ADER 5.1.5.

Ameliorarea şi consolidarea unui nucleu de vaci de rasă Bălţată Românească de tip

Fleckvieh prin selecţie şi utilizarea la reproducţie a celor mai performante structuri
genetice în vederea creşterii eficienţei economice a activităţilor fermei

Coordonator proiect:
Stațiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru
Creşterea Bovinelor Arad
Cod proiect: ADER 5.1.5.

Tip proiect: PLAN SECTORIAL – ADER

Faza: 2 – Aplicarea selecției asistate de

markeri moleculari efectivelor incluse în
studiu

Director proiect: Drd. Ing. Neamţ Radu

 Obiectivul proiectului

• Proiectul are ca scop îmbunătăţirea şi consolidarea

structurii genetice a unui efectiv de rasă Bălţată
Românească de tip Fleckvieh, prin utilizarea la
reproducţie a celor mai performante structuri
genetice şi selecţia asistată de markeri moleculari, în
vederea obţinerii unor parametri productivi vizând
cantitatea şi calitatea laptelui (grăsime și proteină),
competitivi în contextul actual al pieţelor europene.
 Obiectivul fazei
• Selecția asistată de markeri moleculari pentru
genele de interes economic în vederea
stabilirii frecvenței genelor și a genotipurilor
favorabile în efectivul de vaci incluse în studiu.
• Analiza gradului de corelare a genotipurilor cu
nivelul productiv.
• Stabilirea diferențelor productive în raport cu
genotipul
 Activități desfășurate în vederea realizării obiectivului fazei
• Activitatea 2.1 – Colectarea probelor biologice
• Recoltarea probelor biologice individuale (sânge) de la vacile cu lactația curentă încheiată și
corectată prin aducerea la valoarea de echivalent maturitate (EM), în vederea stabilirii
genotipului deținut și a frecvenței genelor. În acest sens se va recolta o cantitate de 2 ml
sânge în vacutainere cu EDTA depozitate la 4°C până în momentul izolării ADN.
•
• Activitatea 2.2 – Izolarea ADN total genomic și analiza merkerilor moleculari.
• Izolarea ADN‐ului genomic total din probele biologice (sânge);
• Amplificarea prin reacţie PCR a genelor de interes;
• Determinarea genotipurile individuale prin tehnica RFLP (care presupune restricţia
enzimatică a ampliconilor rezultaţi în urma amplificării);
• Migrarea în gel de agaroză a produşilor PCR‐RFLP pentru evidenţierea genotipurilor;
• Stabilirea frecvenței alelelor și a genotipurilor în efectiv.
•
• Activitatea 2.3.‐ Corelarea valorilor productive cu genotipul individual
• Stabilirea nivelului productiv al vacilor cu lactația curentă încheiată, sub aspectul producției
de lapte (kg), grăsime (%, kg) și proteină (%, kg);
• Corelarea valorile productive în raport cu genotipul individual;
• Stabilirea valorilor productive privind producția de lapte, grăsime, proteină în raport cu
genotipul individual și testarea statistică a diferențelor.
 Colectarea probelor biologice
Materialul biologic ‐ probe de sânge care au fost prelevate de la
animale de rasa Bălțată Românească
Recoltarea în condiţii aseptice, din vena caudală cu ajutorul
vacumtainerelor cu anticoagulant (K3EDTA).
 Izolarea ADN din probe de sânge
Materiale necesare: vacumtainere cu anticoagulant K3EDTA; pipete automate şi vârfuri 
(10, 100 şi 1000 µl); tuburi Eppendorf sterile de 1,5 ml; kitul Wizard Genomic DNA; 
izopropanol; etanol 70%; termobloc; microcentrifugă; vortex ;

Micropipete automate  Termobloc

Vortex
Microcentrifugă (max.4.000 rpm)
 Protocolul de lucru
Izolarea ADN din probe de sânge ‐ kitul Wizard Genomic DNA Purification (Wizard™ 
Genomic DNA Purification Kit)
Etapele extracţiei ADN din sânge 
Etapa I. Liza celulară
300 μl sânge se pun într‐un tub Eppendorf de 1,5 ml;
se adaugă 900 μl soluţie de liză celulară şi se amestecă prin răsturnare apoi se incubează 10 
min la temperatura camerei;
se centrifughează la 13000xG, 20 secunde;
se îndepărtează supernatantul lăsându‐se deasupra sedimentului o cantitate de 10 µl lichid 
rezidual şi apoi se vortexează timp de 20 secunde;
Etapa II. Liza nucleilor şi precipitarea proteinelor
se adaugă 300 μl soluţie de liză a nucleilor şi se pipetează de 5‐6 ori;
se adaugă 100 μl soluţie de precipitare a proteinelor şi apoi se vortexează 20 secunde
se centrifughează la 13000XG, 3 minute pentru colectarea  resturilor proteice 
Etapa III. Precipitarea şi rehidratarea ADN
se transferă supernatantul în izopropanol 300 μl 
centrifugare la 13000XG,1 minut;
se îndepărtează supernatantul, se adaugă 300 μl etanol 70% şi se centrifughează la 
13000XG,1minut;
se aspiră etanolul şi se lasă la uscat 10‐15minute;
se rehidratează ADN în 50 µl de soluţie de rehidratare timp de o oră la 650C.
 Aprecierea probelor de ADN extrase
Puritatea probelor de ADN extrase a fost apreciată pe baza raportului A260/A280 iar
concentraţia probelor a fost calculată automat cu softwareul spectofotometrului NanoDrop
2000

Graficul spectrelor de absorbanță pentru probele de ADN
 Electroforeza în gel de agaroză
Determinarea integrităţii ADN extras (gradul de fragmentare al probelor)

ADN genomic total migrat în gel de agaroză de 0,8%

 Amplificarea in situ a fragmentelor de ADN, specifice
genelor de interes, prin intermediul tehnicii PCR
Materiale necesare: pipete automate şi vârfuri (10, 100 şi 1000 µl);
tuburi sterile de 0,2; 0,5 şi 1,5 ml; ADN matriţă; primeri sens şi
antisens specifici genelor de interes; Mastermix 2 x; microcentrifugă
pentru tuburi; vortex; PCR thermocycler

Etape de lucru:
‐amplificarea in situ a fragmentelor de ADN, specifice genelor de 
interes, prin intermediul tehnicii PCR;
‐vizualizarea ampliconilor (produşilor PCR) în gel de agaroză;
‐restricţia produşilor de amplificare cu endonucleaze specifice, cu 
ajutorul tehnicii RFLP şi vizualizarea fragmentelor de restricţie de 
lungimi diferite, utilizând tehnica de electroforeză în gel de agaroză; 
 Amplificarea sectoarelor de ADN pentru k‐cazeină
1) κ‐cazeina (κ‐CN)
Simbolul genei: CSN3
ID‐ul genei: 281728
Locus: AC_000163
Secventa amplificată:
ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAGAAAAATCAGGATAAAACAGAAATCC
CTACCATCAATACCATTGCTAGTGGTGAGCCTACAAGTACACCTACCATCG
AAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCTAGAAGCTTCTCCAGAAGTTATT
GAGAGCCCACCTGAGATCAACACAGTCCAAGTTACTTCAACTGCGGTCT
AAATACTCTAAGGAGACATCAAAGAAGACAACGCAGGTAAATAAGCAAA
ATGAATAACAGCCAAGATTCATGGACTTATTAATAAAATCGTAACATCTAA
ACTAGCGTAGATGGATAAATTAAATCTGTTACAGAGAAGGCGAAATGGG
C
 Amplificarea sectoarelor de ADN pentru β‐
lactoglobulina 
2) β‐lactoglobulina (BLG)
Simbolul genei: BLG/LGB/PAEP
ID‐ul genei: 280838
Locus: AC_000168
Secventa amplificată:
TGTGCTGGACACCGACTACAAAAAGTACCTGCTCTTCTGCAT
GGAGAACAGTGCTGAGCCCGAGCAAAGCCTGGTCTGCCAGT
GCCTGGGTGGGTGCCAACCCTGGCTGCCCAGGGAGACCAGC
TGTGTGGTCCTCGCTGCAACGGGGCCGGGGGGGACGGTGG
GAGCAGGGAGCTTGATTCCCAGGAGGAGGAGGGATGGGGG
GTCCCCGAGTCCCGCCAGGAGAGGGTGGTCATATACCGGGA
GC
 Amplificarea sectoarelor de ADN pentru α‐
lactalbumina

3) α‐lactalbumina
Simbolul genei: LALBA/alfaLA/a‐LACTA/
ID‐ul genei: 281894
Locus: AC_000162
Secventa amplificată:
CTCTTCCTGGATGTAAGGCTTGATGCCAGGGCCCCTAAGGCT
TTTTCCACAAATAAAAGGAGGTGAGCAGTGTGGTGACCCCAT
TTCAGAATCTTGGGGGGTAACCAAAATGATGTCCTTTGTCTCT
CTGCTCCTGGTAGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCT
Locus Secventa primerilor Lungime amplicon

κ‐CN 5’‐ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG‐3’ 350

3’‐GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA‐5’

β‐LG 5’‐TGTGCTGGACACCGACTACAAAAAG‐3’ 247

5’‐GCTCCCGGTATATGACCACCCTCT‐3’

α‐LA 5’‐CTCTTCCTGGATGTAAGGCTT‐3’ 166

5’‐AGCCTGGGTGGCATGGAATA‐3’

Primerii utilizaţi pentru amplificarea genelor de interes

Etapele reacției  PCR κ‐CN β‐LG α‐LA

Denaturarea iniţială 95oC ‐ 5 min 95oC ‐ 5 min 95oC ‐ 5 min

Denaturarea 95oC ‐ 30 sec 95oC ‐ 30 sec 95oC ‐ 30 sec

Alipire primeri 60oC ‐ 30 sec 63oC ‐ 30 sec 55oC ‐ 30 sec

Extensie 72oC ‐ 30 sec. 72oC ‐ 30 sec. 72oC ‐ 30 sec.

Extensie finală 72oC ‐ 5 min 72oC ‐ 5 min 72oC ‐ 5 min

Parametrii reacţiei de amplificare

 Vizualizarea ampliconilor în gel de agaroză
Materiale necesare: pipete automate şi vârfuri (10 sau 100 µl); produs PCR; tampon 
electrolitic 1X TBE; agaroză; balanţă analitică; cuptor cu microunde sau baie de apă; 
colorant Bromură de Etidiu sau Midori Green; echipament de electroforeză ; aparat 
transiluminator ; sistem de fotodocumentare a gelurilor 

Sistem de electroforeză orizontală (Consort)

Transiluminator pentru vizualizarea în lumină UV a fragmentelor de ADN.

Sistem de fotodocumentare al gelurilor (Vilber Loumart Print II Systems)

Protocolul de lucru

Pentru migrarea produşilor PCR s‐a folosit un gel de agaroză de 3% şi un

tampon electrolitic TBE (Tris 0,089M; acid boric 0,089M; EDTA 0,002M; pH
8,3). Gelul de agaroză a fost colorat în prealabil cu 5l Midori Green/ 100ml
gel sau 10l Bromură de etidiu/100ml gel. După solidificarea gelului, în fiecare
godeu s‐au introdus 6l produs PCR iar probele au fost migrate la 90 V şi 50
mA pentru aproximativ 40 minute. Analiza imaginii din gel a fost făcută sub
lumină UV. Dimensiunea ampliconilor a fost apreciată în funcţie de distanţa
parcursă faţă de benzile unui ADN standard de greutate moleculară.
Pentru analiza şi interpretarea rezultatelor, gelurile de agaroză au fost
fotografiate în ultraviolet folosind sistemul de fotodocumentare al gelurilor
Vilber Loumart Print II Systems.
Rezultatele amplificării genelor de interes

Produși de amplificare PCR de 350 pb pentru gena din locusul κ-CN

Produși de amplificare PCR de 247 pb pentru gena din locusul β-LG

Produși de amplificare PCR de 166 pb pentru gena din locusul α-LA

 Restricţia produşilor de amplificare cu endonucleaze specifice, cu 
ajutorul tehnicii RFLP şi vizualizarea fragmentelor de restricţie de 
lungimi diferite, utilizând tehnica de electroforeză în gel de agaroză

Materiale necesare: pipete automate şi vârfuri (10 sau 100 µl); tuburi sterile de 
1,5 ml; produs PCR; enzime de restricţie HindIII, HaeIII și MnlI, tampon de reacţie 
al enzimei de restricţie10X; H2O bidistilată sterilă; termobloc.

Protocolul de lucru
Determinarea genotipurilor existent la nivelul genelor de interes s‐a realizat
prin scindarea specifică a ampliconilor cu enzimele de restricţie HindIII (κ‐CN),
HaeIII (β‐LG) și MnlI (α‐LA). Aceaste restrictaze scindează molecula de ADN
(ampliconii) la nivelul unor regiuni specifice, dând naştere fragmentelor de
restricţie de lungimi diferite.
Probele au fost incubate timp de 2 h, la temperatura optimă de activitate a
enzimelor (37oC). După incubare produşii PCR‐RFLP au fost vizualizaţi în gel de
agaroză de 3,5% și fotografiați în ultraviolet folosind sistemul de
fotodocumentare al gelurilor Vilber Loumart Print II Systems.
Produşii de restricţie de lungimi diferite au fost ulterior apreciaţi, din punct
de vedere al dimensiunii, cu ajutorul unui ADN standard de greutate
moleculară
 Lungimea produsilor PCR-RFLP

Locus Lungime amplicon Enzima restrictie Genotip

(pb)

AA AB BB
κ‐CN 350 HindIII 350 350
219 219
131 131

β‐LG 247 HaeIII 148 148

99 99 99
‐ 74/74 74/74

α‐LA 166 MnlI 114 114

78 78
52 52 52
36 36
 Rezultatele PCR‐RFLP (k‐CN)

Produși PCR‐RFLP pentru gena din locusul κ‐CN obținuți prin digestia ampliconilor de 
350 pb cu enzima HindIII
 Rezultatele PCR‐RFLP (β‐LG )

Produși PCR‐RFLP pentru gena din locusul β‐LG obținuți prin digestia ampliconilor de 
247 pb cu enzima HaeIII
 Rezultatele PCR‐RFLP (α‐LA )

Produși PCR-RFLP pentru gena din locusul α-LA obținuți prin digestia ampliconilor de
166 pb cu enzima MnlI
 Corelarea valorilor productive cu genotipul vacilor
Parametri productivi incluși în studiu 
‐producția de lapte (Kg);
‐producția de grăsime (%);
‐producția de grăsime (Kg);
‐producția de proteină (%);
‐producția de proteină (Kg).
Coeficienții de corecție pentru aducerea la echivalent maturitate a producțiilor
în raport cu rangul lactației
Rangul lactației Producție lapte Producție grăsime

1 1,229 1,204

2 1,133 1,118

3 1,067 1,057

4 1,024 1,019

5 1,002 1

6 1 1

7 1,018 1,019
 Aprecierea productivă a efectivului
Valorile medii și indicii de dispersie privind parametri productivi aferenți F1
Parametru de analizat Lapte (kg) Grăsime (%) Grăsime (kg) Proteină (%) Proteină (kg)

Efectiv 82 82 82 82 82

Media productivă 5868 4,04 237,06 3,38 198,33

±S.E.M. 90,64 0,04 5,99 0,02 4,04

V% 17,79 9,1 18,17 6,43 17,73

Minim 2496 3,19 79,62 2,82 70,38

Maxim 7759 5,05 391,82 3,95 306,48

 Frecvența genelor și a genotipurilor pentru generația F1 
Polimorfismul din locusul genelor de interes în efectivul F1 studiat
Locus Genotip Frecvenţa genotipului Frecvenţa alelelor

AA 0,646
pA‐0,81
AB 0,329 qB‐0,19
κ‐CN

BB 0,025 ᵪ=0,0016

AA 0,281
pA‐0,61
AB 0,658 qB‐0,39
β‐LG

BB 0,061 ᵪ=0,008

AA 0
pA‐0
AB 0 qB‐1
α‐LA

BB 1 ᵪ=1
 Frecvența genelor și a genotipurilor pentru generația 
F2 (rezultate parțiale
Polimorfismul din locusul genelor de interes în efectivul F2 studiat (rezultate parțiale)

Locus Genotip Frecvenţa genotipului Frecvenţa alelelor

AA 0,625
pA‐0,75

κ‐CN AB 0,25 qB‐0,25

ᵪ=0,009
BB 0,125

AA 0,406
pA‐0,593

β‐LG AB 0,375 qB‐0,407

ᵪ=0,037
BB 0,219

AA 0
pA‐0

α‐LA AB 0 qB‐1

ᵪ=1
BB 1
 Caracterizarea productivă a generației F1 în raport cu 
genotipul asociat locusului k‐CN
Valorile medii și indicii de dispersie privind producțiile de lapte, grăsime și proteină a
generației F1 în raport cu genotipul deținut pentru locusul k-cazeinei
Genotip AA AB BB AA/AB AA/BB AB/BB

Lapte (kg) 5887,76±115,7 5839,37±117,8 5619±86,34 p>0,37 p≤0,003 p≤0,007

Grăsime (%) 4,19±0,05 4,08±0,06 4,01±0,02 p≤0,04 p≤0,001 p≤0,008

Grăsime (Kg) 246,68±6,83 238,24±9,1 225,32±4,69 p>0,63 p≤0,018 p≤0,022

Proteină (%) 3,27±0,03 3,29±0,03 3,4±0,02 p>0,81 p≤0,012 p≤0,036

Proteină (KG) 192,52±4,12 192,11±6,6 191,04±3,61 p>0,66 p>0,24 p>0,39

Diferențe semnificative statistic la p≤0,05
 Caracterizarea productivă a generației F1 în raport cu 
genotipul asociat locusului β‐lactoglobulinei
Valorile medii și indicii de dispersie privind producțiile de lapte, grăsime și proteină a
generației F1 în raport cu genotipul deținut pentru locusul β-lactoglobulinei

Genotip AA AB BB AA/AB AA/BB AB/BB

Lapte (kg) 5809±117,58 5906,54±166,76 5812±115,11 p≤0,033 p>0,79 p≤0,038

Grăsime (%) 4,17±0,06 4,2±0,08 4,23±0,06 p≤0,017 p≤0,003 p≤0,006

Grăsime (Kg) 242,23±9,96 248,07±5,93 245,84±7,71 p>0,42 p>0,16 p>0,31

Proteină (%) 3,31±0,04 3,34±0,05 3,33±0,01 p>0,57 p>0,39 p>0,081

Proteină (KG) 192,27±5,43 197,27±6,19 193,53±3,94 p>0,44 p>0,73 p>0,55

Diferențe semnificative statistic la p≤0,05
 Activități desfășurate în cadrul fazei

‐ S‐au recoltat probele biologice;

‐ S‐au determinat genotipurile individuale prin tehnica PCR‐RFLP;
‐ S‐a stabilit frecvența genotipurilor și alelelor;
‐S‐a determinat nivelul productiv al vacilor sub aspectul
producției de lapte, grăsime și proteină și s‐a efectuat corelarea
acestuia cu genotipul individual;
‐ S‐au calculat și testat din punct de vedere statistic diferențele
productive privind producția de lapte, grăsime, proteină în raport
cu genotipul individual.
 CONCLUZII
‐Pentru locusul k‐cazeinei, genotipul homozigot AA este asociat
unor producții superioare de lapte și grăsime dar și unor
producții reduse de proteină.
‐Producțiile asociate genotipului homozigot BB pentru K‐cn
sunt caracterizate de valori ridicate ale conținutului de proteină
în lapte.
‐Pentru locusul β‐lactoglobulinei genotipul BB este asociat unei
producții ridicate de grăsime în lapte.
‐Valori semnificativ ridicate pentru cantitatea de lapte și
proteină au fost înregistrate în cazul genotipului heterozigot AB
al β‐lactoglobulinei .
‐Genotipul homozigot AA al β‐lactoglobulinei este asociat unor
valori productive foarte reduse pentru toate caracterele incluse
în studiu, producție de lapte, grăsime % și kg, proteină % și kg.