Antibiograma

5.1. Metoda Kirby-Bauer

Antibiograma sau testarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene la agenţi antimicrobieni

constituie una din cele mai frecvente examinări solicitate în primul rând din motive
clinicoterapeutice, dar efectuată şi în investigaţie epidemiologică, cercetare etc.

Ca orice metodă larg practicată, antibiograma trebuie sa fie accesibilă oricărei unităţi şi să
furnizeze rezultate rapide, reproductibile şi uşor utilizabile.

Dintre multiplele metode, procedee şi variante existente, pentru laboratorul clinic se

recomandă metoda difuzimetrică, care este mai uşor de executat, mai economică şi, dacă se respectă
cu extremă stricteţe toate condiţiile de lucru, poate asigura o reproductibilitate mulţumitoare (de cca
90%).

5.1.1. Principiul antibiogramei  difuzimetrică

Prin depunerea discurilor (microcomprimate) cu antibiotice pe suprafaţa unui mediu solid

însămânţat cu o cultură bacteriană, substanţa antimicrobiană activă va difuza în mediu prezentând o
scădere constantă a gradientului de concentraţie, de la marginea discului către periferie.

După un anumit timp de incubaţie – perioada critică - se vor contura 2 zone distincte: una în
care creşterea bacteriană este inhibată de concentraţii de substanţă antimicrobiană şi o zonă de
creştere, în care concentraţia de antibiotic este prea mică pentru a inhiba creşterea.

Cu cât diametru zonei de inhibaţie este mai mare, cu atât germenul este mai sensibil, adică
cantitatea de antibiotic necesară inhibiţiei germenului (concentraţia minimă inhibată= CMI) este
mai mică şi invers.

Există deci o relaţie invers proporţională între diametrul zonei de inhibiţie şi CMI.

Comparând CMI-ul cu nivelul de antibiotic, care se poate obţine în organism (la nivelul
focarelor infecţioase de multiplicare bacteriană), vom putea deduce dacă sunt şanşe de succes
(“germen sensibil”) sau de insucces („germen rezistent”).

 
 

5.1.2. Standardizarea condiţiilor tehnice de lucru ( metoda Kirby-Bauer)

Fiecare din componentele, care concură la efectuarea antibiogramei, pot influienţa diametrul
zonei de inhibiţie mai mare de geloză va condiţiona zone de inhibiţie mai reduse şi invers; un inocul
prea bogat va determina un diametru de inhibiţie mai redus şi invers atc.

În consecinţă, condiţiile tehnice referitoare la mediu de cultură (compoziţie, pH), inocul,

felul discurilor  microcomprimatelor), efectuarea testului, incubarea, trebuie preacis standardizate.

5.1.2.1. Mediu de cultură este geloza Mueller- Hinton (MH) pe considerentul că are o
valoare nutritivă, care permite dezvoltarea optimă a unei mari varietăţi de germeni şi nu conţine
inhibitori ai acţiunii unor substanţe antimicrobiene.

Caracteristici tehnice:

- concentraţia gelozei 1,5-1,7%, raportată la consistenţa dată de o astfel de concentraţie de

agar pulbere:

- pH 7,2-7,4 măsurat înainte de turnarea în plăci (50°C)

- grosimea stratului de geloză = 4mm turnat în plăci cu fundul perfect plat. Pentru realizarea
acestui strat sunt necesari 25-28 ml mediu pentru o placă de 100 mm Ø şi 50-60 ml mediu pentru o
placă cu Ø 120 mm.

Conservare: plăcile scoase din frigider se lasă pe masă timp de o oră şi apoi 10-20 minute la
termostat; nu pot fi utilizate plăci cu lichid de condens pe suprafaţa gelozei sau pe capac sau plăci
prea uscate.

Utilizare: geloza MH se foloseşte ca atare (după topire, răcire la 50oC, control pH şi turnare
în plăci) pentru majoritatea germenilor.

5.1.2.2 Germenul de cercetat - inoculul

Antibiograma este inutilă sau induce în eroare, dacă germenul cercetat nu este neapărat
germenul responsabil al infecţiei, care trebuie tratată.

Este absolut necesar ca inoculul din germenul din cercetat să fie reprezentativ, adică să
cuprindă toate categoriile populaţiei microbiene-uneori eterogenă .Pentru prepararea inoculului, se
va pleca în mod obligatoriu nu de la o colonie, ci de la 4-6 colonii identice dezvoltate pe un mediu
neselectiv.
 Cultura de plecare şi modul de preparare a inoculului:

- Aproximativ 5 colonii separate dezvoltate pe mediu solid neselectiv – în culturi de 16-20

de ore- se suspendă direct în soluţie salină pH 7,2 sau bulion şi se ajustează la turbiditatea standard;

- Culturi în bulion de peste noapte, care se diluează la nevoie până la tubiditatea standard;

- Se repică 4-6 colonii în 5,0 ml bulion nr. 1, se incubează 4-6 ore la 37grade celsius şi se
ajustează la nevoie la turbiditatea standard.

Suspensia nu va fi reţinută mai mult de 15-20 de minute pînă la însămînţarea pe plăci.

Depunerea inoculului se face cu ajutorul unui tampon de vată steril, care se îmbibă cu
suspensia bacteriană; se elimină cu grijă excesul prin presarea şi rotarea completă a tamponului pe
peretele tubului.

Se şterge tamponul pe suprafaţa mediului in 3 direcţii, până la acoperirea uniformă a întregii

suprafeţe, efectuând în final un striu marginal circular.

Uscarea plăcilor inoculate se realizează prin menţinere la temperatura camerei 5-15 minute,
până la depunerea microcomprimatelor.