INTRODUCCIÓN A LA posee una señal de fluorescencia como

INMUNOHISTOQUIMICA sistema marcador.

Es una técnica que combina diferentes

técnicas, la histología, citología,
histoquímica, bioquímica e inmunología.
Se puede definir como “técnica que
combina metodologías inmunológicas y
bioquímicas para la detección de un
antígeno (proteína) celular o tisular,
mediante el uso de un anticuerpo
especifico y un sistema marcador”.
Esta técnica solo permite la identificación
El anticuerpo es la principal herramienta de proteínas en el tejido.
que se utiliza para poder realizar la
técnica y para poder visualizarla se Antígeno  proteína target (proteína
necesita un sistema marcador. que queremos identificar)

En el esquema se observan los elementos Inmunohistoquimica: reacción

de una IHQ, el anticuerpo secundario inmunológica realizada en tejidos
puede ir o no ir, el sistema de marcaje es Inmunocitoquimica: reacción
el que permite visualizar el lugar donde inmunológica realizada en células
Inmunofluorescencia: reacción
inmunológica con revelado diferente.

HISTORIA

Al desarrollo de la IHQ se le denomino la

“revolución marrón”, contribuyo al
diagnostico histológico y citológico como
técnica complementaria y al desarrollo de
la investigación, permitiendo grandes
avances.

El mayor avance es la disponibilidad de

un gran numero de anticuerpos que
funcionan para muestras incluidas en
parafina.
se realizo la reacción IHQ.
Otro avance es el desarrollo de técnicas
En esta imagen se observa un esquema de recuperación antigénica que
de una inmunofluorescencia, son muy aumentan la sensibilidad de la técnica. La
similares, con la diferencia que esta recuperación antigénica es un
procedimiento que se realiza antes de
comenzar la IHQ para mejorar la
inmunoreactividad de los tejidos que se
pudo perder al fijarlos con aldehídos.

También se desarrollaron sistemas de

detección y amplificación mas sensibles,
permitiendo el reconocimiento de Se dividen en 2 grandes grupos:
antígenos que se encuentran en  Monoclonales: son generados a
cantidades mínimas. partir de un clon de plasmocitos,
son más específicos, pero menos
En 1941 Coons y cols. descubrieron los sensibles
primeros pasos para la IF, con la unión de  Policlonales: son generados a
moléculas fluorescentes a proteínas y partir de muchos clones de
luego de eso comienza el desarrollo de la plasmocitos (diferentes),
IHQ que se dio por la conjugación de haciéndolo más sensible, pero
anticuerpos con enzimas. menos específicos.

Luego se desarrollo la inmunogold, donde Producción de los anticuerpos

se presentan anticuerpos conjugados con
moléculas de oro de diferentes tamaños
(electrodenas). Esta técnica se visualiza
en ME con cortes ultrafinos.
ANTICUERPOS
Monoclonales: son los más sofisticados de
producir, se usan ratones. De manera
invitro se fusionan células tumorales con

Son la principal herramienta para

desarrollar la técnica
inmunohistoquimica. Se sebe asegurar
que tenga la mejor afinidad por la
proteína que se quiere identificar y la
mejor calidad posible.

Son moléculas especificas para un

antígeno particular, tienen una región
especifica que se va a unir al epítopo de
la proteína que se va a identificar.
Son generados por nuestro organismo por
los plasmocitos (linfocitos B activados por
linfocitos T), cuando algún virus u agente
extraño entra al cuerpo.
plasmocitos (que están produciendo un
tipo de anticuerpo especifico), de esta
manera se empiezan a cultivar células
inmortales (hibridonas) que están
produciendo contantemente anticuerpos.

Estructuralmente
presentan 2 Policlonales: en este caso simplemente se
cadenas pesadas y inmuniza a un animal (generalmente
2 cadenas ligeras grande para poder sacer más suero).
unidas por puentes Luego de la inmunización, en el
disulfuro. Además organismo de estos animales se va a
tienen dominios generar una reacción inmunológica
variables y normal donde se empezarán a activar
constantes. diferentes células plasmáticas para
producir anticuerpos contra ese antígeno
Son de la familia de que fue inyectado. Finalmente se purifica
las para tener un suero lleno de anticuerpos
inmunoglobulinas  IgG, IgA, IgM, IgD, que servirá para investigar una proteína
IgE. en concreto.

PROCEDIMIENTOS DE IHQ
Pasos básicos
1. Desparafinaje e hidratación
2. Recuperación antigénica
3. Bloqueo de enzimas endógenas: se
usa solo en caso de ocupar un
método de revelado que use
enzimas.
4. Bloqueo de sitios inespecíficos: se
bloquean proteínas que se
encuentren en el tejido ya que
pueden ser confundidas con las
que se quieren identificar.
5. Incubación con anticuerpo primario
6. Incubación con anticuerpo
secundario: en caso de IHQ
indirecta
7. Revelado: puede ser con o sin
métodos de amplificación, puede
incluir el trabajo de enzimas,
fluoróforos o metales
8. Contraste: es opcional (núcleos)
9. Deshidratación y montaje:
deshidratar, aclarar y cubrir si el
método lo permite.
Imagen: reacción con anticuerpo
secundario.
En la recuperación antigénica también se
usa un sistema de calor para que sea más
efectiva.
Los buffers se utilizan para los lavados
entre cada paso, estos son de gran
importancia ya que así los reactivos
usados en el paso anterior se eliminan y
el tejido queda limpio y mantiene el pH.
RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA
Este paso es necesario para que la
reacción IHQ sea más efectiva.
La fijación con aldehídos tiene un efecto
de enmascaramiento de los sitios
antigénicos, la inclusión también provoca
cambios conformacionales en la proteína
impidiendo que el Ac ingrese, la
recuperación antigénica va a revertir esto
exponiendo los epítopes (región de la
proteína que reconoce el Ac) y así
permitiendo su detección.
Ejemplo del efecto de la recuperación
antigénica
HIER: recuperación antigénica con calor
Se puede observar que en este caso el
buffer que funciono fue el de un pH
básico.
Los buffers generalmente ocupan calor y
los principales equipos usados son:
 Baños de agua
 Vaporera
 Microondas
 Olla a presión u ollas pascales
BLOQUEO DE MOLÉCULAS
ENDÓGENAS
Moléculas que se pueden bloquear
 Proteínas del tejido
 Biotina
 Ezimas endógenas (peroxidasa,
fosfatasa alcalina, etc.)
Izquierda  no bloqueo
Derecha  bloqueo
MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN
 No siempre es necesario
 Cuando se espera que haya poca
cantidad de la proteína que
queremos identificar es necesario,
ya que, tendríamos una mejor
localización de esta.
 Hay una variedad de métodos de
amplificación:
- Inmunofluorescentes (IF)
- Enzimáticos (IHQ)
- Inmunometalicos (inmunogold)
Tipos de inmuno
Método directo  es cuando se utiliza
solamente un anticuerpo, el cual va
conjugado con una molécula que permite
su
revelado.
Método indirecto  es cuando se usa un
anticuerpo primario y un anticuerpo
secundario, siendo este ultimo el que va  Método Avidina Biotina
marcado con una molécula que permite  Método del polímero marcado
su revelado.  Método de Streptoavidina-biotina

Hay distintos sistemas de amplificación

 Complejo PAP
Cada vez van saliendo métodos de
amplificación y revelado más complejos
que van amplificando más la señal.
Mientras más moléculas se añade a este
complejo mayor va a ser la señal.

Las proteínas pueden estar en cualquier

lado, ya sea en el citoplasma de las
células (ej: en células de Purkinje), en la
membrana celular, en el núcleo (ej: capa
granular del cerebelo) o pueden estar
extracelular al encontrarse en el estroma
alrededor de las células funcionales.

¿Por qué se utiliza a la IHQ en el

diagnóstico histopatológico?

En la clínica lo que se va a realizar

generalmente es tipificar tumores.
Cuando un tumor está muy
indiferenciado, cuando se pierde las
características propias de la célula y hace
metástasis en otro órgano, hay que
averiguar qué tipos de células son y de
donde provienen para poder darle el
tratamiento adecuado al paciente.

Inmunofenotipo  son las

características propias de una célula que
la identifican como tal, so características
Interpretación de resultados  Patrones de la estirpe celular.
en IHQ
Las células normales diferenciadas  Describir comportamiento y
expresan un conjunto de antígenos evolución biológica de una lesión.
propios de la estirpe a la cual pertenecen  Evaluar la respuesta a tratamientos
lo que contribuye a su inmunofenotipo. farmacológicos.
Las células tumorales, aun cuando sean  Determinar el pronóstico de
poco diferenciadas, conservan total o lesiones.
parcialmente el inmunofenotipo de la
 Tratamiento para estimular o
estirpe a la que pertenecen, esto a pesar
reponer el sistema inmunitario
de que haya variado mucho su morfología
y características celulares. frente al cáncer, infecciones u otras
enfermedades.
Con la IHQ se va a identificar ¿Cómo se identifican los tumores?
proteínas de parte del
inmunofenotipo de la célula Para poder llegar a determinar que tumor
permitiendo saber el tipo celular, que tipo tiene el paciente se utilizan los
ALGORITMOS.

Algoritmos  es un esquema (fórmula)

de procedimiento o diagrama de flujo en
base al cual se realizan diversas
inmunotinciones que finalmente permiten
obtener el inmunofenotipo del tumor en
estudio. Es un camino para ir

de tumor es y de que tejido puede venir

para irse guiando en el diagnóstico.

En la imagen se observa una IHQ de la

citoqueratina 18 en cáncer de mama.

El proceso de titulación de anticuerpos

consiste en diluir un anticuerpo que se
encuentra concentrado para que este en acercándonos al diagnóstico de un
una dilución optima. paciente

Usos de la IHQ Marcadores clásicos que se utilizan para

distintos tumores
 Diagnóstico
 Pronóstico y tratamiento
 Inmunofarmacoterapia
 Investigación
 Identificación del inmunofenotipo
de lesiones neoplásicas o
preneoplásicas.
Por ejemplo, el anticuerpo TIRO reconoce
proteínas propias de la tiroides.

Hay gran variedad de ac, pero no se

pueden ocupar todos al mismo tiempo,
por eso se debe diseñar primero lo básico
(algoritmos) y a partir de eso seguir

MARCADORES PRONÓSTICOS

Identificación de proteína u oncoproteínas

que permiten evaluar el potencial
proliferativo, invasivo, metastásico,
apoptótico de una determinada población
celular.

investigando.
Permiten determinar cómo va a ser el
pronóstico del paciente según como va
evolucionando el tumor. Por ejemplo, el
Ki67 deja ver la proliferación celular, por
lo que si un tumor expresa mucho esta
proteína significa que posee una alta tasa
de división y va creciendo en tamaño,
siendo un mal pronostico para el
paciente.
 Ki67
 PCNA
 Ciclinas
 p-53
 C-erb-2
 Receptores Hormonales
El anticuerpo PCNA también es de
proliferación celular, por lo que las células
que se encuentran marcadas en la
imagen son células que se están
dividiendo.
MARCADORES DE TERAPIA TUMORAL
La IHQ determina que cantidad de
receptores hay determinando si la terapia
tendrá o no éxito.
Terapia de supresión de estrógenos con
Tamoxifeno. Bloqueo de receptores de
estrógenos parcial o total.
 Impide transcripción genética
 Impide síntesis de ADN
 Impide crecimiento celular
Cáncer de mama con resistencia a
Tamoxifeno no tiene buen resultado
Se refiere principalmente a los receptores
de estrógeno y progesterona, que dan
una idea del diseño terapéutico que se
puede tener con un paciente. Si un
paciente posee muchos receptores de
estrógeno es positivo porque se puede
utilizar una droga para bloquearlos y
tener una repercusión positiva para el
paciente.