RESUMEN EJECUTIVO

PCR COMO TÉCNICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR: FUNDAMENTOS E IMPORTANCIA

ANA MARÍA GARZÓN SÁNCHEZ

ANDRÉS FELIPE DUQUE SALDARRIAGA
MARIA ALEJANDRA CARRASCAL LÓPEZ
ANA SOFIA CASTELLANO REVOLLO
MAYRETH XORYMA LOZANO MOSQUERA

DOCENTE:
XIMENA ANDREA OLARTE CASTILLO

UNIVERSIDAD ANTONIO NARIÑO – UAN

FACULTAD DE MEDICINA
MEDICINA
BIOLOGÍA MOLECULAR
II SEMESTRE
2020-II
 Reacción en Cadena de la Polimerasa.

La técnica de PCR es una técnica, propuesta por Kary Mullis 1 por lo cual se hizo merecedor del
Premio Nobel de Química en 1993. En su experimentación utilizó la PCR para amplificar un gen
B-globina para el diagnóstico de Anemia, siendo desde ese momento una técnica que ha
revolucionado todos los campos que estudian los ácidos nucleicos. Desde su invención y hasta
la actualidad la PCR se ha empleado ampliamente, en múltiples campos, específicamente en
biología molecular, genética, ciencias forenses, filogenia, bacteriología y microbiología. Es una
técnica sensible, específica y eficiente.

Mullis se basó en el proceso de replicación del ADN que poseen los organismos eucariotas en
la cual el ADN Polimerasa cumple un papel esencial. Es así como la PCR ha sido desarrollada
para detectar pequeñas cantidades de ácidos nucleicos por amplificación, de una región de
ADN situada entre dos regiones de una secuencia de nucleótidos conocidos. Justo en ese
segmento se sitúan a cada lado oligonucleótidos que sirven de primers que permiten delimitar
la zona de ADN que se desea replicar, para así iniciar los ciclos que son catalizados por la ADN
Polimerasa, las cuales realizan la síntesis de una cadena complementaria de ADN de doble
cadena, en sentido 5’ a 3’, usando una hebra sencilla. Este método permite la obtención de
millones de copia de ADN in vitro, en poco tiempo.

 Fundamento de un ciclo en PCR

Partiendo de este principio de acción, la PCR se basa en un ciclo de tres pasos fundamentales.

Desnaturalización de ADN Hibridación Elongación

En la primera etapa, que corresponde a la Desnaturalización del ADN, la doble hélice de ADN
se separa en dos hebras, mediante incubación a temperaturas de 93° a 97°C durante 1-9
minutos activando también la acción de las ADN polimerasas. En el segundo paso que
corresponde a la Hibridación, se realiza en temperaturas de 40° a 65°C durante 20-40
segundos, allí la polimerasa une al híbrido de la cadena molde con el cebador para iniciar la
síntesis del ADN. En la tercera etapa que corresponde a la Elongación o extensión, se realiza en
temperatura de 72° a 80°, y su duración depende de la longitud del fragmento que se desea
amplificar. Allí se produce la síntesis de una nueva hebra de ADN por complementariedad a la
hebra molde añadiendo desoxinucleótidos complementarios en la dirección 5’ a 3’ mediante
acción de la ADN Polimerasa.

Posterior a esto, para conservar la reacción a corto plazo se lleva el producto a una
temperatura de 4° a 15°C. Para comprobar el resultado se emplean técnicas de Electroforesis
en gel de agarosa o acrilamida que separan los fragmentos de ADN generados dependiendo el
tamaño de la cadena. La amplificación al final del primer ciclo da como resultado 2 copias de la
muestra original, al final del segundo ciclo da como resultado 4 copias, al final del tercer ciclo 8
copias, y así sucesivamente. Si los ciclos se producen n veces, la cantidad de cadenas serán 2n.
Los productos obtenidos tras ciertas etapas son cortos o largos 4.
 Requerimientos del PCR

Para realizar la técnica se requieren 4 desoxirribonucleótidos, ADN molde que contenga la

región que se desea amplificar con dos cebadores que delimiten la zona específica de ADN que
se va a amplificar, ADN polimerasas Taq termoestables adaptadas a esas altas temperaturas,
extraídas de microorganismos, generalmente arqueas 2, iones divalentes y monovalentes como
Mg2+ y K+ que actúen como cofactores de la ADN polimerasa, solución buffer que mantenga el
pH adecuado y termociclador un aparato que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas
exactos y adecuados, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico.

 Evolución de la PCR: InmunoPCR y medicina.

La técnica de PCR es una técnica estudiada, mejorada y establecida desde hace varias décadas,
sin embargo, su evolución ha permitido grandes hallazgos que en la actualidad permiten
comprender de forma más amplia, las enfermedades que tienen un origen genético o pueden
investigarse mediante biología molecular e inmunología. Este sistema de detección es versátil
y poderoso para análisis celulares y moleculares, y para diagnóstico clínico, y se considera así,
gracias a la especificidad de los anticuerpos por epítopos particulares.

Esta técnica ha sido estudiada y propuesta, para la detección del cáncer en estadios
tempranos3, lo cual reduciría significativamente la tasa de mortalidad. Este es el caso de la
Inmuno-PCR, la cual combina la reacción antígeno-anticuerpo con la amplificación del genoma
presente en la muestra. Esto se da gracias al uso de un anticuerpo, el cual ha sido conjugado a
un oligonucleótido o primer; esta conjugación actúa como puente entre la inmunoreacción y la
amplificación del ADN. Esto permite entonces, detectar, amplificar y hacer visible un antígeno
específico llamado biomarcador tumoral, que expresan ciertas células cancerosas en diversos
tipos de tumores o que expresan las células en defensa al tumor, que generalmente es una
proteína. Algunos de estos biomarcadores tumorales, son específicos de un tipo de cáncer, y
otros se pueden encontrar en varios tipos de cáncer.

También mediante Inmuno-PCR es posible la detección de mutaciones genéticas causadas por

una mutación focal en una región concreta de ADN o locus. Estudiarlas directamente es muy
complejo, por ello, se opta por multiplicar inicialmente el ADN y hacer estudios con una base
más amplia. De los 30.000 genes que actualmente se cree que existen en el genoma humano,
hay un pequeño subconjunto importante en la prevención, desarrollo y progresión del cáncer.
La versión normal de genes se llaman protooncogenes, la versión defectuosa de estos genes se
llama oncogenes que presentaron errores durante su proceso de transcripción y traducción.

Se considera más sensible que el ELISA para la detección de biomarcadores tumorales

incrementados pues, en algunos tumores malignos el incremento de biomarcadores antes de
diseminarse por metástasis es muy bajo para ser detectados por ELISA convencional 3. La
Inmuno-PCR entonces, no es una técnica empleada como diagnóstico para personas con bajo
riesgo de la enfermedad, se emplea principalmente en la detección en personas con
antecedentes familiares de tipos de cáncer con agresivos, con prevalencia y carga genética
importante3, o en personas que ya han tenido un diagnóstico previo de cáncer y tratamiento
para comprobar si aún existen recidivas, es decir actividad metabólica molecular presente, o
para determinar la evolución de este.
 BIBLIOGRAFÍA

1. Mullis, K.B., Saiki, R.K., Scharf, S.J., Faloona, F., Horn, G.T., Erlich, H.A. y Arheim N. (1985) Enzymatic
amplification of b-Globin genomic and restriction site analysis for diagnostic of sickle cell anemia.
Science. 230: 1350-1354. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2999980

2. Mullis K.B., Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., et al. (1988) Primer-
directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–
491. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2448875

3. Khan, A. H., & Sadroddiny, E. (2016). Application of immuno-PCR for the detection of early stage
cancer. Molecular and cellular probes, Elsevier. 30(2), 106-112. Disponible en:
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S089085081630010X?via%3Dihub

4. Bolivar, A., Rojas A., Garcia, P. (2015) “PCR y PCR-Múltiple: Parámetros críticos y protocolo de
estandarización”. Publicación Oficial del Instituto de Inmunología Clínica. Mérida, Venezuela. 3(1):
25-33.