CURS 3

Biosinteza ADN (Replicarea ADN)

 ADN este depozitul informaţiei genetice din celule.

 replicarea semiconservativă
Catena parentală se dedublează
- 2 catene ADN fiice, fiecare:
- catena parentală A
- catenă nou formată având ca matriţa catena parentală
complementara B .

- proces complex
- complex multienzimatic: replizom.

- Segmentul de ADN sintetizat = copie complementara a unui

segment = replicon, dintr-o catenă parentală matriţă.

 ADN procariot (dimensiuni reduse) va constitui un singur

replicon.
 ADN eucariot (cromozomi) - 100 de repliconi.
- fiecare replicon are un punct de start şi un punct terminal .

1
Replizomul :
- ADN girază( topoizomeraza II ),
- helicază,
- topoizomeraze,
- proteine de stabilizare
- ADN polimeraze.

Etapele replicării:
- Initierea.
- Elongarea.
- Etapa terminala.

1. INIŢIEREA
- despiralizarea celor 2 catene - helicaze
- ruperea legaturilor de H dintre catene - topoizomeraze,
- furca de replicare
- proteine de stabilizare - impiedica respiralarea

1. Topoizomerazele
- reglează formarea structurii suprahelicoidale.
- catalizează separarea şi refacerea catenelor ADN
- modifică numărul de legături de hidrogen din structura ADN.

topoizomeraze I,
- actioneaza la nivelul unei singure catene a ADN,
- relaxează ADN

topoizomeraze II,
- acţionează la nivelul ambelor catene simultan,
- combat torsionarea duplexului ADN - torsiune negativă
printr-o contraspiralare.

Energia necesară este furnizată prin hidroliza ATP, utilizat

pentru restaurarea conformaţiei enzimei.

2. Girazele:
- singurele enzime care introduc o supraspiralare negativă la
nivelul ADN relaxat şi se găsesc numai la bacterii.

- Fiecare din segmentele desfăcute ale celor doua catene

va constitui o matriţa pentru sinteza unei catene noi,
complementare si antiparalele.

2
Noua catena ADN:
 se va sintetiza întotdeauna pe directia 5’ → 3’ .
1. Catena conducătoare = Catena parentala - sensul 3’ - 5’ :
- induce sinteza unei catene noi al cărei sens 5 ’- 3’ va
coincide cu sensul de înaintare al despiralizării (sensul de realizare
al replicării).
2. Catena în întârziere – cea de-a 2 catenă sintetizată:
- avanseaza în sens opus sensului de despiralizare, sinteza
desfăşurându-se mai lent.
- sintetizată discontinuu sub forma unui fragment pentru
fiecare ochi de despiralizare.
- fragmente OKAZAKI.

Sinteza noilor catene:

- ADN polimeraze -
- inseră deoxinucleotide într-o secvenţă
complementară cu cea a catenei parentale matriţă.

Sinteza fragmentului ARN primer (40-80 ribonucleotide):

Complex multienzimatic: primozom
- primază (ARN polimerază ADN dependentă), helicază, matrită
ADN, ribonucleotide trifosfat .

Energia:
- hidroliza a 2 legături fosfat macroergice ATP .
ADN polimeraza I :
- excizionează în totalitate ribonucleotidele din fragmentul
ARN primer
- le înlocuieşte cu dezoxiribonucleotide complementare
catenei parentale.
- vor exista doar catene ADN.
ADN ligaza:
- lipeşte fragmentele OKAZAKI din catena în întârziere
- catena în întârziere se va prezenta sub forma unei catene
unice.
- sinteza se desfasoara foarte rapid

Helicazele si topoizomerazele:
- despiralizeaza cele doua catene rapid,
- in spatele buclei de replicare refac spiralizarea celor
doua ADN fiice rezultate in urma replicarii.

3
 1. Particularităţi ale sintezei ADN la procariote
- un singur cromozom extranuclear şi circular.
- un singur centru de iniţiere a replicării = Ori C din care
porneşte replicarea

2. Particularităţi ale replicării la eucariote

A. Diferenţa de mărime si structura ADN.

Procariote:
- creşterea rapidă, după sinteza ADN are loc imediat diviziunea
celulară.
- există un cromozom dublu circular cu localizare
citoplasmatică.
- Viteza de sinteza mai mare, 15 000 nucleotide/sec
Eucariote:
- sinteza ADN şi a histonelor este doar o fază a ciclului celular
(faza S), diviziunea având loc în faza M.
- ADN are mai multe nivele de condensare care încep cu
nucleozomi şi se termină cu cromozomii.
- viteză de sinteză mult mai redusă - 2500 nucleotide/sec
datorita:
a. Număr mai mare de repliconi
b. Numărul de molecule de ADN polimerază este mult mai
mare faţă de numai câteva zeci la procariote.
c. Numărul de tipuri de ADN polimerază.
- In timp ce la procariote avem un tip de ADN polimerază, la
eucariote avem cel puţin 4 cu acţiune specializată şi anume:
 ADN polimeraza σ ce realizează sinteza catenei
conducătoare.
 ADN polimeraza  care are rolul de reparare a erorilor
în catena.
 ADN polimeraza  sintetizează catena în întârziere.
 ADN polimeraza  care este specifică pentru
mitocondrie.
B. Centrul de origine (complex de recunoaştere a originii de
replicare)
- Procariote - centru este fix (Ori C),
- Eucariote - centru este variabil.

Ciclinele şi kinazele dependente de cicline (CDK) -

- controlează ciclul celular

4
 - degradarea lor - inhibiţia diviziunii celulare

C. Replicarea capetelor cromozomilor - telomerii

- regiuni de mărime variabilă
- secvenţe repetitive de 6 nucleotide - TTAGGG - repetate
de mii de ori.
Rol:
- protejează cromozomii de atacul nucleazelor
- blochează fuzionarea cap la cap a cromozomilor
- noile catene sintetizate vor avea capete mai scurte.
- se estimează ca fiecare telomer pierde 100 pb la fiecare
mitoza.
- după 125 de diviziuni mitotice, telomerii vor dispărea complet.
- celulele umane se divid de aproximativ 100 de ori, dar
frecvenţa de replicare scade cu vârsta .
telomeraza:
- activitate enzimatică de tip reverstranscriptază (ADN
polimerază ARN dependentă).
- menţine lungimea constantă a secvenţelor telomerice ale
cromozomilor, având o activitate maximă la celulele embrionare.
- după naştere activitatea scade, astfel că în stadiul adult
activitatea telomerazică este 0.
- la fiecare replicare a celulelor somatice cromozomii
devin tot mai scurţi.
- În momentul în care această scurtare ajunge la nivelul
secvenţelor codante ale cromozomilor apare instabilitatea
cromozomială, proces caracteristic îmbătrânirii celulelor.

- lungimea telomerilor este considerată ca fiind ceasul

biologic al celulelor şi implicit al organismului.

Celule canceroase:
- telomeraza redevine activă
- celulele tumorale se pot divide la infinit fără a-şi scurta
cromozomii,
- pot fi considerate nemuritoare
telomeraza - ţintele terapiei anticanceroase.

5
 Sinteza ADN pe matriţă de ARN
Virusurile oncogene:
- conţin numai ARN (retrovirusuri)
- reverstranscriptază (ADN polimerizează ARN
dependentă) .
- introducerea ARN-ul în celula gazdă
- reverstranscriptaza virală, utilizeaza ARN-ul propriu ca
matrice, va sintetiza o catenă ADN complementară.
- ADN-ul complementar se autoreplică
- sub formă dublu catenară, intră în nucleu unde se inseră
în ADN-ul celulei gazdă.
- initiază transcriptia urmată de translaţie,
- ARN şi proteine virale = copii virale multiple .

Reverstranscriptaza:
- nu are activitate reparatorie (3’-5’ exonucleazică).
- erori de replicare
- modificarea genomul viral.
- numărul enorm de tulpini virale
- modificarea rapidă a acestora în cursul proceselor de
multiplicare.
HIV:
- mutaţii produse rapid,
- eficienţa redusă a tratamentelor

Modificări ale ADN în cursul procesului de replicare

- erorile de replicare.
- nucleotidă eronată la fiecare 104-105 nucleotide inserate.
Prevenirea:
ADN polimerazele :
- acţiune reparatorie de tip 3’-5’ exonuclează şi 5’-3’ polimerază.
- detectează nucleotidele încorporate greşit si le înlocuiesc cu
nucleotide corecte.
- fidelitate deosebită
- 1 nucleotida gresită la 109 nucleotide corecte
- 3-5 erori pe ADN celular
- numarul de erori generate prin replicare devine urias
- modificarile ADN induse de factori interni sau externi
-modificarile patologice ale ADN celular .

Mutaţii ADN

6
 - schimbările transmisibile ereditar ale materialului
genetic.
- celulele somatice şi germinale
- aparitia patologiei
- procesele de reparare sunt continue şi indispensabile .
Leziunile:
- direct reparate sau îndepărtate.

Cheia acestor procese de reparare:

- natura dublu-catenară a ADN, ce conţine informaţia genetică în
duplicat, ceea ce permite restaurarea secvenţelor alterate folosind
ca model informaţia de la nivelul celeilalte catene.
- spontane sau consecutive unor modificări la nivelul
bazelor azotate.
- izomerizarea bazelor azotate
- dimerizarea timinei sub acţiunea radiaţiilor UV
- dezaminarea unor baze
Deosebim:
a) Macroleziuni ale ADN
1. Deleţiile (amputări ale materialului genetic de dimensiuni
variabile)
2. Duplicări şi amplificări ale materialului genetic
3. Fuziuni de gene
4. Inversiuni ce constau în inversarea sensului unui segment
5. Inserţii de secvenţe ADN de lungimi variabile.
- dificil de reparat,
- moartea celulară.
b) Microleziunile ADN (mutaţii punctiforme)
- modificarea unei singure perechi de baze.
1. Tranziţionale (nucleotidă purinică este înlocuită tot cu o
nucleotidă purinică sau o nucleotidă pirimidinică este
înlocuită tot cu o nucleotidă pirimidinică)
2. Transversale (nucleotidă purinică este înlocuită cu o
nucleotidă pirimidinică sau invers)
3. Mutaţii non-sens
- înlocuirea unei perechi de baze cu alta
- rezultă un codon stop care va bloca sinteza proteinei
codificate.
4. Mutaţii missens
- o pereche de nucleotide este înlocuită cu alta,
- rezultă un alt codon,
- generarea unui alt aminoacid în proteina codificată
de genă,

7
 - modificarea structura primara si functia biologica a
proteinei respective.
5. Mutatii ale cadrului de citire
- se adauga /elimina o pereche de nucleotide .
- modificarea completa - secventa nucleotidica organizata
in codoni, anulandu-se sinteza ARN transcriptionat de
gena respectiva .
6. Mutatii mute
- înlocuirea unei nucleotide cu alta
- nu afectează secvenţa de aminoacizi a proteinei
codificate.
- efectele mutaţiilor sunt mai reduse.

Cele mai comune mutaţii:

- substituţia unei perechi de baze cu alta
- procesul spontan de tautomerizare al bazelor azotate
- agenţilor chimici
- radiaţiilor ultraviolete.
 HNO2 acidul azotos, modifică prin dezaminare bazele
azotate ce conţin grupare amino.
 adenina va trece în hipoxantină, guanina în xantină, iar
citozina în uracil. Hipoxantina se va împerechea cu
citozina, uracilul cu adenina, producându-se astfel
mutaţii de tip tranzitie A-T  C- G .
 compuşii aromatici policiclici - mutaţii ale cadrului de
citire, prin inserţia sau deleţia uneia sau a mai multor
perechi de baze .
 Radiaţiile ultraviolete
- cel mai comun agent de lezare al ADN.
- dimeri de pirimidină - blochează procesele de replicare /
transcripţie,
 expansiunea (multiplicarea) tripletelor.
Tripletele = secvenţe repetitive simple = microsateliţii - frecvenţă
mare la nivelul genomului.
- segment poliaminoacidic in secventa proteinei codificate de
genă - modificări structurale
- activitate biologica modificata.
Ex. - expansiunea tripletelor CAG în diferite forme de cancer.

Repararea mutaţiilor ADN

Replicării ADN - nu este de 100%.

8
ADN:
- procese de alterare datorate agenţilor fizici (radiaţii) şi chimici
(radicali de oxigen liberi).
Mecanismele de reparare ale ADN :
1. Repararea directă
- modificările sunt înlăturate fără a întrerupe catena ADN.
Ex. – fotoreactivarea - fotoliaze, ce acţionează asupra mutaţiilor
produse de radiaţiile UV făcând din acestea leziuni reversibile.
- mecanism specific de îndepărtare prin fotoliză a dimerilor
de ciclobutan pirimidină, leziunea majoră produsă de
radiaţiile UV.
ex. - demetilarea bazelor incorect alchilate, sub actiunea unor
agenţi carcinogeni.
2. Repararea prin excizia bazelor azotate
3. Repararea prin excizia nucleotidelor modificat
4. Repararea in cursul proceselor de replicare sau transcripţie
5. Repararea bazelor nepotrivite „mis- match”
- recunoaşterea - metilarea catenei nou sintetizate
- complex proteic codificat de gene MSH şi MLH la om.
- recunoaşte baza ataşată greşit şi o marchează printr-o
incizie.
- exonucleaze
- defectele care intervin în acest tip de reparare pot cauza
cancerul de colon non-polipozic ereditar

6. Repararea in cursul proceselor de replicare sau transcripţie

- mutaţiile pot împiedica replicarea sau transcripţia.
- replicarea întârziată datorită abilităţilor de corectare ale
polimerazelor, care împiedică ataşarea nucleotidelor în
locul opus unei leziuni.
- sistem de reparaţie specific: proteina REC (recombinare).
- Repararea golului apărut la nivelul catenei fiice - recombinare
post - replicativă, ce permite transferul unui fragment din catena
parentală la nivelul golului.
Rupturile dublu-catenare, potenţial letale sunt reparate prin
recombinare omoloagă
7. Cuplarea reparării cu transcripţia:
- formă de reparare prin excizie declanşată de complexul ARN
polimerazei blocat
- direcţionează repararea spre catena matriţă a regiunii
transcrise,
- leziuni sunt mult mai repede reparate.

9
Patologia reparării ADN
- boli a căror cauză o constituie defecte ale enzimelor implicate în
repararea ADN.
Cancerul de colon ereditar nonpolipozic (sindromul Lynch)
- defect în repararea postreplicativă a mutaţiilor de împerechere
nepotrivită a bazelor.
- incidenţa bolii este de 1 : 200,
- defectele sunt localizate la nivelul genelor enzimelor de
reparare MSH şi MLH.

De ce timina ?

Cercetările legate de descifrarea procesele reparatorii la nivelul

ADN au dat răspunsul la o întrebare veche:
 de ce avem timină ( 5-metil-uracil ) în ADN şi nu uracil, ca
în ARN ?
Explicaţia:
- mutaţiile generate prin dezaminarea citozinei produc uracil, care
este recunoscut ca bază modificată de enzimele de reparare şi
îndepărtat.
- Timina, uracil metilat, este recunoscută ca bază corectă.
- în absenţa timinei, uracilul corect nu ar fi putut fi deosebit de
uracilul rezultat prin modificarea citozinei şi astfel procesele
reparatorii nu ar mai fi fost eficiente.
- transformarea citozinei în uracil produce mutatii de tipul G - C 
A-T

Controlul sintezei ADN se desfăşoară în timpul ciclului celular

- replicarea genomului ADN se produce doar într-un anumit

moment specific de pe durata desfăşurării ciclului celular, (faza de
sinteză sau faza S).
- este separată de faza mitotică M;
- prin faze de nesinteză denumite gap 1(G1) şi gap
2(G2), ce apar înaintea şi respectiv după faza S.
- celula se pregăteşte de sinteza ADN în faza G1, iar
pentru mitoză în faza G2.
- toate celulele eukariote prezintă gene ce controlează
trecerea de la o fază la alta a ciclului celular.
 Ciclinele
- familie de proteine, a căror concentraţie creşte şi
descreşte pe parcursul desfăşurării ciclului celular

10
 - activează diferite proteinkinaze ciclin-dependente (CDKs),
care fosforilează substrate esenţiale în progresia ciclului celular.
Ex.
- Ciclinele D activează CDK 4 şi CDK 6. Aceste două kinaze sunt de
asemenea sintetizate în timpul fazei G1 de către celule care se divid
activ.
- Ciclinele D, CDK 4 şi CDK 6 sunt proteine nucleare care formează
un complex spre sfârşitul fazei G1.

Oncovirusurile şi genele inductoare de cancer (oncogene)

 capabile să întrerupă restricţia aparentă, care în mod normal

controlează trecerea celulelor la mamifere din faza G1 în faza
S.
 producţia în exces sau la un timp nepotrivit de cicline poate
caracteriza diviziunea celulară anormală sau necontrolată.

Celulele eukariote si-au dezvoltat mecanisme speciale pentru a

monitoriza integritatea materialului genetic.

- un număr de sisteme complexe de subunităţi enzimatice sunt

implicate în repararea ADN distrus la nivelul secvenţei de
nucleotide.
- nepotrivirile structurale ale ADN sunt monitorizate şi reparate,
integritatea ADN la nivel cromozomial fiind monitorizată continuu
pe tot parcursul ciclului celular.
- Cele patru etape monitorizate au fost denumite puncte de control
„checkpoints control”.
- Dacă apar probleme la nivelul oricărui punct de control, progresia
prin ciclul celular este întreruptă şi trecerea prin ciclul celular este
amânată până ce defecţiunea este reparată.

Puncte de control activate de alterarea ADN

2 gene implicate in raspunsul celular: ATM si p53

Supresorul tumoral p53:

- proteină cu masă moleculară de 53 kDa,
- rol cheie în punctele de control G1 şi G2.
- factor proteic de transcripţie, ce se leaga de ADN.
- face parte dintr-o familie de proteine înrudite, care sunt stabilizate
ca răspuns la distrugerea ADN.

11
- la concentraţii crescute activează transcripţia unui ansamblu de
gene care contribuie la întârzierea tranzitului prin ciclul celular,
până când leziunea ADN va fi reparată.
- dacă leziunea ADN este prea extinsă pentru a putea fi reparată,
celulele afectate vor fi supuse apoptozei, dependentă de proteina
p53.
- Celulele lipsite de proteina funcţională p53, nu vor fi supuse
apoptozei în condiţiile administrării de radiaţii sau agenţi
chimioterapeutici care inactivează ADN.
- gena proteinei p53 este una dintre genele ce prezintă o rată
ridicată a mutaţiilor, dintre care mutaţiile ce reduc expresia genei
sunt asociate cu majoritatea tipurilor de cancer .

Agenţi chemoterapeutici implicaţi în replicare

AG. ANTIBACTERIENI
- blocarea multiplicării celulare a agentului bacterian poate fi
realizata prin utilizarea unor substanţe (antibiotice) ce inhibă
activitatea unor componente ale procesului de replicare.
1. Fluoroquinolonele (norfloxacin, lomefloxacin, fleroxacin,
ciprofloxacin, enoxacin, trovafloxacin novobiocina, acidul
nalidixic) sunt inhibitori ai topoizomerazelor legându-se la
complexul enzimă-ADN.
2. Metronidazolul realizează rupturi la nivelul catenelor ADN
microbiene .
AG. ANTICANCERIGENI
- substanţe care inhibă replicarea ADN din celulele canceroase,
blocând astfel dezvoltarea procesului tumoral.
1. Agenţi de alchilare:
2. Agenti ce blocheaza topoizomerazele:
3. Agenţi ce blochează formarea fusului mitotic (Vincristina,
Vinblastina, etc).
4. Agenti ce hiperstabilizează microtubulii, blocând astfel
diviziunea celulară.

12