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Microbiologie - bactériologie

Licence Chimie parcours Chimie - Biologie (Université Paris-Est Créteil Val de Marne)

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CLASSIFICATION DES BACTÉRIES

Classification des bactéries 1

Croissance des micro-organismes 2
Méthodes d’études 2
Croissance et division cellulaire 2
Outils d’études 2
Etude de la courbe de croissance 2
Cycle cellulaire 4
Réplication 4
Différenciation 5
Constitution des micro-organismes 6
Les échanges avec l’environnement 6
- Les
enveloppes cellulaires 6
- Mem-
branes cytoplasmiques 6
- Paroi
bactérienne 6
- Les
Lipopolysaccharides 7
- Autre
s composants 7
La mobilité 8
Les flagelles 8
La structure des flagelles 8
Flagelle d’une Gram- 8
L’assemblage des flagelles 8
L’énergie, la rotation et le mouvement 9
BILAN 9
Comment étudier ces microorganismes ? 9
Métagénomique 9
Biomasse terrestre 10
Les microorganismes sont ubiquitaires et représentent la biomasse la plus
importante de la Terre. 10
Limites de la vie macroscopique 10
Vie microscopique 10

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Les flores commensales 11

La Diversité des types trophiques chez les microorganismes 14

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Classification phyllogénétique du vivant : trois domaines ayant une origine commune

unique (~3,5 milliards d’années)
Phylogénie : grouper les organismes selon leur généalogie (histoire naturelle)
Utilisation de critères moléculaires :
Notion d’horloge moléculaire (C.R. Woese : ARNr)

CROISSANCE DES MICRO-ORGANISMES

Méthodes d’études

Croissance et division cellulaire

Outils d’études
DÉNOMBREMENT DES MICRO-ORGANISMES

• CHAMBRE DE COMPTAGE
Comptage du nombre de cellules sous microscope dans une chambre de comptage
(quadrillage) en tenant compte du volume de la chambre et de la dilution de l’échan-
tillon

• TURBIDIMÉTRIE
Les cellules bactériennes dispersent la lumière incidente.
On peut mesurer une densité optique (DO) à ~600 nm qui est linéaire en fonction de
la concentration en bactéries pour des valeurs comprises entre DO=0,05 et 0,6. C’est
la méthode la plus simple et la plus utilisée au
laboratoire. [D.O. = log (I0 / I)]

MÉTHODE D’ÉTUDE DE LA CROISSANCE

• CYTOMÉTRIE EN FLUX

• COMPTAGE DE COLONIE SUR BOITE

Isoler, identifier puis classer (taxonomie)
=> Nécessité d’obtenir un microorganisme en culture pure
Utilisable pour des organismes cultivables... Moins de 5% !
Une colonie contient des millions de cellule issues d’une cellule initiale : population
clonale

Etape :
1. Séparations des cellules par étalement ou dilution
2. Sélection sur milieux de culture
3. Incubation
4. Multiplication cellulaire
5. Visualisation des colonies

Technique de comptage qui détecte les bactéries viables uniquement. Comptage des
colonies sur boîte après étalement

On se placera à une dilution de l’échantillon donnant 20 à 300 colonies sur boîte.

Unité : UFC= unité formant une colonie
9ml de milieu Dépôt de 1ml de la dilution
Comptage sur la boite x Facteur de dilution = 1,59.105 cellules (unités formant des co-
lonies)/ml d’échantillon de départ

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Etude de la courbe de croissance

CROISSANCE DES MICRO ORGANISME

DIVISION CELLULAIRE PAR FISSION BINAIRE

Soit N0 le nombre initial de cellules au temps t=0
Soit N le nombre de cellules au temps t

N = N0 x 2n=N0 x 2 μt = N0 x 2 t/q
n = μt = t/q
n= nombre de générations au temps t
μ= taux de croissance = nombre de doublement
effectués par unité de temps (heure-1)
q = temps de doublement (unité de temps)

EXEMPLE DE COURBE DE CROISSANCE

logN = log N0 + n log2

= log N0 + t/q log2

= log N0 + μt log2
logN = f(t)
La phase exponentielle est linéaire en Ln.
La phase de latence: lorsqu’un microorganisme est introduit dans un milieu de culture
frais, il ne se divise pas immédiatement (synthèse de facteurs nécessaires à la divi-
sion, adaptation à un nouveau milieu)
La phase d’accélération : Transition entre latence et exponentielle: les cellules se
mettent en division.
La phase exponentielle: lors de cette phase les microorganismes se développent à leur
vitesse maximale étant donné leur potentiel génétique, le milieu de croissance, les
conditions de culture
La phase stationnaire: la croissance de la population finit par s’arrêter lorsque l’un des
facteurs nécessaires à sa croissance devient limitant (disponibilité en Fer, oxygène,
carbone.......) et/ou production de composés toxiques (production d’acides organiques
par fermentation des sucres=acidification du milieu). La bactérie s’adapte en modi-
fiant sa physiologie.
La phase de mortalité: diminution du nombre de cellules viables

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TAUX DE CROISSANCE ET TEMPS DE GÉNERATION

Le temps de doublement peut être déterminé graphiquement en regardant le temps

nécessaire pour passer de N (5.107) à 2N (1.108) cellules (voir TD)

LE TEMPS DE GÉNÉRATION VARIE SELON LES MICROORGANISMES ET

L’ENVIRONNEMENT
Le temps de génération varie aussi en fonction des milieux de croissance:
Milieu défini ou complexe/ changement de la source de carbone, d’azote..... -> (voir
TD)
Facteurs de l’environnement : Température, pH, oxygénation, osmolarité..

Exemple Listeria
Listeria est capable de se développer entre -2°C et 45°C (opt. 30-40°C) pH 4 à 9,6
(opt. 7)
Isolée en 1926, dans l'animalerie de Cambridge ! Bacille à Gram positif (Firmicutes)
1-4 μm/0,5 μm, en chaînes courtes ou petits amas Mobile à 22°C (péritriche), immobile
37°C

Non capsulé, non sporulé.

Aéro-anaérobie facultatif, ubiquitaire (sol, végétaux, eau)
1 à 10 % des humains seraient porteurs sains de L. monocytogenes dans leur intestin.

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Cycle cellulaire
Réplication
RÉPLICATION DE L’ADN, DIVISION CELLULAIRE ET CROISSANCE BACTÉRIENNE

La bactérie duplique son chromosome circulaire double brin pour donner deux molé-
cules d’ADN filles identiques
Division de la bactérie par scissiparité pour donner deux cellules filles contenant cha-
cune une copie du chromosome
• Invagination de la membrane et de la paroi
• synthèse de peptidoglycane
• Séparation des deux bactéries filles (hydrolyse menagée du peptidoglycane)

Différenciation
LA RÉSISTANCE DE DIFFÉRENTS TYPES D’ORGANISMES AUX DÉSINFECTANTS

EFFET DE LA CARENCE SUR LA CROISSANCE

DIFFÉRENTIATION CELLULAIRE SOUS FORME DE SPORES

Dans certains cas (Bacillacées, Clostridies), les bactéries s’adaptent à la carence en se
différenciant morphologiquement et en formant des spores qui sont des formes de vie
ralentie permettant de résister aux stress de l’environnement (dessiccation,
température, UV, carences......).

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L’IMPORTANCE DES SPORES DANS LE CYCLE DE B. ANTHRACIS

CONSTITUTION DES MICRO-ORGANISMES

Les échanges avec l’environnement

- Les enveloppes cellulaires

- Membranes cytoplasmiques
PHOSPHOLIPIDES ET PROTÉINES
• Barrière imperméable sélective.
• Systèmes de transport permettant l’entrée d’éléments nutritifs, l’excrétion de com-
posés, le rejet de produits toxiques et l’exportation de macromolécules.
• Site d’une série de processus métaboliques essentiels: respiration, photosynthèse,
synthèse des lipides et de constituants de la paroi cellulaire.

DIFFÉRENTES CHEZ LES ARCHÉES

LES ACIDES GRAS
La membrane est en simple couche et les ester qui lient le glycérol aux acide gras
sont remplacé par un éther chez les arches.

LA CONFIGURATION ABSOLU DU GLYCÉROL

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Les Archea sont de configuration S alors que c’est les bactérie et les eucaryote, la
configuration du glycol est en R.

- Paroi bactérienne
LA PAROI
Elle offre une protection pour la cellule : la plupart des procaryote possède une paroi
raison pour laquelle on peut pratiquer des tests de Gram
-> Elle donne une rigidité et une forme aux cellules
-> C’est une protection contre la lyse osmotique, le cytoplasme étant beaucoup plus
concentré que l’environnement
-> Elle est présente chez toutes les bactéries sauf les mycoplasmes.
-> Elle n’est présente que chez certaines archées

LE PEPTIDOGLYCANE
C’est un composant central de la paroi bactérienne
Les osamines de la paroi bactérienne

STRUCTURE DU PEPTIDOGLY-
CANE
Chaines de glycane: (N-acétyl
glucosamine et d’acide N-acétyl-
muramique)
Peptides reliés entre eux par une
liaison peptidique

DAP : Acide DiAminoPimélique

LA SYNTHÈSE DU PEPTIDOGLY-
CANE
Suivant les bactéries la composi-
tion varie légèrement:
- DAP/lysine
- Liaison peptidique/pont pentapeptide Gly
Importance des deux groupements NH2 pour assurer la liaison entre les tétrapeptides

1 glycosyltransférase
Allongement de la chaîne de glycane
2 transpeptidase:
liaison D-Ala-Diaminopimelate (DAP)

GRAM

COMPARAISON DE LA PAROI DES GRAM+ ET DES GRAM-

Capsule, glycocalyx, slime, couche S... Membrane externe
peptidoglycane
Membrane cytoplasmique

L’ENVELOPPE DES BACTÉRIES À GRAM-POSITIF

Protéines associées à la membrane
acides techoïques
acides lipotechoïques
liés de façon covalente à la membrane cytoplasmique
20 à 80 nm d’épaisseur
Acides techoïques
Polymères de glycérol ou de ribitol substitués reliés par des phosphates

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L’ENVELOPPE DES BACTÉRIES À GRAM-NÉGATIF

La membrane externe contient des phospholipides, des protéines (porines, transpor-
teurs) et une couche de lipopolysaccharides (LPS)
La membrane externe est ancrée au peptidoglygane via la lipoprotéine de Braun

LE TEST DE GRAM
Test mis au point en 1883 par le médecin Danois

Etape :
1 Cristal violet (30s) + Rinçage à l’eau
2 Lavage en éthanol 95% ou acétone(10-30s)
=> L’éthanol ne peut pénétrer le peptidoglycane et ne « chasse » pas le cristal violet
du cytoplasme
3 Coloration à la safranine 1-2 min

Coloration différentiel dépendante de la structure de la paroi

Visualisation des lames après coloration sous microscope
Propriétés différentes des enveloppes entre les bactéries Gram négative comme Es-
cherichia coli et les bactéries Gram positives comme Bacillus subtilis

- Les Lipopolysaccharides
STRUCTURE DU LPS
(endotoxine active contre certains hôtes)
Le lipide A est enfoui dans la membrane externe (effet toxique)
Le polysaccharide est central
La chaîne latérale O ou antigène O est constituée de quelques sucres et sa composi-
tion varie suivant les espèces et les souches bactériennes

- Autres composants
COUCHE S (S-LAYER) : (ABSENCE DE PAROI RIGIDE
Présent chez certaines bactéries (Gram+ ou Gram-) et archées
Exemple : Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
Réseau bidimensionnel (monocouche) d’une seule protéine
Structure quasi-cristalline 100 nm
Membrane fluide qui donne une forme lobé a l’organisme.

LA CAPSULE
Dernière couche éventuelle de l’enveloppe, la capsule contient des polysaccharides
qui sont spécifiques de l’espèce ou du poly-D-glutamate
Rôle dans la virulence : Streptococcus pneumoniae Bacillus anthracis

LES PILI ET LES FIMBRIAE (FIBRILLES)

Pilus de conjugaison (voir cours de génétique) 5 à 7 nm de

diamètre plusieurs μM de longueur Structure tubulaire
hélicoïdale de piline

Structure protéique (polymère de fimbrine) présente en surface

(100/cellules) Diamètre 5 nm, longueur 0,2 à 2μm 15-20 nm

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La mobilité

Les flagelles

La structure des flagelles

Des flagelles sont présents chez certaines bactéries Gram-négative et Gram-positive
15 à 20 μm de long

Flagelle d’une Gram-

L’assemblage des flagelles

Chez E. coli, 40 gènes impliqués
Utilisation de flagelline pour synthétiser le flagelle. Structure du filament : hélicoï-
dale.11 protéines par tour hélicoïdal
Jusqu’à 20 000 copies de flagelline/filament de flagelle. Flagelline=8% des protéines
chez E. coli

L’énergie, la rotation et le mouvement

C’est le gradient de H+ entre le périplasme et le cytoplasme qui fournit l’énergie via la
formation d’ATP au niveau du moteur de flagelle.
1 proton -> 1/3 de tour
La direction de la rotation décide du type de mouvement

Vitesse de rotation chez E. coli: 6000-15000 tours par minute ! (40-50 Hz) vitesse de
déplacement : 25 μm/s

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BILAN
Etude d’un grand nombre d’espèces en culture pure
Caractéristiques principales de très nombreuses familles de bactéries et
de quelques archées :
Membranes, parois, capsules, pili, flagelles...

COMMENT ÉTUDIER CES MICROORGANISMES ?

Isoler, identifier puis classer (taxonomie)
=> Nécessité d’obtenir un microorganisme en culture pure
Échantillon (malade, environnement...)
Utilisable pour des Une colonie contient des millions organismes cultivables...de cel-
lule issues d’une cellule
Séparations des cellules par étalement ou dilution
Sélection sur milieux de culture
Moins de 5% !
Incubation
Multiplication cellulaire
Visualisation des colonies initiale : population clonale

Le monde des micro-organismes est extrêmement divers !

MÉTAGÉNOMIQUE
Les ARNr sont très structurés et leurs structures est totalement conservées.
Notion d’horloge moléculaire

La métagénomique... une approche en plein essor...

LA MICROBIOLOGIE AU SERVICE DE L'AGRICULTURE ET DE L'ENVIRONNEMENT

Permet l’étude d’un grand nombre d’espèces même si on ne peut pas les mettre en
culture !!
Possible d’avoir une quantification exhaustive des espèces présentes !

Très grande diversité morphologique des micro-organismes

- Forme
- Taille
- Mobilité
- Présence de pili, flagelle, capsule, spore...
- Ultrastructure

Reflet d’une très grande diversité physiologique des micro-organismes

Diversité des biotopes

Biomasse terrestre
L’eau recouvre 71% de la surface de la planète terre !...
Apollo 17

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Abondance des phototrophes mais pas uniquement sur la terre...

Les coccolithophoridés (algues unicellulaires), fixent le carbone atmosphérique dans le

calcaire de leurs coques (séquestration) et forment à leur mort les sédiments.
Constituent la biomasse la plus importante du plancton marin...

- Dans des conditions favorables, les coccolithophoridés se développent jusqu’à former

des étendues gigantesques, visibles de l’espace !
- Régulation de la biomasse par un virus.

Une vision plus exacte de notre planète : Que d’eau! Mais pas que liquide...

Les microorganismes sont ubiquitaires et représentent la

biomasse la plus importante de la Terre.

- Les océans abriteraient quelques centaines de milliards de milliards de milliards (soit

1029) de cellules procaryotes (bactéries et archées) et... 10 fois plus de particules vi-
rales (1030).
- Les lacs d’Annecy, du Léman ou du Bourget renferment ~107 bactéries et 108 virus
par ml.
Les virus sont présents soit sous forme libre, soit dans leurs hôtes cellulaires.
Le lac du Bourget: ses eaux et sa biologie, G Balvay, J-C Druart & S Jacquet, Ed Quae.

Limites de la vie macroscopique

Certains aigles volent à des altitudes de 11 300 m, les yaks vivent de 3 200 m à 5 400
m d’altitude. Pour que les herbivores puissent vivre, il faut que des herbes, mousses
ou lichens poussent.

Vie microscopique
Des microorganismes ont été retrouvés dans la haute atmosphère (41 km !). Ils ne
sont probablement pas actifs: température très basse, pression extrémement faible,
très forte irradiation aux ultra-violets.
Ils sont transportés par les vents de haute altitude ou par les éruptions volcaniques...
cf l’éruption de l'Eyjafjöll en 2010...
A l’inverse des microorganismes vivent à plus de 10 km sous la mer.
La présence de ces microorganismes n’est pas limitée aux milieux aérobies : des mi-
croorganismes cultivable ont été récupérés par forage profond : 5Km, dans des roches
à 65-75°C.

Ils colonisent l’ensemble des biotopes possibles (se développent si présence d’eau li-
quide).
Des micro-organismes vivent dans des environnements a priori hostiles : Les extrê-
mophiles
Température: de -2°C à 120°C Concentration en sels : 3 à 5M NaCl, pH : <4 et >9
Pression : >400 atmosphères
Beaucoup des extrêmophiles sont des Archaea (mais les archées mésophiles sont éga-
lement très abondantes).

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Ces organismes ont des composants cellulaire qui résistent et fonctionnent, voir tirent
parti, de ces environnements.

Les flores commensales

MICROFLORE NORMALE DE L’HOMME : BOUCHE, DENTS (STREPTOCOCCUS), PEAU,
VAGIN, TUBE DIGESTIF...

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1 g de fèces provenant du côlon humain ~ 100 milliards (1011) de bactéries.

Dans sa flore digestive, un Homme héberge ~ 1014 bactéries soit 10 fois plus que les
cellules qui constituent notre corps (1013) !...

Très grand nombre d’espèces bactériennes (et archées...) différentes (>500 espèces)
dont : Bacteroides, E. coli, Lactobacilles, Clostridies
Elles sont essentielles dans la digestion des aliments et comme barrière contre les
bactéries pathogènes

Très présent dans l’alimentation :

1 g de yaourt renferme un milliard (109) de bactéries

1 g de terre ~ 25 milliards (25 x 109) de microorganismes (4 fois plus qu’il n’y a

d’Hommes sur Terre !...)
En surface : Streptomycètes, Corynebacteries, Mycobacteries, Bacillacées,
Pseudomonas, Nitrosomonas, Ralstonia...
En profondeur : Barophile anaérobie
-> Très important dans les cycles de la matière (C, N, Fer, S..)
-> Colonisent également d’autres organismes tel que les plantes : Symbiose entre les
légumineuses et Rizobium
-> Fixation de N2 qui donne du NH3 : 50 à 400 kg/ha/an !!

Présence de bactériorhodopsine (complexe protéine - rétinal) au niveau des mem-

branes d’ou le nom de membrane pourpre.
Colonisent également d’autres organismes tel que les plantes : pathogènes de plante :
Erwinia carotovora Pseudomonas syringae Agrobacterium tumefaciens

CLASSEMENT À LA PRESSION
Barophile
Barophile facultatif > -2000 m
Barophile< -2000 m

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Barotolérant
Seuil vers 20 Mpa (200 atm)
Rappel : 1Kg/cm2 = 1 Atmosphère = 1 bar = 0,103 Mpa
10 Mpa = 100 Atm !

Les mers et océan profond (inférieur à 1000m) : ~62% du volume de la biosphère ter-
restre. Sous une pression supérieur à 10 Mpa (100 Atm) !

Existe t-il des organismes vivants à 5000 m ?

Oui et pas que des microorganismes !...
- Riftia
- Halothuries
Comment éviter la contamination par des bactéries de surface qui auraient
sédimentées ?
=> Prendre les micro- organismes dans l’appareil digestif des invertébrés ou des pois-
sons des grands fonds !...
=> ! Capturer la bête ! À 5000 m !!

Capturer à 5600 m et 10 476 m !

Microorganismes retrouvés : Psychrophiles hétérotrophes
Température des grands fonds ~ 2°C Absence totale de lumière

Souche CNPT 3
Temps de doublement à 4°C
À pression atmosphérique : 3 à 4 jours
À 50 Mpa (50 Atm) : 4 à 13 H

Souche MT 41
Pas de développement à des pressions inférieur à 38 Mpa.
Pression optimale à 69 Mpa
Perd sa capacité à former des colonies si reste à 1 Atm

PROBLÈME POUR CES ORGANISMES

La dégradation des matières organique s’effectue plus lentement avec la pression sur
des extraits ou fractions cellulaire !
Quels sont les mécanismes conférant cette résistance et adaptation ?
Les « fumeurs noirs » cheminée abyssale ⇒ Présence d’archées anaérobie stricte

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CLASSEMENT À LA TEMPÉRATURE

Le temps de génération varie selon les microorganismes

Le temps de génération varie aussi en fonction des milieux de croissance:
Milieu défini ou complexe/
changement de la source de
carbone, d’azote..... (voir TD)
Facteurs de l’environnement :
Température, pH, oxygénation,
osmolarité..

EFFET DE LA TEMPÉRATURE
SUR LA CROISSANCE
Les membranes se figent :
transport des métabolites in-
suffisant
La vitesse de réaction aug-
mente
La vitesse de réaction s’effec-
tue à un taux maximum: opti-
mum de croissance
Dénaturation de certaines pro-
téines entraîne une absence de croissance

ABONDANCE RELATIVE (%) DES ATOMES SUR TERRE ET CHEZ LES ÊTRES VIVANTS.
En rouge % chez nous en vert % sur la terre. On regarde les atomes encadrer ou
rouge car il ont dés propriété particulière.

LES BESOINS NUTRITIONNELS

On retrouves ces atomes dan sales besoin.
96% du poids sec d’une cellule est composé de quelques éléments majeurs : C, O, H,
N, S, P. (Forme simple) Des ions sont aussi nécessaires K+, Ca2+, Mg2+ et Fe2+...
(forme complexe). On ne peut pas assimilée le P sous toutes ces formes mais que cer-
taines

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Macronutriments
Les bactéries ont aussi besoin de certains éléments à l’état de trace (Mn, Zn, Mo, Cu,
Co, Ni, Se....), vitamines (cofacteurs)...

LES MILIEUX DE CULTURE

Milieu de culture : Mélange de substances utilisées comme nutriments pour la crois-
sance et la multiplication des micro- organismes.
Il doit contenir tous les éléments nécessaires à la croissance du microorganisme =>
Variable d’une espèce à l’autre. Il permettent de fournir le carbone nécessaire.

=> Milieu synthétique ou défini

Le milieu de culture contient des quantités précises de composés inorganiques et, le
cas échéant, des composés organiques.

Milieu complexe : Milieu qui contient des ingrédients de composition chimique indéter-
minée (extrait de levure, de viande, hydrolysat de protéines). Ce sont souvent des
bouillons de culture, ils permettent la croissance de grand nombre d’organisme.
Souvent, ces milieux permettent la croissance de différents micro-organismes

Le milieu de croissance permet de caractériser l’organisme.

La Diversité des types trophiques chez les microorga-

nismes

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