Cursul 1- Genurile Mycobacterium şi Nocardia -

pag.153-165
Saturday, April 18, 2020 3:17 PM

Genul MYCOBACTERIUM Genul NOCARDIA

Germenii din acest gen apartin familiei MYCOBACTERIACEAE. Reuneste specii raspandite in sol, care nu fac parte din microbiota indigena a
Familia Mycobacteriaceae cuprinde mai multe specii, fiind aproape toate saprofite cu organismului.
exceptia unor specii:
⚫ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 1. NOCARDIA ASTEROIDES
⚫ MYCOBACTERIUM LEPRAE 2. NOCARDIA HRASILIENSIS

In 1882 Robert Koch descopera bacilul tuberculozei, tot in acelasi an Paul Ehrlich Sunt patogeni oportunisti care determina la om infectii mai frecvent pulmonare.
descopera acido-rezisteta bacilului tuberculozei. Formele filamentoase se disociaza usor in forme bacilare polimorfe.
In 1884 Koch obtine cultura bacilului tuberculozei pe SER COAGULAT. Specii patogene pentru om sunt partial acido-rezistente: in coloratia Ziehl-
In 1891 tot Koch semnaleaza fenomenul KOCH si TUBERCULINA Neelsen rezista 5-10 secunde la decolorare cu acid-alcool.

In perioada 1908-1921 Albert Calmette si Claude Guerin au cultivat prin treceri la 21 Pe agar sange in aerobioza la 37 de grade, cultiva lent in 1-2 saptamani,
de zile, in bulion cartof glicerinat si biliat o tulpina de Mycobacterium bovis virulenta formand colonii ceroase, incastrate in mediu si pigmentate variabil in galben,
izolata din lapte. In urma acestor treceri s-a obtinut o tulpina fara patogenitate, dar portocaliu.
capabila sa determine rezistenta fata de infectia tuberculoasa, dar cu caracterele Hife aeriene pot sa apara si pe suprafata coloniilor.
morfologice, tinctoriale, nutritionale si de cultura la fel.
Aceasta tulpina numita TULPINA BCG (BACILUL CALMETTE SI GUERIN) a fost utilizata
ca vaccin impotriva tuberculozei incepand cu 1921. FORME CLINICE

- cervico-faciale din focarele dentoalveolare sau tonsilare

CLASIFICARE
1. Micobacterii care nu se dezvolta pe medii de cultura si sunt strict patogene pentru om si
animale:
a. MYCOBACTERIUM LEPRAE este agentul etiologic al leprei umane
b. MYCOBACTERIUM LEPRAEMURIUM este agentul etiologic al leprei sobolanilor
2. Micobacterii care se dezvolta lent (saptamani) pe medii de cultura si sunt patogene pentru
om si animale homeoterme (care isi pastreaza temperatura constanta a corpului):
a. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS este agentul etiologic al tuberculozei umane dar si al
cainelui si pisicii
b. M. bovis produce tuberculoza la bovine si om
c. M. africanum patogen pentru om
d. M. muris care detrmina leziuni cazeoase ganglionare si subcutanate la unele rozatoare
- la nivelul SNC, abcese, meningite
- la nivelul ochiului, in aparatul lacrimal-canaliculite, celule orbitale
- pleuropulmonare
- miocardite, mediastinite
Tratamentul consta in asocierea metodelor chirurgicale (drenarea abceselor,
eventual excizia leziunii) cu administrarea prelungita a unor agenti microbieni in
doze mari (pentru a asigura difuziunea lor in focare prin infiltratul dens, nevascular,
cu fibroza periferica care inconjoara nocardiile)
Local dupa deschiderea larga a leziunii se aplica antibiotice sau antiseptice.
Profilaxia onsta in masuri de igiena bucala, tratarea eficienta a focarelor
dentoparadontale si tonsilare ca si protectia cu antibiotice atunc cand se deschid
aceste zone.

3. Micobacteriile care se dezvolta lent sau rapid (zile) pe medii de cultura, unele din
micobacterii sunt saprofite, iar altele sunt patogene au conditionat patogene.

IN RAPORT CU PIGMENTATIA COLONIILOR SI RITMUL CRESTERII MICOBACTERIILOR SE

IMPART IN:

- Grupa 1 MICOBACTERIILE FOTOCROMOGENE

Culturile se dezvolta la 37 grade celsius.

In intuneric nu sunt pigmentate
Daca sunt expuse 30-60 de minute la lumina zilei sau la o sursade 30 W asezate la o distanta de
50 cm si apoi raman la intuneric 12-24 de ore, culturile se pigmenteaza in galbez sau portocaliu.
ex: MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

- Grupa 2 MICOBACTERIILE SCOTOCROMOGENE

Se dezvolta la 37 grade celsius atat la lumina cat si la intuneric, culturile sunt pigmentate in
galben-portocaliu.
exemplu: MYCOBACTERIUM SCROFULACEUM

- Grupa 3 MICOBACTERIILE NECROMOGENE

exemplu: MYCOBACTERIUM AVIUM

- GRUPA 4 MICOBACTERIILE CU CRESTERE RAPIDA

▪ Coloniile apar dupa cateva zile sub forma S sau R la 37 grade celsius
▪ Cromogenitatea este variabila
▪ Conditionat patogene la om si animale

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MYCOBACTERIUM LEPRAE

Sunt bacili acid-alcoolo-rezistenti, in coloratia Ziehl-Neelsen apar rosii.

1. HABITAT
Bacilul tuberculos manifesta un parazitism strict, el este prezent in leziunile
omului sau a animalelor bolnave de tuberculoza, praful incaperilor in care a fost
raspandita sputa bacilifera sau pe obiectivele contaminate de bolnav.
2. CARACTERE MORFOLOGICE SI TINCTORIALE
• Imobili
Sunt lungi de 4-5 pm si grosi de 0.4-0.5 pm, se gasesc exclusiv la oameni, sunt
dispusi intracelular in gramezi compacte.
Nu se cultiva pe medii artificiale si nici pe medii vii (culturi celulare sau
animale de laborator). Se poate cultiva pe soarecele alb timectomizat si
iradiat, bacilul leprei creste putin (inoculat in planta), acest fapt se face pentru
obtinerea unui antigen lepromina, folosit in diagnosticul intradermic.
Aceşti bacili au multiplicare strict intracelulară, unde formează grămezi care se

MICROBIOLOGIE Page 1
 Nu se cultiva pe medii artificiale si nici pe medii vii (culturi celulare sau
raspandita sputa bacilifera sau pe obiectivele contaminate de bolnav.
animale de laborator). Se poate cultiva pe soarecele alb timectomizat si
2. CARACTERE MORFOLOGICE SI TINCTORIALE iradiat, bacilul leprei creste putin (inoculat in planta), acest fapt se face pentru
obtinerea unui antigen lepromina, folosit in diagnosticul intradermic.
• Imobili Aceşti bacili au multiplicare strict intracelulară, unde formează grămezi care se
• Nesporulati numesc globi leproşi (ca ţigările într-un pachet).
• Necapsulati
• Granulatii puse in evidenta prin coloratii speciale Boala care este dată de M. leprae se numeşte lepră, se transmite prin
• sunt bacili subtiri cu lungime de 3-10 pm si latime de 0,1-0,2 pm, uneori
ramificati, drepti sau usori curbati sub forma literelor: X, Y, Z.
secreţiile patologice eliminate de bolnavi, contactul infectant trebuie să fie
masiv, bolnavii de lepră sunt foarte puţin contagioşi, incubaţia durează mai
3. STRUCTURA PERETELUI mult de un an.

- Lipide in cantitate mare (intre 20-45% din greutatea uscata a bacteriei), lipidele Este rezistent in mediul extern, sensibil la sulfone
se prezinta sub forma de:
a. Fosfolipide- CARDIOLIPINA
b. Acizi micolici in cantitate mai mare la
c. Glicolipide- CORD-FACTORUL tulpinile virulente.
rimfampicina
d. Peptidoglicolipidele- CEARA D Tratamentul dureaza 5 ani.

La celelalte bacterii lipidele sunt in proportie de 3-10%, se coloreaza foarte greu,

ulterior rezista la decolorare cu acizii minerali si cu alcooli, motiv pentru care se
numesc BACILI ACID-ALCOOLO-REZISTENTI.
Se foloseste coloratia Ziehl-Neelsen, pe frotiul colorat astfel bacilul tuberculos va
fi colorat in rosu aprins, datorita fucsinei, in timp ce restul germenilor sau a
celulelor vor fi colorate in albastru
TIPURI DE LEPRA:
1. Lepra tuberculoida (uscada), care este forma benigna, se caracterizeaza
prin foliculii granulomatosi care au tendinta la ulceratii, evolueaza lent.
2. Lepra leprotnatoasa (umeda), este forma maligna, se caracterizeaza prin
leziuni de tip proliferativ cu evolutie rapida.

- Proteine (tuberculoproteinele), tuberculina bruta, cca 1% ofera ANTIGENITATE In ambele tipuri de lepra este afectat SN periferic ducand la aparitia
- Polizaharidele care se leaga de lipidele si proteinele din perete. amputatiilor spontana nedureroase prin atrofia nervilor periferici, la
nivelul membrelor sau extremitatilor.
4. REZISTENTA
Identificarea micobacteriilor impune competenta, norme de securitate
Bacilii rezista luni sau ani in praf microbiologica, dotari si facilitati particulare
Sunt sensibili la actiunea radiatiilor solare si UV
Sunt sensibili la actiunea antibioticelor: - streptomicina
- HIN
dar pot castiga usor rezistenta - acidul para-amino salicilic
- etambutol
- rifampicina (sinerdol)

5. CARACTERE DE CULTURA

Spre deosebire de micobacteriile saprofite care se dezvolta usor si rapid pe

mediile de cultura simple, micobacteriile patogene se dezvolta lent pe mediile
speciale.

Adaugarea glicerinei in mediile de cultura favorizeaza dezvoltarea bacilului

tuberculos uman, in timp ce tipul bovian este patial inhibat.

Pe mediile lichide micobacteriile formeaza un val subtire, care se ingroasa, se

cuteaza, se fragmenteaza si cade la fundul recipientului , iar la suprafata se
formeaza alt val.

Bacilii tuberculosi de tip uman fac un val mai gros decat cel bovin si alcalinizeaza
la inceput mediul, apoi il acidifica progresiv. Insa cel bovin alcalinizeaza mediul la
inceput, iar ulterior nu-l mai acidifica.

Pe mediile solide, de tip Lowenstein-Jensen (LJ), sau de tip Ogawa sunt medii
selective ce contin: saruri minerale, asparagina/acid glutamic, amidon, galbenus
de ou, glicerina si verde malachit.

Amestecul final se repartizeaza intub uri de 18/180 si se coaguleaza in pozitie

inclinata la temperatura de 90 de grade celsius.

Temperatura optima de dezvoltarea a bacilului tuberculos este de 37 de grade

celsius timp de 30-60 zile. Bacilul este aerob, de aceea se insamanteaza pe
mediu solid inclinat (O CANTITATE DE 10% CO2 FAVORIZEAZA CRESTEREA)

Coloniile microbacteriene apar tarziu, dupa prima saptamana abia se vede o

mica formatiune ce numai dupa 30-40 zile ajunge o colonie caracterista de
aspect verucos (conopidiform) de tip RM, aceasta este cresterea EUGONICA a
coloniilor rugoase.
Prezenta coloniilor mici de tip S este o crestere disgonica si este caracterista
pentru MYCOBACTERIUM BOVIS.

6. CARACTERE BIOCHIMICE

Sunt germeni aerobi, au enzime ureaza, catalaza, nitrat-reductaza, se dezvolta la

un ph usor acid. TIPUS HOMINIS E SINGURUL CARE PRODUCE ACID NICOTINIC.

7. CARACTERE DE PATOGENITATE

MICROBIOLOGIE Page 2
 7. CARACTERE DE PATOGENITATE

Virulenta micobacteriilor este data de existenta unei substante CORD FACTOR

care este un glicolipid ce rezista la actiunea enzimelor lizozomale, care lipseste la
micobacteriile avirulente. De asemenea au capacitatea de a se multiplica
intracelular (intramaerofagic), in plus produc in organismul afectat si fenomene
de intoxicatie, care este un factor agravant.

8. EVOLUTIE SI RASPUNS IMUN

a. Germenii patrund si se localizeaza la nivelul ganglionilor pulmonari hiliari, unde

se multiplica intracelular, producand afectiunea PRIMARA

Multiplicarea intracelulara a bacililor duce la leziuni locale manifestate ca leziuni

de tip proliferativ=> se formeaza foliculii tuberculosi

alcatuiti din celule LANGHANS parazitate, in jurul

carora sunt atrase fagocite prin chemotactism

Apar necroze prin actiunea toxica a lipidelor, proteinelor si zaharurilor din

structura bacililor tuberculosi

b. Leziunile din infectia primara sunt amplificate de raspunsul imun celular, care
apar dupa 2-3 saptamani, care nu realizeaza protectie.

c. Limfocitele T elibereaza mai multe tipuri de limfokine ce determina o

aglomerare de celule, care duce la cresterea foliculilor tuberculosi.

Tipuri de limfokine de transfer a sensibilitatii

rol chemotatic

rol blastic
de inhibitie a migrarii neutrofilelor si macrofagelor

d. Apar si limfokine cu rol litic (limfotoxine), limfokine de activare a neutrofilelor si

macrofagelor

e. Macrofagele activate determina o activare a limfocitelor T obisnuite, care nu au

venit in contact cu Ag=> INTERLEUKINA 1, care are actiune de stimulare a
activitatii limfocitelor T efectoare.

f. Astfel rezulta necroza.

Tesutul necrozat se elimina respirator (impreuna cu bacilii virulenti)

se elimina pe cale sanguina=> localizare renala, genitala, osoasa,

meningeala, ganslionara, digestiva (leziuni secundare)

g. Foarte multe dintre infectiile tuberculoase nu duc la o evolutie generalizata, ci

merg spre vindecare datorita mijloacelor de aparare nespecifica a organismului.

h. PREMUNITIA= protectia de suprainfectie

Apare pe fondul existentei unei infectii tuberculoase care duce la

pastrarea Ag in organism.
Stimulul imun celular este continuu cu sensibilizarea a noi limfocite T circulante.
Aceste limfocite T pot asigura protectia fata de germenii tuberculosi de
suprainfectie. Acest fenomen a fost descris de Koch sub numele de FENOMENUL
KOCH care a inoculat bacilii tuberculosi virulenti la cobai, consecutiv apare
sancrul si in final moartea cobaiului.

Insa daca la acelasi cobai i se face un nou inocul, in timp util, apare sancrul
secundar care evolueaza spre necroza, se elimina si apoi se vindeca.

i. Raspunsul imun celular este negativ fata de prima infectie si este pozitiv fata de
suprainfectie.

j. Apare si un raspuns umoral cu aparitia Ac care NU ESTE UN RASPUNS DE

PROTECTIE, dar permite diagnosticarea de laborator

9. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

Este unul bacteriologic.

Se bazeaza prin punerea in evidenta a bacilului Koch in produse patologice. In
acest scop se folosesc 3 metode:

a. Examenul direct
b. Cultivarea
c. Inocularea la cobai

MICROBIOLOGIE Page 3
 Recoltarea produselor patologice se face in recipiente sterile cu capac ce se pot
inchide ermetic.

➢ In TUBERCULOZA PLEURO-PULMONARA se recolteaza: sputa, apirat bronsic sau

cavitar, lichid de spalatura bronsica, piesa de exereza chirurgicala, lichid de
spalatura gastrica, fecale, piese necroptice, lichid pleural.

➢ In TUBERCULOZA URO-GENITALA se recolteaza: urina, sange menstrual, biopsie

de endometru, piese de exereza chirurgicala.

➢ In TUBERCULOZA GANGLIONARA material de biopsie sau punctie.

➢ In TUBERCULOZA OSTIO-ARTICULARA se recolteaza: lichid articular, puroi din

abcese reci, fragmente osoase.

➢ In MENINGITA TUBERCULOASA se recolteaza LCR

Cel mai folosit produs este sputa, pentru ca cea mai intalnit tip de tuberculoza
este cea PULMONARA.

Tehnica de prelevare a sputei trebuie sa se faca in recipiente sterile, de unica

folosinta, trebuie efectuat inaintea inceperii tratamentului medicamentos.
Se recolteaza dimineata la sculare o cantitate de 5-10 ml, se va repeta la 3-4 zile.
Se poate pastra la 4 grade cu adaos de carbonat de sodiu pulvis
(50 mg la 5 ml sputa) sau fosfat trisodic (2-4 ml din solutie de 15%).
Se vor respecta regulile de asepsie a personalului care asista sau transporta
probele.

Aspectul sputei- este purulenta, nu se va lucra sputa mucoasa, care de cele mai
multe ori este saliva.

Examenul microscopic direct se efectueaza pe frotiuri colorate dupa medota

Ziehl-Neelsen, se examineaza cu obiectivul cu imersie, prezenta este data de
prezenta bacililor rosii pe un fond albastru.

Cand numarul de germeni este redus, frotiul se face dupa omogenizarea si

concentrarea produsului patologic. Omogenizarea se face intr-un balon de 250
ml, cu fund plat. Peste sputa se adauga o cantitate egala sau de 2-3 ori mai mare
de NaOH de conc. 0,5% la 60 de grade timp de 30 de minute.

Concentrarea prin hotare, se obtine prin adaugarea de apa distilata pana la

jumatatea balonului si 2 ml de xilol sau neofalina. Se amesteca energic 10
minute, se adauga apa distilata pana la jumatatea gatului balonului, se lasa in
repaus 30 de minute=> inel cremos.

Pe doua lame degresate, care sunt asezate pe o platina incalzita se depun

picaturi din materialul cremos, apoi frotiul va fi uscat, fixat la flacara si colorat
Ziehl-Neelsen.

Se va examina la microscopul cu imersie si se va face o apreciere cantitativa:

Concentratia micobacteriilor tuberculozei in sputa este totdeauna in

raport direct cu dimensiunile si intensitatea leziunii. Alte bacteriicare posibil le
putem intalni in frotiuri se deosebesc morfologic:

a. NONCARDIILE AI ACTINOMICETELE sunt filamentoase cu ramificatii

Apoi produsul patologic se va insamanta pe mediile de cultura amintite

10.INOCULAREA LA COBAI

Se practica in formele de tuberculoza extrapulmonara.

Prelevatul patologic se injecteaza 1-2 ml, urmarindu-se la 15 zile greutatea
cobailor.
Infectia tuberculoasa la cobai se manifesta prin pierderea in greutate,
producerea unui nodul care apoi se ulcereaza (sancru).

Pentru stabilirea sacrificarii exemplarului se efectueaza reactia la tuberculina

11. IDENTIFICAREA CULTURII MICROBACTERIENE PURE

- Controlul puritatii: frotiuri colorate Ziehl-Neelsen

- Primocultura (medii solide): morfologia coloniilor, temperatura optima,
pigmentarea (fotocromogenitatea).
- Culturi in medii lichide (teste fundamentale): acid-alcool rezistenta, viteza de
crestere, producerea de acid nicotic (testul Niacin sau testul Kouno)
- Teste complementare: produce

catalaza peroxidaza ureaza

Reduce nitratii la nitriti

Rezistante ta hidrazida acidului izonicotinic

Dupa obtinerea culturii se va efectua antibiograma pe mediul Lowenstein, pe

care se insamanteaza, se depun discurile de antibiotice sensibile, sau se pot livra

MICROBIOLOGIE Page 4
 care se insamanteaza, se depun discurile de antibiotice sensibile, sau se pot livra
placi care contin fiecare cate un antibiotic si se va insamanta tulpina izolata.

12. IDENTIFICAREA RAPIDA A MICOBACTERIILOR

A. Se face prin colorarea cu fluorocromi (auramin-rhodamina) a sputei si se

examineaza cu microscpul cu fluorescenta.
Micobacteriile se coloreaza in galben portocaliu, pe fond negru, daca
contracolorarea s-a facut cu permanganat de potasiu, celelalte resturi celulare
sunt galben deschis.
B. Reactia de amplificare genica identifica in 24h secventa de insertie tuberculosis,
sau genele care codifica ARN.
C. Sonde AND identifica prin hibridare secvente nucleotidice specifice unor
micobacterii

Profilaxie
a. Nespecifica: depistare, izolare, tratarea sursei de infectie si cresterea rezistentei
nespecifice
b. Specifica este vaccinarea cu BCG de provenienta bovina, cu bacili vii atenuati

Verificarea raspunsului imun se face prin IDR la tuberculina sau PPD(protein-

purificat-deriyat). Se inoculeaza intradermic tuberculina si reactia se citeste dupa
72h.

Daca in organism exista o infectie tuberculoasa, exista limfocite T sensibilizate

care elibereaza limfokine, apare o induratie si o tumefiere a zonei, mai mare de
9 mm deci IDR este +.

O reactie normala, organismul a venit in contact cu bacilul koch, dar este

protejat, dupa 72 de ore va aparea o papula de cel mult 9 mm, fara induratie.

Daca nu apare nici o modificare, IDR(-) semnifica absenta raspunsului imun

celular, deci absenta protectiei, ceea ce impune vaciinarea cu BCG.

Vaccinarea se face imediat dupa nastere, apoi se faccontrolari la 3 ani, 15 si 18

ani.

MICROBIOLOGIE Page 5