Distribuția micotoxinelor produse de Penicillium spp.

inoculate în gem de
măr și crème fraiche în timpul depozitării în condiții de refrigerare

Autori: Monica Olsena, Roland Lindqvist, Albina Bakeevab, Su-lin L. Leongb, Michael
Sulyok

Abstract
Estimările expunerii consumatorilor la micotoxine prin supravegherea micotoxinelor în
comerțul alimentelor sunt bine descrise, dar expunerea datorată alimentelor mucegăite în propriile case
nu este cunoscută. În acest studiu, s- a urmarit creșterea Penicillium expansum pe suprafața gemului
de mere și Penicillium verrucosum pe crème fraiche, precum și producția și distribuția de metaboliți de
ciuperci în proba (aproximativ 6 cm înălțime împărțită în trei straturi egale), utilizând o metodă
multianalitică, în timp (până la 28 zile) și la 4, 8 și 15 ° C.
Ratele de creștere pentru P. expansum au fost de 1,7, 2,7 și 4,3 mm zi -1 pentru păstrare la 4, 8
și 15 ° C, respectiv, timpul de întârziere aparent scăzut cu creșterea temperaturii de depozitare și au
fost 10,6, 7,9 și 2,6 zile la temperaturi corespunzătoare. Patulina și roquefortina C au fost identificate
și cuantificate, printre alți metaboliți fungici. Patulina a fost detectată în toate straturile de 2 cm ale
gemului de mere la 15 °C. Concentrațiile în cele două straturi superioare ale vasului au corespuns
expunerilor care depășesc valoarea de orientare bazată pe sănătate (HBGV) pentru o dimensiune
normală de servire. În consecință, îndepărtarea părții de mucegai este insuficientă pentru a evita
expunerea nesănătoasă. Spre deosebire de patulină, roquefortina C a fost de asemenea produsă la 4 °C.
Creșterea P. verrucosum pe crème fraiche a fost foarte restrictivă și nu a putut fi modelată. În
ciuda coloniei mici (8 ± 0,5 mm în diametru), ochratoxina A și citrinina au fost detectate după 21 de
zile la 15 °C în stratul superior de 2 cm (inclusiv colonia fungică) și la concentrații într-o porție
normală corespunzătoare unei expuneri deasupra HBGV stabilit de EFSA pentru ambele micotoxine.
Questiomycin A, un antibiotic, a fost de asemenea produs în crème fraiche, dar în contrast cu cele
două micotoxine, a fost detectat în toate straturile crème fraiche și a fost produs și la 4 și 8 ° C.
Ca o completare la un studiu anterior, se prezintă de asemenea producția și distribuția
principalilor metaboliți fungici ai gemului de mere și a crème fraiche pentru unele tulpini suplimentare
fungice ( P. crustosum , P. roqueforti și P. verrucosum pe gem de mere și P. expansum pe crème
fraiche). Un studiu pilot care investighează efectul mărimii inoculării asupra producției de toxine poate
avea implicații pentru cel mai bun inocul de utilizat în studiile experimentale.

Cuvinte cheie: patulina, Ochratoxina A, Citrinin, Roquefortine C, Expunere.

1. Introducere

Consumatorii sunt expuși la diferite niveluri de micotoxine în propriile lor diete din cauza
alimentelor mucegaite în timpul păstrării la domiciliu. O întrebare obișnuită din partea consumatorilor
către Food National Agency este dacă produsele alimentare care au devenit mucegăite după cumpărare
pot fi salvate prin îndepărtarea părții mucegăite sau dacă ar trebui să o elimine în întregime.
Astăzi, mulți consumatori sunt conștienți de necesitatea de a minimiza deșeurile alimentare,
din motive de sustenabilitate și din punct de vedere economic, și pot elimina porțiunea de mucegai
vizibil și să mănânce restul. Revizuirea literaturii a arătat că există un număr limitat de rapoarte
privind anchetele distribuția micotoxinelor în alimentele mucegaite; cele mai multe studii sunt vechi și
nu au acoperit gama sau concentrațiile de micotoxine pe care noi le știm astăzi (Olsen și Svanström,
2017). Akerstrand și Andersson (1979) a studiat creșterea mucegaiului și formarea de patulină în
gemurile de mere cu concentrații diferite de zahăr adăugat (scăzut și înalt, corespunzând la 25 sau 33
sau 100 g zahăr la 100 g gem) și cu sau fără conservant adăugat (benzoat de sodiu).
Gemurile a fost ținut la rece la temperatura de 15 °C și inoculat cu P. expansum. După 15 zile
patulina ajunsese la fundul borcanului, dar nu era observată nici o corelație între creșterea coloniilor și
producția de patulină. Creșterea mucegaiului a fost observată în 1 din 4 gemuri cu conținut ridicat de
zahăr, dar nu a fost detectată patulină.
Benzoatul de sodiu a redus creșterea mucegaiului dar a avut un efect stimulativ asupra
producției de patulină la un conținut scăzut de zahăr. Lindroth și colab. (1978), au dscoperit o inhibare
puternică, dar nu completă, a formării de patulină atunci când se adaugă 44 g zahăr la 100 g gem. Cele
mai ridicate niveluri de patulină au fost găsite în gemurile fără adaos de zahăr. Același grup de
cercetători a studiat, de asemenea, producția de aflatoxine în gemuri cu sau fără adaos de zahăr.
Aflatoxina a fost găsită numai în gemuri fără zahăr adăugat și care au fost depozitate la temperatura
camerei (Pensala și colab.,1978). Rezultate similare s-au obținut și de Ostry și colab. (2004) în gem de
caise. Cele mai înalte niveluri de aflatoxine au fost formate la temperatura camerei, dar concentrații de
până la 25 μg / kg de aflatoxine ar putea fi găsită și pe suprafața gemului depozitat la 6 ° C.
În acest studiu, s-a continuat, deci, să se studieze distribuția metaboliților fungici din specia
Penicillium psihotrofică și să se urmărească creșterea și producerea de micotoxine în timp în gem de
mere și cremă fraiche depozitate la temperaturi scăzute sau de refrigerare (4 până la 15 ° C).

2. Materiale și metode

2.1. Sucuri fungice și suspensii de spori folosite pentru inocul

Următoarele specii fungice au fost folosite ca inoculum pe diferite produse alimentare:

Penicillium expansum (M17, pulbere de guma); P. roqueforti (M19, pulbere); P. crustosum (M55,
semințe de floarea-soarelui); P. nordicum (M40, brânză); P. verrucosum (OTA16 și OTA21, cereale).
Coduri de identificare pentru colecția internă de fungi la Agenția Națională pentru Alimente este
prezentată în paranteze împreună cu sursa originală de izolare.
Producția de toxină a fiecărei specii, în plus față de cea a studiului anterior (Olsen și colab.,
2017), a fost examinată prin creșterea pe plăci de agar de zahar de extract de drojdie (YES) la 25 °C
timp de 7 zile. S-au prelevat agar (n = 5) din fiecare colonie și au fost trimise la laborator la IFA-Tulln
din Austria (secțiunea 2.4).
Suspensiile de spori ale fiecărei specii pentru inocularea de produse alimentare au fost
preparate după cum urmează: o cultură pură a tulpinei a fost striată pe agenți de agar de extract de malț
(200 ml în baloane de 500 ml). După incubare la 25 ° C timp de 7 zile, sporii au fost recoltați în soluție
de peptonă 0,1% conținând 0,015% Tween 80 (822187, Merck, Darmstadt, Germania) folosind o
buclă plastică sterilă. Suspensia brută a fost filtrată prin țesătură sterilă în pungi sterile, după care
concentrația de spori a fost determinată microscopic utilizând o cameră Burker; absența fragmentelor
miceliene în suspensie a fost de asemenea confirmată microscopic.
Din suspensia inițială, o suspensie cu o concentrație de spori de 2500 spori în 5 μl a fost
preparată ca inocul pentru utilizare imediată în studiile privind inocularea produselor alimentare. O
altă suspensie de spori de 5000 spori per 5 μl a fost preparată pentru studierea efectului mărimii
inoculării. Această suspensie a fost diluată cu 1:10, 1: 100 și 1: 1000 în soluție de peptonă.

2.2. Produse alimentare

Următoarele produse alimentare au fost obținute de la un magazin local: 250 ml crème fraiche
(15% grăsime, amidon modificat de porumb, pectină și gumă de roșcată ca agent de îngroșare, n = 44);
și gem de mere de 375 grame (26% zahăr adăugat, pectină, acid citric, acid ascorbic, citrat de potasiu,
n = 23) din același lot. Crema și gemul de mere au fost de aceleași mărci ca cele utilizate în studiul
anterior (Olsen et al., 2017), iar valoarea a w a acestor produse a fost de 0,98 și respectiv 0,96.
Gemul de mere, 172 ± 5 g, a fost transferat în pahare de plastic sterile și acoperit cu folie
sterilă. Probele de crème fraiche au fost acoperite cu capace de plastic originale care au fost perforate
de trei ori cu un ac steril pentru a permite aerului în borcan.
Probele neinoculate din fiecare produs alimentar au servit ca martori și au fost păstrate
congelate (-18 ° C) pentru analizele chimice.
 2.3. Proiectare experimentală

2.3.1. Distribuția micotoxinelor și a altor metaboliți secundari majori în gem de mere sau
în crème fraiche

Suspensiile de spori fungici au fost inoculate pe partea superioară centrală a fiecărui articol
alimentar prin plasarea a 5 μl (2500 spori) cu o micropipetă pe suprafață. Toate inoculările au fost
efectuate în două exemplare. Următoarele specii fungice au fost inoculate pe următoarele produse
alimentare: P. expansum (M17), P. nordicum (M40) și P. verrucosum (OTA21) pe crème fraiche; P.
roqueforti (M19), P. crustosum (M55) și P. verrucosum (OTA16) pe gem de mere.
Toate probele au fost incubate la 15 ° C timp de 14 zile. Diametrul coloniei a fost măsurat și
toate probele au fost plasate într-un congelator (-18 ° C) înainte de prelucrare ulterioară. Probele
congelate au fost împărțite în subeșantioane prin tăierea paralelă cu suprafața superioară la 2 cm și 4
cm de partea superioară, obținându-se trei subeșantioane numite straturi A, B și C. Suprafața A
superioară a inclus partea superioară a coloniei fungice.
Fiecare sub-mostră individuală a fost cântărită. În final, subeșantioanele au fost dezghețate
aprox. 30 min înainte de omogenizare cu un amestecător pentru 1-2 minute. Aproximativ 5 g din
fiecare subsuprafețe omogenizate au fost cântărite într-un tub de 50 ml-Falcon și depozitate la -18 ° C
până la analizele chimice (vezi secțiunea 2.4 Analiza micotoxinelor și a altor metaboliți fungici).
Producția de metaboliți secundari a fost exprimată ca și în studiul anterior (Olsen et al., 2017)
ca concentrație în straturile A, B și C (μg metabolit / kg).

2.3.2. Creșterea mucegaiurilor, producția și distribuția micotoxinelor în gem de mere și

în crème fraiche în funcție de temperatură și timp

Gemul de mere: P. expansum (M17) a fost inoculat pe partea centrală superioară a 36 de probe
prin plasarea a 5 μl (2500 de spori) cu o micropipetă pe suprafață. Două probe au fost incubate la
fiecare temperatură, 4, 8 și 15 °C.
S-au extras triplicate de probe în patru timpi de stocare diferite: la 15 °C, probele au fost
prelevate la 3, 7, 10 și 14 zile după inoculare; la 8 și 4 °C, au fost prelevate probe la 3, 7, 14 și 21 zile.
Diametrul coloniei a fost măsurat și probele au fost plasate într-un congelator (-18 ° C) înainte de
divizarea, omogenizarea și analizele descrise mai sus (secțiunea 2.3.1).
Crema fraiche: P. verrucosum (OTA16) a fost inoculată pe partea centrală superioară a 36 de
probe prin plasarea a 5 μl (2500 spori) cu o micropipetă pe suprafață. Două probe au fost incubate la
fiecare temperatură, 4, 8 și 15 ° C. Eșantioane trilitice au fost prelevate la patru timpi diferiți: la 3, 14,
21 și 28 de zile după inoculare. Diametrul coloniei a fost măsurat și probele au fost plasate într-un
congelator (-18 ° C) înainte de divizare, omogenizare și analiză ca mai sus (Secțiunea 2.3.1).

2.3.3. Efectul mărimii inoculării asupra creșterii și producției de metaboliți fungici

Patru probe de gem de mere au fost inoculate cu 5, 50, 500 și 5000 de spori de P. expansum
(M17). Probele au fost incubate la 15 ° C timp de 14 zile. Diametrul coloniei a fost măsurat după 3, 5,
7, 10, 12 și 14 zile. După 14 zile, întreaga probă (170 ± 10 g) a fost omogenizată ca mai sus și s-a
cântărit un subsample (aproximativ 5 g) într-un tub de 50 ml-Falcon și depozitat la -18 ° C până la
analiza chimică.

2.4. Analize de micotoxine și alți metaboliți fungici

Toate probele au fost extrase utilizând 4 ml de solvent de extracție pe gram de probă. Pentru
conectorii de agar, solventul de extracție a fost găsit cel mai bun compromis (acetonitril / apă / acid
acetic 79 + 20 + 1, v + v + v) de Sulyok și colab. (2006); cu toate acestea, fracțiunea de acetonitril a
fost mărită la 84% (v / v) pentru ca probele de alimente să țină cont de conținutul lor de apă, deoarece
solventul de extracție a fost optimizat pentru boabe uscate (conținut de apă <14% conținut de apă în
dopuri de agar YES (82% apă)]. Probele au fost extrase timp de 90 de minute utilizând un agitator
rotativ GFL 3017 (GFL, Burgwedel, Germania). Extractele au fost transferate în flacoane din sticlă
utilizând pipete Pasteur și diluții cu același volum de solvent diluant (acetonitril / apă / acid acetic 20 +
79 + 1, v + v + v) au fost diluate cu alicote de 500 µl. După amestecarea adecvată, 5 µl din extractul
diluat au fost injectați în sistemul LC-MS / MS fără o pre-tratare suplimentară. Pentru fiecare tip de
eșantion, trei replici neinoculate au fost împărțite și apoi analizate pentru a determina recuperările
aparente.
Detecția și cuantificarea au fost efectuate așa cum s-a descris de către Malachova și colab.
(2014). Pe scurt, s-a utilizat un sistem QTrap5500 LC MS / MS (Applied Biosystems, Foster City,
CA) echipat cu o sursă de ionizare cu electrospray TurboIonSpray (ESI) și 1290 Series UHPLC
System (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania). Separarea cromatografică s-a efectuat la 25 °
C pe o coloană Gemini® C18, dimensiune 150 x 4,6 mm, dimensiune a particulelor de 5 µm, echipată
cu un cartuș de protecție C18, cu 4 x 3 mm id (toate de la Phenomenex, Torrance, CA, SUA ). ESI-MS
/ MS s-a efectuat în modul de monitorizare a reacției multiple (sMRM), atât în polarități pozitive, cât
și în polarități negative în două runde cromatografice separate. Fereastra de detecție sMRM a fiecărui
analit a fost setată la timpul de retenție respectiv ± 27 s și respectiv ± 42 s în modul pozitiv și,
respectiv, negativ. Timpul de scanare țintă a fost setat la 1 s. Confirmarea identificării pozitive a
analitului se obține prin obținerea a două sMRM pe analiză (cu excepția moniliforminului și a acidului
3-nitropropionic, fiecare prezentând doar un fragment de ioni), care produce 4,0 puncte de identificare
în conformitate cu Decizia 2002/657 / CE a Comisiei . Cuantificarea sa bazat pe calibrarea liniară, 1 /
x cântărită, utilizând diluții seriale ale unei soluții stoc externe multicomponente. Concentrațiile au
fost corectate pentru recuperări aparente. Exactitatea metodei a fost verificată anterior prin participarea
la studii comparative interlaboratoare (De Girolamo et al., 2017; Malachova et al., 2014), inclusiv o
schemă obișnuită organizată de BIPEA (Gennevilliers, Franța). Limitele de detecție și limitele de
cuantificare au fost determinate în urma ghidului EURACHEM (Magnusson și Örnemark, 2014).

2.5. Modelarea creșterii mucegaiului

Creșterea observată a coloniilor de mucegai pe suprafața superioară a alimentelor a fost

exprimată ca un diametru mediu al coloniei de-a lungul a două axe perpendiculare. Diametrele medii
ale coloniilor în timp, t (zile), au fost montate pe un model bafazic Baranyi (Eq. (1)), descris în Marin
și colab. (2008 IJFM). Rata de creștere (μ) și timpul de întârziere aparent (λ, aproximând timpul până
la creșterea vizibilă) au fost estimate folosind funcția nls în software-ul statistic și de programare R (R
Core Team, 2016).

2.6. Evaluarea expunerii

Pentru a evalua riscul unor concentrații diferite de micotoxine în gemurile de mere și crema
fraiche s-au utilizat următoarele date privind consumul.
Datele privind marimea porțiunilor de gem de mere au fost colectate de la studiul național
suedez Riksmaten (NFA, 2012). Dimensiunea medie a porțiunii a fost de 39 g, 51 g median, 50 g
percentil, 34 g și 85 g percentil 85 (n = 240). Nu au existat mărimi de porție pentru crème fraiche
disponibile în ancheta națională, în schimb sa folosit media a 10 rețete alese aleatoriu, inclusiv crème
fraiche, iar mărimea porției mediane a crème fraiche a fost de 50 ± 12 g. Greutatea corporală pentru o
persoană adultă a fost stabilită la 70 kg.

3. Rezultate si discutii

Capacitatea izolatoarelor fungice de a produce metaboliți secundari, inclusiv micotoxine, a

fost confirmată prin creșterea în primul rând a izolatelor pe plăci de agar YES, metodă utilizată în mod
obișnuit pentru controlul producerii de micotoxine a tulpinilor fungice. Rezultatele sunt incluse în
studiul anterior (Olsen et al., 2017). În acest studiu am adăugat câteva alte tulpini cu capacitatea de
producere a ochratoxinei A, unul P. nordicum (M40) și două P. verrucosum (OTA16 și OTA21), care
au fost verificate utilizând aceleași metode ca și în studiul anterior. Formele metabolitului secundar al
acestor tulpini fungice suplimentare sunt prezentate în Tabelul 1.

3.1. Distribuția micotoxinelor și a altor metaboliți secundari majori în gem de mere sau
în crème fraiche

Primul studiu este o continuare a investigației pentru studierea creșterii și distribuției fungice a
metabolitilor fungici în gem de mere și cremă fraiche. În total, au fost detectate 28 de metaboliți
diferiți în cele două alimente. Nu toți acești metaboliți fungici sunt arătați în tabelul 2, numai aceia
care au fost identificați ca metaboliți originari din tulpinile fungice utilizate în acest studiu sau de
Olsen și colab. (2017) și care sunt considerate drept micotoxine sau compuși biologic activi utilizați în
dezvoltarea medicamentelor.
Izolatele P. nordicum (M40) și P. verrucosum (OTA21) au produs foarte puțini metaboliți și
nici micotoxine în crème fraiche în timpul celor 14 zile de incubare la 15° C și, prin urmare, aceste
rezultate sunt excluse din tabelul 2. Tulpina P. verrucosum (OTA16) nu a produs ocratoxină A sau
citrinină în gem de mere, dar a produs metabolitul fungician questiomycin A, care a fost detectat chiar
și în stratul inferior C. Questiomycin A este un antibiotic (fenoxazină) produs de mai multe specii de
Streptomyces și niște ciuperci și bacterii. Questiomycin A este slab activ împotriva bacteriilor,
fungiilor, plantelor și liniilor celulare tumorale și inhibă aromataza și sulfatazele. Questiomycin, ca și
alte fenoxazine, stimulează creșterea și turnover-ul celular in vitro, o activitate posibil legată de
capacitatea lor de a forma radicali liberi stabili. Mai recent, sa demonstrat că questiomicina A inhibă
pulmonar metastazele cauzate de celulele melanomului de șoarece. Dimensiunea coloniei P expansum
pe crema fraiche a fost destul de mică, în jur de 1 cm 2 și ar putea fi ignorat ca neimportant sau chiar
nedetectat de către un consumator. În ciuda acestui fapt, P. expansum a produs concentrații mari de
patulină în crème fraiche (1440 ± 237 μg / kg în stratul A), deși la concentrații mai scăzute decât în
cazul blocajului de mere în studiul anterior (34,070 ± 3690 μg / kg în stratul A; și colab., 2017). Cu
toate acestea, în crème fraiche Acest izolat de P. expansum (M17) a produs o concentrație ridicată de
citrinină, 1880 ± 662 μg / kg în stratul A. Acest izolat (M17) este capabil să producă citrinină pe YES-
agar conform studiului anterior, dar citrinina a fost care nu au fost produse în blocajele de fructe (măr
și afine) în studiul respectiv. Concentrația patulinei în stratul superior (A) al crème fraiche ar
corespunde unei expuneri peste TDI de 0,4 μg / kg b.w. pe zi (JECFA, 1995) pentru o servire normală
de crème fraiche (50 g) la o adult (70 kg b.w.). Concentrația din stratul B ar depăși probabil TDI la o
rată ridicată de consum (100 g). Grupul CONTAM al Comisiei EFSA (2012) a concluzionat că,
datorită limitărilor și incertitudinile din baza de date, derivarea unei baze de sănătate valoarea de
referință pentru citrinină nu a fost considerată adecvată, dar un nivel de îngrijorare pentru
nefrotoxicitate de 0,2 μg / kg b.w. pe zi a fost determinată (EFSA, 2012). O servire normală de crème
fraiche (50 g) din stratul A ar corespunde cu mai mult de șase ori valoarea de ghidare. Pe de altă parte,
citrinina nu a fost distribuită la fel de mult ca patulina în crema fraiche, iar concentrația în stratul B nu
ar însemna un risc pentru expunere peste valoarea de ghidare. În afară de patulină și citrinină, nici unul
din cei biologic activi substanțele incluse în tabelul 2 prezintă un HBGV.
 3.2 Creșterea și producerea micotoxinei P. expansum in gemul de măr

Creșterea P. expansum a fost observată pe suprafața (stratul superior) a gemului de mere la

toate temperaturile de depozitare. Ratele de creștere estimate la modelul Baranyi au crescut cu
temperaturi de depozitare și au fost de 1,7, 2,7 și 4,3 mm zi-1 (viteze de creștere) pentru depozitare la
4, 8 și respectiv 15 ° C. În schimb, timpul aparent de întârziere a scăzut cu temperaturi de depozitare în
creștere și au fost de 10,6, 7,9 și 2,6 (zile) la temperaturile corespunzătoare.
Metaboliții principali fungali ai P. expansum identificați și cuantificați în gemul de mere au
fost patulina, roquefortina C, andrastinul A și comunesin B. Toți aceștia au fost identificați în stratul A
în gemul de mere care a fost incubat la 15 ° C. Atât antares, cât și comunesine au fostutilizate în
dezvoltarea de medicamente în programele de cercetare antitumorală. Andrastin A inhibă activitatea
farnesiltransferazei proteinelor oncogene Ras,și, de asemenea, promovează acumularea intracelulară
de compuși anticanceri în celulele tumorale. Communesin B, pe de altă parte, este un alcaloid citotoxic
testat pozitiv pentru activitatea antiproliferativă împotriva mai multor linii celulare leucemice (Trost și
Osipov, 2015). Andrastins sunt, de asemenea, în mod natural în brânză albastră împreună cu alți
metaboliți fungici, cum ar fi micotoxina roquefortina C (Fernández-Bodega et al., 2009). Andrastine
pot fi produse atât de P. expansum cât și de P. roqueforti. Ceilalți metaboliți fungali,patulina și
roquefortina C, sunt considerate ca micotoxine.
Analizele probelor a gemurilor de mere incubate la 15 ° C au fost oprite după 14 zile de când
colonia ajunsese la marginea borcanului. Patulin nu a fost detectată în nici o probă incubată la 4 ° C
și la 8 ° C numai în partea superioară A. Când cantitatea totală de toxină din gemul de mere, suma
tuturor toxine a fost reprezentat grafic ca o funcție a diametrului coloniei P. expansum, roquefortină C
a început atunci când au fost diametrele coloniei a ajuns la 15-20 mm la toate temperaturile examinate,
în timp ce la fel au obținut patulină numai la 15 ° C și nu la 8 sau 4 ° C.

3.3 Creșterea de P. verrucosum, producerea și distribuția micotoxinelor în crème fraiche

în dependență de temperatură și timp

Creșterea P. verrucosum în crème fraiche a fost foarte restrânsă, suprafața coloniei a fost
încrețită, culoarea a fost roz și apariția generală a fost atipică pentru această specie. O ipoteză este că
aspectul restrâns și încrețit se datorează concurenței cu bacteriile de acid lactic în crème fraiche, care
a fost foarte proaspăt și tocmai a fost livrată de la fermă.
Creșterea P. verrucosum la 4 ° C a fost observată numai după 28 zile (6,3 ± 2,8 mm), deși la
aceeași dimensiune ca la 8 ° C (5,8 ± 1,4 mm). Aceste rezultate sugerează că experimentele ar trebui
să fie repetate la crème fraiche care nu a fost facută cu lapte proaspăt.
Formarea ochratoxinei A și citrininei a fost observată după 21 de zile de incubare și numai în
subeșantionul A la 15 ° C , cu excepția unuia dintre probele triliate de la 28 de zile la 8 ° C care
conțineau 1,8 μg ochratoxină A / kg. Cu toate acestea, concentrația de ochratoxină A la 21 și 28 de zile
este relativ mare, în ciuda mărimii mici a coloniilor. Atât ochratoxina A cât și citrinina sunt stabile la
căldură, iar rețetele, inclusiv crème fraiche, pot fi fără încălzire sau doar un timp scurt de gătit.
Ochratoxina A este nefrotoxică și clasificată drept carcinogenă de tip 2B (IARC, 1993); sursele de
expunere sunt multe, inclusiv cerealele și produsele din cereale, cafeaua, berea, suc de struguri, fructe
de viță de vie uscată și vin, precum și produsele din cacao, nuci și condiment.
Așa cum am menționat mai devreme, nu se stabilește un aport tolerabil de citrinina, ci este o
valoare de orientare.
Atât ochratoxina A cât și citrinina sunt stabile la căldură, iar rețetele, inclusiv crème fraiche,
pot fi fără încălzire sau doar un timp scurt de gătit. Potrivit lui Boudra și colab. (1995), 150 ° C este
necesară pentru degradarea ochratoxinei A și 160 ° C pentru citrinină (Trivede și colab., 1992) și, prin
urmare, nici o degradare majoră a ochratoxinei A sau nici o degradare majoră și citrinina este de
așteptat în timpul gătitului. Ochratoxina A este nefrotoxică și clasificat drept carcinogen de tip 2B
(IARC, 1993); sursele de expunere sunt multe, inclusiv cerealele și produsele din cereale, impulsurile,
cafeaua, bere, suc de struguri, fructe de viță de vie uscată și vin, precum și produse din cacao, nuci și
condimente. Mai mult, contaminarea hranei pentru animale cu ochratoxina A poate determina prezența
reziduurilor în organele comestibile și în organele comestibile ser de sânge (EFSA, 2006). Cu alte
cuvinte, este important să se mențină expunerea la ochratoxină A din surse cunoscute cât mai scăzute
posibil și nu adăugați reziduuri din alimentele mucegăite.
Așa cum am menționat mai devreme, nu se stabilește un aport tolerabil de citrinina, ci o
valoare de orientare. Linia punctată de citrinină indică concentrația deasupra căreia o servire normală,
care conține 50 g cremă fraiche pe porție, are ca rezultat o expunere mai mare decât HBGV pentru o
persoană adultă (70 kg greutate corporală). Similar cu ochratoxina A, citrinina este nefrotoxic. Într-un
studiu recent (Rašić et al., 2018), combinate efectul ochratoxinei A și citrininei a fost studiat la
șobolani Wistar la afectarea oxidantă a rinichilor și a ficatului. Cele mai multe efecte în combinate
tratamentele au fost atribuite efectelor ochratoxinei A.
Pe lângă cele două micotoxine ochratoxina A și citrinina, P. Verrucosum a produs un alt
metabolit important în crème fraiche, questiomycin A, ale căror efecte biologice au fost descrise mai
sus. Concentrația de questiomicină A în stratul A la 15 ° C a fost de 136 ± 35 pg / kg (n = 3) și 341 ±
447 μg / kg (n = 2) după 21 și respectiv 28 de zile. Spre deosebire de ochratoxina A și citrinina,
questiomicina A a fost detectat atât în straturile B și C, ajungând la 26 ± 6,0 și la 91 ± 112 μg / kg în
stratul B după 21 și respectiv 28 de zile și respectiv 4,2 ± 2,3 și 26 ± 29 μg / kg în stratul C după 21 și
respectiv 28 de zile. Inferior concentrațiile de questiomicină A (<35 μg / kg) în stratul A au fost de
asemenea detectat în probele incubate la 4 și 8 ° C. Nu există un HBGV stabilit pentru questiomicină
și, prin urmare, nu este posibilă evaluarea riscului din concentrațiile detectate.

3.4. Efectul mărimii inoculării asupra creșterii și producției de metaboliți fungici

Dimensiunea de inoculare utilizată în general în acest studiu, 2500 spori / inoculare, este cea
utilizată în studiul anterior (Olsen și colab., 2017). Rezultatele studiului privind dimensiunea inoculării
sunt prezentate în figura 7.
A + B. Nu în mod neașteptat, dimensiunea coloniei în timp pare să depindă de mărimea
inoculării (figura 7A), dar ratele de creștere a diametrului coloniei estimați prin potrivirea modelului
Baranyi au fost aceleași, 4,2-4,5 mm zi-1. Timpul estimat de întârziere a scăzut cu mărimea mărimii
inoculului și a fost de 4,1, 3,9, 3,3 și 2,3 zile pentru mărimi de inoculum de 5, 50, 500 și, respectiv,
5000. Spre deosebire de creștere, modelul și concentrațiile metabolitului (figura 7B) nu au urmat
aceleași tendințe clare. De exemplu, cea mai mare concentrație de roquefortină C a fost asociată cu cea
mai mică dimensiune de inoculare. Acest lucru este doar a un singur studiu pilot și, prin urmare, nu
putem trage concluzii, dar rezultatele indică faptul că aceste efecte ale mărimii inoculării asupra
toxinei producția ar trebui să fie investigată în continuare, deoarece acest lucru poate avea implicații
pentru cea mai bună dimensiune a inoculului de utilizat în studiile experimentale. Mai departe
extrapolând impactul potențial al mărimii mici a inoculului asupra vieții reale scenariu de colonii
provenind din spori singuri este, de asemenea, de interes.

4. Concluzii

• Cantități substanțiale de metaboliți fungici biologic activi se formează atunci când se

formează masele alimentare. Dintre aceste substanțe, doar câteva sunt caracterizate toxicologic în
măsura în care li se administrează un HBGV.
• Producția și distribuția de toxine fungice într-o hrană pare să depindă de mai mulți factori,
printre care specia / tulpina fungică, temperatura de depozitare, mărimea moleculelor de toxine și
proprietățile alimentelor cum ar fi lichiditatea.
• Creșterea mucegaiului și producția de toxine sunt întârziate atunci când alimentele sunt
stocate la temperaturi scăzute, dar când crește mucegaiul (definiția comună a creșterii vizibile a
mucegaiului este de> 3 mm diametru); se pot forma cantități substanțiale de micotoxine în intervale de
interes toxicologic, în ciuda unei dimensiuni reduse a coloniilor. Formularea de consiliere generală
pentru consumatori este, prin urmare, dificilă, cu excepția evitării malformațiilor