FUNGII ÎN APLICAŢII INDUSTRIALE.

BIOTEHNOLOGII

METABOLIŢI FUNGICI DE INTERES MEDICINAL

MICOTERAPIE
 aplicaţii alimentare ale unor specii de microorganisme

produse naturale alimente: pâine, vin, brânzeturi

Penicillium roquefortii

brânzeturi Roquefort, Gorgonzola,
Stilton Blue, Danish Blue

Saccharomyces cerevisiae

bere, produse de panificaţie

Penicillium camemberti

brânzeturi Camembert, Brie
miceliul = crusta

specii de Aspergillus, Rhisopus, Saccharomyces

Aspergillus oryzae 
 alimente fermentate:
sake sos de soia, pasta de soia, tofu fermentat (sufu)
• levurile sunt utilizate în:
• producerea de substanţe medicamentoase, alimente, enzime
• cercetările ştiinţifice de biologie celulară şi moleculară

Schizosaccharomyces pombe
S. pombe

• organism model
• elucidarea mecanismelor de control al ciclului
celular (Premiul Nobel 2001)
• moleculele cheie care controleaza ciclul,
funcţiile acestora, caracterul lor universal
• izolat din bere de mei (1890, Zanzibar - Africa
orientală)
«pombe» = bere (Swahili)
 Aplicaţii industriale actuale

• implică specii fungice capabile să:

• fermenteze anumite substraturi
• sintetizeze metaboliţi diverşi
• transforme sau amelioreze produse existente, naturale sau sintetice

Fermentare fervere (lat.) = a fierbe

(la începutul fermentaţiei alcoolice, la
suprafaţa lichidului se ridică bule de gaz)

• biotehnologii: ansamblu de metode şi procedee care utilizează microorganisme vii

sau anumiţi constituenţi celulari ai acestora
 TULPINI FUNGICE
obţinere, ameliorare, conservare
Caracteristicile tulpinilor selectate pentru producţia bioindustrială

• creştere rapidă, facilă, pe substraturi ieftine

• posibilitate de a secreta enzime în cantităţi ridicate

• stabilitate genetică relativă (condiţii de stres

determinat de multiplicarea pe scară largă)

• capacitate de biotransformare sau de secreţie cu

randament maxim

• posibilitate de separare şi purificare a metabolitilor

cu costuri minime
 Tulpini fungice

speciile fungice utilizate pe scară largă

micromicete
mucegaiuri levuri

• tulpinile de referinţă sunt stocate în colecţii internaţionale:

• ATCC: American Type Culture Collection (SUA)

• CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures (Olanda)
• CICM: Collection Internationale de Cultures de Microorganismes (Franţa)
• NCTC: National Collection of Type Culture (Marea Britanie)
 Tulpini fungice

Selecţionarea de noi tulpini

recoltate din mediul ambiant din toate tipurile de habitate: aer, sol, apă dulce/sărată

triaj primar  tulpini cu potenţial de biosinteză a unor metaboliţi cu proprietăţi:

pentru industria agro-

terapeutice (antibiotice,
alimentară (sinteză de
antifungice, antivirale, fitosanitare (ierbicide,
proteine, fermentaţii, de depoluare biologică
antitumorale, pesticide, nematicide)
activitate enzimatică
antiinflamatoare etc.)
etc.)

tulpinile sunt izolate, purificate, identificate

moleculele active sunt izolate si caracterizate

 Tulpini fungice

• obiective:

• exometaboliţi = substanţe excretate sau secretate pe parcursul dezvoltării

miceliului în mediu nutritiv lichid + agitare continuă
• se regăsesc în supernatant

• endometaboliţi → extracţia de la nivelul miceliului mult mai lungă şi mai

costisitoare
• etapă suplimentară: distrugerea peretelui celular şi a membranei
plasmatice

• automatizarea cât mai completă a proceselor tehnologice şi de analiză

 Tulpini fungice

Ameliorarea tulpinilor fungice

• tulpinile sălbatice:
• adaptate mediului înconjurător şi competiţiei cu alte microorganisme
• nu sunt programate să producă metaboliţi în cantităţi crescute

• sisteme de autoreglare → blochează sinteza odată ce concentraţia necesară a

fost atinsă în celulă

• tulpinile selecţionate pentru producţia industrială → ameliorate din punct de

vedere al activităţii de biosinteză:
• produc metaboliţi în cantităţi superioare necesităţilor proprii
• sintetizează molecule noi, chiar inexistente în patrimoniul genetic al speciei
respective
 Tulpini fungice

• manipulările urmează două direcţii:

• modificarea informaţiei genetice conţinută în celulă (mutaţii induse sau

aleatorii)
• transferul de informaţie genetică suplimentară în celulă
• fuziune de protoplaşti
• recombinări genetice, transgenie

• ulterior trebuie asigurată stabilitatea genomică a tulpinii ameliorate în condiţiile

cultivării intensive
 Tulpini fungice

Conservarea tulpinilor fungice

Congelare
• des folosită
• măsuri de precauţie pentru a reduce procentul de
celule care mor:
• temperatura de congelare foarte mică (-80oC
sau azot lichid)
• viteza de congelare lentă (1oC/min) +
decongelare foarte rapidă
• substanţe crioprotectoare: glicerol, DMSO,
lapte ecremat de concentraţie dublă

Liofilizare
• sublimarea realizată rapid
• închiderea flacoanelor → sub vid (evita
contaminarea datorată aerului ambiant)

o suspensie de spori concentrată (min 107 spori/ml)
poate fi conservată mai mulţi ani la întuneric
 PRODUCŢIA INDUSTRIALĂ
Medii de cultură

• subproduse ale industriei agricole sau petroliere:

• sursa de azot:
• extract apos de seminţe de porumb, făină de soia, făină de peşte, făină
de arahide, deşeuri de abator

• sursa de carbon:
• melasa: 50% glucide diverse, aminoacizi, vitamine, săruri minerale
• zer
• amidon: specii fungice capabile să secrete amilaze (Mucorales,
Aspergillus etc.)
• deşeuri celulozice (lemn, paie, turbă): specii celulolitice (Trichoderma)
• ape sulfitice (deşeuri de la fabricarea pastei de hârtie conţinând oze
provenite din degradarea hemicelulozei)
• parafine (subprodus al rafinării petrolului): aplicare limitată → nu conţin
oxigen în moleculă  aerare intensivă a mediului de cultură
 Producţia industrială

Bioreactoare
• cuve de oţel de capacitate mare (50-1000 m3)
• dispozitive de oxigenare şi agitare a mediului de cultură

• agitarea:
• mecanică: turbine cu palete (tip Waldhof)
• pneumatică: aer comprimat (tip Lefrançois, Vogelbusch)

• aparatură de control a pH-ului, concentraţiei de oxigen, temperaturii, vitezei de

agitare etc.
 Producţia industrială

Extracţia

• etapa finală a procesului industrial

• produşii doriţi sunt izolaţi din:

• biomasă
• recuperată prin decantare, filtrare sau centrifugare diferenţială

• supernatant
• produşii rezultaţi în urma metabolismului fungic şi excretaţi în mediu
• extraşi prin tehnici de dializă, cromatografie etc.
 METABOLIŢI FUNGICI
Metaboliţi primari

• acizi organici, vitamine, alcooli

• se acumulează în mediul de cultură în timpul fazei exponenţiale de creştere a
miceliului în special în perioada terminală a culturii
 Metaboliţi primari

Acizi organici
• produşi finali ai glicolizei (acidul lactic, propionic, gluconic etc.) sau ai oxidării
incomplete a ozelor (acid citric, itaconic, fumaric, oxalic etc.)

Acidul lactic
• specii de Rhizopus, Lactobacillus
• medii cu conţinut de amidon
• domeniul alimentar (acidifiant pentru sucuri, siropuri), farmaceutic (lactat),
industria textilă

acidul lactic
sporangiofori cultura

Rhizopus oryzae
 Metaboliţi primari

Acidul citric
• industria
• farmaceutică (comprimate efervescente, citrat)
• cosmetică (loţiuni astringente, şampoane)
• alimentară (băuturi carbogazoase, conserve, produse de cofetărie)
• anual produse  400 000 tone

• anterior izolat din sucul de lămâie şi ananas

• actualmente → biosinteză → Aspergillus, Penicillium, Saccharomyces ameliorate
genetic
• medii cu conţinut de melasă
• cele mai utilizate specii: A. niger şi Saccharomycopsis lipolytica

acidul citric

A.niger
 Metaboliţi primari

Acidul itaconic

• duble legături  uşor polimerizabil

• utilizat ca răşină înlocuitoare pentru
acidul acrilic
• tulpini mutante de Aspergillus terreus
• medii cu melasă

El-Imam AA, Du C (2014) Fermentative Itaconic Acid Production . J

Biodivers Biopros Dev 1: 119. doi:10.4172/2376-0214.1000119

A. terreus
acidul itaconic
 Metaboliţi primari

Aminoacizi

• avantajul obţinerii prin biosinteză:

• se obţin direct formele levogire (asimilabile în mod direct de către
mamifere)
• sinteza chimică produce numai racemici

acid aspartic

Acidul glutamic, acidul aspartic

• specii de Penicillium, Hansenula, Rhizopus

• corectori de gust (glutamat)
• în alimentaţia parenterală
• în cosmetologie

acid glutamic
 Metaboliţi primari

Vitamine
• cele mai promiţătoare genuri: Streptomyces şi Nocardia

Vitamina B1 (tiamina)
• prezentă în mod normal în celula fungică
• producţia pe scară industrială încă insuficientă

Vitamina B2 (riboflavina)
• sintetizată de către Ashbya gossypii (ascomicetă parazită
a bumbacului şi arborelui de cafea)

A. gossypii

Vitamine liposolubile: ergosterol, provitamina A

 Metaboliţi primari

Alcooli şi solvenţi industriali

specii ameliorate din genurile Candida, Saccharomyces, Debaryomyces


xilitol, dihidroxiacetonă

Trichoderma sp.

specii de Trichoderma degradează deşeurile celulozice


amestec de acetonă – butanol – etanol
 Metaboliţi secundari
• insecticide biologice, antibiotice, alcaloizi din ergot, produşi utilizaţi în industria
alimentară
Insecticide biologice
• utilizate din ce în ce mai mult în locul pesticidelor şi ierbicidelor de sinteză (efecte
nocive)

Arthrobotrys conoides
blocând un nematod

• preparate obţinute din Arthrobotrys şi Dactylaria → nematicide

• specii ale ordinului Entomophtorales → combaterea muştelor, unor fluturi

• specii de Chytridiomicete → combaterea tânţarilor (vectori ai paludismului,

filariozei, febrei Dengue)
 Metaboliţi secundari

Substanţe terapeutice
Alcaloizi din ergot
• culturi de secară infectate artificial (necesită supraveghere)

• biotehnologie:
• producţia industrială în bioreactoare de mare capacitate
• specia Claviceps purpurea
• separarea şi extracţia ulterioară a alcaloizilor este costisitoare

selecţionarea unor tulpini modificate de C. paspali

sintetizeaza doar un singur alcaloid

C. paspali cultură de C.
parazitând paspali de 9 zile
Paspalum dilatatum
 Metaboliţi secundari

Antibacteriene

Peniciline
• sintetizate de către Penicillium chrysogenum

P. chrysogenum
Cefalosporine
• sintetizate de către Cephalosporium acremonium

C. acremonium

• numeroase alte antibiotice sunt ulterior obţinute la scară industrială prin

semisinteză: meticilina, ampicilina, amoxicilina, cefalotina, cefaloridina etc.
 Metaboliţi secundari

Antifungice

Griseofulvina
• sintetizată de Penicillium griseofulvum

P. griseofulvum

Ciclosporina
• imunosupresor important
• secretata de Tolypocladium inflatum

T. inflatum
 Metaboliţi secundari

Enzime
cea mai importantă utilizare pe scară industrială a speciilor fungice, din
punct de vedere cantitativ

Amilaze
• fungii produc în principal β-amilaze
• frecvent utilizate: Aspergillus niger şi A. oryzae
• mediul de cultură conţine aminoacizi, zinc, fier

Invertaze
• hidroliza zaharozei  glucoză + fructoză
• utile în producţia de cofetărie
• β-fructozidaza este produsă de către specii de
Candida, Saccharomyces, Alternaria, Penicillium

conidii de Alternaria alternata

 Metaboliţi secundari

Enzime pectinolitice
• clarifierea sucurilor de fructe, procesarea cafelei şi a pulberii de cacao
• produse de către specii de Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Botrytis

Enzime proteolitice
• industria agroalimentară, producerea de detergenţi (asociere cu amilaze şi
lipaze)
• secretate de tulpini de Aspergillus
 BIOCONVERSII

• microorganismele biotransformă prin metabolismul propriu un anumit substrat în

molecule specifice

• importante pentru obţinerea anumitor substanţe medicamentoase

• reacţiile metabolice implicate: hidroxilări, acilări, fosforilări, oxidări, reduceri

• genurile des utilizate: Curvularia, Rhizopus, Aspergillus, Fusarium

Bioconversia steroizilor
• 11α-hidroxilarea nucleului steroidic → hidrocortizon şi la prednisolon

hidrocortizon
MICOTERAPIE

• tradiţia recomandă utilizarea ciupercilor

medicinale de secole

• micoterapia (tratamentul cu ciuperci) îşi are

originea în anii 1970/1980

• diverse studii ştiinţifice confirmă interesul

utilizării ciupercilor împotriva cancerului
 Micoterapie

Partea utilizată
• macromicetele sunt formate din:

• miceliu subteran → conţine chitosan (precursor al chitinei)

• carpozom → conţine chitină

pălărie

carpozom
picior
hife

spor

miceliu
 Micoterapie

Dezavantajele carpozomilor

chitina

• chitina fixează metalele şi glucidele

• poate fixa metalele grele sau compuşi radioactivi

• principiile active (peptidoglicani) se extrag dificil datorită chitinei

• degradarea chitinei  N-acetil-glucosamine → pot amplifica efectele biologice ale

poliaminelor (induc proliferarea celulară, în special a celulelor maligne)
 Micoterapie

Avantajele miceliului

• în principal miceliile conţin principiile active

• chitosanul conţinut în micelii inhibă poliaminele → evită efectul lor negativ

• exclude riscul de contaminare

• permite o mai bună biodisponibilitate (de cinci ori mai mare)

chitosan
 Micoterapie

Originea produselor

probleme principale:

• carpozomul concentrează elemente toxice (pesticide, metale)

• modul de depozitare influenţează considerabil şi foarte rapid inactivarea

principiilor active

• modul de cultură (pe cereale) induce un risc de contaminare cu micotoxine

• modul de uscare şi pulverizare poate distruge principiile active fragile

 Micoterapie

Principalele ciuperci comestibile cu proprietăţi medicinale

• numeroase micelii au o eficacitate terapeutică acompaniată de inocuitate
• cele mai studiate 10 specii:

Coriolus versicolor (Karawataké) Agaricus blazei

Grifola frondosa (Maïtaké)

Ganoderma lucidum (Reishi)

Hericium erinaceus
 Micoterapie

Pleurotus ostreatus (păstrăv de fag)

Polyporus umbellatus

Lentinus edodes (shiitaké)

Armillaria mellea (ghebe)

Phellinus linteus
 Micoterapie

Principiile active

• în general sunt poliozide ramificate specifice, «hormoni» sau inhibitori enzimatici

• miceliile conţin cantităţi reduse de minerale şi vitamine
• principalele molecule active:

Miceliul Principiu activ

Coriolus versicolor Krestina
Ganoderma lucidum Acizi ganoderici, Glican
Grifola frondosa Fractiunea D, Grifolan
Agaricus blazei Blazeina
Lentinus edodes Lentinan
Hericium erinaceus Erinacerine H şi I
Pleurotus ostreatus Alfa-glucan cu greutate moleculară redusă
Polyporus umbellatus Poliporusterone A şi B, acetosiringona
Armillaria mellea Armillaripina, Armillarigina,
Phellinus linteus Beta-(1-3)-glicani substituiţi cu manoză
 Micoterapie

Principalele utilizări terapeutice

• polizaharidele miceliene → proprietăţi imunostimulante şi antitumorale

• pot complementa tratamentul alopat

• nu interferă cu tratamentele clasice şi sunt lipsite de toxicitate

• principalii compuşi comercializaţi:

• lentinan → Lentinus edodes
• krestina → Coriolus versicolor
• schizofilan → Schizophillum commune

• acţiune:
• stimularea limfocitelor T, a monocitelor/macrofagelor sau a limfocitelor natural
killer
• asupra caspazelor → apoptoza celulelor tumorale
 Micoterapie

Dozaj şi eficacitate

• eficacitatea depinde de:

• concentraţia de principii active
• fenomenele sinergice prezente
• biodisponibilitatea
• modul de conservare a produsului

• miceliile concentrează polifenolii din substratul pe care se dezvoltă  cultivarea

pe scoarţe îmbogăţite cu polifenoli, antioxidanţi sau antitumorale amplifică eficienţa
miceliului

• dozaj: 150 - 300 mg miceliu/zi; tratamentul durează cel puţin trei luni în vederea
modificării statusului imunitar

• regim alimentar fără lactate şi sărac în poliamine amplifică eficacitatea

• corectarea unei eventuale carenţe de vit. D3 micoterapiei