1

Biochimie
Curs nr 12 (săptămâna 13: 7/8.12.2017)
Prof Petrescu Eugenia

Metode fizice utilizate ȋn laboratorul de biochimie

- pH-metria;
- spectrofotometria;
- cromatografia;
- electroforeza

A. pH-metria
Intr-o accepţie generală, pH-ul este o noţiune prin care se poate exprimă proprietatea unei soluţii de a fi acidă, neutră sau alcalină.
pH-ul unei soluţii este funcţie de disociere şi reflectă aciditatea ionică sau reală a soluţiei, respectiv concentraţia de ioni de hidrogen existenţi
ȋn stare liberă. pH-ul se exprimă prin valori numerice cuprinse ȋntre 0 si 14.
Reacţiile biochimice se petrec ȋn condiţiile menţinerii ȋn mediul biologic a anumitor valori ale pH-ului, respectiv ale concentraţiei ionilor de
hidrogen [H+], valori care sunt compatibile cu activitatea biochimică şi fiziologică. Rezultă, astfel, ca pH-ul mediului intern al organismelor
reprezintă o constantă biologică ce asigură desfăşurarea normală a reacţiilor biochimice care stau la baza tuturor manifestărilor vitale.
Homeostazia organismelor se manifestă şi prin valorile constante ale pH-ului, riguros menţinute ȋntre anumite limite datorită intervenţiei
unor mecanisme de reglare. De exemplu, echilibrul acido-bazic din mediul celular şi din lichidele biologice este asigurat şi menţinut prin
mecanisme de reglare fizico-chimice şi fiziologice.
De asemenea, pH-ul constituie o caracteristică determinantă şi pentru alte medii de desfăşurare a reacţiilor chimice şi biochimice „in vitro”,
un parametru important pentru utilizarea ȋn scopuri analitice a unor metode precum electroforeza, cromatografia de schimb ionic etc.
Definiţia pH-ului: pH-ul reprezintă logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraţiei ionilor de hidrogen [H+] şi se exprima prin relaţia:

pH= - lg [H+]

Apa distilată prezintă o conductibilitate electrică foarte mică, ȋnsă constantă şi bine definită.
Această conductibilitate se datorează ionilor rezultaţi prin disocierea moleculelor de apă:

2H2O H3O+ + OH-

Prin disociere, funcţia acidă este conferită prin ionul H+ (ionul hidroniu H3O+), iar funcţia alcalină prin ionul hidroxil (OH-).
Constanta PH2O reprezintă produsul ionic al apei şi se defineşte ca produsul dintre concentraţiile (la echilibru) ale ionilor rezultaţi prin
disocierea apei:
[H+] . [OH-] = PH2O
Valorile pH-ului sunt cuprinse ȋntre 0-14 şi se prezintă prin următoarele domenii sau intervale de pH:
pH
10 11 12 13 44 55 66 77 8 99 110 111 112 113 114
8
Puternic acidă Slab acidă Neutră Slab alcalină Puternic alcalină

Indicatorii de pH
In scopul determinării pH-ului diferitelor soluţii incolore sau slab colorate, se utilizează indicatori de pH denumiti şi indicatori acido-bazici.
Aceşti indicatori sunt substanţe de natura organică, şi anume, acizi sau baze organice foarte slabe care ȋşi modifică culoarea ȋn funcţie de
concentraţia ionilor H+ sau OH-, respectiv de pH-ul unei soluţii.
Indicatorii de pH acidobazici (Hind, IndOH) disociază după schemele:
(1) Hind (culoare ȋn mediul acid) H+ + Ind- (culoare ȋn mediul bazic)
(2) IndOH (culoare ȋn mediul bazic) OH- + Ind+ (culoare ȋn mediu acid)
In ambele cazuri, moleculele nedisociate ale indicatorilor se deosebesc prin culoarea lor de ioni corespunzători.
Prin adăugarea de volume mici din soluţia unui acid sau unei baze la o soluţie de indicator, se produce o schimbare (virarea) treptată a culorii
soluţiei ȋntr-un interval de pH determinat, interval caracteristic pentru fiecare indicator. Astfel, fenolftaleina este un indicator care se
comportă ca un acid slab, fiind incolor la pH <8; dacă la o soluţie de fenolftaleina se adaugă treptat volume mici din soluţia unei baze, apare
o coloraţie roz care se intensifică până la roşu-carmin prin trecere la pH=9,8. Fenolftaleina indică astfel o modificare a pH-ului care se
evidenţiază prin virarea culorii indicatorului respectiv; domeniul de pH cuprins ȋntre 8,2-10,0 reprezintă intervalul de viraj al fenolftaleinei.
Generalizând, intervalul de viraj se defineşte ca domeniul de pH ȋn afara căruia nu se observă o schimbare a culorii indicatorului. In
intervalul de viraj, indicatorul prezintă o coloraţie cu nuanţa progresiv variabilă.
Indicatori acidobazici
Indicator Mediu acid Mediu alcalin Intervalul de viraj (pH)
Albastru de timol Roşu Galben 1,2-2,8
Metil oranj Roşu Galben 3,1-4,4
Roşu de metil Roşu Galben 4,4-6,2
Turnesol Roşu Albastru 5,0-8,0
fenolftaleina incolor Rosu-carmin 8,2-10,0

Mecanismul de acţiune: unul din mecanismele prin care se explică modificarea culorii indicatorilor ȋn funcţie de pH se bazează pe teoria
cromoforoionică, conform căreia schimbarea de culoare este determinată de anumite modificări ȋn structura moleculei indicatorului, precum
şi de modificarea gradului de disociere al acestuia.
In cazul fenolftaleinei, forma azoidă este incoloră, trecând la o anumită valoare a pH-ului alcalin, ȋn forma chinoidă, roşie:
Forma azoidă (incoloră) + Na OH forma chinoidă (culoare roşie ȋn mediu alcalin).
PH-ul unei soluţii se poate determina prin una din următoarele două metode:
- Metoda colorimetrică;
- Metoda electrometrică (potenţiometrică).
 2

Metoda colorimetrică
Principiul metodei: se bazează pe proprietatea indicatorilor de a-şi modifica culoarea ȋn funcţie de pH-ul soluţiei; aceşti indicatori sau
amestecuri de indicatori (indicatori universali) au intervalul de viraj ȋn diferite domenii de pH, unii având capacitatea de a-şi modifica
culoarea ȋntr-un domeniu mai extins de pH.
O modalitate simplă, expeditivă şi cu o largă aplicabilitate pentru determinarea orientativă a pH-ului o constituie utilizarea hartiei indicatoare
de pH, care poate fi considerată ca procedeu colorimetric.
Descriere: Hârtia indicatoare de pH se prezintă sub forma de benzi ȋnguste de hârtie impregnată cu amestecuri de indicatori şi care, ȋn contact
cu soluţia al cărei pH se schimba, ȋşi schimbă culoarea; nuanţa obţinută se compară cu o scală etalon de culori pe care sunt indicate valorile
de pH.
Hârtia indicatoare de pH se prezintă fie sub forma unor carnete sau pliante, fie sub forma unor discuri ȋnchise ȋntr-o cutie de material plastic
pe al cărei capac sunt indicate nuanţele de culori etalon corespunzătoare diferitelor valori de pH.

Hârtia indicatoare de pH

In funcţie de sensibilitate şi de domeniul de pH pe care ȋl acoperă, hârtiile indicatoare de pH sunt de 2 tipuri:

a) hârtie indicatoare cu macrodiviziuni, care acoperă domeniul de pH cuprins ȋntre 1-14, indicând valoarea pH-ului din unitate ȋn unitate;
b) hârtie indicatoare cu microdiviziuni, care cuprinde numai anumite domenii de pH (de exemplu, pH= 1-5; pH=6-8, pH=8-10 ), indicând
valoarea pH-ului cu diferenţe de 0,2 unităţi; acest tip de hârtie indicatoare prezintă o sensibilitate mai mare.
Determinarea pH-ului ȋn unele lichide biologice;
Se determină pH-ul unor lichide biologice, de exemplu: ser uman, ser de bovine, urină umană, urina de rumegătoare, lapte, salivă.
Se efectuează următoarele operaţii:
- Dintr-o bandă de hârtie indicatoare de pH se taie cu o foarfecă mai multe porţiuni mici;
- Pe câte o porțiune de hârtie indicatoare, care se ţine prinsă la un colt cu o pensetă (se evita contactul cu mâna) se depune cu o
pipetă(sau cu o baghetă de sticlă) o picătură din proba de analizat (lichid biologic);
- Se lasă ȋn contact proba cu hârtia indicatoare timp de câteva secunde;
- Se compară apoi culoarea porţiunii de hârtie indicatoare cu culorile etalon indicate pe scala de pH;
- Se stabileşte corespondenţa dintre culoarea dată de către soluţia al cărei pH se determină şi culoarea similară de pe scala etalon;
- Se citeşte valoarea pH-ului respectiv indicată pe scala etalon;
- Se procedează ȋn mod identic cu toate celelalte probe;
- Valorile de pH determinate se trec ȋn tabelele respective.
Se ȋntocmeşte un tabel, se completează valorile de pH obţinute şi se compară cu valorile de pH
normale
Proba pH
determinat Valori normale
Ser uman 7,3-7,4
Ser de bovine 7,3-7,5
Urina umana 5,8-6,4
Urina de rumegatoare 7,8-8,6
Lapte 6,5-6,7
Saliva 6,8-7,2

Metoda potenţiometrică (electrometrică)

Metoda se bazează pe determinarea diferenţei de potențial, utilizându-se un electrod de referinţă (din calomel: Hg 2Cl2) şi un electrod de
măsură (electrod de sticlă); iniţial, se determină diferenţa de potenţial ce se stabileşte ȋntr-o soluţie tampon de pH cunoscut şi, ulterior, se
determină direct pH-ul soluţiei de cercetat.
Pentru aceste determinări se folosesc aparate sensibile numite pH-metre, care indică direct pe un cadran şi cu o mare precizie (de ordinul
sutimilor) valorile de pH.
Soluţii tampon
Stările de echilibru chimic ȋn soluţii apoase, precum şi desfăşurarea reacţiilor chimice şi biochimice sunt condiţionate de concentraţia ionilor
de hidrogen.
Marea majoritate a reacţiilor chimice in vitro, ca şi a reacțiilor biochimice in vivo se petrece la valori riguros definite ale pH-ului.
Pentru a-şi menţine echilibrul acidobazic ȋn condiţii compatibile cu viaţa, organismele posedă mecanisme fine de reglare ce se opun oricăror
variaţii de pH ce ar tinde să modifice acest echilibru. Asemenea mecanisme de reglare se realizează prin intervenţia unor sisteme tampon,
care au rolul de a menţine pH-ul ȋn limitele unor valori optime pentru desfăşurarea reacţiilor şi proceselor biochimice.
De exemplu, plasma sanguină prezintă un sistem tampon foarte eficient care menţine valoarea pH-ului din sânge ȋntre limitele 7,2-7,3. De
asemenea, enzimele ȋşi exercită acţiunea lor catalitică la valori de pH bine definite.
Soluţia tampon se defineşte ca un amestec ȋn echilibru şi ȋn anumite proporţii ȋntre un acid slab şi baza sa conjugată (pereche acid-baza
conjugată) care, la adăugarea de substanţe cu caracter acid sau alcalin, are proprietatea de a se opune modificărilor de pH, menţinând astfel
valoarea pH-ului ȋn limite constante.
Soluţiile tampon prezintă următoarele caracteristici:
- Au o concentraţie a ionilor de hidrogen definită şi constantă, invariabila prin diluare;
- realizează ȋntr-o soluţie dată o anumită concentraţie de ioni de hidrogen;
- Menţin această concentraţie ȋn anumite limite;
Se opun unor variaţii bruşte ale pH-ului unei soluţii.
 3

Soluţiile tampon deţin astfel rolul esenţial de a menţine pH-ul unei soluţii la o valoare constantă; procesul prin care se realizează acesta
acţiune se numeşte „ tamponare”.
Exemple de sisteme tampon:
Sisteme tampon Limite de pH
KH2PO4-Na2HPO4 5,29-8,04
CH3-COONa-CH3COOH 3,60-5,60
Glicocol-HCl 1,04-3,68
Glicocol-NaOH 8,57-13,06
Citrat- HCl 1,04-4,96
Citrat-NaOH 5,02-12,37
Citrat –HCl Veronal sodic –HCl 6,80-9,60
Tris (hidroximetil) aminometan (HOCH2)3CH2N-HCl 7,2-9,0
In organismul uman, principalele sisteme tampon sunt următoarele:
- Bicarbonat-acid carbonic (NaHCO3/H2CO3 ȋn plasmă şi, respectiv, KHCO3/H2CO3 ȋn eritrocite);
- Fosfat bibazic –fosfat monobazic (Na2HPO4/NaH2PO4 ȋn plasma şi, respectiv, K2HPO4/KH2PO4 în eritrocite);
- Hemoglobinat alcalin-hemoglobina (KHb/HHb);
- Oxihemoglobinat alcalin-oxihemoglobina (KHbO2/HHbO2);
- Proteinat alcalin-proteină (proteinat Na/proteina H).
Proteinele funcţionează ca sisteme tampon, datorită caracterului lor amfoter.
Capacitatea de tamponare a unei soluţii tampon este determinată de doi factori: concentraţia molară a componenţilor tamponului (care este
direct proporțională cu capacitatea de tamponare) şi raportul dintre concentraţia acidului slab şi a bazei conjugate.
Determinarea pH-ului sanguin
Menţinerea pH-ului sanguin în limite stricte este un proces dependent de schimburile respiratorii, ce constau din absorbţia O 2 şi eliminarea
CO2.
Determinarea pH-ului în aparatele moderne se face concomitent cu PCO2 şi PO2, în aceeaşi probă de sânge.
PH-metrele moderne constau din doi electrozi (un electrod din sticlă şi un electrod de referinţă) şi spaţiul adiacent cu lichid.
Ionii de hidrogen din proba de sânge împreună cu cei metalici ai electrodului de sticlă creează o diferenţă de potenţial în jurul membranei ce
va fi măsurată electronic.
Aparatul este termostatat şi etanşeizat pentru a preveni schimburile de gaze cu mediul extern, iar sângele este aspirat printr-un capilar.
Măsurătoarea are loc la 37°C, iar electrozii (diferiţi pentru PO2 şi PCO) sunt etalonaţi cu tampoane diferite.
Electrodul de referinţă este confecţionat din calomel, fiind conectat la voltmetru. El conține o pastă din calomel (clorura mercurică) şi o
soluţie saturată de clorura de potasiu. În structura electrodului de referinţă intră de regulă şi o membrană semipermeabilă care permite
trecerea soluţiei de KCl pentru a veni în contact cu proba.
Concentraţia mare de ioni a soluţiei de KCl nu permite decât măsurarea diferenţei de potenţial de la interfaţa probei de sânge.
Valorile normale ale pH-ului din sângele arterial sunt de 7,35-7,45 iar pentru cel venos limitele sunt cu 0,03 mai mici.
În aparatul tip Astrup, se determină doar pH-ul în proba iniţială de sânge; se mai fac ȋncă două măsurători din aceeaşi probă, care au fost
echilibrate la 37° C cu două amestecuri de gaze cu conținut cunoscut în CO2.
Prin cele trei măsurători de pH, cu ajutorul unei nomograme speciale se pot determina şi ceilalţi parametri acido-bazici.

B. Fotocolorimetria (analiza fotometrică)

Este o metoda de analiză fizico-chimică al cărei principiu se bazează pe măsurarea, ȋn condiţii standard, a intensităţii de culoare a unei
soluţii, intensitate care este proporțională, ȋn anumite limite, cu concentraţia componentului chimic ce se dozează.
Metodele fotometrice sunt simple, expeditive şi permit dozarea unor substanţe ȋn prezenţa altora, fără a fi necesară o separare prealabilă a
acestora. De aceea, aceste metode au o largă aplicabilitate pentru determinarea cantitativă (dozarea) unei game variate de componente
biochimice din țesuturi şi lichide biologice.
Termenul generic de „lumină” desemnează energia radiantă constituită din fotoni, lungimi de undă (λ) care se încadrează ȋn domeniul vizibil,
precum şi din lungimi de undă din domeniul invizibil (mai scurte si, respectiv, mai lungi). Astfel, lumina reprezintă un ansamblu complex de
mai multe radiaţii luminoase de culori diferite, constituind un spectru de energie radiantă alcătuita din anumite lungimi de undă pe care
ochiul le percepe ca „lumina albă”. Deoarece lumina se propagă prin unde, lungimea de undă reprezintă o mărime caracteristică ce se
defineşte ca distanţa dintre două maxime (vârfuri). Acesta distanţă, respectiv lungimea de undă (λ), se exprimă ȋn nanometri (nm):
1nm=1.10-9m=1.10-6 mm,
Sau 1nm = 1mμ= 1 Å (1 angstrom= 10-8 cm).
Energia radiantă se caracterizează, astfel, prin lungimea sa de undă. Marea majoritate a corpurilor posedă capacitatea de a absorbi selectiv
energie radiantă de diferite lungimi de undă. Ochiul uman percepe radiaţiile luminoase ȋn domeniul (λ) = 400-760 nm, radiaţii care constituie
domeniul vizibil din spectru, lungimile de unda mai mari de 760 nm constituie domeniul infraroşu (IR) care este invizibil, iar lungimile de
undă mai mici de 400 nm constituie domeniul ultraviolet (UV) care, de asemenea, este invizibil. Radiaţiile luminoase cu lungimi de undă din
domeniile IR si UV pot fi măsurate cu aparate numite spectrofotometre.
Lumina obişnuită (policromatică), vizibilă cu ochiul liber (λ)=400-700 nm, poate fi descompusă prin diferite procedee (prisme, reţele de
difracţie) ȋn radiaţii luminoase cu lungimi de undă diferite pentru care corespund anumite culori din domeniul vizibil al spectrului.
Radiaţia compusă dintr-o singură lungime de undă sau dintr-un domeniu foarte ȋngust de lungimi de undă izolat din spectru poartă denumirea
de radiaţie monocromatică.
Relaţia dintre valorile (λ) ale diferitelor radiaţii luminoase şi culoarea caracteristică pentru anumite
domenii din spectrul luminii:
(λ) (nm) Domeniul din spectru Culoarea observată Culoarea complementară
180-400 UV Invizibilă -
400-440 Vizibil Violetă Galbenă-verde
440-500 Vizibil Albastră Galbenă
500-580 Vizibil Verde Rosie
580-600 Vizibil Galbenă Albastră
600-620 Vizibil Portocalie Albastru-violetă
620-760 Vizibil Rosie Verde-albastră
720-2000 IR invizibilă -
 4

Majoritatea substanţelor chimice prezintă proprietatea de a absorbi selectiv energia radiantă de o anumită lungime de undă. Astfel, o soluţie
apare colorată datorită faptului că ea absoarbe toată lumina incidentă, cu excepţia aceleia pe care o percepe ochiul.
De exemplu, o soluţie apare colorată ȋn roşu deoarece absoarbe radiaţiile albastre cu lungimi de undă mai mici şi ȋn consecinţă va transmite
numai radiaţia roşie cu lungimi de undă cuprinse ȋntre 620 şi 760 nm; prin analogie, o soluţie colorată ȋn albastru va absorbi radiaţii roşii cu
lung de undă mai mari şi, ȋn consecinţă va transmite numai radiaţia albastră cu lungimea de unda cuprinsă ȋntre 440-500 nm.
Legile colorimetriei
Analiza fotometrică se bazează pe măsurarea, ȋn condiții standard, a intensităţii radiaţiei luminoase, utilizând o anumită lungime de undă (λ)
izolata din spectru prin anumite procedee. Aparatele de măsură concepute pe acest principiu poarta denumirea generica de fotometre; acestea
pot fi fotometre cu filtre colorate care permit selectarea unei anumite lungimi de undă și spectrofotometre cu rețea de difracție sau cu prisme
pentru descompunerea luminii incidente în benzi spectrale.
Fotometria se bazează pe măsurarea absorbției unei radiații luminoase monocromatice care străbate o soluție colorată de o anumită grosime
și cu o anumită concentrație în componentul chimic de dozat, prin comparație cu o radiație de lumină identică ce străbate o soluție de
referință (martor) în care nu este prezent componentul de dozat.
Fotometrele implică determinarea valorii absolute a extincției (E) sau a densității optice (DO). Diferitele tipuri de fotometre (cu filtre sau
spectrofotometre) prezintă avantajul ca pentru efectuarea determinării se pot izola și utiliza din spectrul luminii domenii cu o anumită
lungime de undă (lumina monocromatică).
Fotometrele sunt dotate cu un sistem de selectare (izolare) a anumitor radiații din spectru cu o lungime de undă dorită, excluzând radiațiile cu
alte lungimi de undă; acest sistem poartă denumirea de monocromator. In sistemul optic al fotometrelor, înainte și după monocromator, se
intercalează diferite lentile și fante care permit dirijarea radiației luminoase și, respectiv, izolarea unor porțiuni înguste ale acesteia.
Lungimea de undă selectată trebuie să corespundă maximului de absorbție al soluției colorate de analizat (sau să minimalizeze absorbția unor
substanțe care pot să interfereze), în scopul de a obține o sensibilitate maximă.
Schema generală:
- Sursa de lumină (lampa);
- Monocromator (sau filtru);
- Fanta;
- Cuva cu soluție de analizat;
- Celula fotoelectrică;
- Instrument de măsurare.
Lumina policromatică emisă de o lampă trece printr-un monocromator (sau filtru) care permite selectarea regiunii dorite din spectrul luminii
incidente sub forma unei radiații monocromatice cu o anumită lungime de undă. Această radiație este utilizată pentru determinarea
respectivă, în funcție de culoarea soluției de analizat. Fanta intercalată are funcția de a izola o radiație monocromatică îngustă a sursei de
lumină și de a mări puritatea sa cromatică. Radiația monocromatică străbate apoi cuva care conține soluția colorată de analizat ce are
proprietăți absorbante și care reține o porțiune din energia radiantă, în funcție de natura și concentrația componentului ce se analizează.
Radiația neabsorbită este transmisă la o celulă fotoelectrică ce convertește energia luminoasă primită în energie electrică; curentul electric
produs este evaluat cu ajutorul unui instrument de măsură, obținându-se valorile corespunzătoare ale extincției (E) (densității optice). In
paralel, se efectuează o determinare prin utilizarea unei soluții de referință (martor) a cărei compozitie este identică cu cea a soluției de
analizat, dar care nu include substanţa ce se dozează.

La baza utilizării spectrofotometrelor şi fotometrelor se află legea lui Lambert-Beer, care poate fi rezumată sub formula:
I/I0 = e-Kcd
I0 = intensitatea luminii incidente;
I = intensitatea luminii care a trecut prin soluţie;
c = concentrația soluţiei;
d = distanţa străbătută;
e = 2,71828
K = constanta
T% = I/I0 . 100
Transmisia T% este procentul din lumina incidentă care a trecut prin soluţie.
A = (2-log%T) = Kcd
- Constanta K depinde de c şi d;
- A este absorbţia sau densitatea optică
Spectofotometrele conţin o prismă sau o reţea;
Fotometrele conţin filtre.
Aparatele moderne au scala în absorbţie, unităţi de la 0,00 la 2,00;
Fotometrele sau spectofotometrele vechi au scala liniară în T%, fiind necesare tabele de conversie absorbţie-transmisie.
Spectrofotometrul tip „SPEKOL”
Aparatul SPEKOL este un fotometru cu celula fotoelectrică ce funcționează cu un singur fascicul de lumină; măsurarea extincției se
efectuează prin metoda deviației: în calea radiației monocromatice se așează succesiv soluția de referință (martorul) și ulterior soluția
conținând proba de analizat.
Fasciculul de lumină emis de o lampă este descompus spectral cu ajutorul unei rețele de difracție, obținându-se radiații monocromatice de
anumite lungimi de undă. Radiația monocromatică, stabilită în funcție de culoarea soluției de analizat, străbate stratul de lichid al probei ce se
analizează și, ulterior, cade pe celula fotoelectrică, determinând astfel apariția unui fotocurent. Acest fotocurent exprimă gradul de transmisie
a radiației care a străbătut soluția de analizat (și, respectiv, proba martor) și se evaluează pe scala instrumentului de măsura în valori de
extincție.
Extincțiile citite sunt proporționale cu intensitatea culorii soluției de analizat și, deci, cu concentrația componentului de dozat.
Componentele și principiul de funcționare al spectrofotometrului tip spekol;

C. Cromatografia
Cromatografia - un termen folosit pentru a desemna un grup de tehnici de laborator pentru separarea substanțelor dintr-un amestec.
Amestecul este dizolvat într-un fluid ce poartă denumirea de fază mobilă, ce este transportat printr-o structură obținută dintr-un altfel de
material, numită faza staționară. Diferiții constituenți ai amestecului sunt transportați cu viteze diferite, ceea ce-i face să se separe.
 In funcție de direcția de migrare a solventului, și respectiv de separare a substanțelor dintr-un amestec, cromatografia poate fi:
Cromatografie descendentă;
Cromatografie ascendentă;
Cromatografie bidimensională;
 5

Cromatografie circulară

D. Electroforeza
Este metoda cea mai accesibilă clinic pentru separarea macromoleculelor încărcate electric pe baza mobilităţii lor în câmp electric.
În câmp electric, particulele încărcate pozitiv vor migra spre electrodul încărcat negativ (catod), iar cele încărcate negativ se vor deplasa spre
anod.
Viteza de migrare este invers proporţională cu dimensiunea (greutatea) particulelor şi direct proporţională cu sarcina lor electrică.
Particulele cele mai uşoare şi mai puternic încărcate vor migra cel mai repede.
Utilizarea principală a electroforezei este separarea proteinelor, posibilă datorită grupărilor reziduale -COOH şi NH2 ale aminoacizilor.
Aceste grupări au caracter amfoter şi pot fi încărcate electric, cu sarcini pozitive sau negative în funcţie de pH-ul tamponului folosit.
La valori acide de pH, grupările carboxil (-COOH) sunt doar uşor ionizate, iar cele amino vor forma ioni NH 3+ , astfel că proteina va căpăta o
sarcină pozitivă.
În mediu alcalin, grupările amino- vor fi uşor ionizate, iar cele - COOH vor forma ioni COO-, conferind macromoleculei o sarcină negativă.
Ţinând cont de multitudinea de grupări reziduale, cu grade diferite de afinitate pentru ionii H + şi OH- , fiecare proteină se va încarca diferit în
funcţie de pH-ul soluţiei.
Punctul izoelectric corespunde unei valori de pH, caracteristic fiecărei proteine, când sarcina electrică globală este zero.
Pentru proteinele plasmatice, se foloseşte o valoare de pH de 8,5, păstrată constantă prin tamponul respectiv.
Mai pot fi separate electroforetic lipoproteine, imunoglobuline, izoenzime şi hemoglobine.
Aparatul tipic de electroforeză – compus dintr-o cameră din plexiglas (un material plastic) cu două compartimente separate în care se
găseşte soluţia tampon cu un anumit pH.
În fiecare compartiment se găseşte câte un electrod din platină sau cărbune.
Între cele 2 compartimente se află suportul poros sau hârtia de filtru specială, îmbibată cu tampon.
Probele se pun cu ajutorul unui aplicator, se închide ermetic şi se deschide circuitul electric, permiţând migrarea o perioadă de timp în funcţie
de suport.
In cazul folosirii ca suport poros a hârtiei de filtru tip Whatman, pentru o migrare era necesară o perioadă de 16 ore;
In prezent, în special în străinătate, hârtia de filtru a fost ȋnlocuită cu plăci prefabricate din gel de agar, amidon, poliacrilamidă, pentru a
scurta timpul de electroforeză. Plăcile trebuie să vină în contact cu tamponul prin fitile.
După încheierea timpului stabilit, suportul migrat se usucă rapid pentru a preveni difuzia, apoi se colorează cu un colorant adecvat.
Ideal, colorarea fracţiunilor corespunde ca intensitate cu concentraţia fracţiunilor proteice, astfel că acestea pot fi citite cu un densitometru
care este o variantă simplificată a unui spectrofotometru. Banda este mişcată cu o viteza constantă în faţa unui fascicol de lumină
monocromatică, iar variațiile absorbţiei sunt interpretate grafic pe o axa x-y, obţinându-se direct fracţiunile proteice respective.
Densitometrele mai noi au încorporate un integrator care măsoară suprafaţa fiecărei fracţiuni eliberează prin buletin, direct, concentrațiile
fracţiunilor proteice. În lipsa acestui densitometru se foloseşte vechea metoda de eluare.
A doua componenta a aparatului de electroforeză este sursa de curent electric continuu şi constant. În timpul electroforezei se produce
căldura care scade rezistenţa electrică, determinând o migrare accelerată, dacă se foloseşte un voltaj constant. Creşterea căldurii va accelera
evaporarea mărind tăria ionică a tamponului.
Sursa de curent este construită pentru a funcţiona la intensitate sau voltaj constant.
Dacă se foloseşte varianta cu intensitatea constantă, pe măsură ce migrarea decurge trebuie redus voltajul curentului.
Industria tehnică medicală fabrică aparate de electroforeză pentru uzul spitalelor, inclusiv sursa de curent.
În cazul separării izoenzimelor (creatin fosfokinazei, LDH, amilazei), după efectuarea electroforezei obişnuite, în loc de colorare, se va trata
banda cu o soluţie conţinând substratul enzimei (anticorpii specifici), după care se execută reacţia de culoare specifica.
Mare atenţie trebuie acordată tăriei ionice, μ, care este concentraţia însumată a ionilor din tampon.
Tăria ionică afectează norul de ioni ce înconjoară o particulă încărcată electric. Creşterea tăriei ionice scade mobilitatea ionilor, favorizează
mărirea temperaturii, care poate denatura unele proteine termolabile.
Focalizarea izoelectrică este o variantă a electroforezei, în care particulele încărcate migrează pe un suport ce are un gradient continuu de
pH. Proteinele individuale migrează în câmpul electric până ating o valoare pH corespunzătoare punctului izoelectric, când se opresc.