3.3.

Méthodes générales d’analyses :

3.3.1. Préparation de l’échantillon
Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique
s’effectue toujours à partir d’une suspension.
Après ouverture aseptique, l’échantillon sera “homogénéisé” (liquide) ou
broyé dans un volume connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait
la première dilution.
- Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle
vigoureuse en présence de billes de verre permet d’obtenir une homogénéité
satisfaisante.
-Pour les produits solides diverses techniques de “broyage” sont utilisables :
1) broyage manuel au Potter ou en en présence de sable stérile ou de billes de
verre (mortier)
2) broyage mécanique
- avec un broyeur électrique à couteaux de type VIRTIS : Au cours du broyage
les germes doivent être dispersés mais non détruits; la température ne doit pas
trop s’élever (le récipient peut être placé dans de la glace). Le broyage
s’effectue en général avec 10 volumes (ou 9) de diluant pour 1 “volume” de
produit (par exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant stérile). Le
diluant peut être de l’eau distillée, de l’eau physiologique, du Ringer au 1/4 ou
une solution tryptone-sel , etc. .
- avec un broyeur du type STOMACHER : Cet appareil permet de disperser
dans des conditions relativement douces l’aliment dans le diluant. De plus il
n’est pas nécessaire, comme dans le cas de l’utilisation d’un broyeur de type
Virtis, de stériliser les récipients entre deux utilisations. En effet, le Stomacher
(digesteur) utilise des sacs plastiques stériles à usage unique. La prise d’essai
est le plus souvent de 10 g (ou 25) d’aliment et de 90 ml (ou 250) de diluant.
5. DILUANTS
Le choix d’un diluant est fonction du produit à analyser; également le type de
microorganisme à rechercher peut être un facteur déterminant dans le choix
d’un diluant. Se reporter aux normes spécifiques des produits et à la méthode
d’analyse. Lorsque les analyses ne requièrent pas la recherche de salmonelles,
le diluant général « Peptone-Sel » (selon la norme ISO 6887 ) semble le plus
approprié pour la majorité des aliments.
5.1 Choix du diluant approprié
5.1.1 Diluant d’emploi général
Peptone-sel
Peptone 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
Dissoudre les ingrédients et distribuer. Stériliser 15 minutes à 121 ºC.
pH final : 7,0 ± 0,2
5.1.2 Diluant à utiliser si les analyses incluent la recherche de Salmonella spp.
Eau peptonée tamponnée
Peptone 10,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Phosphate disodique (Na2HPO4) 3,5 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) 1,5 g
Eau 1 000 ml
Dissoudre les ingrédients et distribuer. Stériliser 15 minutes à 121 ºC.
pH final : 7,2 ± 0,2
5.2 Bouillons d’enrichissement initiaux
-Doivent toujours être utilisés à la température ambiante (jamais réfrigérés)
sauf pour :
*Les méthodes d’isolement d’E coli O157
*Les méthodes d’isolement de Listeria monocytogenes et Listeria Spp
-Pour les unités d’échantillonnage d’un poids supérieur à 25g , les BEI doivent
être chauffés à la température d’incubation avant de procéder à la dilution --- -
-Pour l’analyse des produits gras , le diluant contenant du citrate de sodium 2%
(dispersant ) est préalablement chauffé à 45°c
-Les diluants préchauffés doivent être utilisés dans la journée
Pour les bouillons d’enrichissement secondaire, ainsi que pour les unités
d’échantillonnage de 25 g ou moins,
il est acceptable que la température du bouillon soit augmentée seulement à
la température ambiante avant de procéder à l’analyse. P
(RÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE 01-D-
550)
6. BROYAGE ET HOMOGÉNEISATION
Définitions :
Selon l’ Arrêté du 22 Dhou El Kada 1437 correspondant au 25 aout 2016 rendant
obligatoire la méthode de préparation des Échantillons, de la suspension mère et
des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique des produits autres
que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pèche

Echantillon pour laboratoire :

Echantillon envoyé au laboratoire et destiné à être utilisé pour un contrôle ou
pour des essais.
Echantillon pour essai :
Echantillon représentatif mesuré en volume ou en masse prélevé sur
l’échantillon pour laboratoire pour servir à la préparation de la suspension
mère.
Suspension mère (première dilution)
Suspension, solution ou émulsion obtenue après qu’une quantité pesée ou
mesurée du produit à analyser (ou de l’échantillon pour essai préparé à partir
de ce produit) a été mélangée avec une quantité neuf fois égale de diluant, en
laissant se déposer les particules grossières, si elles existent.
Dilutions décimales suivantes
Suspensions ou solutions obtenues en mélangeant un volume mesuré de la
suspension mère avec un volume neuf fois égal de diluant et en répétant cette
opération sur les dilutions suivantes, jusqu’ obtention d’une gamme de
dilutions décimales appropriée pour l’inoculation des milieux de culture.

procédure
-La répartition des micro-organismes dans le produit alimentaire à analyser ne
peut pas être homogène. (surtout quand le produit à analyser est volumineux).
-L’homogénéisation doit permettre la répartition homogène des micro-
organismes d’un échantillon.
-L’analyse d’une partie du produit homogénéisé doit être représentative de
l’ensemble de l’aliment.
-Dans certains cas, il faut effectuer plusieurs prélèvements à différents endroits
de l’aliment.
-Pour les produits liquides ou semi liquides , il suffit d’ homogénéiser
manuellement, la présence de billes de verre peut faciliter l’opération.
-Pour les produits visqueux il est possible d’utiliser un agitateur
mécanique(broyeur électrique mécanique ou broyeur de type stomacher ).
Remarques :
Au cours du broyage , les germes ne doivent pas être détruits mais uniquement
dispersés
La T° ne doit pas trop s’élever ( placer le récipient dans de la glace )
En général :le broyage s’effectue avec 9 ou 10 volumes de diluant pour 1
volume de produit
Ex : 10 g de produit pour 100 /90 ml de diluant
Diluants utilisés : eau physiologique , ringer au ¼ , solution tryptone sel , eau
distillée

Préparation de la Suspension mère et des dilutions

décimales
PRINCIPE
Préparation de la suspension mère , de façon à obtenir une répartition aussi
uniforme que possible des micro-organismes contenus dans la prise d’essai.
Préparation, si nécessaire, de dilutions décimales en vue de réduire le nombre
de microorganismes par unité de volume pour permettre, après incubation,
d’observer leur éventuel développement (cas des tubes=milieux liquides) ou
d’effectuer le dénombrement des colonies (cas des boites), comme précisé
dans chaque méthode spécifique.
- Pour restreindre le domaine de dénombrement à un intervalle donné ou si
des nombres élevés de micro-organismes sont attendus, il est possible
d’ensemencer uniquement les dilutions décimales nécessaires (deux dilutions
successives au minimum)
Cas de produits solides : fromages, viandes, ….
Introduire aseptiquement 25g du produit à analyser dans un flacon (sur la
balance tarée) ou dans un sachet stérile pour stomacher contenant 225ml
de TSE (Tryptone Sel Eau), d’Eau Peptonée Tamponnée (recherche des
salmonelles), ou de bouillon Fraser (recherche de listeria), et homogénéiser.
La suspension obtenue représente la dilution mère DM=1/10. 
Préparation des dilutions aux 1/100 et 1/1000 :
-La dilution au 1/100 : 1ml de la dilution mère1/10 + 9ml de TSE.
- La dilution au 1/1000 : 1ml de la dilution 1/100 + 9 ml de TSE.
-Peser dans un sachet stérile 3 × 25 gr du produit à analyser aseptiquement :
 La 1ère pesée servira au contrôle bactériologique.
 La seconde servira à la recherche des Salmonella.
 La troisième servira à la recherche de Listéria.
Cas particulier :
 Cas du beurre pour lequel la prise d’essai est de 10 g qu’on dilue dans 20
ml de TSE (dilution au 1/3), après fonte du beurre au bain marie, et
centrifugation, on dilue 3 ml de la phase aqueuse dans 7 ml de TSE pour
avoir la dilution finale de 1/10
 Cas de certains produits alimentaires ayant subi des traitements
thermiques ou ayant été congelés ou déshydratés ou encore ceux
contenant des sels pouvant exercer une action inhibitrice ( chlorure de
sodium, nitrate ou nitrite de sodium) doivent subir une revivification
Cas de produits liquides : jus, lait pasteurisé en sachet….
 Mélanger de façon aseptique quelques unités (3 à 5) prises au hasard dans le
lot à contrôler ; dans un Erlen Meyer stérile.
Ce mélange constitue la solution mère (SM).
Préparer les dilutions en utilisant comme pour les produits solides :
 Tryptone sel eau (TSE) pour le contrôle bactériologique classique.
 Eau peptonée tamponnée (recherche de salmonelles).
 Bouillon Fraser (recherche de Listeria)
Prélever 1ml de la SM et l’introduire dans 9 ml de TSE => dilution 10ˉ1. 
Prélever 1ml de la dilution 10ˉ1 et l’introduire dans 9 ml de TSE => dilution 10².
Prélever 1ml de la dilution 10²et l’introduire dans 9 ml de TSE => dilution 10³.
Revivification
-Lors des traitements technologiques appliqués aux produits alimentaires
(déshydratation , chaleur , froid ) les micro-organismes sont souvent
endommagés mais non tués
-Ceci se répercute sur:
 leur propriétés physiologiques (phase de latence qui s’allonge )
 Leur sensibilité aux conditions défavorables du milieu

-Ces altérations sont généralement réversibles (quand elles disparaissent ; les

bactéries récupèrent leur propriétés initiales (croissance , pouvoir pathogène )
-La présence de bactéries endommagées peut entrainer des variations dans la
numération et porter à croire qu’il y a peu ou pas de germes et donc pas de
danger pour la santé du consommateur
-Ceci explique la nécessité de la revivification des bactéries avant de les
soumettre à des milieux sélectifs peu favorables à la croissance (présence
d’inhibiteurs )
-Cette opération permet aux cellules ayant subi des altérations de structure ou
d’ordre métabolique de cultiver sur des milieux sélectifs utilisés pour l’analyse .
-Elle consiste simplement à laisser le flacon contenant la dilution mère à 20 ±
2°C pendant 30 à 45 mn.
On distingue :
 La revivification en milieu liquide
 La revivification sur milieu solide
La revivification en milieu liquide :
Il suffit alors de choisir un diluant de composition favorable et d’incuber le tout
à la température optimale de croissance du germe à rechercher pendant un
temps qui varie en fonction du type d’analyse réalisé (temps voisin du temps de
latence du germe normal )
La revivification sur milieu solide :
Quand la numération est effectuée sur milieu solide, la revivification peut être
obtenue par une pré-culture sur une gélose non sélective favorable avec un
temps d’incubation supérieur au temps de latence , mais ne permettant pas la
formation de colonies macroscopiques visibles.
Après revivification, la surface de la gélose est recouverte de gélose sélective

Principales techniques de numération

Méthodes générales directes :
o Comptage direct
o Détermination du poids sec ou dosage des protéines microbiennes ou
dosage des acides nucléiques
o Néphélométrie
o Système luciférine /luciférase
Méthodes générales indirectes :
o Dosage d’un métabolite primaire synthétisé ou de la quantité d’une
substance consommée
o Réduction d’un colorant
 o Dilution et culture :
1. Numération à partir d’un milieu solide :
Technique de numération dans la masse de la gélose
Technique de numération en surface de la gélose
2. Numération en milieu liquide :
Fractionnement de grands volumes liquides
Méthode de Mac Grady (nombre le plus probable )
Numération par filtration
a. les méthodes générales directes
1) Comptage direct
Il s’effectue au microscope à l’aide de microchambres graduées de volume
connu (cellules de Thoma, de Malassez, de Nageotte, de Salimbéni Cloup etc...)
après dilution en eau physiologique pour les germes morts, en eau formolée à
10 % pour les germes vivants. Ce type de comptage peut être automatisé
(compteurs de particules). Il est également possible d’estimer au microscope le
nombre de micro-organismes d’un produit donné après étalement et
coloration d’une quantité connue du produit (de l’ordre de quelques
microlitres) sur une lame. Enfin, un comptage direct est réalisable après
filtration du produit (ou de ses dilutions) sur membrane, coloration de la
membrane et observation microscopique. Cette dernière technique permet
l’évaluation, après coloration par l’acridine orange et observation en
épifluorescence, des micro-organismes vivants et morts (DEFT). Ce colorant est
un intercalant des acides nucléiques avec lesquels il forme des complexes
fluorescents verts (ADN) ou orange (ARN)
2) Détermination du poids sec, ou dosage des protéines microbiennes ou
dosage des acides nucléiques (après sonication par exemple et/ou extraction
en milieu alcalin)
3) Néphélométrie
La turbidité d’un milieu est, dans certaines conditions, proportionnelle au
nombre de microorganismes présents dans ce milieu. Ainsi l’absorbance d’une
suspension microbienne à une longueur d’onde supérieure ou égale à 540 nm
varie linéairement jusqu’à des valeurs inférieures ou égales à 0,8 avec le
nombre de germes. Il est par ailleurs possible de comparer visuellement la
turbidité du milieu avec une gamme étalon d’albumine (méthode de
Mestrezat : ainsi l’opacité d’une suspension de 5.109 staphylocoques par ml est
identique à celle d’une suspension d’albumine à 0,5 g par litre).
4) Système luciférine - luciférase
Cette méthode permet le comptage des micro-organismes vivants par dosage
de l’ATP intracellulaire, la teneur en ATP intracellulaire étant sensiblement
constante pour un microorganisme donné ; cette teneur est égale à 0 si le
germe est mort. Après lyse de la cellule (SDS) l’ATP est dosé par voie
enzymatique selon le schéma suivant :

Le nombre de photons émis à 562 nm mesuré par un compteur à scintillations

est proportionnel à la quantité d’ATP, elle-même fonction du nombre de
cellules vivantes.

Méthodes générales indirectes :

Dosage d’un métabolite primaire synthétisé, ou dosage de la quantité d’un
substrat consommé.
Ces méthodes ne sont applicables que dans des conditions bien définies (phase
exponentielle de croissance, température, milieu etc...).
Réduction d’un colorant :
Certains micro-organismes modifient le potentiel d’oxydo-réduction des
milieux dans lesquels ils se trouvent ; la vitesse de cette modification est à la
fois fonction du nombre de micro-organismes, de leur activité métabolique
(réductrice le plus souvent) et d’autres paramètres tels que la nature du milieu,
Parmi les indicateurs disponibles le bleu de méthylène et la résazurine sont les
plus utilisése germe, la température etc...
Dilution et culture
Cette technique permet en principe la numération des germes vivants.
La culture est réalisée:
- soit en milieu liquide :
Fractionnement de grands volumes liquides
Méthode de Mac Grady (nombre le plus probable )
- soit en milieu solide :
Technique de numération dans la masse de la gélose
Technique de numération en surface de la gélose

Numération à partir d’un milieu solide : UFC

Cette méthodologie est le plus fréquemment réalisée dans des boîtes de Pétri.
Elle repose sur le principe que toute bactérie vivante introduite dans la masse
ou en surface d’un milieu gélosé favorable donne en principe naissance après
incubation à une colonie macroscopique. Le nombre total de colonies
correspond alors au nombre d’UFC présents dans l’inoculum.
De nombreuses critiques à cette méthode peuvent être formulées. Ainsi, les
bactéries aérobies strictes se développent mal dans la masse de la gélose,
tandis que les bactéries anaérobies strictes ne s’y développeront que dans des
conditions d’incubation appropriées (jarre anaérobie par exemple). Il peut aussi
exister certains antagonismes bactériens (bactériocines etc...). Par ailleurs si la
température de mélange du milieu gélosé mélange à l’inoculum est supérieure
à 45 - 47°C , il peut y avoir inactivation de microorganismes. Cette méthode de
culture dans la masse conduit néanmoins à des dispersions homogènes dans la
gélose et donc à une distribution homogène des colonies. Dans cette méthode
des germes se trouveront dans la masse et d’autres en surface, les colonies
formées étant, compte tenu des contraintes stériques imposées par le réseau
gélifié, alors différentes pour un même micro-organisme. Cet inconvénient est
éliminé par la technique de la double couche. La numération en surface n’est
réalisable que sur une surface de milieu parfaitement sèche. L’opération
d’étalement au râteau reste à maîtriser (adsorption de germes sur le râteau) et
le volume d’inoculum déposé ne peut en aucun cas excéder 0,5 ml avec des
boîtes de 9 cm de diamètre (des volumes supérieurs ne sont pas absorbés par
le gel d’agar et l’eau qui reste en surface rend impossible toute numération en
raison de la formation d’une nappe). Cette méthode donne de bons résultats
avec les germes aérobies et aéro-anaérobies.
Technique de numération dans la masse de la gélose (en profondeur) 
Principe 
Les milieux gélosés sont liquéfiés au bain-marie bouillant, puis maintenus en
surfusion à 45 ±1°C. 1 ml de l’inoculum ; dans lequel on veut connaître le
nombre de micro-organismes ; est réparti en gouttes sur le fond d’une boîte de
pétri posée bien à plat dans la zone de protection du bec Bunsen.
On procède de la même façon pour chaque dilution(10ˉ³,10ˉ²,10ˉ ¹) en
réalisant, dans la mesure du possible, 2 essais par dilution. Le milieu gélosé en
surfusion dans lequel l’inoculum sera incorporé doit être à 45°C±1°C. Si sa
température est supérieure à cette valeur il se produira une destruction
partielle de la flore ; au contraire, si sa température est inférieure à 45°C le
milieu se solidifiera irrégulièrement et ne se mélangera pas de façon homogène
avec l’inoculum.
Avantages :
Dispersion homogène dans la gélose et donc une distribution homogène des
colonies.
Inconvénients :
Les bactéries aérobies strictes se développent mal dans la masse de la gélose,
tandis que les bactéries anaérobies strictes ne s’y développeront que dans des
conditions d’incubation appropriées (jarre anaérobie par exemple).
Il peut aussi exister certains antagonismes bactériens (bactériocines etc...).
Si la température du milieu gélosé mélangé à l’inoculum est supérieure à 45 -
47°C, il peut y avoir inactivation de microorganismes.
Technique de numération en surface de la gélose (Méthode par étalement)
Principe
100 à 500 microlitres du milieu à analyser sont déposés à la surface de la gélose
et immédiatement répartis de façon uniforme à la surface du milieu au moyen
d’un ensemenceur stérile du type pipette râteau.
La pipette râteau est “stérilisée” entre deux étalements par immersion dans de
l’éthanol
Avantages
Cette méthode donne de bons résultats avec les germes aérobies et aéro-
anaérobies.
Inconvénients
L’opération d’étalement au râteau reste à maîtriser (adsorption de germes sur
le râteau) et le volume d’inoculum déposé ne peut en aucun cas excéder 0,5 ml
avec des boîtes de 9 cm de diamètre (des volumes supérieurs ne sont pas
absorbés par le gel d’agar et l’eau qui reste en surface rend impossible toute
numération en raison de la formation d’une nappe).
8.Numération en milieu liquide : UFT (unité formant trouble)
Principe :
-Jusqu’à présent, on utilisait une méthode générale pour interpréter le
dénombrement de bactéries en milieu liquide dans un aliment. Ainsi :
Si le tube est + = il y a au moins une bactérie / mL de la dilution considérée
Si le tube est - = il y a moins d’une bactérie / mL de la dilution considérée
-La méthode du NPP (Nombre le Plus Probable) ou MPN (Most Probable
Number) utilise une méthode statistique pour connaître le nombre (le plus
probable) de bactéries présentes dans 1 mL de dilution.
-Cette technique utilise plusieurs tubes par dilution (2, 3, 4 ou 5) et on compare
les résultats à une table statistique = la table de Mac Grady qui donne le NPP
sur la dilution considérée il s’agit donc d’une interprétation probabiliste)
Technique :
1-Réaliser une gamme de dilution du produit analyser
2-Ensemencer 1 ml de chaque dilution dans plusieurs tubes (2, 3, 4 ou 5) d’un
milieu liquide correctement choisi
3-Incuber les tubes à la température adaptée (Ex : 44°C pour les coliformes
thermotolérants
Lecture :
 1- Après incubation des tubes, noter dans un tableau pour chaque tube si le
résultat est positif (+) ou négatif (-).
2- Grouper le nombre de résultats positifs par dilution
3- Regrouper en nombre de 3 chiffres la suite de chiffres obtenue en
commençant par le chiffre obtenu par la plus faible dilution.
4- Choix de la dilution pour le calcul, 2 méthodes sont possibles :
choisir la dilution qui possède le regroupement le plus grand tout en étant
inférieur à :
- 220 pour la méthode à 2 tubes / dilution
- 330 pour la méthode à 3 tubes / dilution
- 440 pour la méthode à 4 tubes / dilution (etc…)
Ou choisir la plus forte dilution contenant tous ces tubes positifs.

9. Numération par filtration

-Cette méthode consiste à faire passer un certain volume d’échantillon ou de
ses dilutions au travers d’une membrane filtrante ; sur laquelle sont retenus
les micro-organismes recherchés.
- Le filtre est alors posé sur la surface d’un milieu de numération adéquat ou
sur un milieu gélosé spécifique du germe à rechercher, face portant les micro-
rganismes vers le haut.
-Après incubation, comme dans le cas de la numération en milieu gélosé, on
compte les colonies formées à la surface du filtre.
-Cette méthode présente certains avantages par rapport aux méthodes déjà
décrites: le temps d’incubation est généralement plus court
il n’y a aucune interférence entre micro-organismes
les agents microbicides associés au produit sont éliminés.