.

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR

Francis Crick en su oficina. Atrás de

él está un modelo de cerebro humano herdado de Jacob Bronowski.
(Photo credit: Wikipedia)

¿A qué se denominan técnicas de biología molecular?

En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se
usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su
estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética),
amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación
de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de
una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una
mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de
mutaciones por RFLP o Restriction fragment length polymorphism), que
significa: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción
debido a polimorfismos en el ADN entre otras.
Aqui les dejo para que vean como se hace una extracción de ADN en
forma casera. Haganclick aquí
Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el
diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o
menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa
seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos
(detección de Escherichi a coli 0257, cepas diferentes de
Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral
(HIV, hepatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para
asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad,
diagnóstico de identidad forense, etc.
La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del
ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque
usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados
de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del
medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir
purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

La figura muestra el pellet o precipitado de células a partir del cual se

obtendrá el ADN
Así se ve el ADN recién extraído en alcohol.
¿Como visualizamos el ADN?
Para poder visualizar el ADN debemos recurrir a los geles de Agarosa.
Una vez extraído el ADN o hecha una reacción de PCR debemos
verificar que el ADN está allí.
Para eso debemos preparar un gel de agarosa, con una serie de pocillos
donde colocar las muestras para que queden sumergidas en el gel y este
en un buffer o solución tampón conductor, como el ADN tiene carga
negativa migrará hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente
eléctrica. De esta forma el ADN migra al polo positivo (ya que tiene carga
negativa). Los fragmentos muy pequeños migran muy rápido en cambio
los más grandes migran más lentamente, permaneciendo cerca del
pocillo donde se depositaron. El ADN previamente o el gel deben ser
teñidos con bromuro de etidio, que es un colorante naranja que emite ese
color solo bajo luz UV. Como se intercala entre los nucléotidos del ADN,
el fragmento de ADN se verá naranja.
Gel de control de amplificación por PCR teñido con bromuro de etidio y
visto en un transiluminador de luz ultravioleta (UV de 302nm). La PCR se
realizó de un segmento de un gen (exón) en tres individuos. 1er, 3ro y
4to pocillo contienen ADN de distintos animales que se amplificó. En el
2do pocillo (de izq. a derecha, no hubo amplificación), o sea falla de la
técnica. En el ultimo pocillo (derecha) se ve un marcador de peso
molecular, para indicar el tamaño de la banda de ADN (en este caso 130
pares de bases)

Fuente
: Sciencephoto Library. Estos son los pocillos donde se siembra el ADN
(con una micropipeta), se ven azules por otro colorante que se usa para
ver por donde esta migrando el ADN sin necesidad de mirarlo bajo luz
ultravioleta. Además el colorante azul contiene glicerol que ayuda a que
el ADN baje rápidamente al fondo del pocillo
En el siguiente video se muestra como se realiza un gel de agarosa
La genética molecular aparece desde el descubrimiento de la
doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1954. Luego Francis
Crickcontinúa con el descubrimiento del código genético en los
60’s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3,
y tres combinaciones de letras significan un aminoácido que
formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse
como es la molécula de ADN y como lleva la información que
contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó
“Dogma central de la biología molecular”.
 Esquema del Código Genético
extractado de www.maph49.galeon.com/sinte/gencode.
Luego aparece el descubrimiento de las enzimas de
restricción que permiten cortar el ADN y así analizarlo. Nace allí
la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la molécula
de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes,
etc. Hasta que, hacia fines de los 80’s, Karl Mullis descubre la
técnica de PCR que revolucionó a la genética por su practicidad
y rapidez para amplificar una región de ADN en cantidad
suficiente para luego hacer todo tipo de análisis. Para saber si la
PCR ha resultado, se colocan las muestras en pocillos de geles
de agarosa, teñidos con bromuro de etidio (color naranja)
La técnica se describe en los videos que les dejo abajo
Aqui les dejo un video sobre la técnica de PCR

Para reírse un rato les dejo un video divertido llamado  «La canción de la
PCR» de una empresa (BIORAD) que vende los termocicladores o
Máquinas para automatizar la técnica para hacer PCR
La secuenciación o forma de determinar el orden de los
nucléotidos en el ADN de cada cromosoma fue descubierta
por Sanger
Gracias a este descubrimiento fueron posibles el uso de muchas
técnicas para realizar tanto la secuenciación completa del
genoma humano como el de muchos animales domésticos y
ademas usar la secuenciaciónque hoy en día es automática y
realizada por un secuenciador en múltiples aplicaciones.
Una de las aplicaciones de los secuenciadores es el
fingerprinting o huellas de DNA que permite tanto la realización
de test de paternidad como identificación de criminales. En las
primeras épocas esta técnica de huellas de ADN descubierta por
Sir Alec Jeffries y se realizaba por Southernblot, técnica
denominada así en honor a su descubridor llamado de apellido
Southern, pero hoy en día se realiza por PCR.
La primera técnica utilizada para la identificación de fragmentos
de ADN fue el Southern blot. Se transfiere al ADN de un gel de
agarosa a una membrana donde se hibridiza con una sonda
marcada radioactivamente. Luego llegaron el northern (para
detectar ARN) y el western para detectar fragmentos de ARN
proteínas respectivamente.
La forma de llevar a cabo esta técnica se puede ver en el siguiente video
Método de Secuenciación descrito por Sanger y basado en
el freno de la síntesis de ADN cuando se usan dideoxinucleótidos
en vez de desoxiribonucleótidos.
Principios de fingerprint o identificación de huellas de ADN
derivada de la primera técnica descrita por Sir Alec Jeffries.

Secuenciación basada en metodo de Sanger pero ahora

realizada por un secuenciador automático.

Aplicaciones de las técnicas

Son innumerables las aplicaciones de estas técnicas y quizás las más
usadas hoy en día, son la PCR seguida de una restricción con enzimas y
detección de los fragmentos en un gel o seguidas de un gel de
poliacrilamida que tiene más definición para la separación de fragmentos
de pocas bases de diferencias. Cuando se usa PCR y enzimas de
restricción se denominan PCR/RFLP (derivado de variación en la longitud
de los fragmentos de restricción en ingles).
Las enzimas de restricción o también denominadas endonucleasas
cortan los enlaces fosfodiéster del ADN cuando reconocen determinada
combinación de nucléotidos o bases del ADN, generalmente de 6 o 4
pares de bases de longitud, llamadas secuencias palindrómicas, es decir
que se leen igual en un sentido en una cadena y en el sentido opuesto en
la cadena complementaria y antiparalela. Se utilizan mucho para el
diagnóstico de enfermedades hereditarias causadas por una mutación
puntual o detección de variantes o alelos de un gen favorable para el
mejoramiento genético animal o vegetal.
¿Por que detectan mutaciones?  porque como reconocen una secuencia
específica de 6 o 4 pares de bases, al aparecer una mutación se puede
perder el que era un sitio de corte para una enzima o al revés se puede
generar un sitio de corte en el ADN.
 https://scielo.conicyt.cl/scielo
.php?script=sci_arttext&pid=S0718-85602011000300005
Si podemos amplificar por PCR un segmento o porción de un gen y luego
le agregamos una enzima de restricción puede que se produzcan
fragmentos, si en el ADN amplificado hay una o varias de esas
combinaciones de 6 o 4 pares de bases. Quizás al comparar el gen
normal con el mutado, se haya perdido o ganado un sitio de restricción
para alguna de las miles de enzimas de restricción conocidas
 Ejemplos
de dos tipos de enzimas de restricción. imagen extraída de
accessmedicina.mhmedical.com
Algunas de las miles de enzimas conocidas son:
Fuente: https://www.e-allscience.com/blogs/news/que-son-las-enzimas-
de-restriccion-para-que-se-usan-y-que-funcion-desempenan-en-la-
naturaleza
A modo de ejemplo y usando la imagen de arriba, si  por una mutación
de la secuencia que reconoce BamHI, en vez de CCTAGG se cambia a
CTTAGG, en ese segmento de ADN se pierde el sitio de corte de BamHI
porque deja de reconocerlo y no corta. De modo que en un alelo normal,
la enzima BamHI corta, por ejemplo generando dos fragmentos pero en
el alelo mutado ya no corta, con lo que veríamos en un gel, solo un
fragmento.  (puede verse graficado abajo)
Esta técnica puede usarse entre otras cosas para detección de alelos de
un gen normales y mutados (enfermedades hereditarias) o para distinguir
cepas bacterianas o virales o alelos más favorables para una
característica de interés productivo para luego aplicarlo a la selección.
Un esquema se muestra para ver en que se basa el diagnóstico
adaptación por
Gabriela Iglesias
En el caso de los test de paternidad, hoy en día se hacen por PCR
seguida de un análisis de unos 9 a 13 VNTRs (numero variable de
repeticiones en tandem) en una misma reacción seguida de la
visualización en geles de poliacrilamida con la ayuda de un secuenciador
automático. En este caso se amplifican sitios específicos del genoma,
que poseen un numero variable de secuencias repetidas. Por ejemplo
GCGA.GCGA.GCGA etc. En este caso se repite 3 veces en uno de
nuestros cromosomas (el materno o paterno) o sea que quizás yo
(Gabriela) poseea 3 repeticiones en el materno y 10 en el paterno. Otra
persona podría tener 5 y 15, otra 10 y 12 etc. Cuanto más variable es el
numero de repeticiones, más precisa es la técnica. De este tipo de
repeticiones se amplifican por PCR 9 a 13 en cada individuo y los
fragmentos se ven luego en geles y se separan por tamaños. El esquema
de abajo muestra un ejemplo con sólo 3 repeticiones en el Individuo A, B
y C. El tamaño de la banda de lo amplificado varía según el No de
repeticiones que cada persona tenga
Usos en la criminología o medicina forense en este caso con Southern
blot y RFLP