Enzimología

Estabilidad - Inmovilización enzimática

Estabilidad enzimática
 Uno de los principales problemas de los
sistemas biológicos es su estabilidad
limitada.
 Es un factor central ya que esta ligado a
los costos del proceso.
 Es una función compleja de las
condiciones ambientales utilizadas: pH,
reactivos, T y agentes desestabilizantes.
Estabilidad enzimática

 Generalmente la inactivación enzimática

es atribuida a efectos térmicos.
 Con una velocidad de 1er Orden
 Estabilidad enzimática
 Para establecer los mecanismos de
aumentar la estabilidad enzimática debe de
considerarse la estructura conformacional
de la proteína .
◦ Disposición espacial 3D
◦ Interacciones entre las cadenas laterales de AA
 Puentes de H.
 Interacciones hidrofóbicas
 Enlaces iónicos
 Puentes disulfuro
Estabilidad enzimática
 Factores que afectan las interacciones de
la proteína:
◦ Disolventes orgánicos
◦ pH extremos
◦ Detergentes
◦ Altas Temperaturas
◦ Altas concentraciones de Sales
Estabilidad enzimática
 Es tanta la suma de interacciones en una
proteína y tan la amplia serie de factores
que las afectan, que resulta imposible la
predicción teórica de la estabilidad
operacional.
 Necesaria la acumulación de datos
experimentales.
Estabilidad enzimática
 Almacenaje de enzimas:
◦ La mayoría son estables de 0-4 °C.
◦ Agentes estabilizantes:
 Glicoles
 Compuestos sulfhidrilo
 Polímeros orgánicos
 Antioxidantes
 Agentes quelantes
Estabilidad enzimática
 Métodos para la estabilización operacional:
◦ Búsqueda de enzimas estables en la naturaleza
◦ Adición de estabilizantes
◦ Modificación química
◦ Inmovilización
◦ Ingeniería de proteínas
Estabilidad enzimática
 Búsqueda de enzimas estables en la naturaleza
 Organismos adaptados a condiciones hostiles
 Adición de estabilizantes
 Los mismos que en almacenaje pero usados con
precaución
 Modificación química
 Acilación, alquilación (difícil de predecir)
 Inmovilización
 Diversos métodos
 Ingeniería de proteínas
 Modificación genética y computacional.
Inmovilización
 Permite una mejora significativa de su estabilidad,
lo que hace posible su empleo en la producción
industrial de productos químicos, farmacéuticos,
alimentos; en el tratamiento de residuos; en el
diagnóstico y tratamiento de enfermedades, y
otras muchas aplicaciones
 Inmovilización
 Definición: Confinamiento físico de una
enzima o célula en una determinada región
del espacio, de manera que su actividad
catalítica se retenga, y pueda ser reutilizada.
◦ 1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, USA.

 Posteriormente Biocatalizadores
inmovilizados: Enzimas, células enteras u
orgánulos celulares (o bien combinaciones
de ellos) que se encuentran en un estado
tal que se permite su reutilización.
 Inmovilización
 La inmovilización de enzimas se conoce desde
1916, año en el que Nelson y Griffin
observaron que la invertasa de levadura se
adsorbía sobre carbón activo y era capaz de
catalizar la hidrólisis de sacarosa.
 La inmovilización es deseable para permitir su
retención en un reactor.
 Se inducen cambios en el medio ambiente de la
enzima y en las propiedades observadas.
 El tipo y magnitud de los cambios dependerá
de la enzima y del método de inmovilización.
 Inmovilización
 Ventajas
◦ Disminución de problemas de autolisis
(proteasas)
◦ Aumento de la estabilidad de la enzima.
◦ Recuperación y Reutilización de la enzima.
◦ Productos más puros (reducción de los costos
de purificación).
◦ Aplicación en procesos continuos
◦ Posibilidad de sistemas multienzimáticos.
 Inmovilización
 Desventajas
◦ Disminución de su actividad especifica (25-80 %
de la libre, generalmente).
◦ Aumento del costo del proceso
◦ Posibilidad de contaminación
◦ Limitaciones difusionales
 Atrapamiento
 Posicionamiento de una enzima dentro de
una red espacial, matriz polimérica o
membrana.
◦ Métodos muy generales aplicables a cualquier
enzima, inclusive células y orgánulos.
 Atrapamiento en Gel
 Red formada por geles poliméricos
(naturales o sintéticos) insolubles en agua.
◦ Alginato
◦ Carragenina
◦ Colágeno
◦ Poliacrilamida
◦ Poliuretano
◦ Silicón
◦ Gelatina
 Atrapamiento en Gel
 Los materiales naturales presentan
propiedades notables como su precio y su
disponibilidad, pero tienen desventajas
como la baja resistencia mecánica y térmica
y su escasa resistencia al ataque microbiano
 Atrapamiento en Gel
 Inconvenientes:
◦ Limitaciones difusionales
◦ Desactivación de la enzima durante la
inmovilización
◦ Abrasión del soporte durante el uso
◦ Baja capacidad de carga catalítica.
 Cuando los poros son muy pequeños
 Cuando los poros son muy grandes
 Atrapamiento
 Atrapamiento en fibras de acetato de
celulosa.
◦ Extrusión del polímero solubilizado en un
disolvente orgánico que está formando emulsión
con la disolución acuosa de enzima sobre otro
disolvente orgánico, como tolueno o éter de
petróleo, donde el polímero precipita, atrapando
microgotas de la solución enzimática en sus
cavidades.
◦ Mejor que en gel: mayor área de contacto, mayor
resistencia a pH y a disolventes orgánicos.
 Microencapsulación
 Restringir al biocatalizador por una
membrana esférica con diámetros entre 1 y
100 µm
 Membrana semipermeable para el flujo libre
de sustratos y productos pero no de la
enzima.
Microencapsulación
 Fácil inmovilización.
 Gran superficie de contacto enzima-sustrato.
 Pérdida de actividad durante la inmovilización
 Restricción en el tamaño de sustratos y
productos.
 Cantidad de enzima Alta.
 Materiales: quitosano, maltodextrinas, celulosa,
polivinil acetato, alginato, acido bórico, etc.
 https://www.youtube.com/watch?v=bw9iPvc5
NwM
 Métodos de unión a un Soporte
 La enzima queda unida al soporte por:
◦ Interacciones físicas (fuerzas de Van der Waals,
puentes de H y enlaces iónicos).
◦ Por enlaces químicos (covalentes).
 Estas interacciones modifican la estructura
espacial e inclusive la química de un
biocatalizador, afectando sus propiedades:
◦ Actividad, estabilidad, afinidad por sus sustratos,
etc
Adsorción física
 Método más elemental y simple.
 Unión a un soporte por fuerzas débiles
◦ Van der Waals, puentes de hidrógeno,
interacciones hidrofóbicas
 Se pone en contacto la solución acuosa
de la enzima con un soporte con una
superficie atractora.
Adsorción física
 La unión enzima-soporte puede alterarse
fácilmente debido al pH del medio, a la
fuerza iónica del medio, a la temperatura,
a la naturaleza del disolvente utilizado, o
simplemente se debilita con el tiempo.
 Ejemplos: CMC, almidón, Colágeno,
agarosa, resinas de IO, carbón activado,
sílica gel, titanio, diatomeas, zeolitas, vidrio
poroso, etc.
Adsorción física
 Adsorción Mixta
Adsorción: Puentes disulfuro
 Formación de enlaces covalentes entre un
tiol libre (cysteina,metionina) y el
soporte.
 A pesar de ser enlaces covalentes es un
método reversible por que se rompen
con facilidad (alterando pH)
 Mas popular DTT (Ditrioteitol) como
activador de sílica gel.
 Adsorción: Enlace metálico
 Quelación de metales de transición con
enzimas.
 Adsorción: Enlace metálico
 Quelación de metales de transición con
enzimas.
 Más usados: titanio (IV) y el zirconio (IV), ya
que sus óxidos no son tóxicos
 Los cloruros de estos metales, así como los
de vanadio (III), hierro (III) y estaño (IV),
forman hidróxidos en medio ácido, que
precipitan como geles, por lo que pueden
ser usados como soportes para la
inmovilización de enzimas.
 Adsorción: Enlace metálico
 El empleo de soportes es más adecuado
por sus propiedades mecánicas.
 Se deposita una capa de hidróxido del
metal sobre la superficie de los poros del
soporte.
 Las proteínas tienen grupos polares que
pueden actuar como ligantes: amino y
carboxilo terminal.
 Método más usado en cromatografía:
columnas de nickel
Adsorción: Enlace metálico
 Enlaces por afinidad
 Fijación de enzimas con determinados
grupos o moléculas orgánicas
 Se añaden a la proteína dominios proteicos
con afinidad por tales grupos utilizando
ingeniería genética.
Enlaces por afinidad
Nueva técnica de inmovilización por afinidad:
unión de Biotina a la enzima y un soporte de
avidina.
Menos fuerte que un covalente
 Enlaces covalentes
 Es uno de los métodos más usados tanto en
laboratorio como a nivel industrial.
 La reacción química de formación del enlace
covalente debe ser poco desnaturalizante
para la enzima.
 Es necesaria una activación previa de los
grupos del soporte.
Enlaces covalentes
 Glutaraldehido unido a una matriz de
aminoetil celulosa
 Enlaces covalentes
 Matriz de polisacáridos activados con
bromuro de cianógeno.
 El CNBr interactúa con los –OH
activándolos para que interactúen con los
grupos amino de las enzimas.
Enlaces covalente
 Método Diazo (Diazonium: aminobencil-
celulosa).
 Entrecrusamiento: Cross-linking
 Método que no necesita soporte.
 La propia enzima se insolubiliza formando
una red de proteínas.
Entrecrusamiento: Cross-linking
 Se produce uniendo las proteínas por
enlace covalente aprovechando los grupos
amino, hidróxilo, tiol, carboxilo, imidazol y
tioeter de las mismas.
 Las enzimas se unen entre si mediante
agentes de entrecruzamiento
(Bifuncionales)
◦ Glutaraldehído, dextranos, diaminas, etc.
CLEAS
 Cross-Linked Enzyme Aggregates
CLEA
CLEAS
Inmovilización
Producción de Enzimas

Producción de enzimas recombinantes

Producción de enzimas
Tecnología de cultivo sumergido

 Consiste en el crecimiento del microorganismo

en vasos de reacción cerrados que contienen
un caldo rico en nutrientes (el medio de
fermentación) y una elevada concentración de
oxígeno (condiciones aeróbicas)
Producción de enzimas
Tecnología de cultivo sumergido: Biorreactor
Producción de enzimas
Tecnología de cultivo sumergido

Agitadores orbitales
 Extracción y purificación
 Existen relativamente un número escaso de
técnicas de separación de proteínas.
 Sin embargo ha sido posible aislar un número
elevado de enzimas en estado puro o casi
puro.
 Para muchos procesos biotecnológicos no
son necesarias enzimas completamente
puras, mientras los contaminantes no afecten
sustratos, productos y a la propia enzima.
 Medicina clínica y Farmacéutica: mayor grado
de pureza para reducir y/o evitar efectos
secundarios
Extracción-Origen microbiano
 Proteína liberada en el medio de cultivo se
separa de las células por centrifugación.
◦ Bacterias gram-positivas (Bacillus subtilis: subtilisina)
◦ Menor grado (presencia de una membrana externa)
gram-negativas (Klebsiella pneumoniane)

 Frecuentemente las enzimas son intracelulares

y necesitan ser liberadas por destrucción
parcial o total de la célula (inulinasa de
levadura K. marxianus, se libera por autolisis)
◦ Métodos de lisado: disrupción mecánica, sonicación,
detergentes, salado, etc.
◦ Generación de contaminantes: ácidos nucleicos y
proteínas
Extracción-Tejidos
 Tejidos animales: Similares a los procesos
de obtención de enzimas microbianas
intracelulares de ecuariontes (levaduras).
 Homogeinización del tejido en una
solución buffer
 Centrifugación diferencial

Pequeña escala
Extracción-Tejidos
 Tejidos Vegetales: mismo proceso, pero
con muchos problemas
 Paredes celulares muy rígidas: requieren
mucha energía que daña las proteínas
 Compuestos fenólicos oxidados que
inactivan enzimas.
 Ejemplos exitosos: bromelina y papaína
 Extracción
 Soluciones buffer mas usadas:
◦ Ditiotreitol.
◦ EDTA (ácido etildiaminotetraacético).
◦ Tween 20 (detergente)
◦ Polivinil pirrodilona
Purificación
 Enzima al 0.01 a 1% del total de proteína en
medio de extracción.
 Fraccionamiento:
◦ Calentar y/o ajustar pH
◦ Ejemplo: aspartato aminotransferasa aislada de
corazón de cerdo por calentamiento breve (20
min) a 72°C en presencia de sustrato 2-
oxoglutarato.
◦ Ejemplo: hialuronidasa de testículos de buey aislada
utilizando ác. Acético/ác. Clorhídrico pH 2.1.
◦ Precipitación con sulfato de amonio a
diferentes concentraciones.
 Purificación
 Fraccionamiento con sulfato de amonio
tiene 2 inconvenientes:
◦ Trazas de metales pesados (uso de sulfato con
gran pureza)
◦ Eliminación del propio sulfato (dialisis,
ultrafiltración, etc).
◦ En este paso también es conveniente eliminar
ácidos nucleicos: sulfato de protamina o por
intercambio aniónico (soporte de Dietilamino-
celulosa)
Purificación
 Cromatografía de intercambio iónico
◦ Uno de los métodos más empleados
◦ Resinas de poliestireno y celulosa (mas usada)
◦ Uso de columnas con gradientes de pH
◦ Cromatoenfoque
Purificación
 Cromatografía de filtración en gel.
◦ Exclusión de tamaños
◦ Columnas: Fase estacionaria reticulada de
Sephadex (polidextraño), Sepharosa (agarosa).
◦ Orden de separación en relación al peso
molecular.
◦ No dañan la enzima.
◦ Muestras pequeñas (1-2% del volumen de la
columna).
 Purificación
 Cromatografía de Afinidad.
◦ Interacción especifica enzima-ligando (sustratos,
colorantes).
◦ Problemas para formar la matriz
◦ Anticuerpos específicos (antigeno-enzima).
◦ Problema para eluir la enzima.
◦ Afinidad por níquel (imidazol)
 Purificación a gran escala
 La mayoría de los procesos pueden
adaptarse a escalas piloto o
industriales
 Problemas de transferencia de calor,
masa, flujo de fluidos.
 Necesidad de ingeniería.
 La centrifugación fraccionada es
impracticable
 Ultrafiltración más usada
 Utrafiltración (UF) es un tipo de
filtración por membranas en la cual
la presión hidrostática fuerza un líquido
contra una membrana semipermeable.
Los sólidos suspendidos y los solutos de
alto peso molecular son retenidos,
mientras que el agua y los solutos de bajo
peso molecular atraviesan la membrana