Metode de obținere a lipozomilor

1. Metoda hidratării filmului

Au fost preparați lipozomi cationici și anionici prin metoda hidratării
filmului, apelându-se la diferite modificări, în funcție de lipidele
utilizate. Pentru prepararea bistraturilor lipidice prima etapă efectuată
a constat în dizolvarea în cloroform a lipidelor, soluția obținută fiind
apoi menținută timp de 2 minute într-un aparat cu ultrasunete, la
temperatura camerei sau la 38°C.
Deoarece fluiditatea bistratului lipidic depinde de temperatura de
tranziție a lipidelor, este necesară inducerea schimbării stării fizice a
lipidelor din faza de gel (stare comandată cu lanțuri de hidrocarburi
complet extinse) la faza de lichid cristalin (o stare mai dezordonată și
fluidă, în care lanțurile de hidrocarburi sunt orientate la întâmplare).
Solventul organic din soluția lipidică obținută a fost evaporat prin
utilizarea unui evaporator rotativ, timp de 45 de minute, la o
temperatură de 30°C, obținându-se astfel bistratul lipidic. Acesta a
fost păstrat la -81°C timp de minim 24 de ore pentru evitarea
degradării fosfolipidelor.
După cele 24 de ore, bistratul lipidic a fost hidratat cu 2 mL soluție
apoasă HEPES 10 mM (pH=7,4) (HEPES- acid 4-(2-
hidroxietil)piperazina-1-etansulfonic) ce conținea cefepimă.
Hidratarea bistratului lipidic a fost efectuată în 2 etape.
 Au fost alternate: un proces de hidratare efectuat în 10 cicluri,
timp de 50 de minute, unul de vortexare (3 minute) și un proces
de ultrasonificare (2 minute).
 Un proces viguros de vortexare (2 ore).
Lipozomii formați au fost multilamelari și aveau o polidispersitate
ridicată.
Pentru generarea unor populații uniforme de lipozomi unilamelari cu
dimensiuni mai mici de 200 nm, s-a realizat extrudarea soluțiilor de
lipozomi utilizându-se un miniextruder și membrane policarbonate cu
diametre între 100-250 nm. Toate soluțiile de lipozomi au fost extrudate
de 10 ori.

Rezultatele eficienței încapsulării.

Eficiența încapsulării antibioticului cefepimă a fost măsurată prin
utilizarea metodei dializei.
• 500 µL de lipozom încărcat cu antibiotic a fost adăugat într-un tub
de dializă ce a fost apoi scufundat într-o cupă ce conținea 80 mL de
HEPES 10 mM.
• O parte de 2 mL de buffer aflat în cupă era extrasă la fiecare 15
minute, fiind apoi înlocuită cu un volum egal de buffer pentru păstrarea
constantă a volumui de buffer din cupă.
• Cuantificarea încapsulării medicamentului s-a realizat cu ajutorul
spectroscopiei UV-vis, la lungimea de undă 258 nm.
• Dializa a fost efectuată timp de minim 24 de ore iar eficiența
încapsulării a fost calculată cu ajutorul formulelor următoare:
EE %= ( [antibiotic]m / [antibiotic]total ) × 100
[antibiotic]m= [antibiotic]total−[antibiotic]buffer [1].
 2. Metoda deshidratării-rehidratării.
Această metodă a constat în dizolvarea unui amestec lipidic în
cloroform:metanol (9:1) și transformarea acestuia într-un film, în urma
etapei de evaporare a amestecului de solvenți, efectuată cu ajutorul unui
evaporator rotativ, la temperatura de 55°C. Peste filmul obținut a fost
adăugată o soluție apoasă formată din amestecul dintre lipide și
trehaloză, în raport masic 1:4.
Au fost preparați lipozomi, utilizănd diferite concentrații de fosfolipide
(de la 3.7 până la 22.5 mg/mL). Dimensiunile lipozomilor au fost
modificate prin multiple procese de extrudare, în care s-au utilizat
membrane policarbonate cu dimensiunea porilor de 100nm.
Lipozomii preformați au fost deshidrați prin congelare la -45°C, timp de
26 de ore, folosindu-se un liofilizator de tip Laconco. După această etapă
lipozomii au fost sigilați și stocați la temperatura de 4°C.
Lipozomii deshidratați au fost lăsați la temperatura camerei si rehidratați
prin adăugarea a 1/10 din volumul inițial de soluție tampon PBS (10 mM
fosfat, 120 mM NaCl, pH 7.4).
Dispersia a fost ținută la temperatura de 55°C timp de o oră și diluată cu
un volum de 9/10 soluție tampon PBS.

Rezultatele eficienței încapsulării.

Eficiența încapsulării proteinelor alergenice în lipozomi a fost de
aproximativ 80%. Rezultatele obținute confirm eficacitatea procesului
de deshidratare-rehidratare în încorporarea medicamentelor hidrofile [2].
Bibliografie:

[1]- M. Moyá, M. López-López, J. A. Lebrón, F. J. Ostos, D.

Pérez, Preparation and Characterization of New Liposomes.
Bactericidal Activity of Cefepime Encapsulated into Cationic
Liposomes, Pharmaceutics (2019), 11:69.
[2]- E. C. M. Cabral, R. L. Zollner, M. H. A. Santana,
Preparation and characterization of liposomes entrapping
allergenic proteins, Brazilian Journal of Chemical Engineering
(2004), 137:146.