temperaturas, incluso por encima de 92ºC. Esta en-
zima es una proteína que consta de una sola cadena polipeptídica con un peso molecular de aproxi-
madamente 95 kDa, cuenta con actividad de exonucleasa 5´→3´. Y su fidelidad de replicación de-
pende de la concentración del ión Mg+2 y de los dNTPs, así como del que exista o no balance en la
concentración de estos últimos. (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se debe estandarizar para evitar la aparición de ban-
das inespecíficas.
2.2 ¿C uáles son las etapas de la P CR?
Las etapas de un ciclo de reacción
Son tres los pasos a seguir y repetir por cada ciclo de la PCR y son: desnaturalización, anillamiento y
elongación; donde sus tiempos y temperatura son específicos del producto a amplificar.(Sánchez P. &
Saldaña, H. 2004).
1. Desnaturalización
Mediante un calentamiento a 94°C, el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se separen o des-
naturalicen ya que se rompen los puentes de hidrogeno dejando al ADN en forma de cadena sencilla,
permitiendo así exponer las diferentes bases nitrogenadas para la hibridación con los cebadores. FIGU-
RA 17. (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004 y Cooper, G. M. & Housman. R. E. 2002).
2. Anillamiento
Los cebadores complementarios que flanquean el sitio a amplificar se enlazan formando puentes de
hidrógeno.FIGURA 17. La temperatura del anillamiento oscila entre 40 y 72°C y se establece dependien-
do de la temperatura de fusión (Tm) menos 4ºC (Sánchez P. & Saldaña, H. 2004, Cooper, G. M. &
Housman. R. E. 2002 y Hernández, J., Mariño, L. et al. 1997).
3. Elongación
Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en los sitios donde los iniciadores se aparean, la poli-
merasa empieza a copiar la hebra, incorporando desoxirribonucleósidos monofosfatos en dirección
5´→3´, Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que es la que coincide con la máxima activi-
dad de la polimerasa (72°C) para evitar alineamientos inespecíficos de los iniciadores. (Sánchez P. &
Saldaña, H. 2004 y Cooper, G. M. & Housman. R. E. 2002)
Al final del primer ciclo, encontramos dos moléculas de DNA bicatenario que nuevamente son copia-
das para generar cuatro nuevas cadenas de DNA bicatenario cuando se repite por tercera ocasión el ci-
clo, las cuatro moléculas del segundo ciclo se copian para producir ahora ocho moléculas. FIGURA 17.
En teoría, 20 ciclos producirán aproximadamente un millón de copias de la molécula molde de ADN, y
30 ciclos generarán alrededor de mil millones de copias de ésta.(Sánchez P. & Saldaña, H. 2004 y
Cooper, G. M. & Housman. R. E. 2002)
FIGURA 17. Etapas de la Reacción en cadena de la polimerasa, (PCR). (Cooper, G. M. & Housman. R. E. 2002)
Ingrese a la siguiente URL: http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es/ para ver un ejemplo grafico de

cómo funciona la PCR. La presentación se encuentra titulada Computer exercise: Design of PCR
and PCR-RFLP experiments; diseñado por la Universidad del País Vasco/Euskal Herriko
Unibertsitatea. (EUV/EHU 2013)
Las variantes de un gen.
Los intrones están presentes en la mayoría de los genes de los eucariotas complejos, como plantas y
animales donde representan una cantidad sustancial del DNA genómico total. en su mayoría no espe-
cifican la síntesis de un producto celular, algunos si codifican RNAs, sin embargo los intrones juegan
papeles importantes en el control de la expresión génica. (Cooper, G. M. & Housman. R. E. 2002).
El procesamiento alternativo o splicing es el proceso en el cual los intrones son removidos, permitien-
do que los exones se unan en diferentes combinaciones, dando como resultado diferentes formaciones
de mRNA maduros y proteínas a partir de un solo transcripto. FIGURA 18. (Cooper, G. M. & Housman.
R. E. 2002).
FIGURA 18. Diferentes formaciones de mRNA y proteínas a partir de un solo transcripto.

(Cooper, G. M. & Housman. R. E. 2002)
2.3 ¿Qué utilidad tiene la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tiene gran variedad de aplicaciones, es una técnica rela-
tivamente simple y de bajo costo, que se utiliza para amplificar un segmento de ADN y copiarlo miles
de millones de veces, permitiendo que sea de interés en diversos campos como:
 En medicina para el diagnóstico de enfermedades, seguimiento de tratamiento de enfermedades e

investigación.
 En paleontología y antropología para realizar estudios filogenéticos.
 En ingeniería genética para la producción y detección de organismos genéticamente modificados
(OMG) como: microorganismos, animales y plantas.
 En medicina legal y forense para realizar pruebas de parentesco y relación individuo-crimen.
 En campo agrícola y pecuario para realizar estudios de huella genómica, filogenia, diagnóstico
de enfermedades, seguimiento de genes, investigación (aislamiento de genes, modificación etc.)
(Sánchez P. & Saldaña, H. 2004).
3. Actividades
3.1 Actividad de introducción: diseño de cebadores
Para realizar la actividad revise el Anexo 2. Guía para diseño de cebadores utilizando bioinformática (base
de datos GENE del NCBI y el programa Primer-BLAST)
1. Objetivo:
Diseñar cebadores utilizando bases de datos y software de bioinformática Primer-BLAST
1 Identificación del gen a amplificar:
1.1 Seleccione un gen de la tabla 9 y busque la secuencia en las bases de datos de GENE del NCBI.
1.2 Confirme la información, y verifique que es la secuencia de interés (los genes pueden tener muchas varian-
tes entre organismos y entre especies) llene el encabezado de la tabla 11.
2. BLAST
2.1 Realice la búsqueda en BLAST
2.2 Consigne la información requerida de BLAST en la tabla 11.
3. Primer-BLAST, diseñar cebadores (primers, oligonucleótidos o iniciadores)
3.1 Seleccione la secuencia a amplificar rango visible.
3.2 Complete la información de la tabla 11.

Tabla 9: Listado de genes, con accesos para trabajar en bases de datos y programa de
bioinformática Primer-BLAST.
Código de Locus Titulo de referencia en

Gen Organismo: función
ID en Gene Longitud: GENE del NCBI
NC_000011
Homo sapiens HBB hemoglobin, beta [ Homo Transporte de
HBB 3043 1606 bp
(Human) sapiens (human) ] oxigeno
DNA linear
NC_000001 F3 coagulation factor III
Homo sapiens Coagulación de
F3 2152 12682 bp (thromboplastin, tissue factor)
(Human) la sangre
DNA linear [ Homo sapiens (human) ]
NC_000003
Homo sapiens OXTR oxytocin receptor [ Homo Contracciones
OXTR 5021 19207 bp
(Human) sapiens (human) ] uterinas
DNA linear
NC_000019 CGB chorionic gonadotropin,
Homo sapiens Hormona de
CGB 1082 1507 bp beta polypeptide [ Homo sapiens
(Human) crecimiento
DNA linear (human) ]
Control, dife-
NC_000017 CSF3 colony stimulating factor 3
Homo sapiens renciación y
CSF3 1440 2453 bp (granulocyte) [ Homo sapiens
(Human) función de los
DNA linear (human) ]
granulocitos
Componente de
NC_000022 NCF4 neutrophil cytosolic factor multiples enzi-
Homo sapiens
NCF4 4689 17030 bp 4, 40kDa [ Homo sapiens mas involucra-
(Human)
DNA linear (human) ] das en la defen-
sa
NC_000002
Homo sapiens IGKC immunoglobulin kappa con- Formación de
IGKC 3514 323 bp
(Human) stant [ Homo sapiens (human) ] anticuerpos
DNA linear
LOCUS
FCGR3A Fc fragment of IgG, low
FCGR3A NC_000001 Homo sapiens Formación de
2214 affinity IIIa, receptor (CD16a)
Fc 8865 bp (Human) anticuerpos
[ Homo sapiens (human) ]
DNA linear
ATF4 activating transcription
NC_000022 Activa el factor
Homo sapiens factor 4 (tax-responsive en-
ATF4 468 2123 bp de
(Human) hancer element B67) [ Homo
DNA linear transcripción
sapiens (human) ]
Tabla 11. Resultados de diseño de cebadores del gen ___________,utilizando el software Primer-BLAST.
Gen Código ID : Organismo: Acceso GENE del NCBI
Función e
importancia
BLAST From To
Enter accession : Rango
Primer-BLAST Rango Enter accession :

Cebador From To Primer melting temperatures (Tm)
Forward Min opt Max Max Tm difference
Reverse
Resultados Par:1 Longitud del producto:
Cebador Sequence (5'->3') Longitud Star Stop Tm GC%
Forward
Reverse
Resultados Par:2 Longitud del producto:
Forward
Reverse
3.2 Ac ti vida d de Es tr ucturación: resuelva un caso de cr imen utili za ndo microsa télites.
Usted se encuentra trabajando para el CTI y tiene que encontrar un asesino; para lo cual usted cuenta con
una muestra de cabello que se obtuvo en las uñas de la victima y un sospechosos que al parecer es la pareja
de la victima.
Por orden del juez se realiza una prueba de DNA para establecer si la pareja de la victima fue quien causo el
crimen. Los resultados del perfilado se muestran a continuación:
La columna 1 corresponde al marcador de peso molecular 1Kb plus.

Las columnas 2 y 6 corresponden al perfil de la victima
Las columnas 3 y 5 corresponden al perfil del sospechoso
La columna 4 corresponde a la muestra encontrada en la victima
Las columnas 7 y 8 están vacías.
20kb
10kb Con base a la información
7kb anterior responda:
5kb
4kb ¿La persona que cometió el
3kb crimen es la pareja de la
victima? Justifique su res-
2kb puesta.
1.5kb
1kb
0.7kb
0.5kb
0.4kb
0.3kb
0.2kb
0.075kb
Nota: Las unidades del marcador de peso molecular (MPM) esta dado en kilo bases (Kpb), recuerde que 1 Kpb es igual a 1000pb.
3.3. Ac ti vida d de a plicación: Pr oblemas basados en s ituaciones hipotéticas

3.3.1 Amplific ación de genes cry de Bacillus thuringiens is
Usted trabaja en un laboratorio de control biológico y esta encargado de un proyecto encaminado a la ca-
racterización molecular de cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) para posteriores trabajos de toxicidad con-
tra plagas de importancia en la agricultura.
Teniendo encuentra la literatura usted encontró que unos cebadores amplificaban el gen cry 3A de Bacillus
thuringiensis var. San Diego el cual utilizara como control positivo (+) obteniendo un producto de 1900pb,
usted decidió diseñar 3 pares de cebadores los cuales utilizo de manera independiente con el DNA plásmi-
do de esta cepa bacteriana. Los productos de las PCR los evidencia en una electroforesis de agarosa obte-
niendo los resultados que se muestran a continuación
Control negativo con el segundo par de cebadores
Po zo 1 Marcador de peso molecular. 1Kb plus Po zo 5
diseñados
Po zo 2 Control positivo Po zo 6 Amplificación con segundo par de cebadores
Control negativo con el primer par de cebadores Control negativo con el tercer par de cebadores
Po zo 3 Po zo 7
diseñados diseñados
Po zo 4 Amplificación con primer par de cebadores Po zo 8 Amplificación con tercer par de cebadores
CONTROLES
Un control negativo (-) tie-

20kb ne todos los reactivos que
componen la PCR a excep-
10kb ción del DNA molde, sien-
7kb do remplazado por H2O
5kb destilada desionizada, sir-
4kb viendo para verificar la pu-
3kb reza de los reactivos.
2kb Un control positivo (+) co-

rresponde a una muestra de
1.5kb una secuencia de DNA con
peso conocido, para este
1kb caso es la cepa de referen-
cia Bacillus thuringiensis
0.7kb var. San Diego
0.5kb Nota: Las unidades del marca-

0.4kb dor de peso molecular (MPM)
esta dado en kilo bases (Kpb),
0.3kb recuerde que 1 Kpb es igual a
0.2kb 1000pb.
0.075kb
Con base a lo anterior argumente sus respuestas:
1. ¿Explique que ocurrió en cada uno de los carriles?

2. ¿Qué par de cebadores es el adecuado para realizar la amplificación?
3.3.2 Socialización: discuta con los compañeros del curso
1. ¿Para usted qué implicaciones socioculturales tiene el uso de la PCR a nivel mundial?
2. ¿Qué operaciones mentales usted desarrollo al realizar esta unidad ?
Bibliografía:
Cooper, G. M., Housman. R. E. (2002). Cooper,s la célula. Segunda edición. Madrid: Marbán.
Hernández, J., Mariño, L., Orozco, C., Naváez, J. (1997). Uso de la reacción en cadena de la polimerasa
para caracterizar aislamientos nativos de Bacillus thuringiensis. REVISTA CORPOICA, 2(1), 1-9.
Lodish, H., Berk, A., Matsudaira P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Matthew P., Lawrence, S., Zipursky.,
Darnell, J. (2005). Molecular Cell Biology. Quinta edición. New York: Médica Panamericana. Recu-
perado de http://bcs.whfreeman.com/lodish5e.
NCBI. (2013). National Center for Biotechnology Information. Recuperado de http://

www.ncbi.nlm.nih.gov/
Protein Data Bank. (2013). © RCSB Protein Data. Recuperado de http://www.rcsb.org/pdb /home/
home.do
Sánchez P., Saldaña, H. (2004). La reacción en cadena de la polimerasa a dos décadas de su invención.
CIENCIA UANL, 7(3), 323-335.
Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (2013). Computer exercise: Design of PCR
and PCR-RFLP experiments. Recuperado de http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es
Glosario
D NA Enzima que sintetiza una nueva cadena de DNA en dirección
Marcador visual Proteína que emite bioluminiscencia en la zona del espectro visible.
pol im e ra s a 5’ → 3’ usando una cadena Antiparalela de DNA como molde
Secuencia corta de DNA que se utilizan generalmente como ceba-

E xón Secuencia codificante de un gen Oligonucleótidos
dores.
Un segmento de DNA que codifica para una proteína (vía mRNA), un Grupo de genes cuya expresión esta controlada por los mismos
Gen Operón
tRNA o un rRNA elementos de control
Es un gen de secuencia de codificación de enzimas necesarios
Genoma Conjunto de genes contenido en una célula o un virus Operón ara
para el catabolismo de la arabinosa
Una molécula (generalmente poli nucleótido) al cual el DNA polime-
Es un gen de secuencia de codificación de enzimas necesarios
Iniciador rasa puede unir el primer desoxiribonucleótidos, durante la replica- Operón lac
para el catabolismo de la lactosa
ción del DNA
Inmunoglobu- Proteína a soluble, producida por los linfocitos B que interactúa con Son pequeñas secuencias de ADN que anillan a secuencias especí-
Primers
lina (Ig) el antígeno, también se le conoce como anticuerpo ficas,
3.2 Ac ti vida d de Es tr ucturación.
3.2 .1 Pr uebas de confir mación de DNA r ecombinante media nte cor tes con en zimas de res tr icc ión.
Usted se encuentra trabajando para el INVIMA y tiene que realizar un control de calidad a tres cepas bacte-
rianas de E coli. las cuales contienen una molécula de DNA recombinante. Las especificaciones técnicas
dicen que el DNA recombinante debe tener un peso de 2984pb y esta compuesto por un vector de DNA cir-
cular (pAW9) con un peso de 2552pb y el gen Octodon degus insulin mRNA, con 432pb introducido en la
posición 160.
Teniendo en cuenta esta información usted aísla el DNA recombinante de las 3 cepas y las sometió a diges-
tión con la enzima de restricción Dral que corta en la posición 1634, de manera independiente utiliza la en-
zima Bst6l que corta en las posiciones (522) y (2483). Finalmente puso a correr las muestras en una electro-
foresis de agarosa obteniendo los siguientes resultados:

Po zo 1 Marcador de peso molecular 1Kb plus Po zo 5 Muestra dos tras 2 cortes con Bst6l
Po zo 2 Muestra uno (tras 1 corte con Dral 1634) Po zo 6 Muestra tres (tras 1 corte con Dral 1634)
Po zo 3 Muestra uno tras 2 cortes con Bst6l Po zo 7 Muestra tres tras 2 cortes con Bst6l
Po zo 4 Muestra dos (tras 1 corte con Dral 1634) Po zo 8 Vacio
20kb
10kb Con base a la información
7kb anterior responda:
5kb
4kb 1. ¿Qué ocurrió en cada uno
3kb de los carriles de la electro-
foresis de agarosa?
2kb 2. ¿Las cepas bacterianas
contienen el mismo DNA
1.5kb
recombinante? justifique
1kb
0.7kb Nota: Las unidades del marca-

dor de peso molecular (MPM)
0.5kb esta dado en kilo bases (Kpb),
recuerde que 1 Kpb es igual a
0.4kb 1000pb.
0.3kb
0.2kb
0.075kb
3.3.2 Pruebas de confirmación del plásmido pGLO con en zimas de res tr icción en electroforesis
de a garosa.
Para realizar la confirmación del vector pGLO usted revisa minuciosamente las especificaciones de la casa
comercial: el peso total del plásmido pGLO es de 5371pb compuesto por: el Gen: GFP de 720pb, Gen:
araC, araBAD, de1201pb ori y f1ori de 1169pb y Gen: ampR de 861pb
Para este ensayo usted realiza dos pruebas:
1. Corta el plásmido pGLO con la enzima de restricción BfrBI que se ubica en la posición 7
2. De manera independiente corta el plásmido pGLO con las enzimas AsuNHI que se ubica en la posición
1345 y EcoRI que se ubica en la posición 2063.
Teniendo en cuenta esta información usted aísla el plásmido de 3 muestras donde a cada una la somete a
digestión con enzimas de restricción. Los resultados se muestran a continuación:

Po zo 1 Marcador de peso molecular 1Kb plus Po zo 5 Muestra 2 pGLO (tras corte con AsuNHI y EcoRI)
Po zo 2 Muestra 1 pGLO (tras 1 corte con BfrBI) Po zo 6 Muestra 3 pGLO (tras 1 corte con BfrBI)
Po zo 3 Muestra 1 pGLO (tras corte con AsuNHI y EcoRI) Po zo 7 Muestra 3 pGLO (tras corte con AsuNHI y EcoRI)
Po zo 4 Muestra 2 pGLO (tras 1 corte con BfrBI) Po zo 8 Vacio
20kb
En base a lo anterior
10kb argumente sus respuestas:
7kb
5kb 1. Explique que ocurrió en
4kb cada carril.
3kb
2. ¿Cuál es la muestra que
2kb cumple con las especifica-
ciones técnicas del plásmi-
1.5kb do?
1kb 3. ¿Las muestras contienen

el mismo plásmido pGLO?
0.7kb
Nota: Las unidades del marca-
0.5kb
dor de peso molecular (MPM)
0.4kb esta dado en kilo bases (Kpb),
recuerde que 1 Kpb es igual a
0.3kb
1000pb.
0.2kb
0.075kb
Anexos
Pág.
Anexo 1. Guía para realizar mapas de restricción a través

de bioinformática (base de datos GenBank del NCBI y el 108
Software SnapGene) y diseño manual.
Anexo 2. Guía para diseño de cebadores utilizando bioin-

formática (base de datos GENE del NCBI y el programa 143
Primer-BLAST)
Anexo 1. Guía para realizar mapas de restricción a través de bioinformática (base de datos GenBank del
NCBI y el Software SnapGene) y diseño manual.
A. Guía para realizar mapas de restricción utilizando base de datos GenBank del NCBI y el Software
SnapGene
Base de datos GenBank del NCBI
La base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information): está diseñado para proporcionar y
fomentar el acceso de la comunidad científica a la más actualizada y completa información de la secuencia del
ADN, en la web de forma gratuita, conformándose como la más grande colección de secuencias de varias
fuentes incluyendo: RefSeq, TPA, PDB, Datos del genoma, secuencias de bases de datos (NCBI 2013), GenBank
que es la base de datos que contiene los formatos para trabajar en esta unidad temática.
Buscar la secuencia de interés
1. Se ingresa a la bases de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI). A través de la
URL. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
1.1 Al ingresar a la URL. La ventana emergente muestra la pagina principal, al lado derecho se encuen-
tra la opción Nucleotide en recursos populares, al seleccionar esta opción, y dar clic se inicia el buscador
especifico.
1.2 Para acceder a la información hay dos maneras, a partir de una secuencia de interés, ingresando el código
del LOCUS o el nombre del ORGANISMO. Sección 1.2.1 y 1.2.2 respectivamente.
1.2.1 Se ingresa el código del LOCUS de una secuencia de interés en la barra del buscador:
Ejemplo: plásmido Ti LOCUS: NC_002377
La Tabla 2, contiene un listado de secuencias donde se encuentran algunos códigos de LOCUS.

1.3 La ventana emergente es un formato GenBank que contiene: LOCUS, que es un código de acceso directo especifico a la secuencia,
la longitud de la secuencia en pares de bases 194.140pb, tipo de secuencia y forma DNA circular. DEFINITION, es el titulo del acceso a la
secuencia, ACCESSION, comprende otro código correspondiente a esta secuencia. KEYWORDS, son palabras claves con información
sobre. SOURCE, es la fuente de la secuencia. ORGANISM , es el organismo del cual se obtuvo esta secuencia. REFERENCE, contiene las
referencia bibliográfica en relación a la secuencia, AUTHORS, quienes publicaron la secuencia, y la subieron a la base de datos TITLE, de
la publicación. JOURNAL, referencia bibliográfica completa, PUDMED, contiene el acceso directo a la revista con la publicación. GENE,
contiene la ubicación especifica de los genes dentro de la secuencia CDS, corresponde a la zona codificante del gen, el rango y su res-
pectiva Translation, (traducción) de la zona codificante en secuencia de aminoácidos. ORIGIN, presenta la secuencia completa de nu-
cleótidos, enumerados cada 60 pares de bases.
1.4 El código del LOCUS , se selecciona y copia para trabajarlo en el programa SnapGene,.
1.2.2 Se ingresa el nombre del ORGANISMO, de una secuencia de interés en la barra del buscador.
Ejemplo: Agrobacterium tumefaciens
La Tabla 2, contiene un listado de secuencias donde se encuentran algunos nombres de organismos.

1.2.3 Al ingresar el nombre del organismo se abre una ventana emergente que contiene los resultados de una
búsqueda, pero por ser menos especifica genera muchas búsquedas de secuencias como resultado de traba-
jos relacionados con el mismo organismo.
1.2.4 Se selecciona una de las secuencias de interés y se da clic.
Ejemplo: Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiBo542, complete sequence

1.3 La ventana emergente es un formato GenBank que contiene: LOCUS, que es un código de acceso directo especifico a la secuencia,
la longitud de la secuencia en pares de bases 244.978pb, tipo de secuencia y forma DNA circular. DEFINITION, es el titulo del acceso a la
secuencia, ACCESSION, comprende otro código correspondiente a esta secuencia. KEYWORDS, son palabras claves con información
sobre. SOURCE, es la fuente de la secuencia. ORGANISM , es el organismo del cual se obtuvo esta secuencia. REFERENCE, contiene las
referencia bibliográfica en relación a la secuencia, AUTHORS, quienes publicaron la secuencia, y la subieron a la base de datos TITLE, de
la publicación. JOURNAL, referencia bibliográfica completa, GENE, contiene la ubicación especifica de los genes dentro de la secuencia
CDS, corresponde a la zona codificante del gen, el rango y su respectiva Translation, (traducción) de la zona codificante en secuencia
de aminoácidos. ORIGIN, presenta la secuencia completa de nucleótidos, enumerados cada 60 pares de bases.
1.4 El código del LOCUS , se selecciona y copia para trabajarlo en el programa SnapGene,.
Instalación del programa SnapGene
SnapGene
Es un software revolucionario que permite a los biólogos moleculares crear, explorar y com-
partir archivos de ADN de hasta 1 Gb de largo, las aplicaciones básicas del programa se en-
cuentran en una versión gratis SnapGene Viewer la cual brinda a los usuarios diferentes op-
2. Se ingresa a la URL. http://www.snapgene.com/
2.1 La ventana emergente muestra la pagina principal, al lado derecho se encuentra la opción Get
SnapGene Viewer (flecha de color azul agua marina y borde rojo) se da clic para descargar el programa
e instalarlo.
2.2 La ventana emergente presenta hacia el lado derecho dos opciones de descarga según el sistema operativo
del computador donde se trabaje (Windows o MAC OS X) se da clic para iniciar la descarga.
2.3 La ventana emergente es un asistente de instalación, se da clic en Next 3 veces y finalmente en Aceptar
para terminar la instalación.
A continuación se realiza un ejercicio para explicar como se trabaja el programa SnapGene utilizando
bases de datos de GenBank, y actividades de lápiz y papel.
2.4 Se ingresa desde el escritorio y se da clic en el botón de inicio que se encuentra en la parte inferior izquier-
da. La ventana emergente muestra una serie de programas instalados, se selecciona con el apuntador el progra-
ma descargado SnapGeneViewer identificado con un símbolo ( eppendorf), al darle clic se abre la ventana prin-
cipal de SnapGene Viewer 1.5.2.
2.5 la ventana principal presenta una serie de opciones, se selecciona la opción Import From GenBank.
3. La ventana emergente es un formato para búsqueda de secuencias en NCBI se debe ingresar el código del LO-
CUS de la secuencia de interés encontrado en la base de datos de GenBank, del punto 1.3. se da clic en import.
Ejemplo: la secuencia seleccionada es la del Plásmido Ti, código del LOCUS: NC_002377
3.1 Pasados algunos segundos se abre la ventana con la secuencia del plásmido Ti y todas sus características: un
circulo que representa un DNA circular, en el centro la longitud de la secuencia 194.140pb, hacia la parte inter-
na del circulo se encuentran los genes y secuencias que componen el plásmido Ti, y hacia la parte externa se
presentan las enzimas de restricción con la posición de corte a lo largo de la secuencia.
Se verifica que la barra de herramientas inferior se encuentra en la selección de MAP.
A continuación se presenta un ejercicio con la enzima de restricción Smil que realiza un corte en
esta secuencia circular y su ubicación especifica (posición de corte dentro del plásmido Ti).
3.2 Hacia la parte superior izquierda de la ventana se encuentra un símbolo de tijeras, que representa las enzi-
mas de restricción, al seleccionarlo se da clic sobre un corte ( Unique cutters).
(Nº) El numero que se encuentra entre paréntesis representan el numero de enzimas en una determinada selección,
3.3 La grafica presenta únicamente las enzimas de restricción que realizan un corte en esta secuencia circular y
su ubicación especifica (posición de corte dentro del plásmido Ti).
Se presentan los datos de la enzima Smil (2,892) en la tabla 3.
3.4 Se selecciona la enzima Smil que corta la en posición (2.892) y se da doble clic.
3.5 A continuación cambia la grafica, presentando únicamente la enzima de restricción Smil que realiza un corte
en esta secuencia circular. Esta selección muestra la secuencia de reconocimiento, el tipo de corte (romo), lon-
gitud de la secuencia de reconocimiento 8pb, temperatura y buffer que se recomienda utilizar para el trabajo en
laboratorio con dicha enzima. Se presentan los datos de la secuencia de reconocimiento y tipo de corte en la ta-
bla 3.
3.6 Al seleccionar con el apuntador DNA letter codes y hacer doble clic se abre la siguiente ventana.
3.7 La ventana emergente, presenta los códigos de letras, estándar que se maneja en biología molecular para
identificar secuencias de DNA y aminoácidos, en bases de datos.
3.8 A continuación se muestra como quedan finalmente completadas la tabla 3 y las gráficas 3, 3.1 para el plás-
mido Ti, tras el tratamiento con la enzima de restricción Smil que realiza un corte en esta secuencia circular.
Tabla 3. Resultados de fragmentos del plásmido Ti obtenidos tras el tratamiento con

1 enzima de restricción que realiza un corte en esta secuencia circular.

NC_002377 194.140pb Plásmido Ti Agrobacterium
tumefaciens
Enzima de restricción
Nombre de la enzima, posición de corte y
zona de reconocimiento
SmiI(2892)
UNICO 194.140
NOTA 1. Cuando se trabaja con secuencias de DNA circular como los plásmidos al realizar solo un corte con
una enzima de restricción se obtiene un fragmento con igual longitud que la inicial de la secuencia, pasando
de DNA circular a DNA linear.
NOTA 2. Para trabajar con secuencias de DNA linear, hay que tener en cuenta que si la enzima de restric-
ción reconoce una posición de corte en la secuencia se obtienen dos fragmentos; sin embargo cuando se re-
conocen dos posiciones de corte se obtienen tres fragmentos, cuando se reconocen tres posiciones de corte
se obtienen cuatro fragmentos y así sucesivamente. El programa SnapGene trabaja secuencias lineares y
circulares de la misma manera permitiendo efectuar todos los ejercicios con diferentes tipos de secuencias.
NOTA 3. Al trabajar las graficas con secuencias de DNA linear se tiene en cuenta que el inicio y el final de la
secuencia no están unidos por lo que se recomienda trabajar una grafica lineal, en este caso se trabaja la
grafica 9. para realizar los mapas de restricción.
3.9 Para seleccionar específicamente las enzimas de restricción se selecciona el símbolo de las tijeras y en la ven-
tana lateral se da clic en la opción Choose Enzymes como se muestra a continuación.
3.10 se abre la vantana que se presenta a

3.9 Para seleccionar específicamente las enzimas de restricción se selecciona el símbolo de las tijeras y en la ven-
tana lateral se da clic en la opción Choose Enzymes como se muestra a continuación.
3.10 se abre la vantana que se presenta a continuación

3.11 La grafica presenta las enzimas seleccionadas como se muestra a continuación.
Nota. El programa muestra las posiciones de corte de las enzimas, cuando se producen mas de 6 cortes el pro-
grama automáticamente las saca del listado ya que posiblemente no sea apropiado su uso en laboratorio.
A continuación se presenta un ejercicio utilizando dos enzimas de restricción que realizan cada una un
corte en esta secuencia circular y su ubicación especifica (posición de corte dentro del plásmido Ti).
4. La ventana principal del plásmido Ti muestra los datos de las dos enzimas de restricción que reconocen una po-
sición de corte: se presentan los datos de las enzimas Smil (2,892) y PmeI (175,203) en la tabla 4.
4.1 Se selecciona alguna de las dos enzimas y se da doble clic.
Ejemplo: seleccionando la enzima Smil que corta la en posición (2,892) y se da doble clic.
4.2 A continuación cambia la grafica, presentando únicamente la enzima de restricción Smil que realiza un corte
único en esta secuencia circular y su ubicación especifica (posición de corte dentro del plásmido Ti). Esta selec-
ción muestra la secuencia de reconocimiento, el tipo de corte (romo), longitud de la secuencia de reconocimiento
8pb, temperatura y buffer que se recomienda utilizar para el trabajo en laboratorio con dicha enzima. Se presen-
tan los datos de la secuencia de reconocimiento y tipo de corte en la tabla 4.
4.3 Se realiza las operaciones del punto 4.1 y 4.2 con la otra enzima PmeI (175,203) que realiza un corte en esta
secuencia circular y se presentan los datos en la tabla 4. y la grafica 4.
Determinación del tamaño de los fragmentos
4.4 El mapa de la ventana principal muestra que las enzimas PmeI (175,203 y SmiI (2,892) que reconocen una po-
sición de corte generando 2 fragmentos, para determinar su longitud se requiere: seleccionar una de las dos en-
zimas y luego con la tecla Ctrl + sostenido seleccionar la otra enzima, automáticamente el programa arroja los
resultados del tamaño de ese fragmento y su ubicación especifica dentro del plásmido.
Ejemplo: se selecciona PmeI (175,203) + Ctrl sostenido + SmiI (2,892)
4.5 La selección anterior muestra en color azul la longitud del fragmento iniciando por la posición de corte de la
enzima PmeI 175,203 y finalizando en la posición de corte SmiI 2,892, el tamaño del fragmento se evidencia el la
barra que se encuentra inmediatamente encima de la grafica a manera de encabezado, = 21,829pb.
Se presenta el valor del tamaño del fragmento en la tabla 4. y grafica 4.

4.6 Para determinar el tamaño del fragmento faltante se realiza la selección de las enzimas, en el rango que se
busca determinar la longitud.
Ejemplo: se selecciona, SmiI (2,892) + Ctrl sostenido + PmeI (175,203)
enzima SmiI 2,892 y finalizando en la posición de corte PmeI 175,203. el tamaño del fragmento se evidencia el la
barra que se encuentra inmediatamente encima de la grafica a manera de encabezado, = 172,311pb.
4.8 A continuación se muestra como quedan las tablas 4, 4.1 y gráficos 4, y 4.1 para el plásmido Ti tras el trata-
miento con dos enzimas de restricción que realizan cada una un corte en esta secuencia circular.
Tabla 4. Resultados de fragmentos del plásmido Ti obtenidos tras el tratamiento con

2 enzimas de restricción que realizan cada una un corte en esta secuencia circular.

NC_002377 194.140pb Plásmido Ti Agrobacterium tumefaciens
Fragmento longitud pb Nombre de la enzima, Nombre de la enzima,
SmiI(2892) PmeI(175,203)
172.311
1
PmeI(175,203) *final de secuencia SmiI(2892)

(194.140)
2 21.829

∑= (1+2) ∑= 194.140 final se le suman las pb desde el punto cero hasta dónde llega el primer
corte.
A continuación se presenta un ejercicio utilizando 4 enzimas de restricción que realizan uno y dos cor-
tes en esta secuencia circular y su ubicación especifica (posición de corte dentro del plásmido Ti).
5. Se selecciona el símbolo de tijeras, que representa las enzimas de restricción, en la ventana emergente se
da clic sobre uno y dos cortes (Unique y Dual cutters)
Se verifica que la barra de herramientas inferior se encuentra en la selección de MAP.
(Nº) El numero que se encuentra entre paréntesis representan el numero de enzimas en una determinada selección.
5.1 La ventana principal del plásmido Ti presenta únicamente los datos de 4 enzimas, y su posición de corte
dentro del plásmido Ti: Smil (2,892), PmeI (175,203), PacI (22,819), PacI (22,819), SgrDI (180,239) y SgrDI(121,046).
se presentan los datos en la tabla 5.
5.2 Se selecciona alguna de las enzimas y se hace doble clic.
Ejemplo: seleccionando la enzima SgrDI que corta en la posición 121.046 y 180.239

5.3 A continuación cambia la grafica, presentando únicamente la enzima de restricción SgrDI (180,239). que rea-
liza dos cortes en esta secuencia circular y su ubicación especifica (posición de corte dentro del plásmido Ti).
Esta selección muestra la secuencia de reconocimiento, el tipo de corte (cohesivo), longitud de la secuencia de
reconocimiento 8pb, temperatura y buffer que se recomienda utilizar para el trabajo en laboratorio con dicha
enzima. Se presentan los datos de la secuencia de reconocimiento y tipo de corte en la tabla 5.
5.4 Con las otras 3 enzimas se realizan las operaciones del punto 5.1 y 5.2 y se presenta la información en la
tabla 5.
5.5 El mapa de la ventana principal muestra que las enzimas de restricción: Smil (2,892), PmeI (175,203), PacI
(22,819), PacI (22,819), SgrDI (180,239) y SgrDI(121,046). Realizan seis cortes generando 6 fragmentos, para
determinar su longitud se requiere: seleccionar una de las cuatro enzimas y luego con la tecla Ctrl + sostenido
seleccionar otra enzima, automáticamente el programa arroja los resultados del tamaño de ese fragmento y su
ubicación especifica dentro del plásmido.
Ejemplo: se selecciona SgrDI (180,239) + Ctrl sostenido + SmiI (2,892)
enzima SgrDI 180,239 y finalizando en la posición de corte SmiI 2,892, el tamaño del fragmento se evidencia el la
barra que se encuentra inmediatamente encima de la grafica a manera de encabezado, = 16.973pb. Se realiza la
misma operación con los fragmentos faltantes y se presentan los resultados en la tabla 5 y grafica 5.
5.7 A continuación se muestra como quedan las tablas 5, 5.1 y gráficos 5, y 5.1 para el plásmido Ti tras el trata-
miento con cuatro enzimas de restricción que realizan seis cortes en esta secuencia circular.
Tabla 5. Resultados de Fragmentos del plásmido Ti obtenidos tras el tratamiento con

4 enzimas de restricción que realizan uno y dos cortes en esta secuencia circular.

NC_002377 194.140pb Plásmido Ti Agrobacterium tumefaciens
Nombre de la enzima, Nombre de la enzima,
SmiI(2892) PacI(22,819)
1 19.927
PacI(22,819) SgrDI(121,046)
2 98.227
SgrDI(121,046) PacI (138. 221)
3 17.175
PacI(138. 221) PmeI(175,203)
4 36.982
PmeI(175,203) SgrDI(180.239)
5 5.036
SgrDI (180.239) *final de secuencia SmiI(2892)

(194.140)
6 16.793

∑= (1+2+3+4+5+6) ∑= 194.140 final se le suman las pb desde el punto cero hasta dónde llega el primer
corte.
B. Guía para realizar mapas de restricción utilizando un diseño manual a partir de los datos obtenidos por
bioinformática.
Grafica 3. El diseño manual del mapa de restricción utiliza un circulo que representa el plásmido Ti y a partir de
la longitud total con una escala aproximada. Ubicando la posición de corte de 1 enzima de restricción que realiza un
corte en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por bioinformática de la tabla 3.
Grafica 3.1 El diseño manual del mapa de restricción posterior al corte representa el plásmido Ti tras el corte
con 1 enzima de restricción que realiza un corte en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por bioinformáti-
ca de la tabla 3. La grafica es una línea que representa el fragmento obtenido a partir del corte y su escala aproxi-
mada partiendo de la longitud del plásmido.
Tabla 4.1 Resultados de fragmentos del plásmido Ti obtenidos tras el calculo manual utilizando las 2 enzimas
de restricción trabajadas en la tabla 4. que realizan cada una un corte en esta secuencia circular.
Locus: Longitud: Organismo:

NC_002377 194.140pb Agrobacterium tumefaciens
C. Diferencia (A-B)
SmiI (2.892) PmeI (175,203) -172.311 1. 172.311pb

194.140 172.311 21.829 2. 21.829pb
∑ (fragmentos 1+2) = (Tamaño de la secuencia) = 194.140pb
*para establecer la longitud de los fragmentos: se toma el valor de las diferencias obtenidas sin tener en cuenta los
signos.
Grafica 4. El diseño manual del mapa de restricción utiliza un circulo que representa el plásmido Ti y a partir del
peso total se presenta una escala aproximada. Ubicando la posición de corte de 2 enzimas de restricción que reali-
zan cada una un corte en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por bioinformática de la tabla 4.1
con 2 enzimas de restricción que realizan cada una un corte en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por
bioinformática de la tabla 4.1. La grafica es una línea que representa los fragmentos obtenidos a partir de los cor-
tes y su escala aproximada partiendo de la longitud del plásmido.
Tabla 5.1 Resultados de fragmentos del plásmido Ti obtenidos tras el calculo manual utilizando las 4 enzimas
de restricción que realizan uno y dos cortes en esta secuencia circular trabajadas en la tabla 5.
Organismo:
Locus: NC_002377 Longitud: 194.140pb
Agrobacterium tumefaciens
C. Diferencia (A-B)
SmiI(2.892) PacI(22.819) - 19.927 1. 19.927pb
PacI(22.819) SgrDI(121.046) -98.227 2. 98.227pb
SgrDI(121.046) PacI (138.221) -17.175 3. 17.175pb
PacI (138.221) PmeI(175.203) -36.982 4. 36.982pb
PmeI(175.203) SgrDI(180.239) -5.036 5. 5.036pb

194.140 -177.347 16.793 pb 6. 16.793pb
∑ (fragmentos 1+2+3+4+5+6) = (Tamaño de la secuencia) = 194.140pb
los signos.
Grafica 5. El diseño manual del mapa de restricción utiliza un circulo que representa el plásmido Ti y a partir del
peso total se presenta una escala aproximada. Ubicando la posición de corte de 4 enzimas de restricción que reali-
zan uno y dos cortes en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por bioinformática de la tabla 5.1
con 4 enzimas de restricción que realizan uno y dos cortes en esta secuencia; Utilizando los datos obtenidos por
bioinformática de la tabla 5.1. La grafica es una línea que representa los fragmentos obtenidos a partir de los cor-
tes y su escala aproximada partiendo de la longitud del plásmido.
Anexo 2. Guía para diseño de cebadores utilizando bioinformática (base de datos GENE del NCBI y el pro-
grama Primer-BLAST)
Primer-BLAST.
Representa una herramienta de software que disminuye la dificultad para diseñar cebadores específicos. BLAST
utiliza un algoritmo de alineación global para asegurar una completa alineación del cebador al DNA objetivo y es lo
suficientemente sensible para diseñar cebadores en los casos que el DNA objetivo presenta desajustes en sitios
de unión a los cebadores.
El programa permite diseñar nuevos cebadores específicos en un solo paso. Es compatible con secuencias de DNA
que presentan intrones/exones y polimorfismos de nucleótido único (SNP) (NCBI 2013).
1 Se realiza la búsqueda de una secuencia de interés: ingresando a la bases de datos del Centro Nacio-
nal para la Información Biotecnológica (NCBI). A través de la URL. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
1.1 Al ingresar la ventana emergente muestra la pagina principal, al lado derecho de se encuentra la
opción Gene en recursos populares y se da clic para iniciar el buscador especifico.
1.2 Para acceder a la información de los genes hay dos maneras, ingresando el código del ID o el nombre del
GEN. Sección 1.2.1 y 1.2.2 respectivamente.
1.2.1 Al ingresar el código del ID del gen de interés en la barra del buscador:
La tabla 9 contiene un listado códigos ID de genes para diseñar cebadores.
ejemplo: gen HBB código del ID: 3043

1.3 La ventana emergente es un formato GENE, que contiene la información del gen seleccionado
1.2.2 Se Ingresa el nombre del gen de interés en la barra del buscador:
ejemplo: hemoglobin beta
La tabla 9 contiene un listado de genes para diseñar cebadores.

1.2.3 Al ingresar el nombre del gen se abre una ventana emergente que contiene los resultados de una bús-
queda, pero por ser menos especifica se observa muchos genes como resultado de trabajos relacionados con
la misma secuencia.
1.2.4 Se selecciona la secuencias de interés y se da clic.
ejemplo: HBB – hemoglobin, beta [Homo sapiens]

1.3 La ventana emergente es un formato GENE que contiene la información del gen seleccionado.
1.4 Se selecciona la opción Graphics que se encuentra en la barra de herramientas inferior hacia el costado de-
recho y se da clic.
1.5 La ventana emergente de Graphics es la herramienta multimedia para diseñar cebadores. Los genes se en-
cuentran representados en color verde, los exones de color negro, y al final de la secuencia se encuentran unos
recuadros enumerados de color azul agua marina que representan las variantes del gen.
A continuación se presenta un ejercicio de cómo se realiza la búsqueda en BLAST
2. Se selecciona con el apuntador el gen HBB (líneas y flechas de color verde), se da clic derecho y esta opción
abre una pestaña lateral a la secuencia con unas opciones en la cual se ubica el apuntador en el símbolo del
martillo. Se abre una ventana adicional con dos opciones; se da clic en la opción BLAST Search (visible range).
2.1 La ventana emergente es un formato para búsqueda de secuencias en BLAST donde se observa el numero de
acceso que corresponde específicamente al gen HBB y el rango de búsqueda, se muestran los datos en la tabla
10, las opciones que se presentan ya están predeterminadas y no hay que realizar modificaciones. Al final de la
pagina se encuentra un icono BLAST , se da clic para iniciar la búsqueda.
2.2 Pasados algunos segundos BLAST, arroja los resultados observándose una ventana como la que se muestra,
donde se observa: un alineamiento con secuencias que coinciden con el gen HBB, variantes del gen, las líneas ro-
jas que representan un nucleótido diferente (SNP) en comparación con la secuencia del gen HBB.
A continuación se presenta un ejercicio de cómo se realiza el diseño de cebadores con Primer-BLAST.
3. Una vez realizada la búsqueda en BLAST se trabaja a partir de dichos resultados. Se selecciona con el apunta-
dor el gen HBB (líneas y flechas de color verde), se da clic derecho y esta opción abre una pestaña lateral a la
secuencia con unas opciones en la cual se ubica el apuntador en el símbolo del martillo. Se abre una ventana adi-
cional con dos opciones; se da clic en la opción Primer-BLAST Search (visible range).
3.1 La ventana emergente es un formato para búsqueda de cebadores en Primer-BLAST donde encontramos el
numero de acceso que corresponde específicamente al gen HBB y el rango de búsqueda, se presentan los datos
en la tabla 10, las opciones ya se encuentran predeterminadas elimine la opción de búsqueda especifica de
primers que se encuentra hacia la parte inferior de la ventana. Se selecciona la opción Get Primers, y se da clic
para iniciar la búsqueda.
3.2 Pasados algunos minutos. Primer-BLAST, arroja los resultados observándose una ventana como la que se
presenta continuación: los cebadores están identificados con 2 flechas unidas por una línea (ambos de color azul)
y representan el rango de amplificación, debajo de la herramienta de graphics se encuentra las especificaciones
técnicas de cada par de cebadores en este caso se observan 5 donde cada par presenta: dirección y secuencia
de nucleótidos de ambos cebadores, longitud, inicio y terminación, respectivas Tm, porcentaje de G-C y comple-
mentariedad entre cebadores (no debe tener un valor superior a 3 ).
Finalmente se presentan los datos en la tabla 10, con los resultados de 2 pares de cebadores utilizando el
programa primer-BLAST.
Tabla 10. Resultados de diseño de cebadores del gen HBB, utilizando el software Primer-BLAST.
Gen Código ID : Organismo: Acceso GENE del NCBI

HBB hemoglobin, beta [ Homo sapiens
HBB 3043 Homo sapiens (Human)
(human) ]
Función e
Transporte de oxigeno, un mutante de la hemoglobina beta es la causante de la anemia.
importancia
BLAST From To
Enter accession : Rango
5246458 5248545
NC_000011.9
Primer-BLAST Rango Enter accession : NC_000011.9
Cebador From To Primer melting temperatures (Tm)
Forward 5246144 Min opt Max Max Tm difference
Reverse 5248857 57.0 60.0 63.0 3
Resultados Par:1 Longitud del producto: 433pb
Forward AGGCCATCACTAAAGGCACC 20 5247895 5247914 60.03 55.00
Reverse AGTCAGGGCAGAGCCATCTA 20 5248327 5248308 60.03 55.00
Resultados Par:2 Longitud del producto: 1.222pb
Forward ATCAGGGGCTGTTGCCAATG 20 5246636 5246655 60.04 60.00
Reverse CTGCTGGTGGTCTACCCTTG 20 5247857 5247838 59.97 55.00

C PCR y Enzimas de Restriccion

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C PCR y Enzimas de Restriccion

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Página 1 Unidad didáctica: tecnología del DNA recombinante para la enseñanza de biología molecular

2.1 ¿Qué son las enzimas de restricción? 38

2.2 ¿Cómo actúan las enzimas de restricción? 39

2.3 ¿Qué utilidad tienen las enzimas de restricción? 40

3.1 Actividad de introducción 40

3.2 Actividad de estructuración 51

3.3. Actividad de aplicación 52

E squema sobre E nzimas de restricción

FIGURA 12. .Enzima de restricción EcoR124I

2. C ontenidos tomado de ProteinDataBank (2013)

2.1 ¿Qué son la enzimas de restricción?

Enzima Especie Genero Cepa Orden de identificación

2.2 ¿C ómo actúan las enzimas de

Muchas de las enzimas de restricción están conforma-

Ingrese a la siguiente URL: http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es/ para ver un ejemplo grafico de cómo

2.3 ¿Qué utilidad tienen las enzimas de restricción?

3.1 Actividad de introducción mapas de restricción.

2. Importar datos en el programa SnapGene:

2.1 Instale el programa SnapGene y ejecútelo.

3. Identificación de enzimas de restricción:

3.1 Seleccione una enzima de restricción con corte único.

3.2 Identifique la posición de corte y la zona de reconocimiento de la enzima seleccionada,

3.4 Complete la información de las tablas 6, 7 y 8.

B. Actividad de diseño manual de mapas de restricción.

Salmonella enterica subsp. enterica se-

Genome AM270983 Aspergillus niger Aspergillus niger supercontig An04

Penicillium digitatum PHI26 unplaced

Tabla 6. Resultados de fragmentos de la secuencia ___________ obtenidos tras el tratamiento con

Locus: Longitud: Secuencia: Organismo:

Fragmento longitud pb Enzima de restricción

Nombre de la enzima, posición de corte y

Tabla 7. Resultados de fragmentos de la Secuencia__________ obtenidos tras el tratamiento

Locus: Longitud: Secuencia: Organismo:

*El DNA plásmido es circular y no tiene extremos, por lo que al extremo

Locus Longitud: Organismo:

A. Nombre de la enzima y B. Nombre de la enzima * Nº y longitud del

D. Diferencia (Tamaño de la * Nº y longitud del

∑ (fragmentos 1+2) = (Tamaño de la secuencia) =

Tabla 8. Resultados de Fragmentos de la secuencia_____________ obtenidos tras el tratamiento con

Locus: Longitud: Secuencia: Organismo:

*El DNA plásmido es circular y no tiene extremos, por lo que al extremo

Locus Longitud: Organismo:

A. Nombre de la enzima y B. Nombre de la enzima * Nº y longitud del

D. Diferencia (Tamaño de la * Nº y longitud del

∑ (fragmentos 1+2+3+4+5+6) = (Tamaño de la secuencia) =

Grafica 9. Diseño manual de mapa de restricción de la secuencia____________ de DNA linear tras el

Plásmido pUB-GFP tomado de addgene.org (2013)

En base a lo anterior responda:

Nota: El peso del plásmido es de 5122pb

Electroforesis en agarosa 1,5% TE

RFLP. Es una técnica que se

En base a lo anterior argumente sus respuestas:

3.3.2 Socialización: socialice con los compañeros del curso

1. ¿Usted como docente como abordaría la temática enzimas de restricción ?

NCBI. (2013). National Center for Biotechnology Information. Recuperado de http://

2.1 ¿Qué es la PCR? 57

2.2 ¿Cuáles son las etapas de una PCR? 60

2.3 ¿Qué utilidad tiene la PCR? 63

3.1 Actividad de introducción 64

3.2 Actividad de estructuración 67

3.3 Actividad de aplicación 68

2. C ontenidos FIGURA 15.

FIGURA 16. Termociclador