UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EXPRESIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA DE

HIDROFOBINAS AISLADAS DEL HONGOS HALÓFILO
Aspergillus sydowii

TESIS PROFESIONAL POR ETAPAS

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

B I O L O G O
P R E S E N T A:
HECTOR EDUARDO FRANCO COTERO

CODIRECCIÓN

DRA. MARIA DEL RAYO SANCHEZ CARBENTE

M EN C. YORDANIS PÉREZ LLANO

CUERNAVACA, MORELOS DICIEMBRE, 2017

 ÍNDICE

1. MARCO TEÓRICO........................................................................................................................................................1

1.1. LOS EXTREMÓFILOS.....................................................................................................................................1

1.1.1. HALÓFILOS.................................................................................................................................................2
1.2. MECANISMOS DE HALÓFILIA........................................................................................................................3
1.2.1. “SALT IN”.....................................................................................................................................................3
1.2.3. EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE TRASPORTADORES.............................................................................4
1.2.4. SOLUTOS COMPATIBLES.........................................................................................................................4
1.2.5. MODIFICACIONES EN PARED CELULAR................................................................................................5
1.3. HIDROFOBINAS..............................................................................................................................................5

2. ANTECEDENTES..........................................................................................................................................................6

3. OBJETIVOS...................................................................................................................................................................8

3.1. GENERAL........................................................................................................................................................8
3.2. PARTICULARES..............................................................................................................................................8

4. METODOLOGÍA............................................................................................................................................................8

4.1. EXPRESIÓN DE HFB´S......................................................................................................................................8

4.1.1 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES HFB1,2 Y 4..................................................................................................8
4.1.2 TRANSFORMACIÓN DE E. COLI........................................................................................................................9
4.1.3. TRANSFORMACIÓN DE P. PASTORIS.............................................................................................................9
4.1.4. SELECCIÓN DE CÉLULAS TRANSFORMANTES...........................................................................................10
4.1.4. PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE HFB´s...................................................................................................10
4.2. CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA..................................................................................................................10
4.2.1 WCA (Water Contact Angle)...............................................................................................................................10
4.2.2. ESPECTRO DICROISMO CIRCULAR (DC).....................................................................................................11
4.2.3. DLS (DYNAMIC LIGHT SCATTERING)............................................................................................................11
4.2.4. BALANZA LANGMUIR-BLODGET....................................................................................................................12

5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES............................................................................................................................13
 1. MARCO TEÓRICO

1.1. LOS EXTREMÓFILOS

La percepción de la vida y sus límites ha cambiado radicalmente con el hallazgo

de organismos en ambientes que creímos inhóspitos –extremos- para la vida misma,
capaces no solo de sobrevivir a estas condiciones adversas sino desarrollarse
exitosamente en todos los aspectos. El término extremófilo se usó por primera vez por
Marceloy en 1974, para los organismos que crecen en ambientes extremos, pero el
ambiente que puede ser extremo para algún organismo podría ser esencial para el
crecimiento y multiplicación de otro. (Ramirez, Serrano, & Sandoval, 2006).
Entonces, para conceptualizar el término extremófilo, existen dos puntos de vista:
el primero completamente antropocéntrico, indica que todos aquellos organismos
capaces de vivir en ambientes en que el hombre no puede son extremófilos, y la
segunda supone que los factores físicos, geoquímicos y biológicos determinan un
amplio y continuo intervalo de valores y los límites que enmarcan este intervalo, se
consideran como ambientes extremos (Ramírez, Sandoval, & Serrano, 2004).
Los organismos extremófilos se clasifican de acuerdo a los requerimientos físicos
o químicos en los que encuentra su óptimo de crecimiento. Dentro de estos se
encuentran organismos que crecen a altas temperaturas –termófilos- o bajas
temperaturas –psicrófilos-, aquellos que prefieren ambientes con pH acido –acidófilos- o
pH básico –alcalófilos-, aquellos que crecen con alta presión atmosférica –Piezófilos-,
los que crecen en baja disponibilidad de agua –xerófilos-, y también los que se inclinan
por ambientes con altas concentraciones de sales –halófilos- (Madigan, 2005). Ver
tabla I
Se han identificado hasta la fecha organismos en las tres ramas filogenéticas del
árbol de Woose, termófilos y halófilos en Archeae, los hipertermófilos del subgrupo
Lokiarchaeota; mientras que los acidófilos, psicrófilos, alcalófilos, piezófilos, xerófilos y
halófilos son más comunes en Bacteria y Eucarya (Mosier M, Avi, Mix et al., 2006).

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 Condicion Termino Valores Ejemplo
Hipertermofilo 80-113°C Pyrolobus fumarii
Termofilo 70-80°C Thermus acuaticus
Mesofilo 25-40°C Cyanidium caldarium
Psicrófilo > -5°C Pseudomonas
Temperatura Psicrófilo facultativo 15-0°C Heteromita
Alcalófilo 8-9 Spirulina
PH Acidófilo >5 Ferrplasma acidarmanus
Desecación Xerófilo Perdida de agua Metallogenium
Metales Metalófilo altas concentraciones Ralstonia metallidurans
Barófilos extremo 10,000m
Barófilos 5000-6000m Metanococcus
Barótolerante 400m Moritella
Presión Halófilo extremo <20% Nocardiopsis halophila
Halófilo moderado 10-20% Sterptimonspora
Halófilo debil .5-10% Actinopolyspora halophila
Concentracion NaCl Halótolerante <.5% Aspergillus
Tabla I. Clsificación de los organismos extremófilos (Madigan, 2005)

1.1.1. HALÓFILOS

Dentro de los extremófilos el grupo de organismos que han logrado adoptar

mecanismos para sustentar su óptimo fisiológico en ambientes mayores a 1M de NaCl,
se denominan halófilos (Dassarma & Dassarma, 2015). Se puede subclasificar los
halófilos de acuerdo a la concentracion de sales en la cual encuentran su optimo
crecimiento: halófilo debil (.5% a 10 % de NaCl), halófilo moderado (10% a 20% de
NaCl) y halófilos extremos (>20% de NaCl). Tambien, existen organismos capaces se
sobrevivir a estrés por sales, pero cuyo crecimiento no es optimo, se denominan
haloótolerantes (Madigan, 2005).
La condicion de alta concentracion salina en el espacio extracelular, producen
dos tipos de estrés a la célula: el osmótico debido a las altas concentraciones de
solutos en el exterior, y, estrés iónico, derivado de la disociación de la molécula de
NaCl en sus iones, siendo estos tóxicos para la célula (Serrano, 1996).
Existe una amplia diversidad de organismos halófilos, dentro de los tres dominios
de la vida (Woese & Fox, 1977), donde se han descrito mayoritariamente bacterias,

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aunque en la actualidad tambien se han descrito algunas especies de algas y hongos.
Particularmente el porcentaje de hongos filamentosos descritos hasta la fecha es muy
pobre y aun se requiere de mas estudios para entender los mecanismos moleculares
que les permiten contender contra las altas concentraciones de NaCl (Gunde-
cimerman, Ramos, Plemenitas, & Gadd, 2009) y la mayoría de las estrategias utilizadas
han sido estudiadas en bacterias
Es interesante mencionar que debido a que los microorganismos halófilos
ofrecen una multitud de aplicaciones en varios campos de la biotecnología, como en la
producción de enzimas industriales, producción de colorantes y aditivos, biotecnología
alimentaria y producción de alimentos fermentados, producción de antibióticos
(actinomicetos halófilos), producción de biopolímeros y biorremediación (Ramírez,
Sandoval, & Serrano, 2004), la caracterización fisiológica y molecular de estos resulta
relevante.

1.2. MECANISMOS DE HALÓFILIA

Entre las estrategias que los microorganismos halófilos han desarrollado

mencionaremos algunas:

1.2.1. “SALT IN”

La estrategia de “salt-in” es característico de bacterias y arqueas, en este

mecanismo las macromoléculas y componentes estructurales de las células se han
adaptado a la presencia de altas concentraciones de sal. Esto implica que las proteínas
deben ser estables en presencia de alta fuerza iónica, por lo que se ha observado que
existe un incremento de aminoácidos ácidos y pocos aminoácidos hidrofóbicos en sus
proteínas (Dassarma & Dassarma, 2015).

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 1.2.2. “SALT OUT”

La segunda estrategia de los halófilos es el denominado “salt-out” en el que la

célula mantiene la concentración de NaCl por debajo de las concentraciones en el
exterior. Para lograrlo pueden tener una o varias estrategias, entre las que se
encuentran:

SOLUTOS COMPATIBLES

Algunos organismos eucariontes halófilos –como hongos filamentosos y

levaduras-, regulan la presión osmótica intracelular mediante la acumulación de
metabolitos osmóticamente activos –osmolitos-, que se denominan “solutos
compatibles” (Saito & Posas, 2012).
Estos solutos son sintetizados por la célula o captados del medio extracelular, los
cuales son utilizados para ajustar la cantidad del agua del citoplasma sin intervenir en
los procesos celulares. Estos compuestos son solubles en agua, y existen de varios
tipos como: azucares –sacarosa, trehalosa, glucosilglicerol-, alcoholes –glicerol,
arabinol-, derivados de aminoácidos o bien iones de potasio. Para cada organismo la
cantidad máxima de producción de solutos compatibles es genética, y en resultado la
tolerancia -a diferentes rangos de potencial de agua- es distinta para cada organismo
(Madigan, 2005).

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE TRASPORTADORES

La fuente primaria de energía para la expulsión del Na+ y acumulación de K+ es

el gradiente electroquímico de protones a través de la membrana citoplasmática. Este
gradiente electroquímico de protones deriva de la cadena transportadora de electrones
o del ATP formado durante la fosforilación por la actividad de la ATPasa. Se puede
también establecer un gradiente de Na+ por un gradiente de protones, vía los

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antitransportadores Na+/H+. Estos antitransportadores juegan un papel importante para
mantener bajas las concentraciones de Na+. Se ha descrito que la actividad del
antitransportador Na+/H+ de la membrana citoplasmática -en bacterias- aumenta
cuando las células crecen en altas concentraciones de NaCl, además se la expresión
de algunos otras transportadores y bombas de eflujo –como la bomba de sodio-potasio-
(González-Hernández & Peña, 2002).

1.2.3. MODIFICACIONES EN MEMBRANA CITOPLASMATICA

La adaptación de la composición lipídica de las membranas celulares frente a

una nueva situación de estrés osmótico incluye modificaciones en el tipo de fosfolípidos
y en el tipo de ácidos grasos que forman parte de los lípidos. A medida que aumenta la
salinidad, la membrana se enriquece en fosfatidilglicerol (o di-fosfatidilglicerol),
cargados negativamente, y disminuye en la fosfatidiletanolamina, con carga neutro, lo
cual porta rigidez a la membrana. La composición en ácidos grasos de los fosfolípidos
de membrana también experimenta modificaciones, el cambio más destacable es un
aumento de los ácidos grasos ciclopropánicos, a costa de los insaturados
proporcionando a la célula una disminución en la fluidez de la membrana, para
mantener la integridad de la misma (Madigan, 2005).

1.2.4. MODIFICACIONES EN PARED CELULAR

Existen varias modificaciones de la pared celular que les permite a los

organismos contender con altas concentraciones de sales. Una de ellas, es el
engrosamiento –quitina- de la mima para mantener alejados los iones -principalmente-
extracelulares y que no afecten el equilibrio electroquímico celular, además genera un
gradiente y dificulta su entrada -compactación- por osmosis. Otra es la mecanización,
observada –principalmente- en organismos halófilos que crecen ambientes con alta
incidencia solar, que producen una delgada capa granular de melanina para protegerse
de la luz solar. Recientemente se ha propuesto que una estrategia particular de los

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halófilos, podría ser la expresión diferencial de unas proteínas que recubren a las
paredes celulares de estos: las hidrofobinas (Plemenitaš et al., 2014; Gunde-cimerman,
Ramos, Plemenitas, & Gadd, 2009).

1.2. HIDROFOBINAS

Las hidrofobinas son proteínas producidas y secretadas exclusivamente por

Hongos filamentosos (Ascomicetos y Basidiomicetos), de tamaño molecular pequeño
( aprox., 30 kDa) y capaces de autoensamblarse en una interfaz hidrofílica-hidrofóbica.
Facilitan el contacto del hongo con una superficie, además de estar implicadas en la
formación de estructuras aéreas (Plemenitaš et al., 2014).

Existen dos grupos de hidrofobinas, divididos en base a modelos de hidropatía y

solubilidad, las hidrofobinas clase I (HCI) y clase II (HCII). Las HCI se han observado
tanto en Ascomicetos como en Basidiomicetos mientras que las HCII son exclusivas de
Ascomicetos (Wessels, 1997).

En una interfaz agua- aire las HCI tienen mayor contenido de estructuras
proteicas hoja beta plegadas mientras en agua- solido se favorece la aparición de α-
hélices. El estado α-hélice representa un estado intermedio de autoensamblaje mientras
el estado β-plegado, es más estable y favorable el contacto e interacción con la
superficie. Las HCII son estudiadas, por lo cual existe carencia de información de todos
los cambios estructurales (Wessels, 1997, H. a. . Wosten, 2001).

En las HCI y II, los puentes disúlfuro –formados por ocho residuos de cisteína
altamente conservados- son los encargados de mantener los monómeros solubles en
agua y previenen el autoensamblaje prematuro, así se explica la presencia de las ocho
cisteínas altamente conservadas en la secuencia de aminoácidos en ambas clases de
hidrofobinas (H. Wosten, De Vries, & Wessels, 1993).

En el 2014, de acuerdo a Zacj et al., 2014, realizando un estudio

transcriptómico de un hongo halófilo obligado, W. ichthyophaga, describen que hay
expresión diferencial de las hidrofobinas y podrían tener potencialmente en
dependencia de la concentración de sal en la que crecían. Ellos proponen que
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posiblemente la expresión de ciertas hidrofobinas confieran resistencia al hongo en
ciertas condiciones de salinidad. Sin embargo, no existen aún evidencias
experimentales (Zajc, Kogej, Galinski, Ramos, & Gunde-cimerman, 2014)

Las hidrofobinas que se describen en W. ichthyophaga contienen el patrón

característico de ocho residuos de cisteína, pero contienen una alta proporción de
aminoácidos ácidos en comparación a homólogos de otros hongos. Se explica que
posiblemente podría ser una adaptación a la sal, puesto que los aminoácidos ácidos
pueden interactuar con las moléculas de NaCl y agua, y así evitar cambios inducidos
por estrés salino (Siglioccolo, Paiardini, Piscitelli, & Pascarella, 2011; Zajc, Kogej,
Galinski, Ramos, & Gunde-cimerman, 2014).
2. ANTECEDENTES

En el Laboratorio de Biología Molecular de Hongos del CEIB-UAEM, se aisló una

cepa de un hongo halófilo, la que por criterios morfológicos y moleculares se identificó
como Aspergillus caesiellus, pero que recientemente a través de una filogenia
concatenada usando de cuatro marcadores específicos del genero Aspergilli se ha re-
clasificado como Aspergillus sydowii.
De acuerdo a Pérez-Llano et al., 2017 (en preparación), tras analizar el
transcriptóma de A.sydowii, se observó la expresión diferencial de 6 genes, tres de los
cuales –HFB1,2,4- se expresaban diferencialmente en diferentes concentraciones de
NaCl.
Se Identificó que la HFB4 se expresa en mayor abundancia cuando el hongo no
está expuesto a elevadas concentraciones de NaCl o en su ausencia, pero su expresión
es mínima cuando aumenta la concentración de sales. Así mismo se registró que la
HFB1, 2 Y 3 se sobreexpresaban cuando los valores de NaCl en el medio eran
elevados -.5M y 2M-. Ver tabla II

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Tabla II. Expresión diferencial de los genes de HFB de A. sydowii. Tomado de Pérez- Llano et al., 2017 .

Estos resultados también sugieren que las hidrofobinas podrían ser una
respuesta a hipersalinidad. Es de relevancia caracterizar las propiedades biofísicas de
estas proteínas y estudiar si la presencia de sal tiene un efecto en la estructura de la
proteína o en la formación de películas o en la hidrofobicidad-hidrofilicidad de estas. En
estudios futuros sería importante comprobar si efectivamente estas participan en la
resistencia a altas concentraciones de sal del hongo.

3. OBJETIVOS

3.2. GENERAL

Evaluar las propiedades biofísicas de las hidrofobinas HFB1, HFB2 y HFB4 del
hongo halófilo Aspergillus sydowii.

3.3. ESPECIFICOS

Expresar y purificar los genes correspondientes a las hidrofobinas HFB1, HFB2 Y

HFB4 de Aspergillus sydowii en el sistema heterólogo Pichia pastoris.

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 Determinar la influencia de la salinidad en el recubrimiento, la modificación de las
propiedades superficiales y en la estructura de las HFBs.

Evaluar el efecto de la adición de hidrofobinas al medio de cultivo en el

crecimiento y tolerancia a altas concentraciones de NaCl de A. sydowii.

4. METODOLOGÍA

4.2. EXPRESIÓN DE HFBs

4.1.1 AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES HFB1,2 Y 4

La amplificación se realizará a partir de ADN complementario (ADNc), derivado

de un cultivo fermentación semi-solida de A. sydowii en paja de trigo, Los cultivos
estuvieron a diferentes concentraciones de NaCl (Sin NaCl, 0.5M NaCl y 2.0M NaCl).
Se utilizarán cebadores diseñados específicamente para la inserción del
producto de PCR en el vector Ppic-Zα, los cuales están flanqueados por sitios para las
nucleasas EcoRI Y XbaI, el Fw contiene el sitio para EcoRI y el Rv el de XbaI. Los Fw
llevan una etiqueta c-Myc para el monitoreo en la purificación de las proteínas
heterólogas, también un sitio correspondiente a la proteasa factor Xa -para su
eliminación en los últimos pasos de purificación y que no intervenga en las pruebas
biofísicas-. Ver tabla III

SECUENCIA 5'-3'
Sitio EcoRI C-myc Factor Xa Región HFB
FwHFB1 ATA GAATTC GAGCAGAAACTCATCTCTCTGAAGAGGATCTG ATCGAAGGTCGT CATCCCCAACGGCCCTGGCTA

FwHFB2 ATA GAATTC GAGCAGAAACTCATCTCTCTGAAGAGGATCTG ATCGAAGGTCGT GCTCCCCCCGGCCAGGCC

FwHFB4 ATA GAATTC GAGCAGAAACTCATCTCTCTGAAGAGGATCTG ATCGAAGGTCGT CATGCCTTCCTCCGAGCAGGCC
Sitio XbaI Región HFB
RvHFB1 GC TCTAGA CTAGAGAACCTTGACGGGAATGCAAGG

RvHFB2 GC TCTAGA TTAGAGAAGAGAACCAAGAGCAACGCAAGGAAG

RvHFB4 GC TCTAGA TTACTCCTCGGCCTCCTCGGTCT

Tabla III. Construcción especifica de los cebadores Fw y Rv para las HFB. Modificado de Pérez- Llano et

al., 2017.

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4.1.2 TRANSFORMACIÓN DE E. COLI
Una vez obtenido el producto de PCR –digerido con EcoRI y XbaI- se ligará con
el vector específico para Pichia Pastoris –PpicZα-, y se procederá a transformar E. coli
(XL1-BLUE), mediante electroporación. Se harán cultivos en medio solido LB bajo en
sales y se utilizara Zeocina (Zeocin ™, 25µg/ml) como antibiótico de selección.
Se verificará que las cepas transformantes contienen el inserto mediante PCR de
colonia. Los plásmidos con el inserto se purificarán a partir de un cultivo líquido de 5 ml
de LB bajo en sales con Zeocina, utilizando el kit GeneJET Plasmid Miniprep
(ThermoFisher Scientific).

4.1.3. TRANSFORMACIÓN DE P. PASTORIS

Se procederá a hacer las células electrocompetentes de P. pastoris –cepa

KM71H- , las cuales se prepararán de un cultivo crecido durante toda la noche hasta
alcanzar la fase exponencial (DO < 2). Se lavarán las células tres veces con una
solución estéril de sorbitol (1.0M) y se resuspenderán 10 10 células en 200 µL de sorbitol
(1.0M). Por otro lado, se linearizarán los plasmidos mediante digestión con SacI. La
purifición se realizará en gel de agarosa 1% utilizando el kit GeneJET Gel Extraction
(ThermoFisher Scientific). Las células se incubarán aproximadamente 1hr con el
plásmido y se esparcirán en placas de medio solido YPD + Zeocin ™ (100µg/ml).

4.1.4. SELECCIÓN DE CÉLULAS TRANSFORMANTES

Se realizara un PCR en colonia con resistencia a Zeocina y una vez identificadas

se realizara un fermentación en medio BMG (0.34% YNB, 1% sulfato de amonio, 1%
glicerol, 4x10-50% biotina en tampón fosfatos 0.1M), para inducir la expresión de las
proteínas. Posteriormente se pasarán a 5-10mL de medio BMM (0.34% YNB, 1%
sulfato de amonio, 1% metanol, 4x10-50% biotina en tampón fosfatos 0.1M).
El cultivo se realizará en las condiciones: temperatura de 28°C y agitación de 250
rpm y se tomará una muestra inmediata -0hrs- del medio BMG y a las 24,48,72 y 120
hrs del medio BMM. La muestra de ambos cultivos de analizará mediante SDS-PAGE el

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cual se teñirá con el kit SilverQuest Silver Staining (Novex, Life Technologies), para
verificar la inducción proteica.

4.1.4. PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE HFB´s

Ya identificadas las células de P. pastoris transformantes, se realizará una

fermentación en medio BMG y para la inducción de las proteínas heterólogas, mas
tarde las células se resuspenderán en medio BMM, el cual contiene metanol. Se
purificarán mediante cromatografía de exclusión molecular usando una columna
superdex-75.

4.3. CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA

4.2.1 WCA (Water Contact Angle)

Se utilizará el método WCA para determinar la hidrofobicidad-hidrofilicidad de las

hidrofobinas expresadas en P. pastoris. Se utilizarán dos tipos de superficies, el primero
de vidrio –como material hidrofílico- y el segundo será de lámina de polietilen tereftalato
(PET) –como material hidrofóbico-.
Una vez lavados y secados, se incubarán toda la noche en una solución con 5
µM de las proteínas en tampón fosfato (0.1M, pH 5), con 2M de NaCl y sin sal, con la
finalidad de observar el efecto de la sal sobre el recubrimiento de las mismas. Más
tarde, se hará la deposición de gota sésil sobre los mismos, utilizando agua destilada,
para medir el ángulo de contacto con la superficie.

4.2.2. ESPECTRO DICROISMO CIRCULAR (DC)

Para determinar el efecto de NaCl sobre las hidrofobinas, se medirá el espectro

DC. Para ello, el sobrenadante del cultivo con las proteínas se centrifugará con
membranas de diafiltración con un corte de 5.0kDa. Una vez que se han concentrado

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las proteínas de 5 a 10 veces, se prepararán muestras 10µM de las mismas, y se
suspenderán en 10uM tampón fosfato, con 2M de NaCl o sin NaCl.
Las proteínas se incubarán solo 5 minutos en el tampón con 2.0M. La medición
del espectro DS sin NaCl se realizará en el rango 260-190nm, mientras que en
presencia de 2M NaCl será a 203nm (puesto que el tampón con NaCl interfiere con la
medición en el otro rango).

4.2.3. DLS (DYNAMIC LIGHT SCATTERING)

Utilizando un analizador de partículas se medirán las propiedades de las

moléculas sin ensamblar (como diámetro y potencial zeta). Así se podrá caracterizar la
estructura supramolecular de HFB en solución y en diferentes concentraciones de NaCl.
También se medirán las propiedades surfactantes, para ello se medirá el diámetro
medio de las partículas en una emulsión y su cambio en función de la adición de
cantidades crecientes de HFB.

4.2.4. BALANZA LANGMUIR-BLODGET

Consiste en un sistema compuesto por barreras móviles que permite la

expansión o compresión de la monocapa. Mediante un sensor de tensión se mide la
fuerza de tensión con una dina de platino adaptado al extremo del sensor, el cual es
sumergido parcialmente. Los cambios de tensión se hacen evidentes debido a los
cambios de fuerza asociados a las variaciones en el área molecular que se modifica
atreves de las barreras. El resultado de la adición del material tensoactivo a la interface
es la formación de una monocapa sobre una superficie liquida –agua-, que afecta la
tensión superficial y es censada por el tensiómetro.
Por otro lado, permite que la monocapa sea transferida mediante fijación a la
superficie de un soporte sólido, que consiste en colocar un soporte solido perpendicular
a la interface agua/aire cubierta por la monocapa que se transferirá –mediante
inmersión-. Durante la transferencia se hace avanzar las barreras para compensar la

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pérdida de moléculas y un mecanismo de retroalimentación entre el sensor de tensión y
el motor de la barraras mantiene constante la presión. Esta técnica en combinación con
microscopia de fluorescencia permite estudiar los cambios en la organización
supramolecular del material tensoactivo – en el proceso de compresión y durante las
distintas faces en las que encuentra la monocapa.

5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

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BIBLIOGRAFIA

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