Sunteți pe pagina 1din 18

U.S.AM.V.

Facultatea de Biothenologii

LACTAT
DEHIDROGENAZA

Coordonator științific:
Asisten dr. Simion Vasilica

Absolentă:
Baltoiu Mădălina Cornelia
Grupa: 6202

București
2016
CUPRINS
Introducere
Capitolul I - ENZIMELE - generalități
I.1. Clasificarea enzimelor
Capitolul II - LACTAT DEHIDROGENAZA
I.1. Lactat dehidrogenaza – generalități
I.2. Determinarea activității lactat dehidrogenazei
I.2.1. Dozarea LDH prin metoda spectrofotometrică (cinetică)
Concluzii

2
Introducere

Enzimele sunt macromolecule de natură proteică, ce au


rol de catalizatori în reacţiile din organismele vii .
Termenul de enzimă a fost introdus de Kühne în 1878 şi
înseamnă în drojdie, ceea ce arată că activitatea enzimelor
catalizatori ai reacţiilor biochimice nu este legată de viaţa
celulei de drojdie.
Enzima a existat din cele mai vechi timpuri, dezvoltându-
se pe baze empirice, pe experienţa câştigată de generaţii.
În ultimii ani enzimologia s-a dezvoltat exploziv, pe baza
unor cercetări ample privind structura enzimelor, mecanisme de
reacţii studiate la nivel electronic și cuantic, integrarea şi
reglarea proceselor enzimatice în cadrul metabolismului
intermediar. Sinteza chimică a unor enzime reprezintă una din
marile performanţe ale enzimologiei moderne – ce deschide
calea unor importante posibilităţi de aplicabilitate teoretică şi
practică. S-au obţinut preparate enzimatice înalt
purificate(proteaza, pectinaze, amilaze, ribonucleaze,
celulaze, etc.) în stare liberă sau imobilizate pe suporturi
solide, care deschid perspectiva obţinerii unor complexe
multienzimatice, utilizate ca medicamente, ca senzori
enzimatici pentru poluare, în microbiologie, în industria
alimentară, în industria medico-farmaceutică, în menaj.
Printre factorii care determină calitatea alimentelor ,
gustul şi mirosul joacă un rol important. Complexul de senzaţii
compus din gust şi miros formează arma. Substanţele aromate
pot exista ca atare în legume şi fructe sau se formează după
recoltare sub influenţa activităţii diferitelor enzime al căror

3
substrat poate fi aminoacizi, zaharide, derivaţi , lipide , acizi
graşi sau alte substanţe numite precursori aromatici.
În general substanţele aromatizante sunt uşor volatile şi
în timpul conservării se pierd. Produsul conservat îşi pierde de
cele mai multe ori aroma de produs natural proaspăt şi capătă
în schimb alte caractere organoleptice.
Cercetătorii au constatat că prin sterilizare termică se
distrug pe lângă alte enzime şi enzimele ce caracterizează
formarea substanţelor aromatizante dar nu se distrug
precursorii substanţelor aromatizante. Dacă la procesul
alimentar conservat se adaugă preparate enzimatice extrase
din produsul natural (sau din
altă plantă din aceeaşi familie), alimentul conservat
redobândeşte gustul şi mirosul specific al produsului crud.
Botanica şi chimia agricolă aplică analiza enzimatică în cercetarea
fiziologiei plantelor, în controlul calităţii unor produse vegetale. Studiile privind
comportamentul la ger şi la secetă a unor plante de cultură folosesc analiza
enzimatică.
Calitatea seminţelor este testată prin activitatea enzimatică a proteinelor,
a alfa – amilazei. Folosirea preparatelor enzimatice pentru hidroliza
materialelor celulozice, deschide perspective transformării superioare a unor
reziduuri vegetale sau animale.
Enzimele îşi găsesc o largă aplicabilitate şi în microbiologie.
Microorganismele sunt crescute în medii de cultură încât pot produce cantităţi
mari dintr-o gamă variată de substanţe organice.
În industria chimică enzimele sunt utilizate atât ca reactivi chimici de
analiză, cât şi ca reactivi chimici de sinteză. În domeniul chimiei, proteinelor nu
li se poate concepe studiul secvenţei de aminoacizi a unei proteine fără utilizarea
metodelor de hidroanaliză enzimatică cu proteinoze.

4
În chimia analitică sunt folosiţi electrozi enzimatici sensibili la
concentraţia diferitelor substanţe.
În chimia preparativă se folosesc diferite transferaze pentru grefarea
unor grupări de compuşi organici rezultând substanţe noi, ce se obţin greu prin
metode chimice clasifice. Preparatele enzimatice sunt folosite în industria
textilă, industria tăbăcăriei, blănurilor, în curăţătorii chimice.
Importanţa deosebită a enzimelor explică varietatea domeniilor de
aplicabilitatea
acestora.
Capitolul I
ENZIMELE - generalități

Enzimele sunt substanţe organice care catalizează reacţiile de sinteză şi


de degradare din organisme.
În general, enzimele acţionează asemănător catalizatorilor
neenzimatici:
- acţionează in cantităţi extrem de mici, dar manifestă o activitate extrem de
intensă;
- nu se consumă şi nu se transformă in reacţiile catalizate;
- catalizează reacţii termodinamic posibile, adică reacţii care corespund unei
diminuări a energiei libere;
- nu modifică starea finală de echilibru a reacţiilor ci numai viteza cu care se
realizează acest echilibru.
Reacţiile catalizate de enzime se numesc reacţii enzimatice, iar
substanţa care este transformată se numeşte substrat.
În organismele vii sinteza enzimelor are loc in toate celulele.
Studiul enzimelor obţinute in stare pură a dus la concluzia că ele sunt
substanţe de natură proteică. Unele sunt holoproteine, iar majoritatea sunt
heteroproteine.
Substratul (S) reprezintă compusul chimic de care se poate lega o enzimă
5
(E) cu formarea unui complex activat enzimă-substrat S + E « ES. Această
fixare se face in zone bine determinate de pe suprafaţa enzimei, numite "centri
activi" sau "situsuri catalitice" care sunt formate din resturi de aminoacizi din
catena polipeptidică, apropiaţi in spaţiu in urma plierii lanţului de aminoacizi.
Enzimele heteroproteice (cu structură binară) sunt formate din două
componente: una proteică nedializabilă şi termolabilă numită apoenzimă şi alta
neproteică, dializabilă şi termostabilă numită coenzimă.
În procesul biochimic, apoenzima fixează substratul şi determină şi
specificitatea de acţiune, adică direcţia reacţiei, iar coenzima participă in mod
esenţial la transformarea enzimatică. Aceste enzime prezintă de obicei doi centri
activi: unul situat in fragmentul proteic (situsul catalitic), iar celălalt in zona din
moleculă la care se ataşează coenzima.
Coenzimele sunt reprezentate de substanţe cu structură diferită, multe
din acestea fiind vitamine sau derivaţi ai acestora, hormoni, metale etc.
Situsul allosteric, aparţinand unei clase speciale de molecule proteice, se
caracterizează sub aspect structural prin două trăsături generale distincte, in
stransă corelaţie şi anume: zone care sunt esenţiale pentru manifestarea
activităţii catalitice (situs catalitic) sau pentru funcţia de reglare a unor secvenţe
de reacţii (situs allosteric).
O serie de enzime oligomere (formate din mai multe subunităţi)
denumite şi enzime allosterice care au rolul de reglare enzimatică, conţin in
molecula lor, pe lângă situsul catalitic şi un al doilea situs numit "situs
allosteric"
O caracteristică esenţială a enzimelor este marea lor specificitate, adică
ele acţionează catalitic asupra unui singur substrat sau a unei grupe de substanţe
cu caracter chimic comun şi catalizează numai anumite reacţii. Deci
specificitatea este de substrat şi de acţiune.
Specificitatea de substrat.
Există unele enzime care au specificitate absolută. De exemplu ureaza
(ureamid-hidrolaza) catalizează numai reacţia de scindare a ureei in dioxid de
6
carbon şi amoniac. Altele au insă specificitate relativă, de exemplu pepsina
hidrolizează toate tipurile de proteine.
Un caz deosebit este specificitatea stereochimică, adică o enzimă
acţionează numai asupra unuia din izomerii unui substrat, preferându-l în raport
cu alt izomer. Se cunoaşte faptul că numai glucidele din seria sterică D sunt
asimilate şi aminoacizii din seria sterică L.
Specificitatea de acţiune este insuşirea unor enzime de a alege, dintre
toate reacţiile posibile, numai una pe care o vor cataliza. Pentru aceasta, energia
de activare este atat de mult coborată, încat se poate stabili echilibrul.
De exemplu, un L-aminoacid poate suferi decarboxilarea numai sub
acţiunea decarboxilazelor, iar transaminarea numai sub acţiunea
transaminazelor. Deci fiecare enzimă manifestă o anumită specificitate de
acţiune; specificitatea enzimelor se datorează in mare măsură apoenzimei.

I.1. Clasificarea enzimelor

Această clasificare a enzimelor este realizată de comisia de enzime a


uniunii internaţionale de chimie pură şi aplicată(IUPAC):
1. Oxido-reductaze - catalizează reacţiile de oxidă reducere prin transfer de H2
sau electroni prin combinarea unui substrat de O2;
2. Transferaze - catalizează transferul unei grupări chimice, alta decât protonul
de la un substrat la altul;
3. Hidrolaze - catalizează hidroliza legăturilor peptidice, glucozilice, a esterilor
din diferite substraturi prin adiţia apei;
4. Liaze - catalizează scindarea legăturilor din molecule pe alte căi decât în
prezenţa apei;
5. Izomeraze - catalizează izomerizarea optică, geometrică şi în funcţie de tipul
de rearanjare moleculară racemaze, cistrans, izomeraze, etc;
6. Ligaze - catalizează formarea legăturilor covalente dintre molecule cu consum
energetic preluat din compuşi.
7
Capitolul II
LACTAT DEHIDROGENAZA

I.1. Lactat dehidrogenaza – generalități

Este o enzimă intracelulară, larg distribuită în organism, fiind întâlnită cu


precădere în rinichi, miocard, musculatura scheletică, creier, ficat și plămâni
(Fig.II.1).

8
Figura I.1. Lactat dehidrogenaza
https://en.wikipedia.org/wiki/Lactate_dehydrogenase

LDH are o greutate moleculara de aproximativ 140.000 daltoni.


Actuala clasificare și nomenclatură a enzimelor se bazează pe principiile
și regulile stabilite de către Comisia de Enzime a Uniunii Internaționale de
Biochimie. Această comisie a prezentat un sistem numerotat codificat, criteriul
esențial de clasificare constituindu-l tipul de reacție chimică catalizată de
enzimă. Conform acestuia, fiecare enzimă este codificată printr-un număr format
din 4 cifre despărțite ărin puncte. Toate enzimele cunoscute s-au încadrat în 6
clase (grupe). Cele patru cifre prin care se indentifică o enzimă vor reprezenta în
ordine: clasa, subclasa, subsubclasa și poziția pe care o deține enzima în
subclasă.
9
Astfel, lactat dehidrogenaza aparține la clasa 1, subclasa 1, subsubclasa
1, poziția 27, deci se codifică: 1.1.1.27.
Lactat dehidrogenaza este un tetramer compus din două subunități: una
musculară (M) și una cardiacă (H). Subunitățile sunt codate de gene diferite și
apar asfel 5 izoenzime, LDH1-LDH5.
LDH (lactat dehidrogenaza) este prezent în citoplasma celulelor și
participă în stadiul final al glicolizei la – interconversia piruvatului și lactatului
(Fig. II.1.).

Figura II.2. Piruvat redus la lactat

LDH este un indicator nespecific de lezare tisulara. Pentru a identifica


sursa cresterii nivelului enzimatic sunt necesare izolarea si cuantificarea celor 5
fractiuni diferite ale LDH-ului rezultate prin combinarea in diferite proportii a
celor doua tipuri de monomeri H si M: LDH-1 (H4), LDH-2 (H3M), LDH-3
(H2M2), LDH-4 (HM3) si LDH-5 (M4).
Subunitățile nu sunt active din punct de vedere biochimic.
Specificitatea tisulara deriva din faptul ca in anumite tesuturi exista
sinteza specifica de diferite subunitati in raporturi bine definite. Astfel celulele
cardiace, eritrocitele si rinichii sintetizeaza preferential subunitati H (LDH-1
-H4), in timp ce hepatocitele sintetizeaza aproape exclusiv subunitati M.
Musculatura striata scheletala produce, de asemenea, in mare masura, subunitati
M, astfel incat LDH-5 creste atat in afectiuni hepatice cat si musculare. LDH-1
si LDH-5 sunt cel mai adesea utilizate pentru a indica patologie cardiaca sau
hepatica. LDH-2 se gaseste in eritrocite, inima, rinichi, sistemul

10
reticuloendotelial, LDH-3 se intalneste preferential in plamani, limfocite si
pancreas, iar LDH-4 in musculatura striata, ficat, rinichi sau pancreas.

I.2. Determinarea activității lactat dehidrogenazei

Enzima lactat dehidrogenaza localizată în citoplasmă se determină


histoenzimatic printr-o colorație albastru închisă (Fig.II.3.). Se utilizează ca
substrat lactat de sodiu în tampon fosfat pH 7,8 si NAD +, iar pentru vizualizarea
produsului o sare de tetrazoliu. Incubarea s-a făcut timp de 10 minute la 37ᴼC.
Locurile tisulare cu activitate enzimatică se evidentiază printr-o coloratie
albastra-indigo.

Figura II.3. Activitatea LDH – cu săgeți sunt marcate zonele cu actvitate


enzimatică intensă
Lactat-dehidrogenaza (LDH) poate fi determinată din ser sangvin sau din
omogenat tisular.
Reactivul conţine: tampon fosfat disodic (50 mM, pH 7,5), NADH+H +
(0,1 mM) şi piruvat (1 mM). Se calculează volumul fiecărui reactant astfel încât
volumul total de reacţie să fie de 2000 μl, din care 1900 μl reactiv şi 100 μl ser
sau omogenat tisular. Reacţia este declanşată în cuva spectrofotometrului, prin
adăugarea probei (ser sau omogenat tisular) care conţine enzima. Lungimea de
undă la care se face citirea este de 365 nm; se urmăreşte scăderea concentraţiei
NADH din mediul de reacţie (scăderea extincţiei) prin citiri succesive la

11
intervale de un minut, atâta timp cât reacţia se desfăşoară aproximativ liniar (4-5
min.).
Determinarea activității LDH în ficat, creier și ser.
Activitatea LDH a fost măsurata prin metoda Horecker și Kornberg.
Reacția a fost realizată în cuvă de cuarț. Amestecul de reacție (3 ml) contine 1
ml tampon 0,2 M Tris-HCI (pH 7,4),0.15 ml 0,1 M KCI, 0.15 ml 50 mM piruvat
de sodiu, 0.20 ml de 2,4 mM NADH și solutie corespunzatoare de enzima
diluata. Activitatea enzimatică a fost monitorizată prin scăderea absorbanței la
lungimea de unda 340 nm timp de 3 min. Amestecul de reacție fără enzimă
proteică a servit ca martor în acest sistem de testare

I.2.1. Dozarea LDH prin metoda spectrofotometrică (cinetică)

Principiul metodei
Lactat dehidrogenaza (EC 1.1.1.27: L-lactat: NAD+ Oxidoreductaza;
LDH) catalizează conversia piruvatului la L-lactat în prezenţa NADH, care este
transformat în NAD+.
Viteza de conversie NADH/NAD+ este măsurată la 340 nm, şi este
proporţională cu activitatea LDH.
Proba
Ser nehemolizat, proaspat.
Plasma heparinizata.
Mod de lucru
Într-o eprubeta se pipeteaza 1 ml amestec R1 + R2 si 10 μl ser sau
plasmă.
Se agită și se incubează timp de 1min la 370C.
Se măsoară variația absorbanței la λ = 340 nm față de apa distilată, în
cuve de 1 cm, timp de 3 min., la fiecare minut.
Se calculează variația absorbantei pe minut (ΔA/min).
Calcul
12
CP = (ΔA/min) x 16030 in U/l
unde: CP – concentratia probei
ΔA/min – variatia absorbantei pe minut
Factor de conversie: U/L x 0.0167 = μkat/L.
Valori normale
Adulți 135 - 225 U/l
Sugari 0 – 1 an 225 – 600
Copii 2 – 14 ani 120 - 300
Variații fiziologice – crește in efort fizic
Variații patologice
Valori crescute:
• în infarctul miocardic apar niveluri crescute de LDH la 36-55 ore de la debut,
care persista 3-10 zile;
• în infarctul pulmonar creșterile LDH se înregistrează în decurs de 24 ore de la
debutul durerii toracice;
• insuficienta cardiacă congestiva, afecțiuni hepatice (ciroză, alcoolism, hepatita
acuta virală), tumori solide, leucemii, limfoame, hipotiroidism, afecțiuni
musculare (distrofii, traumatisme), anemii megaloblastice și hemolitice,
convulsii, delirium tremens, soc, hipoxie, hipotensiune, hipertermie, infarct
renal, pancreatita acuta, fracturi, obstructie intestinala, mononucleoza
infectioasă.

Valori scăzute:
• se asociază cu un răspuns bun la terapia citostatică.

I.3. Aplicații

Determinarea LDH este utilă pentru diagnosticul retroactiv al infarctului


miocardic, stabilirea gradului de activitate a bolii în alveolita fibrozantă
criptogenică și în alveolită alergică extrinsecă, marker al hemolizei  in vivo 
13
(anemii hemolitice) sau  in vitro  (artefact), monitorizarea terapiei citostatice în
diverse tumori. LDH crește în infarctul miocardic, infarctul pulmonar,
insuficiența cardiac congestivă, afecțiuni hepatice (ciroza, alcoolism, hepatita
acuta virală), tumori solide, leucemii, limfoame, hipotiroidism afectiuni
musculare (distrofii, traumatisme), anemii megaloblastice si hemolitice,
convulsii, delirium tremens, soc, hipoxie, hipotensiune, hipertermie, infarct
renal, pancreatită acută, fracturi, obstrucție intestinală, mononucleoza
infectioasă.

Concluzii

Creșteri ale LDH-1 si LDH-2 sugerează existența unui infarct miocardic


sau a unei anemii, iar LDH-4 si LDH-5 în leziunile hepatice și procesele
neoplazice (care apar in proliferarea anormala a celulelor-tumori).
Determinarea activității LDH se bazează pe transformarea NADH în
NAD+ în prezența substratului (piruvat).
Viteza de oxidare a NADH este proporțională cu activitatea LDH.
Izoenzimele LDH pot fi separate din ser prin electroforeza pe folii de acetat de
14
celuloză, în gel de amidon, agar, poliacrilamidă și pot fi vizualizate printr-o
reacție de culoare. În plus, anticorpii monoclonali ( technica Western Blot) pot fi
utilizați la detecția izoenzimelor.
De exemplu, se pot obține unii markeri (indicatori) tumorali pentru
fosfataza acidă (din prostată), fosfataza alcalină (din placentă) sau
deoxinucleotid transferaza. Măsurarea activității enzimatice nu constituie o
evidență suficientă pentru diagnosticarea bolilor și de aceea aceasta se face
împreună cu stabilirea unor simptome sau a altor tipuri de analize.
LDH este o enzimă intracelulară larg distribuită în organism, fiind
întalnită cu precadere în rinichi, miocard, musculatură scheletică, creier, ficat și
plămâni. 
Deși cresterile LDH sunt nespecifice, testele sunt utile pentru
confirmarea diagnosticului de infarct miocardic sau pulmonar. În infarctul
miocardic persistenta nivelului LDH crescut este mai îndelungată decât a
celorlalte enzime.
LDH1 existǎ în ţesuturile cu metabolism predominant oxidativ (creier,
inimǎ, rinichi); în aceste ţesuturi e favorizatǎ sinteza izoenzimelor de tip H;
LDH5, LDH4 exitǎ în ţesuturile cu metabolism predominant glicolitic (muşchi
scheletic); în aceste ţesuturi e favorizatǎ sinteza izoenzimelor de tip M; cele
douǎ catene H şi M sunt distincte între ele.

În infarctul miocardic acut, LDH este aproape întotdeauna crescut, încǎ


din primele 10-12 ore de la debut, atingând un vârf dupǎ 48-72 de ore.
Persistenţa valorilor crescute timp de 10-14 zile este utilǎ pentru diagnosticul
mai târziu la primul consult al pacientului dupǎ o perioadǎ suficient de lungǎ
astfel încât valorile CPK şi GOT sǎ devinǎ normale.
Valori ale LDH mai mari de 2000U/l sugereazǎ un prognostic foarte
rezervat. Deoarece existǎ numeroase afecţiuni în care valorile LDH cresc, este
necesarǎ şi determinarea activitǎţii izoenzimelor LDH1 şi LDH2. Valorile LDH1

15
pot rǎmâne crescute chiar dacǎ cele ale LDH total revin la normal. În infarctele
minore, LDH1 poate fi crescut, în timp ce LDH total prezintǎ valori normale. În
IMA asociat cu insuficienţa cardiacǎ congestivǎ pot apare valori crescute ale
LDH1 şi ale LDH2. În insuficienţa cardicǎ congestivǎ propriu-zisǎ, valorile
izoenzimelor LDH sunt normale.
Introducerea valvelor intracardiace prostetice determinǎ constant
hemoliza cronicǎ însoţitǎ de creşteri ale LDH total, ale LDH 1 şi LDH2. Astfel de
creşteri apar şi înainte de intervenţiile chirurgicale la pacienţii cu modificǎri
hemodinamie severe ale valvelor cardiace.

Tabel 1. Creşteri ale izoenzimelor LDH în diferite tipuri de afecţiuni

Afecţiunea Izoenzime LDH

crescute
Infarct miocardic acut I şi II
Infarct cortical renal acut I şi II
Anemie pernicioasǎ I
Şocuri electrice şi termice, V
traumatisme
IMA cu congestie hepaticǎ acutǎ I şi V
Limfoame maligne III şi IV
Carcinom de prostatǎ V
Embolie pulmonarǎ şi infarct II şi III
Dermatomiozite V

Determinarea activitǎţii LDH este utilǎ şi în cazul respingerii acute a


transplantului de inimǎ deoarece LDH1 creşte mai mult de 100U/l şi - ca procent
- ajunge la 35% din LDH total în primele 4 sǎptǎmâni dupǎ intervenţie. Aceste
16
valori pot scǎdea sub o terapie imunosupresoare corespunzǎtoare; LDH total
continuǎ sǎ rǎmânǎ crescut, chiar dacǎ LDH1 revine la normal.

Bibliografie

Artenie, Biochimie, Ed. Universității Al. I. Cuza, Iași, 1991


Elena Moldoveanu, Biochimie medicală – curs, Editura Universității Titu
Maiorescu, București
K. Rathee, V. Dhull, R. Dhull, S. Singh, Biochemistry and Biophysics Reports 5
(2016) 35–54.
S.N. Aisyiyah Jenie, B. Prieto-Simon, N.H. Voelcker, Biosensors and
Bioelectronics 74 (2015) 637–643.
Legninger, A.L., Biochimie – vol I, Ed. Tehnică, București, 1987

17
L.V. Galbraith, F.Y. Leung, G. Jablonsky, R. Henderson, Clinical Chemistry 36
(1990) 1317-22.
S. Moldoveanu, Investigatii tanatochimice in vederea stabilirii diagnosticului de
deces -Teza de doctorat, Universitatea de medicina si farmacie, Gr. T. Popa,
Iasi, 2013.
T .Marshall, J. Williams, K.M. Williams, Journal of Chromatography 569
(1991) 323-345

18