Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
I
Perete celular Absent sau compus din celuloza/chitina Are structura complexa
Nu prezinta glicopeptid Prezentand glicopeptid, proteine,
lipide
1
2. Clasificati bacteriile dupa forma si dispunere - exemple
a) Forma cocoidala
➔ Diametre egale sau inegale (coci)
➔ Dispuse izolat sau grupat
➔ Sferici → majoritatea streptococilor si stafilococii
➔ Ovalari → enterococii
➔ Lanceolati → pneumococii
➔ Reniformi → gonococii si meningococii
Dispunerea bacteriilor depinde → mediul de cultura in care se dezvolta
→ varsta culturii bacteriene
→ de alte aspecte fiziologice
→ modul in care are loc diviziunea in cursul procesului de crestere si
multiplicare (planul de divizune)
Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru undele genuri de
bacterii:
➔ Stafilococii sunt coci sferici dispusi in gramezi (“ciorchine”)
➔ Pneumococii sunt coci lanceolati dispusi doi cate doi, eventual inconjurati de o capsula comuna
(in diplo)
➔ Streptococii sunt coci dispusi in lanturi
d) Actinomicete: in culturi tinere formeaza filamente lungi, ramificate (asemanator mucegaiurilor);
aceste filamente se fragmenteaza si rezulta aspecte bacilare (ex: Actinomyces israelli)
2
e) Forma spiralata
➔ bacili curbi - V. cholerae
➔ spirili si spirochete - T. pallidum
4. Structura peretelui la bacteriile Gram pozitive si Gram negative
Bacteriile Gram-pozitive
● Aprox. 80-90% mureina (peptidoglican, gricopeptid parietal)
● Mureina = heteropolimer al carui schelet este format din lanturi polizaharidice
○ Lanturile sunt formte prin polimerizarea alternanta a 2 structuri zaharidice:
■ Acidul N-Acetil-Muramic (NAM)
■ Acidul N-Acetil-Glucozamina (NAG)
3
○ Fiecare molecula de NAM are substituit un tetrapeptid alcatuit din D si L-aminoacizi
○ Aminoacizii in forma D confera un grad de protectie fata de enzimele proteolitice
○ Intre tetrapeptidele substituite, la lantutile polizaharidice alaturate, se tabillesc legaturi
peptidice prin:
■ gruparea terminala COOH a unui tetrapeptid si
■ grupari terminale libere ale tetrapeptidului vecin
⇒ se formeaza structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor straturi care
inconjoara intreaga celula bacteriana
● Retin violetul de metil (violet de genetiana in coloratia “clasica”) si au culoare violet pe frotiul
colorat Gram
● La unele bacterii, reteaua de baza este acoperita de retele splimentare cu specificitate
antigenica, alcatuite de exemplu din acid teichoic (polimer de ribitol fosfat si glicerol fosfat),
legat de regula covalent la peptidoglican
● In cazul in care structurile fosfat se gasesc in cantitati limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul
peretelui bacterian putem intalni acidul teichuronic
● Bacterii Gram-pozitive
○ Stafilococul
○ Streptococul
○ Enterococul
○ Bacilul difteric
○ Bacilul listeriozei
○ Actinomicetele
○ Bacilul antraxului
○ Clostridiile
Bacteriile Gram-negative
● Se descrie un perete celular in general mai subtire, dar mult mai complex
● Peretele este alcatuit dintr-un strat fin de peptidoglican (cca. 10-20% din structura peretelui)
care este acoperit de o membrana externa
● Spatiul dintre membrana citoplasmatica si membrana externa (include peptidoglicanul) = spatiul
periplasmic
4
● Dpdv chimic, membrana externa este alcatuita din:
○ Fosfolipide
○ Proteine (alte proteine importante de la acest nivel → porinele)
○ Cantitati variabile de lipopolizaharide (endotoxina) - au in componenta 2 structuri
esentiale:
■ Lipidul A
■ Polizaharidul O
● Se decoloreaza cu alcool-acetona
● Se recoloreaza cu fucsina diluata (au culoare rosie la coloratia Gram)
● Bacterii Gram-negative:
○ Meningococ
○ Gonococ
○ Enterobacterii
○ Vibrionul holeric
○ Bacilul piocianic
○ Cocobacilii Gram-negativi (ex: Haemophilius influenzae, Bordetella pertussis, Brucella
abortus)
5
6. Coloratia Gram, timpi-interpretare-exemple
a. Timpi:
● diluăm într-un recipient fucsina (9 părţi apă distilată / 1 parte fucsină)
● acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genţiană din punct de vedere
istoric), pentru 1-3 minute (nu are rost să acoperim cu colorant lama în întregime)
● îndepărtăm colorantul
● acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute
● îndepărtăm lugolul
● acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă (1 parte acetonă / 3 părţi alcool de 96º)
pentru un timp foarte scurt, 7-8 secunde
● spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
● acoperim frotiul cu fucsina diluată 1/10 pentru 1 minut
● spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
● aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare cu
sugativă sau hârtie de filtru
● examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm
b. Interpretare
● în cazul în care frotiul a fost realizat din cultură pură putem vizualiza microorganisme cu
aceeaşi formă, aceleaşi dimensiuni (excepţie Proteus spp.), o anumită dispoziţie, cu sau fără
capsulă (halou necolorat), gram pozitive (colorate în violet) sau gram negative (colorate în roşu),
levurile se colorează în violet
● în cazul în care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule diferite
(în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul şi citoplasma apar în
diverse nuanţe de roşu, bacterii gram pozitive şi / sau gram negative, fibrină şi levuri care se
colorează în violet etC
6
7. Protoplasti - Sferoplasti - Forme L
Protoplast = bacteria Gram-pozitiva dupa indepartarea completa a peretelui, de exemplu sub actiunea
lizozimului care lizeaza mureina
➔ In medii hipotone, protoplstul se lizeaza
➔ Structura care nu se poate multiplica
Sferoplast = bacteria Gram-negativa dupa degradarea partiala a peretelui (contine o cantitate mai mica
de mureina)
➔ In medii hipotone sferoplastul se lizeaza
➔ Se poate multiplica
Anumite bacterii produc autolizine = enzime hidrolitice care degradeaza peptidoglicanul (ex: glicozidaze,
amidaze, peptidaze)
Este probabil ca aceste substante sa aiba un rol in → cresterea bacteriana
→ multiplicare bacteriana
Formele L
➔ 1935, s-a pbservat prezenta unor germeni modiicati structual
➔ Au fost numiti forme “L”, dupa numele Institutului Dr. Lister unde s-au descoperit
➔ Nu erau microorganisme noi, ci varinate ale unor microorganisme cu peretele bacterial
modificat
➔ S-au putut obtine de la majoritatea bacteriilor utulizandu-se lizozim sau penicilina ca agenti
inductori
➔ Este posibil ca aceste forme “L” sa explice prin prezenta lor in organism anumite infectii cronice
(ex: infectii ale aparatului urinar)
7
8. Coloratia Ziehl-Neelsen, timpi - interpretare - exemple
Este o coloraţie utilă în identificarea prezenţei de bacili acid-alcool rezistenţi (BAAR),
solubilizând peretele bacterian prin creşterea temperaturii, facilitând penetrarea colorantului.
a. Timpi
● punem frotiul uscat şi fixat pe un suport situat deasupra tăviţei de colorare
● acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată (filtrată extemporaneu)
● trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperită de fucsină, până începe emiterea de
vapori (nu atingem temperatura de fierbere).
○ În cazul în care lama nu mai este acoperită complet cu fucsină, adăugăm colorant.
○ Timpul de lucru este de 10 minute, perioadă în care repetăm de 3 ori operaţia de
încălzire a lamei până la emiterea de vapori.
● spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet
● adaugăm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool
etilic 90-95º), pentru 2-3 minute
● spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
● recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut
● spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet
● aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare cu
sugativă sau hârtie de filtru
● examinăm la microscop, notăm observaţiile, interpretăm
b. Interpretare
● frotiu colorat Ziehl-Neelsen sau Kinyoun / putem vizualiza:
○ bacili de culoare roşie, relativ fini (în cazul prezenţei BAAR),
○ alte bacterii (ne-AAR),
○ celule diferite (în funcţie de sediul recoltării)
○ celule inflamatorii de culoare albastră (toate structurile ne-AAR apar colorate albastru)
etc;
● în cazul colorării unui frotiu din cultură pură vom evidenţia numai bacili de culoare roşie
8
9. Structura si rolul membranei citoplasmatice
Roluri:
1. Filtru selectiv datorita permeazelor (rol in permeabilitate si transport)
2. Contine enzime ale metabolismului respirator (ex: citocromi)
3. Este sediul majoritatii activitatilor enzimtice ale celulei bacteriene (ex: intervine activ in
procesele de biosinteza)
4. Rol in divicunea celulara, contribuind la formarea septului tansversal
5. Implicata in chemotaxie prin receptorii de pe suprafata sa
6. Asupra membranei pot actiona anumite antibiotice (ex: polimixine)
9
10. Ribozomii, structura si rol
● Forma sferica
● Marimea depinde de concentratia ionilor Mg si K
● Dpdv chimic contin - 65% ARNr
● Constanta de sedimentare = 70S → costituiti din subunitati
○ 30S
○ 50S
● Intre cele 2 subunitati e fomeaza un canal prin care trec moleculele de ARNm in cursul sintezei
proteice
Rol:
➔ esential in procesul de biosinteza proteica
➔ Initial are loc transcrierea informatiei genetice pe ARNm, care va transporta aceasta informatie
de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare
➔ Sinteza ARNm - catalizata de transcriptaza (ARN polimeaza ADN-dependenta)
➔ Traducerea mesajului genetic este realizata la nivelul ribozomilor de catre ARN, care pune la
dispozitie aminoacizii pe care ii transporta
➔ Succesiunea specifica a nucleotidelor este transpusa intr-o secventa specifica de aminoacizi care
intra in costitutia lantului polipeptidic din proteina in curs de formare
10
11. Mezozomii - Incluzii - Vacuole (in structura celulei bacteriene)
Mezozomii = invaginari ale membranei citoplasmatice de care raman legati
➢ Au structura chimica a membranei citoplsmatice
➢ Aceleasi functii in permeabilitate si respiratie
➢ Mai dezvolati la bacteriile gram-pozitive
➢ Cu un capat se pot fixa de materialul nuclar ⇒ favorizeaza distribuirea in mod egal a genomului
intre cele 2 celule fiice
➢ Rol si in formarea eptului transversal
Incluziile = formatiuni structurale inerte care apar in citoplasma la sfarsitul perioadei de restere activa
➢ Pot contine:
○ Polimeri anorganici (ex: corpusculii metacromatici ai genului Corynobacterium)
○ Substante anorganice simpl
○ Polimeri organici (rezervor e energie mai ales la germenii sporulati aerobi)
○ Lipide
Vacuolele = formatiuni sferice care contin diferite substante in solutie apoasa
➢ Au o membrana lipoproteica = tonoplast
11
12. Masa nucleara bacteriana - structura caracteristici
Masa nucleara
● Vine in contact direct cu citplasma
● Localizata in partea centrala a celulei
● Contine ADN
● Nu are nucleoli
Unicul cromozom bacterian este:
● Alcatuit dinr-o singura molecula de ADN dublu catenar
● Aspectul uni fir lung
● Inchis intr-un inel
● Replicat pe el insusi
● Replicarea CR bacterian se face printrun mecanism semiconserativ
Nucleul detine informatia genetica necasara proceselor vitale de crestere si multiplicare.
Codonul
● Dpdv functional = 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN
● Detine informatia genetica pentru a plasa intr-o anumita secventa un anumit aminoacid in lantul
polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor
Cistronul = subunitatea functionala a genei, capabila sa deterine independent sinteza unui lant
polipeptidic
Gena = o portiune a genomului, respectiv o anumita secventa de nucleotide dispue luniar
● Poarta inscrisa in structura sa informatia genetica necesara pentru sinteza unei proteine
specifice, structuale sau functionale (enzime)
12
13. Cum este inscrisa informatia genetica in genomul celulei bacteriene
Nucleul detine informatia genetica necasara proceselor vitale de crestere si multiplicare.
Codonul
● Dpdv functional = 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN
● Detine informatia genetica pentru a plasa intr-o anumita secventa un anumit aminoacid in lantul
polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor
Cistronul = subunitatea functionala a genei, capabila sa deterine independent sinteza unui lant
polipeptidic
Gena = o portiune a genomului, respectiv o anumita secventa de nucleotide dispue luniar
● Poarta inscrisa in structura sa informatia genetica necesara pentru sinteza unei proteine
specifice, structuale sau functionale (enzime)
13
15. Capsula bacteriana - structura, rol, localizare
Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care formează în jurul celulei
o matrice fibroasă, numită glicocalix:
La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană şi reprezintă capsula.
Există bacterii care deţin o capsulă:
➔ Bine definită
➔ Cu structură polizaharidică (S. pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc)
➔ Sau cu structură polipeptidică (Bacillus anthracis etc).
La alte bacterii, glicocalixul formează o reţea laxă de fibrile:
➔ Se pierde parţial în mediu
➔ Poate fi separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibilă, care nu este vizibilă la
microscopul optic.
Roluri:
1. factor de virulenţă, împiedicând fagocitarea bacteriei şi favorizând invazivitatea;
2. rezistenţă faţă de surfactanţi, anticorpi;
3. permite aderarea unor bacterii (rol de adezină);
4. barieră protectoare faţă de bacteriofagi, protozoare;
5. conţine substanţe cu specificitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K.
→ exemplu:
➢ în cazul S. pneumoniae există peste 90 tipuri antigenice capsulare
➢ la E. coli sau la Klebsiella pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare.
14
16. Flagelii bacterieni - structura, rol, localizare
Structura:
➔ Formaţiuni fine, alungite, flexibile
➔ Origine la nivelul corpusculului bazal
➔ Acesta este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate
ca două perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor
➔ Corpusculul bazal este plasat în perete şi membrana citoplasmatică
➔ Din punct de vedere chimic flagelul este de natură proteică (flagelina).
Roluri:
1. în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie,
asemănătoare unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia
opusă; „motorul” rotaţiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din ATP;
2. antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip);
3. în clasificarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând fi:
➢ monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae,
Pseudomonas aeruginosa;
➢ lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate);
➢ peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de exemplu E.
coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi.
15
17. Fimbriile bacteriene
16
18. Sporii bacterieni - structura, rol, localizare
● Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus).
● Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi
poate sute de ani.
Materialul genetic:
➔ este concentrat
➔ împreună cu apa legată, lipide, Ca++, Mg++, este înconjurat de un strat protector (membrana
sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale)
Roluri:
1. formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate transforma
într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi considerată una
dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de reproducere celulară
aşa cum se întâmplă la fungi sau paraziţi);
2. rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc.
17
19. Apa, substantele minerale si pigmentii in structura celulei bacteriene
Apa
● reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacterie.
● Există:
○ apă liberă (mediu de dispersie)
○ apă legată fizico-chimic cu diferite structuri
● Sporii au puţină apă, în special apă legată
● Bacteriile sunt fiinţe „acvatice” prin excelenţă
● Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă
○ Au o membrană lipoproteică numită tonoplast
○ Au fost descrise în special la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în plutirea
acestora.
Roluri:
1. Apa reprezintă un mediu de dispersie
2. Este reactiv în reacţiile metabolice
3. Reprezintă etapa finală a unor reacţii oxidative etc.
● Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp îndelungat.
● O metodă des utilizată datorită eficienţei sale este liofilizarea (criodesicarea).
● Studiile ştiinţifice au arătat că, în general, germenii Gram-negativi rezistă mai puţin timp
liofilizării decât cei Gram-pozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subţire de
peptidoglican.
Substantele minerale
18
○ Compoziţia chimică a mediului
● Unele elemente intră în compoziţia diferitelor structuri (exemplu sulful intră în structura
aminoacizilor, fosforul în structura fosfolipidelor etc).
Roluri:
1. favorizează schimburile cu mediul
2. participă la reglarea presiunii osmotice
3. pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului difteric, care
condiţionează şi producerea de toxine)
4. activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a potenţialului de
oxido-reducere.
Aşa cum am menţionat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg++ şi K+ .
Pigmentii
● Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene şi este dependentă de condiţiile de
cultivare.
● Producerea de pigmenţi poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. în cazul tulpinilor de
Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus).
● In cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ şi nu vom clasifica drept
„patogenă” o tulpină de stafilococ în funcţie de „culoarea” coloniei.
● Stafilococii sunt condiţionat patogeni.
● Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat în mod
obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacienţi.
19
Datorită producerii de pigmenţi (albastru, galben-verde, maro etc. în cazul Ps. aeruginosa sau auriu,
citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se poate orienta în alegerea
testelor de identificare într-un anumit context clinic şi microbiologic.
Roluri
1. de protecţie faţă de radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi)
2. antibiotic (exemplu piocianina elaborată de P. aeruginosa faţă de B. anthracis)
3. Enzimatic
Glucidele
Proteinele
Există:
● proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic)
● proteine complexe, cum ar fi:
○ mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din
structuri de tip capsular)
○ cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi)
○ nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici).
20
Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic,
precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare biochimică a bacteriilor faţă de
acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice).
Lipidele
● Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor
● variază cantitativ în funcţie de:
○ Specie
○ vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un semn de
degenerescenţă)
○ compoziţia mediului.
● La mycobacterii, sunt în cantitate mai mare (circa 20-40%), în special la nivel parietal şi
determină o serie de proprietăţi specifice, inclusiv afinitatea tinctorială.
● Lipidele se pot găsi:
○ libere în vacuole
○ Combinate
○ Făcând parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi).
21
21. Substante cu actiune antibiotica produse de bacterii
● plasmidul „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra
altor bacterii receptive înrudite, de exemplu:
○ colicinele elaborate de E. coli
● unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice, de exemplu:
○ B. licheniformis produce bacitracina
○ B. brevis sintetizează gramicidina
○ B. polymyxa sintetizează polimixina
○ Vitaminele bacteriene
Generalitati
Nutriţia bacteriană = suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale convertibile
în energie şi în diferite componente celulare
Nutrienţii = substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în
reacţiile metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară.
22
În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:
➔ bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii)
➔ bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic şi trăiesc la
întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).
În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază
➔ bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie anorganică
➔ bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici.
● Majoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante pentru om,
sunt chimiosintetizante, heterotrofe.
● Se diferenţiază în funcţie de tipul respirator.
● Există şi bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă.
○ Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din
genurile Rickettsia şi Chlamydia, care depind nutriţional de o gazdă vie).
● Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma:
○ Proteine
○ acizi nucleici
○ Polizaharide
○ lipide.
23
● secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este determinată:
○ fie după un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine)
○ fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide.
● După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează ⇒ structuri supramoleculare:
○ Ribozomi
○ Perete
○ Flageli
○ Pili etc.
● Rata sintezei macromoleculelor şi activitatea căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o
permanentă balanţă a biosintezei).
Microorganismele = un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de căi metabolice
● de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu,
benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi reglată de mai multe sisteme
de control.
● Principiul determinant pentru căile metabolice este acela al organizării unui număr relativ mic
de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine specifică.
● Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de la care se
porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari.
● Principiul determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc
numai când activitatea lor este necesară.
● Activitatea unei enzime poate fi modificată variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care
acţionează.
○ În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori
specifici (metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).
○ De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este
(poate fi) inhibată de produsul final al căii respective.
○ O astfel de inhibiţie nu poate depinde de competiţia pentru situsul de legare al enzimei
la nivelul substratului.
○ Inhibiţia depinde de faptul că enzimele reglatoare sunt alosterice.
24
○ Fiecare enzimă are:
■ un situs catalitic de legare cu substratul
■ unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite
efectori).
○ Legarea unui efector de situsul său duce la o modificare conformaţională a enzimei ⇒
afinitatea situsului catalitic:
■ ↓ (inhibiţie allosterică) sau
■ ↑ (activare allosterică).
● Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună ⇒ deplasare
liniară
● La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se dau peste cap”)
● Acest comportament face posibilă chemotaxia = o celulă care se îndepărtează de sursa
atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent în comparaţie cu una care
se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa înspre atractant.
○ Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de receptori
specifici localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi la
transportul membranar al acelei substanţe).
○ Celula bacteriană este prea mică pentru a fi capabilă să detecteze existenţa unui
gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat experimental că detectează gradienţii în
timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe scade în timp ce bacteria se
îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie de sursă)
● Anumiţi compuşi acţionează ca:
○ respingători (R)
○ atractanţi (A).
● Un mecanism care ar explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv
demetilarea unei proteine specifice din membrană, care depinde de GMPc.
● Atractanţii produc o inhibiţie tranzitorie a demetilării acestei proteine.
● Respingătorii stimulează demetilarea.
25
Transducţie senzorială = mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca
răspuns la o modificare de mediu
● Aceasta pare să fie responsabilă de:
○ Chemotaxie
○ aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2)
○ fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină)
○ deplasarea spre acceptorul de electroni etc.
Respiraţia = suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de energie.
● Mecanismul de bază este reprezentat de:
○ oxido-reducerea biologică (pierderea ionilor de hidrogen sau a electronilor) de către o
substanţă chimică (donor)
○ transportul lor pe molecula unei alte substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a
doua se reduce: AH2 + B <=> A + BH2).
În funcţie de natura acceptorului final, respiraţia poate fi
➔ Aerobă
➔ Anaerobă
26
NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin mononucleotid);
FAD (flavin adenin dinucleotid).
Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată cu partea
terminală a lanţului respirator.
● Acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanţă anorganică diferită de oxigen
sau de orice substanţă organică (fermentaţia)
● Fosforilarea se face la nivelul substratului
● Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezultă prin fermentaţia
zaharidelor
○ reprezintă un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere taxonomic
şi biochimic.
○ Etapele fermentaţiei sunt mai reduse
○ câştigul energetic este mai mic.
○ Rolul biologic al fermentaţiei este reprezentat de producerea energiei şi nu de
obţinerea unor produşi finali.
Sinteza ATP-ului
● Se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de fosforilare.
● În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată
cu partea terminală a lanţului respirator.
● În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii fiind
metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia).
● Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
● Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
27
● Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie.
Tipul respirator
În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din mediu,
bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale:
➢ strict aerob → bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă numai în prezenţa unei
presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic.
○ Aceste bacterii posedă catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface
H2O2 toxic pentru celula bacteriană)
○ utilizează numai procese de respiraţie
○ Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în medii lipsite
de oxigen, dacă în mediu sunt prezenţi nitratul sau nitritul;
➢ strict anaerob → bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum,
Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absenţa O2.
○ Nu pot supravieţui în prezenţa O2, care nefiind redus are o acţiune bactericidă.
○ Nu au catalază, peroxidază (care acţionează asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2).
○ Aceste bacterii folosesc pentru obţinerea energiei numai procese de fermentaţie.
○ Pentru cultivarea lor este necesară utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte
scăzut.
➢ aerob facultativ anaerob → bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvoltă mai bine în
mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, în
funcţie de potenţialul redox.
○ Majoritatea au catalază sau citocromoxidază, dar nu au peroxidaze flavoproteice.
○ În acest tip se încadrează majoritatea bacteriilor studiate.
➢ anaerob microaerofil → bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează mici cantităţi de O2.
28
24. Definiti factorii de crestere bacterieni; exemple
Factorii de creştere = metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza substanţelor
care se găsesc în mediul extern.
● Trebuie neapărat incluşi în mediul de cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul
respectiv, numit „microorganism pretenţios” (ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de
izolare pentru Haemophilus influenzae).
25. Clasificati bacteriile in functie de temperatura optima de dezvoltare;
exemple
29
➢ termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la temperaturi
apropiate de 95ºC, ca de ex. Thermus aquaticus).
○ Bacteriile termofile sunt adaptate să reziste la temperaturi de peste 60°C printr-o
varietate de modalități.
○ Acizii graşi din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grași saturaţi, permiţând
membranelor să rămână stabile şi funcţionale la temperaturi ridicate.
➢ extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi o
temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene.
Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile.
Această cale de biosinteză are o importanţă particulară în medicină, oferind şi baza acţiunii selective a
unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină, cicloserină etc).
Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele nu sunt izotone cu fluidele organismului.
● În interiorul lor presiunea osmotică este foarte mare
● Viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular.
30
Orice compus care inhibă o etapă în biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în creştere va putea
produce liza bacteriană (efect bactericid).
27. Definiti notiunea de cultivare a bacteriilor; enumerati pe ce substraturi se
realizeaza
Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient să
obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior să îi putem studia
diferitele caractere în vederea identificării.
Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii.
Termenul „însămânţare” defineşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un mediu
de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales animale de
experienţă folosim termenul „inoculare”.
Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură = medii solide sau lichide care
asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene
Cultură bacteriană = totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă
31
Substraturi pe care se realizeaza cultivarea bacteriilor:
● Medii speciale:
○ Mediul electiv → contine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltarii unei anumite
bacterii (ex: mediul Loffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric)
○ Mediul selectiv → inhiba dezvoltarea altor bacterii decat cea a carei izolare se
urmareste (ex: mediul cu telurit de K pt izolarea bacilului difteric)
○ Mediul de imbogatire → favorizeaza inmultirea anumitor bacterii patogene, inhiband
dezvoltarea florei de asociatie dintr-un produs patologic (ex: mediul hiperclorurat
pentru stafilococ)
○ Mediul diferential → contine un anumit substrat care poate fi sau nu metabolizat,
determinand modificarea culorii sau aspectului culturii (ex: agarul cu albastru de
brom-timol lactozat - AABTL- care diferentiaza bacteriile lactoza-pozitive -cu este E.coli-
de bacteriile lactozo-negative - Salmonella)
● Colonia izolata
32
28. Definiti notiunea de crestere si multiplicare bacteriana
Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule.
● Deoarece creşterea volumului celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul
creşterii se ajunge la un punct critic.
29. Definiti notiunea de mediu selectiv, electiv si imbogatire; exemple
Mediul electiv
● conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite bacterii
● de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric
Mediul selectiv
● Inhiba, prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene dezvoltarea altor bacterii decât cea a
cărei izolare se urmăreşte.
● De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii în care
includem antibiotice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă)
Mediul de îmbogăţire
● favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea florei de asociaţie
dintr-un produs patologic.
● Funcţionează concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu electiv
● de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de îmbogăţire utilizate pentru
izolarea Salmonella typhi
33
30. Definiti notiunea de mediu diferential; exemple
Mediul diferenţial
● conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu metabolizat,
determinând modificarea culorii sau aspectului culturii.
● Exemple:
○ agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile
lactoză-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella)
○ ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză)
○ TSI (3 zaharuri şi fier)
○ MIU (mobilitate indol uree)
31. Ce este o colonie bacteriana? Cum se pot obtine colonii bacteriene izolate?
Colonia = totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene.
● Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii.
● O colonie este o clonă bacteriană.
Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin dispersie (cu ansa
bacteriologică sau cu tamponul).
● După prelevarea cu ansa a unei porţiuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura
unui viitor poligon
● se resterilizează ansa
● se verifică temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă neînsămânţată, cât mai periferic
● cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului
● se resterizează ansa şi se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge
prima latură
● În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după trecerea timpului
necesar multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate
34
Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare pentru
dezvoltarea culturii.
● Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia unei culturi în circa 18-24 de ore
de incubare la temperatura optimă de dezvoltare (asigurată în termostat) pentru că timpul de
generaţie este de circa 30 minute.
● Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz cultura devine
pozitivă în 2-8 săptămâni.
● Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care
s-au adăugat ingrediente cu activitate reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că
dacă transportul nu se face în condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat
indiferent de mediile utilizate
● Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial.
● Dinamica reală a populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie caracterizată
printr-o curbă la care distingem patru faze:
○ faza de lag;
○ faza de multiplicare logaritmică;
○ faza staţionară
○ faza de declin
35
○ sunt foarte sensibile la antibiotice.
➢ durează aproximativ 2 ore
➢ este aparent dependentă de o varietate de factori incluzând:
○ dimensiunea inoculului,
○ timpul necesar pentru a-şi reveni din şocul fizic datorat transportului,
○ timpul necesar pentru sinteza coenzimelor esenţiale sau a factorilor de diviziune
○ timpul necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza
substratul prezent în mediu.
Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva mai mari)
● citoplasma este intens bazofilă
● Omogenă
● lipsită de incluzii.
Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice.
➢ Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor
➢ sau pentru recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri.
➢ durează aproximativ 2-3 ore.
3.Faza staţionară
➢ Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor care sunt
distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de creştere devine nulă.
➢ Germenii au morfologia caracteristică speciei
➢ în această fază realizăm identificarea germenilor.
➢ Apar incluziile caracteristice.
➢ La speciile sporogene începe formarea sporilor.
➢ Durează aproximativ 2-3 zile.
36
➢ bacteriile sunt distruse progresiv
➢ se produc şi enzime autolitice
➢ rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi butiric sau glicogenul) se consumă
➢ pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul celular.
➢ Unele bacterii pot persista 2-3 luni.
➢ În acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare şi se exprimă o serie de gene care duc
la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durată limitată de timp.
➢ La speciile sporogene, fenomenul de sporogeneză devine foarte intens.
33. Aspectele culturilor bacteriene pe medii solide; coleratii intre acestea si
patogenitatea; exemple
Condiţiile de cultivare + aspectul culturii = caractere cheie în identificarea bacteriilor.
● Aspectul coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri definitive de
specie (dar au utilitate în contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi în contextul
general al diagnosticului de laborator, care la rândul său trebuie să aibă loc într-un context în
care punem în balanţă şi alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea între medicii de diferite
specialităţi este esenţială).
● Se examinează:
○ dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici, sub 1
mm),
○ conturul (circular, lobat, zimţat),
○ relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),
○ suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă),
○ culoarea (pigmentate, nepigmentate),
○ opacitatea (transparente, opace),
○ Consistenţa,
○ aderenţa la mediu,
○ prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge).
37
Colonia S (smooth)
➢ are suprafaţă bombată şi netedă,
➢ margini circulare
➢ adesea aspect strălucitor.
➢ Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie salină fiziologică.
➢ Germenii capsulaţi îşi păstrează capsula.
➢ Virulenţa este conservată.
➢ Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S:
○ S. aureus
○ S. pyogenes
○ E. coli
38
➢ Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi şi de tip S şi de tip M.
● În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom putea obţine
colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”).
● Cultura se întinde pe toată suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive.
● Fenomenul de „invazie” poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri biliare,
tiosulfat de sodiu etc.
34. Aspectele culturilor bacteriene pe medii lichide; corelatii intre acestea si
patogenitatea; exemple
● Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l.
● Bacteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului.
● Ca un aspect particular, în apa peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl”
la suprafaţa mediului.
○ În acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5.
● Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen mediul
(majoritatea bacteriilor).
● Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă.
○ Pot lăsa mediul limpede, formând flocoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa
mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos)
39
steril şi evacuare a unei cantităţi corespunzătoare de cultură (de exemplu în dispozitivul
numit chemostat sau turbidostat).
Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, aflat în concentraţie mai
redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii.
➢ Mediul de cultură proaspăt este admis în vasul de cultură în ritmul în care este consumat
factorul limitant, iar cultura este evacuată cu acelaşi ritm.
➢ Cultura este menţinută astfel la o valoare constantă şi submaximală ratei de creştere, reglată
prin factorul limitant.
➢ Chemostatele sunt foarte utile pentru obţinerea de tulpini mutante pentru că după ce rata de
multiplicare a fost determinată şansa de selectare a acestor tulpini este mai mare
În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue.
36. Definiti notiunile de asepsie si antisepsie; exemple de antiseptice; aplicatii
Asepsie = anasamblul de metode prin care evitam contaminarea mediului ambiant cu germeni
microbieni sau prin care putem mentine “sterilitatea” tesuturilor, mediilor de cultura, medicamentelor
injectabile etc.
Antisepsie = inlaturarea sau distrugerea formelor vegetative (nu spori) microbiene de pe tegumente,
mucoase sau din plagi
➔ Se realizeaza cu ajutorul substantelor antiseptice
Antisepticele → se utilizeaza pentru dezinfectia tegumentelor si mucoaselor si/sau a mainilor
● Exemple:
➔ Alcoolul etilic 70%
➔ Diferiti derivati halogenati
➔ Hipermanganat de K 1%o → utilizat in antiseptizarea mucoaselor
➔ Peroxid de oxigen sol 3% in apa → utilizat in atiseptizarea plagilor
➔ Rivanol
➔ Tincturi de iod 5%
40
➔ KMnO₄ 0,1%
Atat in cazul antisepticelor, cat si in cazul denzifectantelor este important ca subsanta utilizata:
➔ Sa aiba concentratia corespunzatoare
➔ Sa fie aplicata pe o durata de timp corespunzatoare
➔ Sa se afle in termenul de garantie
Aceeasi substanta chimica (ex: cloramina) poate intra in categoria antisepticelor sau in categoria
dezinfectantelor, in functie de concentratie.
37. Definiti notiune de sterilizare si dezinfectie; exemple de dezinfectante;
aplicatii
Sterilizare = distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme
vegetative sau spori, de pe o suprafata sau dintr-un mediu (lichid sau solid)
Dezinfectie = distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori si a sporilor) din anumite medii
(lichide, solide) sau de pe suprafete
41
38. Antiseptice si dezinfectante. Mecanisme de actiune
Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă, alterând structuri
şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.
➢ Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase.
➢ Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii. O parte dintre
dezinfectante au efect sterilizant.
Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de acţiune, după cum
urmează:
A. Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid):
➢ Acizii
➢ Bazele
➢ Alcoolii şi derivaţii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70º, folosit pentru
antiseptizarea tegumentelor).
B. Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):
➢ hipermanganatul de potasiu, KMnO7 1‰, util în antiseptizarea mucoaselor,
➢ peroxidul de hidrogen, H2O2, soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor,
➢ halogenii (Cl2, I2, Br2) şi derivaţii lor (hipocloriţi, cloramine, soluţii iodurate etc.
○ Există și diferite clase de compuşi halogenaţi cu potență mai mare, cum ar fi cei
care au în componenţa lor radicalul benzil -C6H5.
○ Indiferent de substanța folosită este necesară realizarea concentraţiei
corespunzătoare.
C. Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):
➢ metale grele [sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu
merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ),
➢ sărurile de argint,
➢ compuşi de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide],
➢ grupările alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa),
42
➢ oxidului de etilen (C2H4O) etc.
Sterilizarea prin căldură umedă = cea mai eficientă metodă de sterilizare
● Are ca mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor.
● Se poate folosi pentru:
○ diferite substanţe în soluţie,
○ sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor),
○ instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac),
○ medii de cultură,
○ aparate de filtrat etc.
43
I. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi pentru unităţile
sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat.
● Vaporii de apă realizează
○ la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC,
○ la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC
○ la 2 atmosfere o temperatura de 134ºC
● Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un capac
prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt comprimaţi
la presiunea necesară în vederea sterilizării
● Există mai multe tipuri de autoclave:
○ autoclave cu perete simplu
■ Verticale
■ Orizontale
○ autoclave cu manta de aburi
■ Verticale
■ Orizontale
Autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung
în camera de sterilizare de jos în sus
● Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru.
● Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete:
○ unul superior (robinetul de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul
exterior)
○ unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan).
● Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite evacuarea
vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă.
● În momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi
aflaţi sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului
până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior.
● Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un
spaţiu în care se află sursa de căldură.
44
● În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă de metal
perforată
● Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este perforată permite
trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei.
● În vederea sterilizării se procedează astfel:
○ verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o
distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează
(recomandabil se va utiliza apă distilată);
○ aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător;
○ închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat
autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;
○ conectăm sursa de căldură;
○ deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul
cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori,
vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge
temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;
○ închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori;
○ presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului; atunci
când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în
aşa fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30
minute) ;
○ după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se
răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice;
○ deschidem lent robinetul de vapori;
○ deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;
○ lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;
○ atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate.
II. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) = o metodă de sterilizare prin căldură umedă care evită
depăşirea unei temperaturi de 100ºC.
● Substanţele de sterilizat se menţin la 56-100ºC timp de 30-60 minute, 3 până la 8 zile succesiv.
● Astfel, utilizând medii care permit germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt
distruse formele vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor.
45
● În ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele vegetative rezultate din germinarea
sporilor iar după răcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc.
● Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate:
○ autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu se
va depăşi în interior temperatura de 100ºC),
○ băi de apă
○ băi de nisip.
● Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.
III + IV. Pasteurizarea şi fierberea → nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anumite
situaţii.
Pasteurizarea:
● foloseşte căldura umedă
● are aplicaţii în conservarea pentru scurtă durată a unor alimente (lapte, bere etc).
● Există:
○ o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65ºC),
○ o pasteurizare medie (15 minute la 65-75ºC)
○ o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-90ºC).
● Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.
Fierberea:
● poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar
mecanismul de acţiune este denaturarea proteinelor.
● Fierberea timp de 30 minute la 100oC, distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile,
dar nu şi sporii bacterieni.
● Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă.
● Eficienţa acestei metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%.
46
40. Autoclavarea - principiu; parametrii tehnici; utilizari
Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi pentru unităţile sanitare
în general, indiferent de sistemul public sau privat.
● Vaporii de apă realizează
○ la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC,
○ la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC
○ la 2 atmosfere o temperatura de 134ºC
● Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un capac
prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt comprimaţi
la presiunea necesară în vederea sterilizării
● Există mai multe tipuri de autoclave:
○ autoclave cu perete simplu
■ Verticale
■ Orizontale
○ autoclave cu manta de aburi
■ Verticale
■ Orizontale
Autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung
în camera de sterilizare de jos în sus
● Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru.
● Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete:
○ unul superior (robinetul de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul
exterior)
○ unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan).
● Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite evacuarea
vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă.
● În momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi
aflaţi sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului
până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior.
47
● Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un
spaţiu în care se află sursa de căldură.
● În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă de metal
perforată
● Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este perforată permite
trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei.
● În vederea sterilizării se procedează astfel:
○ verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o
distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează
(recomandabil se va utiliza apă distilată);
○ aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător;
○ închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat
autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;
○ conectăm sursa de căldură;
○ deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul
cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori,
vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge
temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;
○ închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori;
○ presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului; atunci
când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în
aşa fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30
minute) ;
○ după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se
răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice;
○ deschidem lent robinetul de vapori;
○ deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;
○ lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;
○ atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate.
48
41. Sterilizarea prin caldura uscata; metode, presiune, temperatura, aplicatii
Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene.
Amintim câteva dintre variantele tehnice:
I. Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă („la roşu”) = introducerea şi menţinerea în flacăra
becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care urmează a fi sterilizat.
● Se poate aplica pentru:
○ ansa bacteriologică (cu buclă sau fir)
○ pentru spatulă
● Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge
temperatura de incandescenţă.
○ se aplică pentru:
■ Portansă
■ gâtul unui recipient de sticlă (tub, eprubetă, flacon etc)
■ capilarul pipetelor Pasteur
○ nu reprezintă sterilizare.
II. Sterilizarea cu aer cald → se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur)
● Etuva este o cutie metalică cu pereţi dubli.
● Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se obţine şi menţine temperatura
pentru sterilizare.
● Uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de
ventilaţie
● Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă trebuie să
atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore.
● Pot exista și alte variante, de exemplu în funcție de dimensiunea obiectelor de sterilizat.
● Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru:
○ obiecte de sticlă,
○ obiecte de porţelan,
49
○ pulberi inerte şi termostabile,
○ uleiuri anhidre,
○ instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menţionat faptul că
repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc
● Nu se vor steriliza în etuvă:
○ soluţiile apoase,
○ obiectele de plastic,
○ obiectele de cauciuc,
○ vată, bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile,
○ materiale contaminate din laborator.
42. Congelarea si liofilizarea bacteriilor - definitie, efecte asupra viabilitatii
germenilor, aplicatii
● Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic.
● La temperaturi scăzute:
○ reacţiile biochimice încetinesc,
○ multiplicarea poate fi stopată.
● Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (menţinând viabilitatea
germenilor şi încetinind în acelaşi timp multiplicarea acestora) la o temperatură de circa 4ºC.
● O serie de culturi pot fi de asemenea menţinute la temperatura frigiderului pentru o durată
limitată de timp în vederea prezervării şi posibilităţii de a repeta anumite teste de identificare
etc.
50
În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele posibile efecte
asupra structurilor celulare bacteriene:
A. Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC
● efecte bactericide prin:
○ formarea de cristale de gheaţă
○ hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;
C. Liofilizarea (criodesicarea) = congelarea bruscă concomitent cu desicaţia (deshidratarea în vid).
● O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi păstrată în fiole închise timp
îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).
51
2. Coada fagului:
➢ are structură proteică,
➢ simetrie helicoidală;
➢ rol de adsorbţie, ajutând fagul să penetreze bacteria.
➢ Se descriu următoarele formaţiuni:
○ cilindrul axial;
○ teaca cozii;
○ placa bazală (cu croşetele de fixare);
○ fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).
Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în studierea înrudirii
dintre diferiţi bacteriofagi.
Relaţii bacteriofag-bacterie:
● Între bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii:
○ de tip litic sau productiv
○ de lizogenizare sau de tip reductiv
● Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori.
1. Adsorbţia:
➢ Ataşarea este specifică.
➢ Există receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc receptori de la
nivelul bacteriei.
➢ Fixarea pe receptori este iniţial reversibilă (prin fibrele cozii), apoi ireversibilă (prin
croşetele plăcii bazale).
➢ Adsorbţia fagică modifică permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene.
52
2. Penetrarea:
➢ Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele bacterian.
➢ Teaca cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian, ducând apoi
la injectarea ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană;
3. Multiplicarea:
➢ După aproximativ 4-5 minute, funcţia ADN-ului bacterian este blocată şi preluată de
ADN-ul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii.
➢ Se sintetizează un număr însemnat de proteine virale.
4. Maturarea (ansamblarea) fagului
5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) şi eliberarea
bacteriofagului matur, virulent.
Bacteriile lizosensibile permit adsorbţia, penetrarea şi multiplicarea fagilor virulenţi până la realizarea
lizei celulei bacteriene.
53
○ plajele produse de bacteriofagii virulenţi sunt clare, în comparaţie cu plajele mai puţin
clare produse de bacteriofagii temperaţi (fagii virulenţi sunt acei bacteriofagi care nu
pot evolua decât în ciclul litic)
● Bacteria a devenit lizogenă, se reproduce şi transmite descendenţilor fagul latent (profag, fag
temperat).
● În anumite condiţii profagul poate deveni fag virulent.
● Fagul temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat
(K12).
54
● Bacteriile lizorezistente nu permit infecţia cu un fag:
○ fie datorită lipsei receptorilor specifici,
○ fie datorită unei stări de imunitate.
● Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenţi omologi profagului găzduit.
● Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se reactivează).
Legături fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al moleculei
adiacente ⇒ formeaza o catenă lungă polinucleotidică
Prin analiza compoziţiei în baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există
o anumită compoziţie care diferă la diversele specii.
Compoziţia de nucleotide a ADN-ului este surprinzător de variabilă:
● Suma procentuală a citozinei şi guaninei variază
○ la bacterii de la 22% până la 74%
○ la organismele eucariote intervalul este ceva mai restrâns (28 - 58%)
○ la om variază între 39-40% în funcţie de tipul de ţesut (timus 39%; ficat 39,4%).
● Acest fapt se explică prin evoluţia în decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ
cu a eucariotelor în general şi a omului în particular.
Comparaţiile conţinutului de C+G ale diferitelor organisme și microorganisme au fost folosite drept
fundament în vederea stabilirii relaţionării/legăturii genetice.
55
Timina fiind susceptibilă la alterări fotochimice (lumină UV):
● bacteriile cu un conţinut bogat de C+G este posibil să fi evoluat în medii supuse unei lumini
solare foarte puternice sau unor temperaturi înalte
● cele cu conţinut redus de C+G s-ar fi dezvoltat în locuri mai protejate.
Așadar, compoziţia în baze azotate, numită şi procentul de C+G, este diferită în funcţie de specie, dar se
păstrează constantă în cadrul unei anumite specii.
ADN-ul:
● apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele şi
complementare răsucite în dublu helix.
● Cele două catene sunt unite prin punţi de hidrogen formate între bazele azotate opuse (A=T şi
G≡C).
● Modelul structural al ADN-ului a fost propus de către Watson şi Crick în anul 1953.
56
● Complementaritatea bazelor azotate este cea mai importantă proprietate a acizilor nucleici şi
condiţionează toate proprietăţile ADN-ului, mai ales
○ cea de autoreplicare
○ cea de transfer al informaţiei genetice.
La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiţii fiziologice normale, datorită
legăturilor intercatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G)
➢ Dacă temperatura depăşeşte 65ºC
○ stabilitatea punţilor de hidrogen începe să cedeze
○ dublul helix începe să se desfacă
○ rezultă două catene complementare (proces numit denaturare termică)
➢ Denaturarea devine completă la temperaturi care depăşesc valoarea de 90ºC.
57
Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite:
➢ fie în tehnologia ADN-ului recombinant
➢ fie în studierea relaţiilor filogenetice între diferite specii
Cu cât speciile sunt mai înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un mai mare grad de similitudine
(lanţurile lor monocatenare renaturează mai rapid).
Replicarea ADN
● constă în sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula parentală şi identice între ele,
pe bază de complementaritate (replicare semiconservativă).
● După ruperea legăturilor de hidrogen şi separarea celor 2 catene, fiecare catenă serveşte drept
matriţă pentru sinteza unei noi catene.
● este una dintre cele mai importante reacţii din lumea vie.
● Watson şi Crick au fost primii care au propus modelul semiconservativ de replicare a ADN.
În celula care se dezvoltă rapid, există posibilitatea ca înainte de terminarea primei replicări să se
iniţieze încă o replicare.
➢ În acest caz celula bacteriană va putea fi
○ merodiploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori decât
în mod normal)
○ poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori decît în mod normal).
58
În general, dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviziunea celulei (aşa cum se întâmplă
în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa cromozomilor supranumerari.
Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică diferită, pentru că ei
reprezintă copii ale cromozomului iniţial (deci sunt identici cu acesta).
In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite într-o unitate de replicare independentă
=replicon.
Indiferent dacă celula are mai mulţi cromozomi (celula eucariotă este diploidă) sau un singur cromozom
(celula procariotă), tot genomul trebuie să fie replicat.
Repliconul bacterian este bicatenar şi circular, caracterizat prin:
● o secvenţă nucleotidică specifică marcând începerea replicării;
● gene care codifică sinteza unor proteine specifice numite iniţiatori;
● o secvenţă nucleotidică semnal pentru terminarea replicării.
Exemple de repliconi:
● cromozomul şi plasmidele bacteriene;
● genomul bacteriofagilor.
Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi
● O genă structurală din cromozom are toată informaţia necesară sintezei iniţiatorului replicării
(o proteină complexă).
● După ce replicarea a început, nu mai poate fi oprită până în momentul când se ajunge la
dedublarea cromozomului.
● Cromozomul bacterian funcţionează ca un replicon, fapt dovedit de experienţa în care
fragmentele de ADN introduse într-o celulă bacteriană (de ex. prin conjugare) nu se pot replica
dacă rămân „libere” în citoplasmă, dar vor putea fi replicate odată cu întregul cromozom în
cazul în care sunt integrate în cromozomul bacterian.
Replicarea corectă este controlată de un mecanism foarte precis care:
➢ „identifică” apariţia de nucleotide libere, împerecheate eronat
➢ în momentul apariţiei unui astfel de eveniment nucleotidul este „tăiat”
➢ polimerizarea se opreşte (corectitudinea citirii este realizată cu ajutorul ADN-polimerazei I).
59
48.Plasmidele; definire, tipuri, roluri în celula bacteriană + 49.Factorul F şi
factorul R; definiţie, roluri
Genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici:
1. genele esenţiale, localizate în structura cromozomului bacterian şi
2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura:
→ plasmidelor şi
→ elementelor genetice transpozabile.
Plasmidele = elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic independentă de
cromozom (replicon), dar depinzând de factori codificaţi de nucleul bacterian.
● Conţin informaţie genetică neesenţială pentru viaţa celulei bacteriene.
● Sunt transmise stabil de-a lungul generaţiilor.
● Dimensiunea plasmidelor variază între 1kb şi circa 200 kb.
● Majoritatea sunt alcătuite din molecule de ADN circular, dar există şi plasmide liniare (ex. la
Borrelia burgdorferi).
● Plasmide:
○ ADN dublu catenar
○ ADN monocatenar (se consideră că plasmidele de ADN monocatenar reprezintă de fapt
o situaţie intermediară în cursul procesului de replicare; au fost detectate de ex. la
Staphylococcus aureus).
● Unele plasmide (numite şi epizomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în citoplasmă)
sau integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc).
● Celelalte plasmide persistă indefinit numai în stare autonomă (de exemplu plasmida R, Col, F
etc).
60
Clasificarea plasmidelor
În raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica în:
Plasmidele R
Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul sau la mai multe
antibiotice.
Plasmidele R au o structură genetică complexă, fiind alcătuite din:
➢ gene care asigură proprietatea de rezistenţă la antibiotice;
➢ gene care formează „factorul de transfer al rezistenţei” (RTF).
61
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducţia mediată de
bacteriofagi.
Plasmidele „Col”
● codifică proprietatea unor bacterii de a elabora substanţe antibiotice de tip special, numite
bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).
● sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin
○ transformare genetică,
○ transducţie fagică
○ sau prin conjugare.
Bacteriocinele:
● Sunt bactericide
● Au un spectru de activitate limitat (faţă de specia omologă)
● Biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare.
Bacteriile F-
● lipsite de factorul F
● echivalente unor celule „femele” care se comportă ca receptoare de material genetic.
62
Bacteriile F+
● deţin factorul F autonom în citoplasmă
● echivalente unor celule „masculine”, donoare de material genetic, capabile să transmită factorul
F.
Bacteriile F’
● deţin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate recombinant) care a fost anterior
integrată în structura unui cromozom şi s-a desprins din acesta, încorporând în structura sa
unele gene cromozomale
● au caracter de „mascul”
● se comportă ca donoare de material genetic (factorul F’).
50.Definiţi noţiunile de genom, genotip şi fenotip; variabilitatea genetică şi
fenotipică
Variabilitatea bacteriană presupune modificarea la un moment dat a comportamentului celulei
bacteriene sau a descendenţilor ei şi pot exista în principiu două variante:
➢ variabilitatea fenotipică
➢ variabilitatea genotipică;
63
Variaţiile fenotipice = modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se transmit
ereditar. Genomul nu este afectat.
Variaţiile genotipice = modificări definitive ale materialului genetic (cromozomial sau extracromozomial)
care se transmit descendenţilor.
Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de:
➢ mutaţie;
➢ transfer genetic urmat de recombinare genetică.
Mutaţia = o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene, ducând la modificări ale
mesajului genetic.
Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:
➢ Substituţii;
➢ Inversii;
➢ Inserţii;
➢ Deleţii.
Mutaţia spontană = Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor
decelabil
Mutaţia indusă = Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii
ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi mutageni
➢ Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.
Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon.
Mutaţiile extinse = alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta secvenţe mai mari ale
uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).
Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea acestora la tipul
iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.
64
Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a secvenţei
bazelor nucleotidice persistă.
Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie receptor
sunt:
➢ Transformarea;
➢ transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);
➢ conjugarea.
Transformarea = un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber provenit de la o
bacterie donor sau din alte surse.
● Bacteria receptor trebuie să fie „competentă” în a accepta ADN-ul de la bacteria donor.
● Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare la
virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb.
● Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a ciclului
celular.
● Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin recombinare
genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un caracter genetic
nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice).
● Unele bacterii sunt „competente” în mod natural.
● În cazul bacteriilor care nu sunt „natural competente”, pentru a putea realiza fenomenul de
transformare este necesară tratarea chimică a acestora, de ex. cu ioni de calciu.
65
53.Transducţia; definiţie, mecanism, tipuri de transducţie
= transferul unui fragment genetic (cromozomial sau extracromozomial) de la o bacterie la alta prin
intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag temperat).
● Fagul se numeşte transductor.
● Bacteria receptoare se numeşte transductant.
54.Conjugarea bacteriană
= un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau extracromozomial) realizat prin
intermediul unei legături intercelulare directe.
● Este condiţionată de prezenţa factorului F în celula donoare.
Receptorii specifici
● Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de suprafaţă
atât la celula donoare, cât şi la celula receptoare.
● Aceştia vor permite „recunoaşterea reciprocă”.
66
Fiziologia conjugării bacteriene
● După un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F+ formează cu bacteriile F- „perechi de
recombinare”
● între celulele alăturate se formează un canal de conjugare.
● Prin canalul de conjugare se realizează transferul unidirecţional al materialului genetic.
● Fragmentul transferat poate fi apoi integrat parţial sau total în genomul celulei receptoare,
ducând la apariţia unor proprietăţi noi ale acesteia, manifeste sau nu.
Antibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene = un grup de substanţe medicamentoase capabile să
distrugă sau să inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic în bolile infecţioase.
● Au o acţiune selectivă asupra celulelor microorganismelor, exercitând acţiuni minime asupra
celulelor organismului gazdă. Aceste substanţe pot fi:
○ Antibacteriene,
○ Antivirale,
○ Antifungice,
○ Antiparazitare.
În mod clasic, în această grupă de medicamente au fost incluse şi antineoplazicele (ex. dactinomycina,
doxorubicina, bleomycina).
Există și antibiotice folosite ca:
➢ inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini),
➢ imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizată de Tolypocladium inflatum),
➢ hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus),
➢ Insecticide,
➢ ierbicide etc
La începutul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de antibiotice şi
chimioterapice antiinfecţioase diferite.
67
Având în vedere utilizarea mai puţin raţională a acestor medicamente, Organizaţia Mondială a
Sănătăţii elaborează periodic o listă a medicamentelor esenţiale, inclusiv antibiotice şi chimioterapice.
68
Un antibiotic este bactericid dacă acţiunea sa duce la distrugerea bacteriilor
● Ex:
○ penicilinele,
○ cefalosporinele,
○ polimixinele,
○ aminoglicozidele,
○ rifampicina,
○ vancomicina,
○ streptograminele etc.
Trebuie cunoscute situaţiile patologice în care se poate administra un antibiotic bacteriostatic, precum
şi situaţiile în care este absolut necesară administrarea unui antibiotic cu efect bactericid (spre exemplu
la persoanele care prezintă imunodepresie).
a) Agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei peretelui celular
➢ au efect bactericid
➢ sunt reprezentaţi de:
○ antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme etc),
○ glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina),
○ bacitracina,
○ cicloserina,
○ fosfomicina,
○ izoniazida etc;
b) Agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea funcţiei membranei celulare
➢ au efect bactericid
➢ sunt reprezentaţi de
○ polimixine (polimixină B, colistin),
○ gramicidină,
○ tirocidină,
○ imidazoli,
○ nistatină,
○ amfotericină B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice);
69
c) Agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor
➢ de exemplu
○ aminoglicozidele,
○ tetraciclinele,
○ cloramfenicolul,
○ macrolidele,
○ lincosamidele (lincomicina, clindamicina),
○ acidul fusidic,
○ streptograminele etc;
d) Agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei acizilor nucleici
➢ de exemplu
○ rifampicina,
○ chinolonele,
○ sulfonamidele,
○ trimetoprimul,
○ pirimetamina,
○ novobiocina etc.
Antibioticele beta-lactaminice
● inhibă selectiv sinteza peretelui celular în mod diferit la bacteriile Gram-pozitive faţă de cele
Gram-negative (datorită diferenţelor dintre acestea în ceea ce priveşte structura peretelui).
● Pentru realizarea acestei acţiuni este necesară legarea de receptori celulari numiţi PBPs
(penicillin-binding proteins).
● Beta-lactaminele inhibă de exemplu reacţia de transpeptidare (de formare a punţilor peptidice)
între lanţurile adiacente de peptidoglican.
● Rezistenţa la beta-lactamice apare de ex. atunci când microorganismele produc enzime numite
beta-lactamaze, care „desfac” inelul beta-lactamic.
● Alte mecanisme de rezistenţă sunt reprezentate de:
○ alterarea porinelor din membrana externă (Gram-negativi) ceea ce afectează
transportul beta-lactaminelor către sediul de acţiune,
○ mutaţii care afectează structura PBSs şi respectiv afinitatea faţă de beta-lactamine etc.
70
Polimixinele (polimixina B, colistinul)
● acţionează selectiv pe membrana germenilor Gram-negativi, printr-un mecanism asemănător cu
cel al detergenţilor cationici deteriorând membrana.
● Se leagă şi de lipo-poli-zaharid şi acţionează asupra membranei externe a microbilor
Gram-negativi.
● Nu se recomandă (de primă intenţie) pentru administrare pe cale generală.
● Rezistenţa la polimixine apare rar.
71
● Acţionează pe:
○ germeni gram pozitivi
○ gram negativi,
○ spirochete,
○ mycoplasme,
○ rickettsii,
○ chlamydii.
● Printre reacţiile adverse amintim senzațiile de greaţă, voma, diareea, toxicitatea renală şi
hepatică, acumularea la nivel osos şi dentar.
Cloramfenicolul
● se leagă de subunitatea 50S a ribozomilor bacterieni
● inhibă peptidil-transferaza, interferând cu legarea de noi aminoacizi în lanţul peptidic în curs de
formare.
● Rezistenţa poate apărea de ex. prin sinteza de către bacterii a unei acetil-transferaze sau a unei
nitrat-reductaze.
● Acţionează pe germeni aerobi şi anaerobi gram pozitivi și gram negativi.
● Este un medicament bacteriostatic.
● Are indicații în abcesul cerebral, febra tifoidă, salmoneloze sistemice, infecţii severe cu
anaerobi.
● Printre reacţiile adverse cele mai grave la care poate să ducă enumerăm anemia aplastică cu
leucopenie şi agranulocitoză.
72
● Pot acționa pe specii de Mycobacterium.
● Au efect asupra
○ Treponema,
○ Mycoplasma
○ Chlamydia.
● Sunt indicate în infecţiile strectococice la bolnavii cu hipersensibilitate la betalactamine dar și în
difterie, tuse convulsivă, pneumonii atipice etc.
● Dintre reacţiile adverse amintim: greaţă, vomă, diaree, febră, rash, reacţii anafilactice.
Lincosamidele (bacteriostatice) acționează pe germeni gram pozitivi aerobi şi anaerobi şi pe
germeni gram negativi anaerobi.
Rifampicina
● inhibă creşterea bacteriană prin legarea de ARN-polimeraza ADN-dependentă.
● Acţionează pe:
○ mycobacterii,
○ coci gram pozitivi și gram negativi,
○ unii bacili gram negativi,
○ germeni anaerobi gram pozitivi și gram negativi.
● Dintre indicații putem menționa tratamentul tuberculozei, leprei, infecţiilor stafilococice
meticilino-rezistente sensibile (testarea sensibilității tulpinilor respective este necesară).
73
Sulfamidele (sulfonamidele)
● sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic (PABA)
● inhibă dihidro-pteroat-sintetaza.
● Se formează analogi nefuncţionali ai acidului folic, metabolismul celulei bacteriene fiind astfel
inhibat.
● Rezistenţa apare prin alterarea dihidropteroat-sintetazei scăzând capacitatea de legare a
sulfonamidelor şi este mediată plasmidic.
● Rezistenţa la un membru al familiei trebuie înregistrată ca rezistenţă şi faţă de celelalte
substanţe cu structură similară.
Trimetoprimul
● omolog al acidului dihidrofolic
● inhibă reductaza acestui acid.
Unele antibiotice, cum ar fi actinomicinele, sunt inhibitori eficienţi ai sintezei de ADN; dar realizează
această inhibiţie atât la nivelul celulei bacteriene cât şi la nivelul celulei animale, nefiind suficient de
selective pentru a putea fi utilizate în terapia antibacteriană.
74
58.Clasificarea antibioticelor după structura chimică; clase principale, exemple
a) Penicilinele:
➢ penicilinele naturale (de exemplu penicilina G);
➢ penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina,
flucloxacilina, nafcilina);
➢ aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina);
➢ alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul, ciclacilina,
epicilina);
➢ peniciline stabile în prezenţa unor beta-lactamaze produse de enterobacterii (temocilina; în
această categorie ar putea intra şi ampicilina, amoxicilina, ticarcilina şi piperacilina);
➢ peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina, azlocilina,
mezlocilina, piperacilina, apalcilina);
➢ alte peniciline şi inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic + amoxicilină /
ticarcilină, sulbactam + ampicilină, tazobactam + piperacilină);
b) Cefalosporinele
➢ din generaţia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina);
➢ din generaţia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima);
➢ din generaţia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona);
➢ din generaţia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma).
Cefalosporinele se mai pot clasifica şi în:
➢ cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc);
➢ cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola etc);
➢ cefalosporine care prezintă o mai bună stabilitate în prezenţa beta-lactamazelor (cefuroxima,
cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc);
➢ cefalosporine cu activitate faţă de Pseudomonas aeruginosa(ceftazidima, cefpiroma, cefepima,
cefoperazona, cefsulodimul etc).
75
c) Alte antibiotice beta-lactaminice
➢ monobactamii (de exemplu aztreonamul);
➢ penemii (de exemplu ritipenemul);
➢ carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina; cilastatina este
un inhibitor al dehidro-peptidazei);
➢ oxacefemii (ex. latamoxef);
➢ carbacefemii (ex. loracarbef).
3. Aminoglicozidele
➢ streptomicina (care este de fapt un oligozaharid);
➢ kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.;
4. Ciclinele
ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc
5. Ansamicinele
ex. rifampicina, rifabutina
6. Macrolidele
ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina
76
8. Antibioticele care nu se încadrează în nici una din grupele de mai sus
➢ Cloramfenicolul;
➢ lincosamidele (lincomicina şi clindamicina);
➢ acidul fusidic (cu o structură asemănătoare steroizilor);
➢ streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin);
➢ oxazolidinonele (linezolid);
➢ mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite în special ca răspuns la
apariţia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilină etc.
Chimioterapicele
1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul);
2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol)
3. Dapsona (diaminodifenilsulfona);
4. Ethambutolul;
5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida);
6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina, levofloxacina, moxifloxacina,
gatifloxacina, gemifloxacina etc);
7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina);
8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.
Rezistenţa microbiană la antibiotice = capacitatea unor microorganisme de a supravieţui şi de a se
multiplica în prezenţa antibioticului.
Pe măsură ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecţioase afectează
multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de acţiune al beta-lactaminelor) au
fost descoperite şi mecanismele prin care bacteriile pot rezista faţă de acţiunea medicamentului
antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc).
77
Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită.
a. Rezistenţa naturală (intrinsecă) = rezistenţa tuturor membrilor unei specii bacteriene faţă de
un antibiotic şi este determinată genetic
→ de exemplu rezistenţa bacilului tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) la
penicilina G.
b. Rezistenţa dobândită = acea rezistenţă necaracteristică unei specii bacteriene, dar achiziţionată
de anumite subpopulaţii din acea specie în circumstanţe date
→ de exemplu, antibioticul acţionează ca un presor selectiv (pacientul are o infecţie în
care majoritatea populaţiei bacteriene este sensibilă la agentul antimicrobian, dar
există tulpini care prezintă rezistenţă; în aceste condiţii, tulpinile sensibile vor fi
inhibate sau distruse în timp ce tulpinile rezistente vor fi „selectate”; această situaţie nu
poate fi detectată decât utilizând tehnicile de testare a sensibilităţii bacteriilor la
antibiotice şi chimioterapice, de ex. antibiograma difuzimetrică standardizată).
a. Rezistenţa cromozomială
● se poate dezvolta ca rezultat al unei mutaţii spontane, la întâmplare, la nivelul unui
locus ce controlează sensibilitatea faţă de un anumit produs antimicrobian (deleţie,
substituţie sau adiţie de bază).
● Prezenţa substanţei active antimicrobiene serveşte ca un mecanism selector,
suprimând organismele sensibile şi favorizând dezvoltarea unei populaţii provenite din
organismele mutante, rezistente la antibiotic.
● Mutaţia spontană apare cu o frecvenţă variind între 10-12-10-7.
● Mutaţiile cromozomiale:
○ sunt definitive,
○ afectează numai un anumit antibiotic sau o familie de antibiotice
○ se transmit vertical la toţi descendenţii suşei bacteriene devenite rezistentă.
○ Pot fi clasificate în
■ mutaţii într-un singur pas (single large step mutations) – o singură
mutaţie duce la creşterea CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la
78
eşuarea tratamentului atunci când acesta este instituit cu un singur
antibiotic
■ mutaţii în mai mulţi paşi (multistep mutations) – mutaţii secvenţiale
care duc la creşterea gradată a CMI.
b. Rezistenţa extracromozomială
● este mult mai frecventă decât cea cromozomială, reprezentând circa 90% din cazurile de
rezistenţă.
● În acest caz, transmiterea materialului genetic pentru rezistenţă se poate face:
○ transversal (orizontal),
○ la toţi membrii populaţiei bacteriene existente la un anumit moment dat, prin
plasmide, material plasmidic sau transpozoni.
B. Din alt punct de vedere, rezistenţa se poate manifesta:
➢ direct (leagă o anumită bacterie de un singur anumit antibiotic);
➢ încrucişat (rezistenţa unei bacterii faţă de mai mulţi agenţi antimicrobieni cu structură şi/sau
mecanism de acţiune asemănător);
○ de ex. rezistenţa la o sulfonamidă sau la o tetraciclină conferă rezistenţă la toate
sulfonamidele sau la toate tetraciclinele în timp ce stafilococii rezistenţi la meticilină
(MRSA) sunt rezistenţi la toate medicamentele beta-lactamice;
79
60.Antibiograma difuzimetrică; principiu, interpretare
= metoda de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la
bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită dezvoltarea optimă
a microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu pe agar Mueller-Hinton).
Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină bacteriană), chiar în
cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt:
A. Tehnicile calitative
o antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)
o antibiograma difuzimetrică comparativă
o antibiograma difuzimetrică standardizată
o antibiogramele difuzimetrice rapide
B. Tehnicile cantitative
o metoda diluţiilor în mediu lichid
o metoda diluţiilor în agar
o metoda microdiluţiilor în agar
o metoda „punctelor de ruptură”
o testul „E”
o metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.
● Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar
Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri.
● Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic,
a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (există şi alte variante tehnice).
● După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea
becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în
concentraţie standardizată.
80
● Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu
ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de
marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).
● Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul
unei pense le presăm uşor (după caz).
● După încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în
funcţie de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului testat.
● Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie în care
coloniile microbiene nu se dezvoltă
● Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil.
● Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se
dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent
● Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt numai
eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active,
pentru că tehnica nu este standardizată.
● Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de referinţă,
din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare).
● Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de
Staphylococcus spp.
● Tulpina de referinţă are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm.
● Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex.
calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul
de referinţă şi pentru microorganismul testat.
● Rezultatele se exprimă cu termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de
diametrul zonelor de inhibiţie a multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic
(jumătăţile de cerc se examinează comparativ).
● În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă inhibitorie) a microorganismului de
referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru microorganismul testat.
● Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale
marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie
81
microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care
dorim să realizăm testarea.
● Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la apariţia după incubare a unor colonii
foarte apropiate, dar care să nu fie confluente.
● Plasăm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste
noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm rezultatele.
● Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este
standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care
permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite
● Elementele necesare standardizării sunt:
○ mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă
corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)
■ există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor
microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa,
atunci când este testată sensibilitatea la aminoglicozide);
■ se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
■ există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor
microorganisme pretenţioase;
■ grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
○ inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să aibă
o turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108
unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
○ timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3
plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
○ concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea
microcomprimatelor (6 mm diametru);
○ alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
○ păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de
polietilenă, la +4°C);
○ utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
82
○ interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară
rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de
referinţă).
Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace ale antibioticului
la nivelul focarului infecţios.
61.Definiţi noţiunea de CMI şi CMB; cum se determină şi care este utilitatea
determinării CMI şi CMB ?
Metoda diluţiilor în mediu lichid → acest tip de metodă oferă informaţii cu privire la CMI ale
antibioticelor studiate, faţă de microorganismul testat.
CMI = concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică concentraţie de agent antimicrobian,
exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o acţiune bacteriostatică asupra germenului testat.
● Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion
Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 16
micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără
antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub).
● Preparăm un inocul standardizat turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10
tuburi cu câte 1 ml de inocul.
● Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20
ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura
frigiderului
● Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de
referinţă corespunzătoare. În ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele.
● Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia finală de
antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de 16 mg/ml, diluţia
finală va fi 8 mg/ml etc.).
● În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea, în tubul martor
menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezentă
83
● În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe
care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină.
● În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea
microorganismului corespunde CMI.
● Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie de specia microbiană) că
microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3 mg/ml vor fi eficient inhibate de către antibioticul
respectiv şi in vivo.
● CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite.
○ De ex. CMI la amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru
Staphylococcus aureus,
○ 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae,
○ 0,25 mg/ml pentru Haemophilus influenzae,
○ 2 mg/ml pentru E. coli,
○ 16 mg ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in vivo”) pentru Bacteroides fragilis
iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sau Chlamydia trachomatis
tulpinile sunt rezistente.
Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacităţii antimicrobiene a
unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infecţiilor severe (de exemplu
84
endocardite, meningite, sepsis etc), precum şi la imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este
indispensabilă.
Testul E: Determinarea CMI prin „E test”
„E test” = o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite microorganisme,
inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi.
● se aseamănă metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei difuzimetrice cu cele de
diluţie
● este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică permite determinarea valorii
CMI
● Din punct de vedere tehnic sunt necesare:
○ o placă Petri cu agar Mueller-Hinton,
○ inoculul standardizat
○ langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice în gradient
● Însămânţăm microorganismul care urmează a fi testat în condiţii standardizate şi depunem
radiar langhetele cu antibiotice
● Principiu:
○ Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca
turbiditate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit
microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri.
○ Benzile „E test” conţin un gradient de agent antimicrobian şi se aplică după
însămânţare.
○ În funcţie de antibiotic, gradientul „acoperă” un şir continuu de concentraţii între
0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml.
○ După incubare (timp de 16-18 ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică de inhibiţie.
Valoarea CMI se citeşte acolo unde creşterea bacteriană intersectează banda „E test”
● Materiale şi reactivi necesari:
○ plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8ºC până în momentul utilizării);
○ bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ şi 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizează câte 5
ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8ºC);
○ medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene necesare
efectuării controlului de calitate ;
○ tulpini martor;
85
○ inocul bacterian;
○ soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea inoculului
bacterian;
○ benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi
antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării. Modul
de prezentare a benzilor “E-test”); au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru prima
grupă) şi respectiv de 2-3 ani
○ tampoane sterile;
○ standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;
○ pipete Pasteur sterile;
○ Foarfece;
○ plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;
○ incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă îmbogăţită
cu CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;
○ sursă de lumină;
○ aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).
● Tehnica de lucru
A. Benzile „E test”
➢ scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la
temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu
mai observăm nici o urmă de umezeală
➢ înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există
perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai
pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o
foarfecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile
➢ scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi
le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat
➢ păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru a le
proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea
directă la lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C)
B. Inoculul bacterian:
➢ cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură
bacteriană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm
86
(există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore
până când obţinem densitatea dorită)
➢ ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un
standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate
ajusta la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii
inoculului nu garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plăcilor:
➢ introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim
de câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii
interiori ai tubului;
➢ depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim
complet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o
treime);
➢ lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile „E test”.
D. Aplicarea benzilor „E test”:
➢ luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus agentul
antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat cu E
(benzile trebuie să fie complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe
suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se foloseşte
aplicatorul „E test”, banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al
aplicatorului);
➢ aplicăm banda „E test” pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine
concentraţia cea mai mare aproape de marginea plăcii;
➢ dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă lucrăm
cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun la
distanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată cu E
trebuie să atingă marginea plăcii);
➢ banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule de aer
de sub bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în sus
pe gradient până la capătul notat cu E(prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul
testării);
➢ banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu mediul
de cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat); dacă
87
banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce şi
se pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau
un alt obiect, se poate folosi în continuare atât timp cât nu a luat contact cu o substanţă
lichidă.
E. Incubarea:
➢ timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent
antimicrobian ce urmează a fi testate;
➢ incubarea în atmosferă de CO2 modifică pH-ul mediului de cultură şi poate afecta
activitatea agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care
microorganismele supuse testării necesită pentru multiplicare CO2(Haemophilus spp.,
Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).
● Interpretarea rezultatelor:
○ putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape
confluentă
○ ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton); citim
valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”; dacă
am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-chocolate
Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de
lumină reflectantă şi o lupă;
○ pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a
hemolizei;
○ în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai
mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test”;
○ dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda „E
test”), valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai scăzută
a agentului antimicrobian de pe banda „E test”;
○ în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe
care îl notăm va fi valoarea cea mai mare;
○ raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul obţinut
pentru tulpina de referinţă (control de calitate);
○ rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards)
88
62.Definiţi noţiunile de simbioză, comensalism, parazitism; exemple
Patogenitatea = capacitatea unui germen de a declanşa în organismul gazdă fenomene morbide,
patogene, modificări locale, generale şi „functio laesa”.
● este un atribut de specie
● este determinată genetic.
Virulenţa = gradul diferit de patogenitate exprimat în cadrul unei specii.
● este un atribut al tulpinii microbiene agresoare.
Variabilitatea în exprimarea patogenităţii depinde de condiţiile în care trăieşte microorganismul
respectiv: de exemplu, o populaţie bacteriană care a pierdut virulenţa în condiţii nefavorabile poate
redeveni virulentă în anumite condiţii, aşa cum se întâmplă cu tulpina vaccinală BCG la pacienţii cu
infecţie HIV / SIDA
Virulenţa poate fi cuantificabilă de ex. prin numărul de microorganisme necesare în condiţii standard
pentru a omorî 50% dintr-un grup de animale (acest număr este numit DL50, adică doza letală 50%).
Factorii care condiţionează patogenitatea şi virulenţa unei specii (tulpini) microbiene pot fi:
➢ multiplicarea şi invazivitatea manifestată de germenii patogeni;
➢ multiplicarea şi elaborarea de toxine de către germenii toxigeni (în general „exotoxine”).
Agenţii cauzali ai bolilor infecţioase (microorganismele condiţionat patogene, dar mai ales germenii
patogeni) sunt foarte numeroşi. Ei se pot împărţi în următoarele grupe mari:
89
● virusuri = agent patogen care se reproduce numai în interiorul celulelor vii şi care provoacă boli
infecţioase numite viroze;
● chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplică în citoplasma
celulelor gazdă printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic;
● mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot trăi liber în natură şi care se pot dezvolta
pe medii artificiale îmbogățite;
● rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici decât bacteriile; de regulă nu se pot
cultiva în afara celulelor vii;
● bacterii propriu-zise;
● Fungi;
● protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor;
● metazoare.
● Temporar, tegumentul poate fi contaminat cu germeni coliformi, chiar stafilococi potențial
patogeni precum Staphylococcus aureus, însă fără manifestări nete de agresivitate.
90
○ Propionibacterium spp.,
○ Corynebacterium spp.
91
E. La nivelul tractului respirator
● Mucoasa nazală este întotdeauna bogat colonizată, fiind supusă unor numeroase contaminări
prin contacte şi traumatisme locale.
● În mod normal se pot găsi:
○ Staphylococcus epidermidis,
○ Staphylococcus aureus (la aproximativ 20% din populaţie),
○ streptococi,
○ corynebacterii,
○ pneumococi etc.
● Flora de la nivelul faringelui se aseamănă în compoziţie cu flora cavităţii bucale.
● Astfel se pot găsi:
○ streptococi,
○ neisserii saprofite,
○ bacili Gram-negativi (Lactobacillus spp, Bacteroides spp.)
● Tractul respirator inferior este steril, fapt datorat și clearance-ului mucociliar.
92
○ staflococi,
○ corinebacterii
○ Enterobacterii.
● Flora vaginală este dominată de lactobacili (flora Döderlein) asociaţi în proporţii diferite cu:
○ mycoplasme nepatogene,
○ stafilococi,
○ streptococi,
○ enterococi,
○ clostridii,
○ Candida spp., Bacteroides spp. etc.
● Predominanţa lactobacililor menţine local un pH acid nefavorabil multiplicării altor germeni (în
special patogeni).
● Mucusul cervical are în plus o acţiune bactericidă prin lizozim.
● La femeile fără activitate sexuală predomină lactobacilii, pe când la restul compoziţia florei este
mixtă.
Exotoxinele
● sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu bacilul difteric,
streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic
(Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin mecanism
cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub
control plasmidic (unele tulpini de E. coli)
● Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legării de
receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active).
● Exotoxina nu îşi exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din structura
iniţială.
● Sunt secretate în timpul vieţii germenilor.
● Sunt difuzibile la distanţă.
93
● Toxicitatea lor este foarte mare, doza letală fiind de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg corp în
cazul toxinei botulinice).
● Au afinitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC,
rinichi în cazul bacilului difteric).
● Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă (când toxina este deja fixată pe celulele
ţintă).
● Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale, toxina
putând fi neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie.
● Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină.
● Un alt exemplu important privind exotoxinele se referă la Tcd A şi Tcd B, produse de Clostridium
difficile și care acţionează asupra celulelor intestinului gros, fiind responsabile de o boală
diareică uşoară, până la colită fulminantă. Ele produc la acest nivel leziuni microscopice, dar şi
leziuni mari, asemănătoare unor plăgi; endoscopic, se vor identifica noduli.
● Prin degradarea proteinelor Rho, Rac şi Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor structurale
dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic alterarea
microfilamentelor de actină, rezultând marginalizarea nucleului, schimbări în morfologia
citoscheletului, dar şi alte modificări (alterarea suprafeţei celulare şi rearanjarea microvililor).
● Astfel, modificările produse de toxinele Tcd A şi Tcd B sunt: inflamaţia, creşterea
permeabilităţii ţesutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine şi citokine,
acumularea de neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea
mastocitelor, producerea substanţei P, distrugerea directă a mucoasei intestinale, ruperea
joncţiunilor strânse (Zonula occludens), degradarea actinei F.
● Substanţa P este responsabilă de: activarea neuronilor din submucoasă, eliberarea TNF-α,
activarea macrofagelor din lamina propria; este implicată în diareea inflamatorie.
Antitoxinele
● Având structură proteică, exotoxinele sunt imunogene şi determină apariţia de anticorpi
specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare
specifică cu toxina.
● Se pot obţine astfel seruri imune utile în seroterapia specifică.
● De regulă aceste seruri sunt preparate pe cal şi sunt utile în neutralizarea exotoxinelor (ex. în
tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).
94
● Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauţie datorită faptului că anticorpii preparaţi
pe cal reprezintă în acelaşi timp şi antigene pentru gazda umană, dar în acelaşi timp cât mai
curând posibil.
● Tratamentul acestor entităţi clinice este complex şi nu reprezintă subiectul acestui manual.
● Administrarea antitoxinelor trebuie făcută după o testare a unei eventuale hipersensibilităţi şi
în cazul că aceasta există se recurge la desensibilizare şi abia ulterior la seroterapie
(administrarea de antitoxină).
● O alternativă ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dacă acestea sunt
disponibile.
Anatoxinele
● Exotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a
temperaturii şi formolului.
● Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin puterea imunogenă şi devin
anatoxine.
● Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (în cadrul
vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum şi pentru hiperimunizarea animalelor în
scopul obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc).
Endotoxinele
● Endotoxinele au fost evidenţiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe.
● Sunt elaborate de aceştia şi apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în urma distrugerii
germenilor.
● Au structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituţia lor intrând acizi graşi, un lipid A şi
lanţuri de polizaharide.
● Au efecte toxice la nivelul celulelor majorităţii mamiferelor; aceste efecte sunt similare
indiferent de specia bacteriană care le eliberează.
● Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în comparaţie cu exotoxinele), dar pot acţiona la mai
multe nivele inducând apariţia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilităţii vasculare, hipotensiunii
arteriale până la colaps, sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc.
95
● Sunt implicate între altele în apariţia şocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină
proporţională cu numărul germenilor distruşi).
● Studiile arată că mortalitatea în şocul endotoxic este în relaţie destul de directă cu cantitatea de
endotoxină / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identifică 100 unităţi endotoxină / ml de
plasmă.
96