INTV- an IV FIM

Interactiunea
nanoparticulelor cu
tesuturile vii

Prof. Alina Badanoiu

Definitii

Nanoparticula = particule care

au diametre cuprins intre 1-100
nm sau au cel putin o
dimensiune de ordinul 1-100
nm
Nanopulberile = aglomerari de
nanoparticule
Nanomateriale = materiale cu o
structura fizico-chimica cu o
dimensiune mai mica de
100nm care au caracteristici
diferite de cele ale acelorasi
materiale la scara mai mare Nanoparticule de alumina
R.Rogojan, Teza doctorat, UPB,2013

A.Badanoiu 1
INTV- an IV FIM

Metode de sinteza
Mai ieftina si mai usor
de realizat
Jos-sus “Bottom-up”
Se porneste de la atomi sau molecule care se
asambleaza in diferite nanostructuri
Ex. Sol-gel, pirosol, metoda hidrotermala etc.
Sus-jos “Top-down”
Se porneste de la o structura generala la o
scara mai mare si se micsoareaza pana se
ajunge la elementele componente
Ex: litografia

Metode de sinteza a nanoparticulelor

(https://www.nanowerk.com/how_nanoparticles_are_made.php)

A.Badanoiu 2
INTV- an IV FIM

Principiul unor metode de producere a

nanoparticulelor (Jos-sus)
 Se bazeaza pe auto-asamblarea atomilor sau moleculelor

Procese fizico-chimice implicate in producerea nanomaterialelor – “bottom-up”

(https://www.nanowerk.com/how_nanoparticles_are_made.php)

Clasificarea nanoparticulelor

Bucher 2006

A.Badanoiu 3
INTV- an IV FIM

Nanomateriale au proprietati diferite

cu cele ale materialelor la scara micro
 Un procent mai mare de atomi pe suprafata,
comparativ cu numarul de atomi in interior
 Energie de suprafata mult mai mare
 Reactivitate chimica mai mare
 Proprietati catalitice
 Proprietati magnetice

Interactia cu tesuturile vii

Reactivitate chimica foarte mare
+
Dimensiuni (nm) mai mici sau egale cu cele ale
componentelor sistemului celular
=
Efect toxic asupra organismelor vii?

A.Badanoiu 4
INTV- an IV FIM

Studii care apreciaza impactul asupra

organismelor vii si sanatatii umane
1. Identificarea potentialelor pericole si riscuri
2. Determinarea probabilitatii de expunere
3. Analiza ciclului celular al liniilor celulare
puse in contact cu nanoparticulele (NP)
4. Controlul eliberarii nanoparticulelor in aer,
apa sau provenite din ciclul alimentar
5. Stabilirea limitelor de siguranta
6. Atestarea metodelor si implementarea
practicilor

A.Badanoiu 5
INTV- an IV FIM

Haynes group (https://www.chem.umn.edu/groups/haynes/research.html)

Potentiale pericole si riscuri

Otlia Radacina , Teza doctorat,

UPB,2013

A.Badanoiu 6
INTV- an IV FIM

Bucher 2006

COPD=boli
Efectul inhalarii de nanoparticule pulmonare cronice
(Terrazo at.al 2010- adapat in Atmospheric Nanoparticles and Their Impacts on Public Health http://dx.doi.org/10.5772/54775) obstructive

A.Badanoiu 7
INTV- an IV FIM

Probabilitate de expunere
Fulerene (C60)

Nanotuburi de C SWCNT

MWCNT
Nano-TiO2, Nano-ZnO, Nano-Ag

Concentratii ale unor nanoparticule in mediu

K. Aschberger et.all, Environment International 37 (2011) 1143–1156

Surse de nanoparticule Proiect ENHES

 Nanoparticule de C
 tratamente medicale “drug delivery”
 degradarea unor produse care le contin
(materiale polimerice armate cu fulerene, baterii, celule
solare etc)
 Nanotuburile de C (CNT)
 materiale in care CNT sunt adaugate pentru a
imbunatati (substantial) o serie de proprietati
 tratamente medicale

A.Badanoiu 8
INTV- an IV FIM

Exemple de produse existente pe piata

 EPOCYL™ - rasini modificate cu nanotuburi de carbon pentru
imbunatatirea urmatoarelor proprietati:
 Conductivitate electrica
 Rezistenta mecanica si durabilitate
 Greutate mica ↔ proprietati performante
 Utilizari: industria aerospatiala, automobile, vapoare si aplicatii
sportive

Exemple de produse existente pe piata

 BIOCYL™ este destinat acoperirilor bordajului

exterior al navelor si are ca principal avantaj
aderenta scazuta a organismelor marine;
indepartarea organismelor marine se face nu
datorita toxicitatii acoperirii ci ca urmare a
modificarii structurii stratului superior (aderenta
scazuta).

 THERMOCYL™ este destinat acoperirilor

ignifuge, care nu produce gaze toxice in timpul
arderii si asigura si o rezistenta buna la zgariere
si abraziune.

A.Badanoiu 9
INTV- an IV FIM

Surse de nanoparticule Proiect ENHES

 Nano-Au (colidal) – cataliza, aplicatii optice si

electronice
 Nano-Ag – produse la scara industriala
 Tesaturi
 Vopsele
 Produse cosmetice
 Containere de alimente
 Echipamente medicale inclusiv (bandaje,
catetere etc)
 Etc.

Surse de nanoparticule Proiect ENHES

 Nano-particule oxidice – produse la scara

industriala
 ZnO Spray-aerosol!
 Vopsele
 Cosmetice (creme protectie solara, pasta de dinti, etc.)

SCCS, 2012

A.Badanoiu 10
INTV- an IV FIM

Creme de protectie solara

Regulamentul (CE) nr.

1223/2009 al
Parlamentului
European și al
Consiliului din 30
noiembrie 2009
privind produsele
cosmetice
-ZnO (colorant)
-Ag (colorant)- E174
-TiO2 (colorant si
filtru-max.25%) - E171

Produse cu ZnO
 Produse de ingrijire a pielii iritate, expuse macerarii: balsamuri /
unguente (produse anhidre), creme (emulsii): pana la 20%

Produse de ingrijire a tenului acneic (usuca pustulele, are efect
calmant si anti-inflamator): pana la 20%

Produse de protectie solara: 25%.

NOTA: NU este un ingredient adecvat pentru sapunul facut

“la rece”! Oxidul de zinc reactioneaza cu hidroxidul de sodiu
rezultand compusi improprii unui produs cosmetic!


A.Badanoiu 11
INTV- an IV FIM

Exemple produse cu nano-ZnO

 Produse de protectie a mobilierului de
gradina

http://www.
nanophase.
com

Protectie UV – tot spectrul

UVA-320 pana la 400 nm; UVB- 280 to 320 nm.

 Tratarea tesaturilor
 Tratarea obiectelor de plastic (filme) – previn
degragarea
 Acoperiri geamuri
 Vopsele – pentru exterior constructii, industria
autovehiculelor, vapoare etc.

A.Badanoiu 12
INTV- an IV FIM

TiO2

 Rutil

[TiO6]
 Brookite
 Anatas

Superoxide
radical anion

S.-Y. Lee, S.-J. Park / Journal of Industrial and Engineering Chemistry 19 (2013) 1761–17691764

A.Badanoiu 13
INTV- an IV FIM

S.-Y. Lee, S.-J. Park / Journal of Industrial and

Engineering Chemistry 19 (2013) 1761–1769-1764

 Surse de TiO2 (inclusiv nano)

 Cataliza, celule solare, senzori etc.
 Vopsele (pigment)
 Materiale de constructie (auto-curatare)
 Acoperiri de protectie antifungice,
antibacteriale
 Cosmetice ( filtre UV)
 Protectia mediului (tratare ape/aer poluat)
 Implanturi
 …si multe altele (E171 - http://www.controleuri.ro/aditiv-
filtru/1/1004)

A.Badanoiu 14
INTV- an IV FIM

Y. Gao et al. / Applied

Anatas Rutil Surface Science 294
(2014) 36– 41

vanderbilt.edu

S.-Y. Lee, S.-J. Park / Journal of Industrial and

Engineering Chemistry 19 (2013) 1761–1769-1764 http://wyss.harvard.edu

Alte nano particule oxidice

 Oxid de fier (magnetita- medicina, protectia
mediului)
 Oxid de siliciu
 Oxid de zirconiu
 Oxid de ytriu Nanopulberi ceramice
 Oxid de aluminiu

R.Rogojan,
Teza doctorat,
UPB,2013

TEM nanoparticule alumina SEM nanoparticule de zircona

A.Badanoiu 15
INTV- an IV FIM

Toxicitatea nanoparticulelor la nivel

celular
 Celula – vehiculul care defineste informatia
ereditara pentru o specie
 Informatia ereditara – ADN

Baze
azotate

Ciclul celular de duplicare

S de la “sinteza” ADN
aprox.10-12h

M de la “mitoza”
aprox.1h

A.Badanoiu 16
INTV- an IV FIM

G0
“stare specializata de
odihna”

Durata G1
poate varia
in functie de
conditiile
externe si
semnalele
extracelulare

G1 si G2 – “pauze”

A.Badanoiu 17
INTV- an IV FIM

Tehnicile care pot fi folosite pentru a

determina toxicitatea nanomaterialelor
 Studiile in vitro pentru viabilitatea/proliferarea
celulelor, studii mecanistice
(apoptoza,necroza, potenţialul cu care se
distruge ADN-ul);
 Evaluarea microscopică a localizărilor
intracelulare (care includ SEM-EDX,
TEM,AFM; microscopie de fluorescenţă,
imagistică RMN);
 Studii in vivo

Studii pe culturi celulare -avantaje

 Observarea efectelor primare ale celulelor
ţintă cu absenţa efectelor secundare cauzate
de inflamaţii;
 Identificarea mecanismelor primare ale
toxicităţii în absenţa factorilor psihologici şi
compensatorii care afectează interpretarea
întregului studiu pe animale;
 Eficienţă, rapiditate şi costuri reduse;
 Îmbunătăţirea designului studiilor pe animale
care sunt foarte scumpe;
 Aspecte etice.

A.Badanoiu 18
INTV- an IV FIM

Studii pe culturi celulare - dezavantaje

 nu pot studia o gamă largă a efectelor

patogenice care sunt probabile să aibă loc la
testele in vivo, datorate translocaţiei,
toxicocineticii şi răspunsului coordonat al
ţesuturilor.
 Studiile clasice bazate pe pigmenţi, cu care
se determină viabilitatea celulară, produc
rezultate neconcludente pentru unele
nanomateriale datorită interacţiei şi/sau
absorbţiei coloranţilor de către acestea.

Viabilitatea celulara
1. Detectarea activitatii mitocondriilor (metoda
MTT)
 Principiul metodei: schimbarea culorii de la
galben la violet, ca urmare a reducerii 3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide -MTT) cu formare de formazan
(C19H15ClN4) in celulele care au
mitocondriile intacte.
 Se masoara absorbanta solutiei (de ex:
=570nm)
https://www.youtube.com/watch?v=vn6enA6lSKs

A.Badanoiu 19
INTV- an IV FIM

Evolutia viabilitatii celulare (determinata pe trei linii celulare diferite) in

urma tratarii cu nanoparticule de oxid de fier (NPF)

Viabilitatea celulara reprezinta raportul procentual intre absorbanta

determinata pe solutiile obtinute pe liniile celulare tratate cu NPF respectiv
linia celulara de control.

In anumite cazuri NP pot reactiona cu substantele utilizate sau pot

modifica valoarea absorbantei  rezultate false

2. Detectarea formarii de lactat dehidrogenazei (LDH) in

urma necrozei celulelor

 Oxidarea sarii galbene de tetrazoliu (INT- 2-(p-

iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium
chloride) la fomazan (rosu).
 Analiza solutii prin specrofotometrie (=340nm)
 Metoda este adecvata pentru nanoparticule,
nanotuburi de carbon, grafene
 Metoda NU este adecvata pentru nanoparticle
metalice, ioni metalici ( de ex. Cu) sau in conditii de
pH acide sau puternic bazice.

A.Badanoiu 20
INTV- an IV FIM

Citometria in flux
 Determinarea mai multor parametri fizici şi
chimici, caracteristici unei singure celule
aflate în mişcare într-un curent de lichid
 Măsurarea caracteristicilor fizice şi/sau
biochimice ale particulelor (celule,
nuclei,organite celulare) şi anume:
- Mărimea;
- Granularitatea;
- Cantitatea de ADN;
- Antigene de suprafaţă.
https://www.youtube.com/watch?v=EQXPJ7eeesQ

Etape
1. Prepararea suspensiei de celule;
Marcarea cu substante
2. Marcarea celulelor; fluorescente
(iodura de propidium)
3. Analiza;
4. Achiziţia datelor;
5. Stocarea datelor;
6. Interpretarea datelor

A.Badanoiu 21
INTV- an IV FIM

Schema de principiu a unui aparat de citometrie in flux

Analiza citometrie in flux

https://www.youtube.com/watch?v=TDRhCWaYRsg

A.Badanoiu 22
INTV- an IV FIM

Metode de cuantificare a procentului de

celule din fiecare fază a ciclului celular

utilizând markeri utilizarea unui algoritm

in programul de (fitarea unui curbe
analiza Gauss fiecărei faze
a ciclului celular)

Diagrame obţinute în urma analizei prin citometrie în flux a

culturilor de celule HCT8 tratate cu diferite nanoparticule de ZnO,
concentraţie 1mg/ml
Otlia Radacina , Teza
doctorat, UPB,2013

A.Badanoiu 23
INTV- an IV FIM

EVIDENŢIEREA MICROSCOPICĂ A MORFOLOGIEI ŞI

VIABILITĂŢII CELULELOR DUPA COLORAŢIA DUBLĂ,
FLUORESCENŢĂ

 Celulele sunt incubate timp de 24h, 37oC, 5% CO2,

cu compuşii de testat.
 Spălare, fixare cu metanol rece, uscare la
temperatura camerei
 Colorare timp de 5 minute. Pentru o discriminare
bună între celulele viabile şi cele moarte, s-a realizat
marcarea cu iodură de propidiu (PI) şi fluorescein
diacetat (FDA) a culturilor de celule fixate.
 Preparatele obţinute au fost vizualizate la
microscopul cu fluorescenţă.

a)

Interpretarea
rezultatelor
 celulele colorate în verde cu
morfologie normală sunt cele care au
incorporat FDA şi sunt viabile,
 celulele colorate în roşu cu structură
ordonată sunt celule necrotice, cu
membrană celulară permeabilizată b)
ce a permis pătrunderea PI,
 celulele cu nuclei coloraţi în roşu cu
structură alterată, sau celule colorate
dual (roşu-verde) sunt celule
apoptotice cu morfologie tipică.

Otlia Radacina , Teza

doctorat, UPB,2013

Viabilitatea celulara (a) şi morfologia (b) celulelor

stem mezenchimale (MSC) tratate cu nano-TiO2

A.Badanoiu 24
INTV- an IV FIM

Testari in vivo
 Soareci de laborator inclusiv femele gestante
 Iepuri
 Pesti zebra, mormoloci ( broaste) etc.
 Moduri de administrare:
 Inhalare
 Instilatii
 Injectare intravenoasa sau intradermala
 Aplicare (pe piele)
 Alimente/Apa

A.Badanoiu 25
INTV- an IV FIM

Interactiunea
nanoparticulelor cu
tesuturile vii

Prof. Alina Badanoiu

Efectul asupra tesuturilor vii

Nano TiO2

A.Badanoiu 1
INTV- an IV FIM

Nano - TiO2
Initial a fost clasificat ca “inert”
Acumulare – posibil cancerigen
Studii in vivo si in vitro referitoare la efectul nano-TiO2 asupra tesuturilor vii (Makoto et all, 2010)

GD- gestation day

In vivo

In vitro

Efecte nano-TiO2
Principale efecte
răspunsuri inflamatorii
citotoxicitate si genotoxicitate

Factori de influenta:
doza
dimensiunea de particulă
gradul de cristalinitate, defecte de structura
acoperiri de suprafaţă etc.
in studiile in vitro – linia celulara, mod de lucru

A.Badanoiu 2
INTV- an IV FIM

Studii in vitro
TiO2 (anatas) – fototoxicitate
la iradierea cu lumină solară sau radiaţii UV a
cauzat toxicitatea in cazul bacteriilor, algelor si
a planctonului marin
TiO2 în faza anatas, în prezenţa radiaţiei UV,
catalizeaza degradarea ADN-ului si determina
genotoxicitatea
Acoperirea nano-pariculelor de TiO2 cu
diverse substante poate reduce efectul geno-
toxic
Anatas de 100 de ori mai toxic comparativ cu
rutilul
5

Stres oxidativ
Stresul oxidativ este cauzat de un
dezechilibru intre productia de oxigen reactiv
si capacitatea sistemului biologic de a
detoxifia cu rapiditate reactivii intermediari
sau de a repara cu usurinta prejudiciile
rezultate
Compusi ROS (Reactive Oxigen Species)-
peroxizi si radicali liberi – necesari pentru a
transmite semnale celulelor (proliferare sau
apoptoza)

A.Badanoiu 3
INTV- an IV FIM

A.Badanoiu 4
INTV- an IV FIM

Otlia Radacina , Teza

doctorat, UPB,2013

Citotoxicitate (in vitro)

M. Hamzeh, G.I.
Sunahara / Toxicology in
Vitro 27 (2013) 864–873

NP
penetreaza
memberana
celulara

NP formeaza
aglomerari si
NU
penetreaza
memberana
celulara

Fig. 1. Imagini microscopice: a) celule pulmonare hamster (control); celule tratate cu 100 mg/L: b) TiO2 (100%
anatas, d=5.9 nm); c) TiO2 (100% anatas, d= 169,4 nm); d) TiO2 (coated) – tendinta aglomerare

10

A.Badanoiu 5
INTV- an IV FIM

M. Hamzeh, G.I.
Efect asupra ADN (genotoxicitate) Sunahara / Toxicology in
Vitro 27 (2013) 864–873

“DNA tail”

Fig.2.Imaginea microscopica a nucelului celulelor (commet assay) a) Celula control; b)

celule tratate cu 100 mg/L TiO2 anatas, d=5.9nm; c) TiO2 (83% anatas+17% rutil
d=34.1 nm), d) nanofilament – rutil d=15.5 nm, e) 100% anatas d=169,4 nm, f) “coated”
nano TiO2, (b,c,d,e, - 24 ore expunere)

11

Aprecierea ROS (specii reactive de oxigen) –

tratare cu o subst. care penetreaza membrana celulara si formeaza cu speciile ROS un
compus fluorecent (dichlorofluorescein)

M. Hamzeh, G.I.
Sunahara /
Toxicology in Vitro 27
(2013) 864–873

Fig.3.Imagini microscopice ale probelor; a) etalon ( celule tratate 10 min. cu H2O2); celule in
contact(24h) cu 100 mg/L TiO2:b) anatas, d=5.9nm; c) 83% anatas+17% rutil, d=34.1 nm, d)
nanofilament – rutil d=15.5 nm, e) 100% anatas d=169.4 nm, f) “coated” nano TiO2

12

A.Badanoiu 6
INTV- an IV FIM

Studii in vivo-nano TiO2

Chang et al. Nanoscale Research Letters 2013, 8:51
http://www.nanoscalereslett.com/content/8/1/51

Cea mai mare parte dintre studiile “in vivo” pun in

evidenta cea mai mare concentratie de NP (nano-TiO2)
in ficat si rinichi

13

Scientific Committee on Consumer Safety,

European Commision, 2013
OPINION ON Titanium Dioxide (nano form)
Efecte cancerigene – in cazul inhalarii (spay)
Nu exista suficiente elemente care sa confirme un
efect negativ in cazul expunerii dermale (piele
sanatoasa) in urmatoarele conditii:
conc. max 25% (din care anatas max 15%)
puritate>95%
nanoparticule cristaline cu dim. 30-100nm
sunt fotostabile in formularea finala
nu au activitate fotocatalitica mare (max.10%)
pot fi acoperite (“coated”) – ex: cu silice, alumina, acid
stearic, stearati etc.

14

A.Badanoiu 7
INTV- an IV FIM

Efectul asupra tesuturilor vii

Nano ZnO

15

ZnO
Foma cristalina - wurtzite

Zn

16

A.Badanoiu 8
INTV- an IV FIM

Nanostrucuri ZnO

http://www.materialsviews.com
/using-nanocrystals-to-predict-
metal-fatigue/

17

Nano-ZnO
Oxidul de zinc nanometric este foarte puţin solubil
după intrarea în organism (pH >7), dar poate fi
ionizat pentru a elibera Zn2+, care poate intra în
celule prin canalele ionice.
Zn2+ poate intra în fluxul sanguin şi:
poate distruge metabolismul celular

celulele produc mari cantităţi de specii reactive de oxigen (ROS)

Eliberare de degradarea
reducere a funcţiilor
lactatdehidrogenaza ADN
mitocondriale
(LDH)
http://www.youtube.com/w apoptoza
atch?v=i8c5JcnFaJ0

18

A.Badanoiu 9
INTV- an IV FIM

Toxicitate ZnO
ZnO LD50>TiO2 LD50
Valoarea LD50 este definită ca dozajul de
nanoparticule de oxid dovedit a fi fatal la 50 % din
bacteriile/liniile celulare utilizate.

19

Studii in vitro Dimensiune

medie
cristalit
16-17 nm

G0/
G1

Replicare defectuoasa a celulelor

Otlia Radacina , Teza
doctorat, UPB,2013

20

A.Badanoiu 10
INTV- an IV FIM

Bolcarea celulelor in
faza G1
efect anti-proliferativ

Fig.4.Reprezentarea grafică a rezultatelor de citometrie în flux obţinute în urma

tratamentului celulelor MSC cu soluţii de nanoparticule de ZnO, concentraţie 1mg/ml.
Otlia Radacina , Teza
doctorat, UPB,2013

21

Fig.5.Evidenţierea eficienţei experimentului de clonare (imagine stânga), a viabilităţii

(imagine mijloc) şi morfologiei (imagine dreapta), a celulelor stem mezenchimale (MSC)
tratate cu ZnO_P_700_0,05 M (sus) si ZnO_P_600_0,1 M (jos)

Otlia Radacina , Teza

doctorat, UPB,2013

22

A.Badanoiu 11
INTV- an IV FIM

Forma nano-ZnO
ZnO-RT,
lungime=18.0±4.2 nm

ZnO-60,
lungime=80.5±6.8 nm

Fig.6.Nano particule TiO2 (bastonase

“rods”)
S.J. Park et al. / Toxicology Letters 207 (2011) 197– 203

23

S.J. Park et al. / Toxicology Letters 207 (2011) 197– 203

Fig.7.Citotoxicitatea nano-TiO2:
a) ZnO-RT, lungime=18.0±4.2 nm
b) ZnO-60, lungime=80.5±6.8 nm

Efect negativ mult mai intens a

baghetelor cu dimensiuni mai
mari asupra viabilitatii celulelor

Formare ROS

24

A.Badanoiu 12
INTV- an IV FIM

Fig 8.Efectul nano ZnO (d med=50nm) asupra ROS (GSH, SOD – markeri
ROS)
L02- celule
hepatice umane
HEK293-celule
embrionale Reducerea nivelului de GSH si SOD cu cresterea
rinichi concentratiei solutiei care contine nano ZnO
sugereaza conditii de stres oxidativ in celule
(neechilibru)

R.Guang et all, Nanoscale

Research Letters 2012, 7:602

25

Genotoxicitate nano ZnO R.Guang et all, Nanoscale

Research Letters 2012, 7:602

Fig. 9.Influenta nano ZnO asupra

modificarilor ADN ( comet
assay)
a) Celule hepatice
b) Celule rinichi

26

A.Badanoiu 13
INTV- an IV FIM

Studii in vivo

Broaste - Xenopus laevis- efectul nano-ZnO

asupra organogenezei (embrioni)
S-a urmarit:
Mortalitate
Malformatii
Lungimea tractului digestiv (SVL)
Lungime totala corporala (TBW)
S. Nations et al. / Chemosphere 83 (2011) 1053–1061

27

S. Nations et al. / Chemosphere 83 (2011) 1053–1061

(intenstin)

Fig.10.Procentul de malformatii determinate

de expunerea la nano-ZnO

Efect negativ asupra vietii acvatice!

Fig.11.Efectul asupra lungimii tractului

intestinal (SVL) si lungimii totale corporale
(TBL) determinat de expunerea la nano-ZnO

28

A.Badanoiu 14
INTV- an IV FIM

Scientific Committee on Consumer Safety,

European Commision, iulie 2013
OPINION ON Zinc Oxide (nano form)
Se pot folosi ca filtre UV nano-particule de ZnOdaca
indeplinesc urmatoarele conditii:
puritate>96% (impuritatile admise fiind CO2 si apa si
sub 1% alte impuritati)
nanoparticule cristaline sub forma de clusetri, baghete,
forma de stea
diametru mediu D50(50% din particule au dimensiuni
mai mici)=30nm si D1=20nm
solubilitatea sa fie mai mica de 50 mg/l
pot fi acoperite (“coated”) cu diferiti produsi acceptati
pentru produsele cosmetice

29

A.Badanoiu 15
INTV- an IV FIM

Interactiunea
nanoparticulelor cu
tesuturile vii

Prof. Alina Badanoiu

Efectul asupra tesuturilor vii

Nano CuO

A.Badanoiu 1
INTV- an IV FIM

Cu si CuO
Cu – important pentru metabolismul uman
Toxic in cantitati mari – poate forma specii
oxidante reactive (ROS) si are efect
genotoxic
Crestere continut Cu in organism:
Alimentatie
Poluare (nano CuO)
Provenienta CuO in mediu – cataliza, aditivi
antimicrobieni, pigmenti

A.Semisch et all,Particle
and Fibre Toxicology
2014, 11:10

Fig 12.Imagine SEM a CuO

a) Nano CuO NP –dmediu=55nm
b) Micro CuO MP dmediu=1289nm

A.Badanoiu 2
INTV- an IV FIM

Solubilitatea CuO in diferite medii

A.Semisch et all,Particle
and Fibre Toxicology
2014, 11:10

Fig.13 Solubilitatea nano si

micro CuO in medii cu diferite
pH-uri;
H2O –apa distilata ultrapura
(pH=7)
AAF –solutie artificiala alvelora
(pH=aprox.6.5)
ALF-solutie artificiala
lizozomala (pH=4.5)

Pocesul de endocitoza
(inertizare) are loc in
lizozozmi

Schema unei celule animale tipice, indicând componentele subcelulare.

Organitele sunt (1) nucleu (2) nucleol (3) ribozom (4) veziculă (5) Reticul
endoplasmatic rugos (R Er) (6) aparatul Golgi (7) citoschelet (8) Reticul
endoplasmatic neted (R En) (9) mitocondrie (10) vacuolă (11) citoplasmă
(12) lizozom (13) centriolă
Wikipedia

A.Badanoiu 3
INTV- an IV FIM

A.Semisch et all,Particle
and Fibre Toxicology
2014, 11:10

Fig. 14.Continutul
de Cu determinat in
citoplasma (a) si
nucleul (b) celulelor
aflate in contact cu
nano si micro CuO
si solutie de CuCl2

Continutul ridicat de Cu in
interiorul celulei poate
determina cito- si geno-
toxicitate

S. Nations et al. / Chemosphere 83 (2011) 1053–1061

Studii in vivo

Fig.15.Procentul de malformatii determinate de expunerea la

nano-CuO (d=23-37 nm)

Fig.16.Efectul asupra lungimii tractului intestinal (SVL) si lungimii Fig.17.Prezenta particulelor de nano-CuO in
corporale (TBL) determinat de expunerea la nano-CuO intestinele embrionului (Xenopus laevis )

A.Badanoiu 4
INTV- an IV FIM

Concluzii
Cito- si geno-
toxicitatea nano CuO
mai putin studiata
comparativ cu alti
nano-oxizi
(TiO2,ZnO)
Efectul negativ
asupra tesuturilor si
organismelor vii al
nano-CuO important

Efectul asupra tesuturilor vii

Nano Ag

10

A.Badanoiu 5
INTV- an IV FIM

Efectele nano-Ag
Contact cu pielea schimbarea culorii pielii
(nuanta gri sau albastruie) depunere
Ingestie (terapie neconventionala a artritei
sau cancerului) argrya

Argrya Argryosis – schimbarea culorii ochilor

http://www.anatomybox.com/blue-man/
http://scienceblogs.com

11

Systemic argyria associated with ingestion

of colloidal silver

Argrya Akhil Wadhera MD and Max Fung MD

Dermatology Online Journal 11 (1): 12

Particule de Ag se
gasesc in piele in derma
si special in glandele
sudoripare

Biopsii – piele

12

A.Badanoiu 6
INTV- an IV FIM

Consecinte ale ingerarii nano-Ag

Absorbite in intestinul subtire inflamatii si
ulceratii,
Trecere in fluxul sanguin complex cu
albumina concentrare in creier, muschi (in
corelare cu aportul sanguin)

13

14

A.Badanoiu 7
INTV- an IV FIM

c)

Fig. 1. Imagini TEM (a), SAED (b) SEM (c) şi distribuţia granulometrică (d) ale
pulberilor de Ag obţinute prin metoda pirosol tratate la 650°C

Otlia Radacina , Teza doctorat, UPB,2013

15

Fig.2. Evidenţierea eficienţei experimentului de clonare (imagine stânga), a

viabilităţii, (imagine mijloc) şi morfologiei (imagine dreapta), a celulelor stem
mezenchimale (MSC) tratate timp de 24h, la 37°C, 5% CO2 cu
Ag_P_650°C (sus) respectiv Ag_P_700°C (jos)

Otlia Radacina , Teza doctorat, UPB,2013

16

A.Badanoiu 8
INTV- an IV FIM

Efectul nano –Ag asupra celulor MSC

Efect toxic – afecteaza:
procesul de clonare
viabilitatea si morfologia celulelor

17

In Vitro Cytotoxicity of Nanoparticles in Mammalian Germline Stem Cells.Laura Braydich-Stolle, Saber

Hussain, John J. Schlager, Marie-Claude Hofmann, Toxicol Sci. Dec 2005; 88(2): 412–419.

Modificare
structura

Necroza
si
apoptoza
(sageti) Acumulare in
citoplasma,
agregate care
nu patruns in
nucleu

Fig.3. Morfologia liniei celulare C18–4 (celule stem spermatogenice) dupa incubare timp de 48
de ore cu diferite nano-particule: a) Control, b) oxid de cadmiu (10 µg/ml), c) Ag—15 nm (10
µg/ml), d) Al—30 nm, 10 µg/ml).e) Oxid de molibden (MoO3—30 nm, 10 µg/ml).

18

A.Badanoiu 9
INTV- an IV FIM

Endocitoza

Modificarea
proceselor
mitocondriale

Cytotoxicity and Genotoxicity of Silver Nanoparticles in Human Cells,P. V. AshaRani, Grace Low Kah Mun,
Manoor Prakash Hande, Suresh Valiyaveettil , ACS Nano, 2009, 3 (2), 279–290
19

Efectul asupra tesuturilor vii

Nano- Au

20

A.Badanoiu 10
INTV- an IV FIM

http://www.mi2g.com

Nano-Au coloidal – culoarea este diferinta in functie de dimensiunea

nano particulei (NP) si concentratie

http://www.horiba.com

21

Aplicatii Nano-Au
Protectia mediului
Catalizatori
Energie ”curata” – celule electrice
Electronica
Medicina - detectia si tratamentul cancerului
Hipertermie
“Nano-carier” pentru medicamente

22

A.Badanoiu 11
INTV- an IV FIM

protein

Fig.4. Aplicatiile medicale ale nano_Au (GNP)

F.K. Alanazi et al., Biopharmaceutical applications of nanogold, Saudi Pharmaceutical Journal (2010) 18, 179

23

Interactia cu tesuturile vii

Tab.1 Studii in vivo si in vitro nano-Au (Makoto et all, 2010)

In vivo

In vitro

24

A.Badanoiu 12
INTV- an IV FIM

Fig.5. NP intrate in fluidul extracelular sunt acoperite cu biomolecule (protein corona).

Patrunderea in celula este poate avea loc in mod “pasiv” prin transport prin membrana
celulara sau “activ” – mediata de recepotori (endocitoza)
25

Citotoxicitatea nano-Au
Depinde de dimensiunea NP
NP de dimensiuni mai mari (10-100nm) sunt
internalizate prin “fagocitoza” – au o suprafata
mai mare si intra in contact cu mai multi
“receptori”
NP de dimensiuni mai mici (<10nm) se
acumuleaza initial in membrana si intra apoi
“gradual” in regiunea intracelulara

26

A.Badanoiu 13
INTV- an IV FIM

Influenta dimensiunii particulelor de nano-Au

QD 8nm
HELA
cells

DHLA-Au
3.3. nm
HELA
cells

Polystiren
100 nm
MSC cells

Fig.6. Modul de internalizare a NP de diferite dimensiuni

(Shang et al. Journal of Nanobiotechnology 2014, 12:5)

27

Influenta naturii liganzilor

Fig. 5. Nanoclusteri de Au cu liganzi de tipul trifenilfosfide

Yu Pan et al., Size-Dependent Cytotoxicity of Gold Nanoparticles, DOI: 10.1002/smll.200700378

28

A.Badanoiu 14
INTV- an IV FIM

GNP
1.2 nm
Ligand
TPPMS

GNP
GNP 1.2 nm
1.4 nm Ligand
Ligand TPPTS
TPPMS

Fig. 6. Imagini microscopice a celulelor HeLa (celule epiteliale de

carcinom crevical ) netratate (G) si tratate cu clusteri pe baza de
nano-Au (H-J)

Yu Pan et al., Size-Dependent Cytotoxicity of Gold Nanoparticles, DOI: 10.1002/smll.200700378

29

Yu Pan et al.,
Size-Dependent
Cytotoxicity of
Gold
Nanoparticles,
DOI:
10.1002/smll.200
700378

Fig.7. Imagini microscopice (vizibil si de fluorescenta) a celulelor HeLa netratate(B, A)

respectiv tratete cu nanoclusteri cu GNP (C,D).
Culoare verde – apoptoza, culoare rosie -necroza
30

A.Badanoiu 15
INTV- an IV FIM

Concluzii studii in vitro

Citotoxicitatea nanoparticulelor de Au (GNP)
depinde in principal de dimensiunea acestora
Citotoxicitatea nanoparticulelor de Au (GNP)
este in principal determinata de patrunderea
in celula prin procesul de endocitoza

31

Studii in vivo
3 nm 5 nm 8nm 12 nm

17 nm 37 nm 50 nm
100 nm

Fig. 7. Imagini TEM ale nano particolelor de Au (GNP) cu diferite dimensiuni

Yu-Shiun Chen et al, Nanoscale Res Lett (2009) 4:858–864

32

A.Badanoiu 16
INTV- an IV FIM

Studii in vivo
GNP s-au injectat intraperitoneal unor soareci de
laborator (BLB/C) doza 8µg/kg/saptamana
Soarecii injectati cu GNP de dimensiuni:
3,5,50,100 nm s-au comporat normal si au
suprevietuit intregii perioade de tratament;
Soarecii injectati cu GNP de dimensiuni:
8,17,12,37 nm au prezentat simptome de
intoxicare (inclusiv schimbarea coloratiei blanii) si
incepand cu ziua a 14-a de tratament au prezentat
umflaturi importante pe spate si deformari ale
coloanei vertebrale.

33

Timpul mediu de supravietuire

(L50- perioada de timp pana la care au au supravietuit mai
mult de 50% dintre subiecti)

Yu-Shiun Chen et al, Nanoscale Res Lett (2009) 4:858–864

34

A.Badanoiu 17
INTV- an IV FIM

Modificari
anormale
ale unor
organe

Fig.8 Examene histopatologice ale ficatului, plamanului si splinei

(ex-vivo) pentru subiectii care au murit
Yu-Shiun Chen et al, Nanoscale Res Lett (2009) 4:858–864

35

Concluzii
Studiile in vivo si ex-vivo confirma
dependenta toxicitatii GNPs de dimensiunea
particulelor
GNPs cu dimensiuni intre 8-37nm determina:
Cresterea numarului de celule macrofage in
ficat – raspuns la prezenta unor toxine
Modificari ale plamanului – emfizem
(pierderea elasticitatii alveolelor)
Modificarea structurii splinei

36

A.Badanoiu 18
INTV- an IV FIM

Nanoparticule de oxid de ceriu

Structura CeO2
Structura de tip fluorit
Temperatura mare de topire – 2400oC

Ce4+

O2-

1
INTV- an IV FIM

Utilizari- Nano oxid de ceriu

Materiale pentru polisare/lustruire ecrane
electronice, sticla optica etc.
Absorbanti – folositi pentru indepartarea
metalelor grele din sisteme apoase
Catalizatori pentru combustibili automobile -
disel creste eficienta de combustie si scad
emisiile de pulberi (funingine)
Farmacologie- tratamentul bolilor determinate
de ROS (diabet, cancer, boli autoimune, etc.)

Fig.1. Continutul de oxid de

ceriu (NP) internalizat de o
linie celulara pulmonara -
(A549)
Expunerea a fost sub
forma de aerosoli

Nano-CeO2 in
membrana apicala

Dupa 10 min 35% din NP de oxid

de ceriu se gasesc in interiorul
celulei

Nano-CeO2
in
membrana
Dupa 30 min 60% din NP de oxid
apicala
de ceriu se gasesc in interiorul
celulei si in
vezicula

2
INTV- an IV FIM

Fig. 2. Viabilitatea celulara ( A549- celule cancerigene-carcinom pulmonar)

dupa 1-3 zile expunere la doze diferite de nano-CeO2 ( d=20nm)

Fig. 3. Activitatea LDH in mediul de cultura celulara ( A549) dupa 3 zile de

expunere la doze diferite de nano-CeO2 ( d=20nm)

Cresterea nivelului activitatii LDH sugereaza o crestere a numarului de

celule carora li s-a rupt membrana – moarte celulara

3
INTV- an IV FIM

Nivelul GSH se
reface dupa 3 zile de
expunere

3 zile de expunere Fig.4. Nivelul GSH (a)

b si α-tocopherol (b) in
functie de dozajul
nanoparticulelor de
CeO2 si timp de
expunere

GSH si α-tocopherol
sunt 2 antioxidanti
importanti.

Caputo et. all, considera ca NP de CeO2 pot avea influenta

pozitiva – pot reduce continutul de specii reactive de oxigen-
ROS

SOD (superoxide
dismutase) si
Catalase =
enzime cu
proprietati
antioxidante
Defectele de
suprafata – reduc
superoxidul la
H2O2

Ce3+ oxideaza
H2O2 la O2 si 2 H+

4
INTV- an IV FIM

Capacitate antioxidanta a NP de oxid

de ceriu
Activitate anti-cancerigena
Medicamente anti-obezitate – pot reduce
genele (mRNA) implicate in producerea de
celule/tesut adipos
Cicatrizarea ranilor – reducerea stresului
oxidativ, proliferarea fibroblastelor sau
celulelor vaculare endoteliale
Tratarea unor patologii neurodegenerative

Toxicitatea nano oxidului de ceriu

Moduri de expunere (in vivo test):
Instilatii intratraheale
Injectii intravenoase si intraperitoneale
Ingestie (aditiv alimentar)

EFECTE:
Acumulare in diferite organe: inima, plaman,
creier, ficat
Determina inflamatii
Hepatotoxicitate – in functie de doza
(7mg/kg) -soareci
10

5
INTV- an IV FIM

CITOTOXICITATE
Linie celulara – carcinom pulmonar
penetreaza membrana si ajung in citoplasma
determina apoptoza/necroza celulelor
maligne
Linie celulara (HepG2) – carcinom ficat
Influenta formei particulelor de CeO

11

Nanoparticule de CeO2

Suprafata 18.9 m2/g 29.9 m2/g 83.2 m2/g

specifica
Fig.6. Nanoparticule de CeO2 cu morfologie diferita: (A) – cubice; (B)-
octaedrice; (C)- baghete

12

6
INTV- an IV FIM

Efect negativ – modificare forma, apoptoza

Cel mai intens

Fig.7. Microfotografii ale liniei celulare HepG2 inainte (control) si dupa punerea
in contact cu 50 µg/ml nanoparticule de CeO2 cu morfologie diferita

13

Agregate de
CeO2 NP
prezente in
lizozomi si
citoplasma
(internalizate
prin
endocitoza)

Fig.7. TEM ale linei celulare HepG2 dupa punerea in contact 24 h cu 50 µg/ml
nanoparticule de CeO2 cu morfologie diferita; (A) – cubice; (B)- octaedrice; (C)-
baghete

14

7
INTV- an IV FIM

Concluzii studiu
Toxicitatea nanoparticulelor de CeO2 depinde
de doza
Cea mai mare citotoxicitate o au particulele
cu forma cubica (cu cea mai mica suprafata
specifica)
Nanoparticulele de CeO2 sub forma de
baghete au avut cea mai bun efect
antioxidant.

15

Genotoxicitatea CeO2

Fig.8. Imagini TEM ale CeO2 – a) nanoparticule dmediu=23.2nm (NPs) si

b) microparticule dmediu=3.26 µm (MPs)

16

8
INTV- an IV FIM

Test in vivo- Wistar rat – femele – ingestie apa cu

NPs sau MPs (1000 mg/kg)
“Commet assay” – pe celule prelevate din ficat

Control CP- Control pozitiv-

– apa deionizata cyclophosphamide

Fig.9.Genotoxicitatea CeO2 (Nanoparticule-NP si microparticule MP) – commet

assay

17

Concluzii studiu
CeO2 MP nu prezinta reactii adverse pentru
dozajele studiate
CeO2 NP prezinta genotoxicitate si
citotoxicitate doar pentru dozaje mari
(1000mg/kg)
Expunerea la CeO2 NP determina necroza
hepatica si alterarea tesutului din rinichi
Bioacumularea CeO2 NP este mai mare
decat a CeO2 MP

18