Metode de detectare rapidă a contaminării microbiene

 Detectarea rapidă a microorganismelor de alterare în lanțul de producție și prelucrare

a alimentelor este critică indiferent de sistemul utilizat sau implementat. Cu toate acestea,
există diferite niveluri de detectare, care pot fi necesare de la un simplu da / nu la date
cantitative pentru a satisface cerințele legislative . Astfel, este nevoie de instrumente
comerciale care să fie rapide, dar relativ ieftine pentru detectarea contaminanților microbieni
in produsele alimentare. O gamă de metode a fost dezvoltată bazându-se pe proprietățile
biochimice și fizice ale micoorganismelor. 

1. Metode convenționale

Metodele convenționale de detecție microbiană utilizate în industria alimentară au o

serie de dezavantaje, incluzând o intensitate a forței de muncă, consumatoare de timp și
uneori costisitoare. În plus, într-un cadru HACCP, acțiunile corective necesită analize în timp
real.

Metodele microbiologice clasice se bazează de obicei pe mai multe etape: izolarea;

identificarea și apoi, dacă este necesar, numărarea și bazarea unității care formează colonii în
principal pe markeri microbiologici și biochimici specifici.

Aceste metode necesită mult timp pentru a fi finalizate și au nevoie de un operator

calificat pentru a interpreta rezultatele, dar sunt sensibile și ieftine și oferă informații atât
calitative, cât și cantitative. Întrucât apariția agenților patogeni în alimente este de obicei la un
număr foarte mic, este necesară o etapă de îmbogățire inițială pentru a detecta
microorganismele contaminante .

1
 Metoda greutății uscate este cea mai simpla metoda utilizată pentru estimarea
biomasei. Greutatea uscată este utilizată pe scară largă pentru evaluarea biomasei în probele
de cultură de fermentație. Prin îndepărtarea volumului necesar, celulele sunt spălate fără
componente ale mediului și uscate până la greutate constantă, încălzindu-se într- un cuptor la
105ºC, răcite și ponderate. Această metodă poate fi aplicată numai probelor lichide care nu
conțin suspensii solide.

Alte metode, cum ar fi metoda de numărare viabilă (test de motilitate) sunt utilizate
pentru a estima populațiile microbiene. Această metodă se bazează pe creșterea celulelor fie
în mediu de cultură lichidă, pe un mediu agar sau pe filtre de membrană. Dilurea în serie a
probei se efectuează de obicei înainte de a răspândi proba pe placă sau de a filtra prin
membrană. Metoda impune incubarea plăcilor sau a culturilor la o temperatură de creștere
adecvată timp de 12-72 ore, în funcție de tipul de microorganisme analizate. Numărul de
colonii este contorizat și calculat ca o unitate formatoare de colonii (UFC/ml) obținută în
eșantionul inițial.

Dezavantajele acestei metode constă în timpul îndelungat de incubație necesar înainte

de obținerea rezultatelor, ceea ce este periculos în testarea alimentelor, deoarece alimentele ar
fi fost deja accesibile consumatorului. Metode standard precum NF EN ISO 11290-1 pentru
detectarea Listeria monocytogenes poate necesita 7 zile pentru identificarea coloniilor
vizibile.

HYCONÕ dip sunt echipamente portabile de imersie utilizate pentru a monitoriza

contaminarea microbiană în mostre de lichide și conțin diferite medii microbiologice pe
fiecare parte. Acest lucru poate fi fie scufundat în eșantion, fie strecurat.

Echipamentele portabile de contact, care conțin și medii de creștere selectivă, sunt

utilizate pentru detectarea contaminării pe suprafețe de bacterii, drojdii și mucegaiuri. Aceste
teste necesită un timp de incubație între 2-3 zile. Utilizarea de filtre de membrană de acetat de
celuloză extrem de poroasă (0,45 m) a fost de asemenea implementată în detectarea
microbiană. S-au folosit membrane care permit trecerea unui volum mare de probă de lichid,
dar care împiedică trecerea bacteriilor sau fungilor. Microorganismele reținute pe membrană
sunt incubate pe un mediu de agar specific și temperatura camerei corespunzătoare. Numărul
de colonii este ulterior contat pe filtru. Avantajul principal al acestei metode este volumul
mare de eșantion care poate fi aplicat pe aceste tipuri de filtre.

2
 Turbiditatea este de asemenea utilizată pe scară largă pentru estimarea celulelor în
suspensii prin utilizarea unui spectrofotometru. Capacitatea celulelor microbiene de a
împrăștia luminile și, prin urmare, de a apărea tulbure într-o soluție este utilizată în această
tehnică pentru a măsura concentrația celulelor. Lumina împrăștiată a unei suspensii
microbiene este proporțională cu numărul de celule prezente. Măsurătorile sunt efectuate de
obicei la 600 nm de analiză bacteriană folosind un spectrofotometru. Se folosește o curbă de
calibrare standard a logului Io / I față de numărul total sau de greutatea uscată. Curba de
calibrare se aplică numai unui anumit microorganism cultivat în condiții de creștere. Dar
aceasta tehnica nu este în măsură să diferențieze între celulele viabile și cele viabile. Park și
colaboratorii (1995) au utilizat analiza spectrofluorometrică pentru a detecta coliformele
totale și fecale în probele de apă.

Microscopia este, de asemenea, o tehnică importantă în diagnosticul

microorganismelor, deoarece permite vizualizarea celulelor cu ajutorul microscopului.

Cea mai importantă procedură de colorare în microbiologie este colorația Gram.

Folosind această metodă , morfologia celulelor bacteriene și reacția Gram pot fi examinate
prin utilizarea microscopiei de colorație Gram, care oferă informația dacă organismul este un
gram negativ sau un gram pozitiv bazat pe diferențele dintre pereții celulelor bacteriene .
Colorația Gram este o procedură rapidă care poate fi efectuată în câteva minute.

2. Tehnici de specialitate: epifluorescență (DEFT),

bioluminescență și numărarea particulelor

2.1 Microscopia fluorescentă este o metodă foarte rapidă pentru enumerarea

microbiană și nu necesită o etapă de incubație. Metoda de filtrare a epifluorescenței
directe(DEFT) a fost dezvoltată pentru detectarea contaminării microbiene în lapte și alte
produse lactate.

Principiul metodei este similar cu filtrarea membranei și durează aproximativ 25 min.

Metoda presupune re-tratarea eșantionului cu enzima tripsină și detergent (Triton X- 100)
pentru a descompune celulele somatice și conținutul globulelor de grăsime din lapte,

3
permițând-o să fie filtrată printr-o membrană de policarbonat, păstrând bacteriile prezente în
probă. Fluorocromul (portocaliu acridin sau diamidino -2-fenilindol) este adăugat la proba
filtrată pentru un timp de contact de câteva minute și apoi filtrat printr-o membrană de
policarbonat. Membrana este clătită cu același volum de probă de apă distilată și
microorganismele sunt numărate folosind microscopie epifluorescență. Sub lumina
ultraviolată, acidul dezoxiribonucleic (ADN) se identifică în culoarea verde iar acidul
ribonucleic (ARN) în portocaliu. Această metodă poate face diferența între microorganismele
active de cele inactive pe baza conținutului lor mai mare de ARN (Allen, 1990).

Sisteme precum Sistemul de Microbiologie Automat Bactoscan (Foss Electric,

Hillerød, Danemarca) au fost dezvoltate pentru detectarea bacteriilor în probele alimentare și
băuturi. Acest dispozitiv este rapid, cu aproximativ 60 - 70 probe efectuate în fiecare oră.
MicroFoss este un instrument ușor de utilizat și a fost utilizat în special în segmentele
de lapte și carne și oferă analize microbiologice rapide bazate pe creșterea
microorganismelor , modificarea pH-ului și indicarea coloranților. Produsele includ, de
asemenea, flacoane gata de utilizare pentru enumerarea numărului total viabil de
Enterobacteriaceae , Coliform , E. Coli și drojdie. MicroFoss a arătat capacitatea de a detecta
numărul de concentrații de 0,5 ml ml 1 în lapte. Utilizarea indicatorilor fluorescenti poate face
discriminări între celule viabile de celule non-viabile.

Anticorpii conjugați cu fluorocrom, cum ar fi iosthiocianatul de fluoresceină, au fost

folosiți pentru detectarea microbiană. Prin aplicarea pe eșantion a anticorpului marcat pentru
microorganismul țintă, microorganismul va fi fluorescent datorită formării complexului cu
anticorpul său marcat complementar. Numărul de celule fluorescente este apoi contorizat
folosind un microscop epifluorescent. Această metodă a avut aplicații mai largi în domeniul
estimării on-line a biomasei fermentatoare

2.2 Bioluminescența

Testul de bioluminiscență bazat pe adenozina 5 'trifosfat (ATP) este o metodă rapidă și

sensibilă utilizată pentru detectarea microbiană. ATP este molecula de energie pentru toate
celulele vii (animale, vegetale, bacterii, drojdii și celule de mucegai).

Măsurarea se bazează pe Luciferază utilizarea luciferază enzimei licurici:

luciferaza
Luciferină +ATP + O2 Oxyluciferină + AMP + CO2 + PPi + Foton

4
 Lumina este produsă în funcție de concentrația de ATP din eșantion, care poate fi
interpretată la conținutul microbian.

Mai multe instrumente au fost dezvoltate pe baza acestui principiu pentru estimarea
biomasei microbiene și, de asemenea, pentru testarea curățeniei și igienei. Produsele Clean-
Trace TM, cum ar fi instrumentele Biotrace Uni- Lite Õ și Uni- Lite Õ XCEL (Biotrace Ltd.,
Bridgend, Marea Britanie) sunt instrumente care folosesc principiul de mai sus.

Alte companii precum Celsis International plc (Suffolk, Marea Britanie) și Biotest
(New Jersey, SUA) comercializează, de asemenea, instrumente bazate pe această tehnologie.
Instrumentele ATP pot detecta, de obicei, un nivel scăzut de contaminare (103 celule /ml) și
sunt utilizate pentru testarea în fabricile de produse alimentare și lactate. La testarea
eșantioanelor de lapte, eșantioanele trebuie tratate în prealabil pentru a îndepărta ATP-ul non-
bacterian prezent în celulele somatice înainte de a putea fi efectuată analiza pentru
contaminarea microbiană a laptelui. Testele pot dura între 10-20 de minute, în funcție de
procedura care urmează să fie implementată în teste.

2.3 Numărarea particulelor

Principiul tehnicii se bazează pe trecerea unei suspensii de celule printr-o mică

deschidere care separă doi electrozi între care curge un curent electric (zona de detectare).
Impulsul generat de fiecare celulă este amplificat și înregistrat electronic, oferind un număr al
numărului de celule care curg prin orificiu.

Metoda Coulter pentru dimensionarea și numărarea particulelor se bazează pe

modificări măsurabile ale impedanței electrice produse de particulele neconductoare
suspendate într-un electrolit. În acest caz, celulele pot fi numărate în mediul în care cresc.

O serie de produse sunt disponibile în comerț, cum ar fi seria COULTER COUNTER1

Z1, (Coulter International Corporation, Miami SUA) și MultisizerTM 3 Coulter CounterÕ
(Beckman Coulter, Marea Britanie).

CellFacts I, dezvoltat și fabricat de CellFacts Instruments Ltd, Marea Britanie,

folosește de asemenea determinarea electrică a impedanței fluxului numărarea și mărimea
particulelor dintr-un eșantion. Principiul de analiză al CellFacts I constă în faptul că numără și
mărește fiecare particulă dintr-un eșantion introdus în instrument și oferă informații detaliate

5
despre starea microbiologică a acestui eșantion cu aplicații în cercetarea microbiologică și în
industria alimentară, biotehnologică, apă, cosmetică și farmaceutică.

Clarke și colab., au concluzionat că dispozitivele bazate pe densitometria de rezonanță

acustică ar putea oferi o determinare eficientă a biomasei în timp real și in situ a proceselor de
fermentație și în aval. Tehnica se bazează pe modificarea rezonanță acustică a unui volum fix
de cultură fermentator în timpul perioadei de fermentație datorită creșterii microbiene.

3. Tehnici specializate: citometrie în flux, microscopie

electronică și tehnici de imunotestare

3.1 Citometrie în flux

Citometria în flux este o tehnică puternică care permite utilizatorului să măsoare mai
mulți parametri într-un eșantion și este una dintre cele mai revizuite metode pentru detectarea
bacteriilor. Parametrii precum caracteristicile fizice, dimensiunea celulei, forma și
complexitatea internă pot fi examinate.

Principiul din spatele tehnicii se bazează pe faptul că un flux subțire de fluid care
conține celulele de interes este trecut printr - un fascicul laser. Biomasa este analizată prin
metode de împrăștiere a luminii și prin colorarea componentelor chimice precum ADN-ul.
Energia luminii este transformată într-un semnal electric prin utilizarea tuburilor
fotomultiplicatoare utilizate în citometria de flux pentru analiza stărilor microbiologice ale
laptelui și produselor lactate.

3.2 Microscopie electronică

A fost raportată utilizarea unui microscop electronic de scanare pentru numărarea

bacteriilor pe filtrele de membrană. Cu toate acestea, această tehnică are un cost ridicat în
ceea ce privește instrumentele și abilitățile de operator necesare.

6
 3.3 Tehnici de imunotestare

Imunodetecția cu anticorpi a fost folosită cu succes pentru detectarea celulelor

microbiene, virușilor și sporilor, Anticorpii pot fi produși cu ușurință pentru o serie de
microorganisme. Tehnicile de imunoanaliză au fost dezvoltate pentru detectarea microbiană,
folosind diferite etichete pentru a genera semnalul. Radioizotopii au fost primii utilizați, dar
enzimele au devenit mai atractive din cauza problemelor legate de costuri și de mediu.

Testele de imuno-test cu flux lateral, cum ar fi RapidChekTM pentru E. coli O157,

comercializate de SDI (Strategic Diagnostics Inc. Hampshire, Marea Britanie) pot detecta o
celulă în 25 de grame și a fost aprobată de AOAC RI pentru aplicații în carne de vită
măcinată, carne de vită dezosată și cidru de mere. Testul a fost validat și pe tampoane de
carcasă și păsări de curte și este disponibil pentru un timp de îmbogățire de 8 ore și timp de
testare de 10 min. De asemenea, SDI comercializează un RapidChekTM pentru Salmonella ,
cu timp de îmbogățire 24 de ore (timp de testare de 10 min).

ClearviewTM și REVEALÕ sunt o gamă de produse comercializate de Oxoid

(Basingstoke, Marea Britanie) și Adgen Ltd. (Ayr, Marea Britanie), respectiv pentru
detectarea E. coli O157, Salmonella și Listeria , pe baza aceluiași principiu folosit de SDI.
Testele pentru Campylobacter sunt de asemenea disponibile pe piață. Majoritatea
acestor teste se bazează pe izolarea și enumerarea bacteriilor înainte de detectare. Motivul este
că concentrația acestor bacterii în alimente (legume crude, lapte, brânză moale și mâncare
pregătită gata) sunt de obicei foarte mici pentru a fi detectate direct și trebuie izolată și lăsată
să se înmulțească la nivelul detectabil.

Testele imunosorbante legate de enzimă (ELISA) au fost utilizate pentru detectarea

infecțiilor microbiene în bolile veterinare, cu limita de detecție în intervalul de 103 celule /ml.
Testele ELISA pentru detectarea microbiană în eșantioane alimentare sunt, de
asemenea, comercializate de mai multe companii (de exemplu, laboratoarele Syva, SA; SDI ;
BioMérieux; Adgen). O serie de formate de testare a fost, de asemenea, dezvoltat, cum ar fi
imobilizarea anticorpului pe un suport solid de mărgele. Perlele sunt paramagnetice și pot fi
ușor separate de proba alimentară într-un câmp magnetic . Această etapă de separare va
elimina microorganismul contaminat țintă pentru proba de alimente. Perlele pot fi spălate și

7
fie folosite pentru a detecta microorganismul în urma procedurii Elisa, care durează 2 ore
pentru test sau re-suspendate și transferate pe o placă selectivă de agar, strecurate și cultivate,
dacă concentrația este scăzută pentru detectarea ELISA. Rezultatele în acest caz pot fi
obținute în 24-48 ore. Utilizarea mărgelelor paramagnetice a fost aplicată pentru detectarea
Salmonella, E. coli 0157 și Listeria în probele alimentare. Testele de imuno-test pot dura până
la 2 ore pentru a obține rezultatele, prin urmare nu este o procedură „în timp real”. Cu toate
acestea, automatizarea completă a testului poate fi realizată folosind gama de echipamente
disponibile pe piață pentru această aplicație. De asemenea, progresele anticorpilor
recombinanti și apariția receptorilor peptidici afișați de fagi și aplicarea lor în detectarea
agenților patogeni oferă o posibilitate crescândă de dezvoltare rapidă a metodelor.

4. Detectarea componentelor celulare: API, enzime

metabolizante și acizi nucleici

În literatura de specialitate sunt raportate metode de estimare a biomasei prin

măsurarea concentrației unei componente biochimice a microorgansmului vizat. Cu toate
acestea, prezența acestor compuși trebuie să fie detectată cu precizia adecvată, pentru a fi
utilizată pentru estimarea microbiană. Pentru o cuantificare microbiană au fost utilizate o serie
de compuși cum ar fi lipidele și derivații lor, carbon / fosfat celular, și azot / proteine totale.
Unele dintre aceste metode sunt dependente de fiziologia celulelor și, prin urmare, validitatea
lor poate fi discutabilă.

4.1 API

Kit-urile de test API sunt cele mai cunoscute teste biochimice pentru identificarea
microbiană . Testele API comercializate de BioMerieux Inc (Franța) conțin de obicei
aproximativ 20 de teste biochimice în miniatură, care pot detecta toate grupele bacteriene și
550 de specii.

Procedura implică inocularea fiecăruia dintre cele 20 de mini-test tuburi cu o

suspensie salină de cultură pură. Probele sunt apoi incubate timp de 18–24 ore înainte de
citirea schimbării de culoare. BioMerieux Inc. comercializează un sistem API bazat pe
8
detecția enzimelor (Rapidec). Testul este urmat fie de o schimbare de culoare direct, fie după
adăugarea de reactivi adecvați .

4.2 Enzime de metabolizare

Enzimele specifice au fost utilizate ca indicator pentru prezența microorganismelor

specifice . De exemplu, coliformele totale și E. coli conțin enzima „ galactosidaza” care poate
fi utilizată ca indicator al prezenței lor. E. coli conține, de asemenea, enzima glucuronidază,
care este utilizată pentru a indica prezența E. coli la probe. Diferite companii au implementat
analiza acestor două enzime pentru a dezvolta produse pentru detectarea microbilor. Palintest
Ltd. (Tyne and Wear, Marea Britanie) a produs testul Colilert, care este un test colorimetric
bazat pe detectarea acestor enzime prin interacțiunea lor cu substratul.Testele sunt capabile să
detecteze 1 CFU 100 mlÿ1 în 24 de ore de incubare. Enzimele catalază și oxidază au fost, de
asemenea, utilizate pentru a analiza contaminarea bacteriilor.

4.3 Acizi nucleici

Blocurile de construcție (acizii nucleici) ale ADN-ului și ARN sunt prezente în toate
celulele vii și pot fi utilizate ca un indicator general al biomasei microbiene.

Principiul testelor se bazează pe hibridizarea unei sonde caracterizate de acid nucleic

la o secvență specifică de acid nucleic într-o probă de test, urmată de detectarea hibridului
împerecheat. Utilizarea reacției în lanț a polimerazei (PCR) a fost frecvent aplicată pentru
detectarea microbiană pentru a spori sensibilitatea metodei bazate pe acid nucleic. Tehnica a
fost utilizată pentru analiza calitativă, dar măsurătorile cantitative sunt importante în analiza
alimentelor și au fost dezvoltate metode pentru a face testul cantitativ.

Utilizarea fluorometriei pentru analiza produsului PCR a fost implementată pentru

teste rapide și sensibile. Metodele PCR cantitative sunt dovedite a fi foarte sensibile cu o
limită de detecție de 10 celule mlÿ1 și a fost raportat un timp de analiză de aproximativ 3 h.
Metodele PCR au fost utilizate pentru a detecta virusuri, bacterii și protozoare, în
probele de apă și de alimente. Cu toate acestea, aceste metode pot fi costisitoare,
consumatoare de timp, necesită muncitori calificați și uneori complicate.

9
 Tehnica de protecție a hibridizării GEN-PROBE (HPA) folosește o sondă ADN
specifică, marcată cu o moleculă de detector de ester acridinium care emite un semnal
chemiluminescent. Două metode care au utilizat această tehnologie cu succes sunt
AccuProbeÕ și FlashTrak (Gen-Probe Incorporated, San Diego, SUA). În aceste sisteme
sonda ADN este orientată împotriva ARN ribozomal al organismului țintă.
Chimioluminiscența este apoi măsurată de luminometrul de gene. Această metodă a fost
dezvoltată pentru detectarea ciupercilor și a bacteriilor și durează 5 ore pentru a obține
rezultatele cu sensibilitate și specificitate 92 - 100%.

Molecular Devices Corporation (Sunnyvale, SUA), au dezvoltat produse pentru

testarea ADN-ului total, care pot fi aplicate pentru detectarea microbiană. Matricea ADN
comercializată de Affymetrix (Santa Clara, SUA), cum ar fi GeneChip E. coli Antisense
Genome Array este utilizată pentru examinarea expresieituturor genelor E. coli cunoscute .
Array GeneChip Yeast Genome S98 conține seturi de sonde pentru aproximativ 6.400 de gene
S. S. cerevisiae (tulpina S288C) identificate în baza de date a genomului Saccharomyces .
Tehnologia GeneChip poate fi utilizată în principal pentru spectrul larg de aplicații de analiză
a acidului nucleic, inclusiv analiza secvenței, genotiparea și monitorizarea expresiei genice.
Alte companii precum MediGenomix GmbH (Germania) se extind și în analiza ADN-ului
pentru testarea veterinară și alimentară.

5. Metode electrochimice: impedimetrie, conductivitate și

alte metode

5.1 Impedimetrie și conductivitate

Modificările conductivității ionice a mediului de cultură datorate creșterii microbiene

au fost utilizate pentru a măsura conținutul microbian. Măsurătorile de impedanță au fost
utilizate în dezvoltarea dispozitivelor microbiene. Bactometrul comercializat de BioMérieux
(BioMerieux Inc., Marcy-'Etoile, Franța) este unul dintre aceste instrumente bazat pe
tehnologia impedanței dovedite. Oferă un sistem rapid și rentabil pentru detectarea materiilor
prime stricate. Oferă teste cantitative și calitative, incluzând numărul total de

10
enterobacteriacee, coliforme, drojdie și mucegai. Sistemul Malthus (Malthus Instruments Ltd,
Bury, Marea Britanie) se bazează, de asemenea , pe detectarea microorganismelor prin
măsurarea schimbărilor în fluxul unui curent electric care trece printr-un mediu. Acest sistem
poate detecta o serie de microorganisme precum Coliformele , Salmonella , drojdia și
mucegaiul din alimente.

5.2 Tehnologia cu celule cu combustibil

Tehnologia se bazează pe conversia directă a energiei chimice în energie electrică.

Dispozitivul cu pile de combustie folosește un anod, un catod și unmediu de electrolit de
susținere pentru a conecta cei doi electrozi și un circuit extern pentru a utiliza electricitatea.
La Utilizarea microorganismelor pentru generarea de energie electrică a fost raportata o
îmbunătățire în urma incorporării ferrocianurii de potasiu sau benzochinona în soluție.

Pentru monitorizarea creșterii microbiene au fost utilizate dispozitive bazate pe

utilizarea sistemelor mediate și sisteme care nu sunt mediate. Sensibilitatea analitică a
metodei cu celule de combustibil a fost crescută prin utilizarea mediatorului fenosinei
etosulfat pentru detectarea E. Coli (limită de detectare de 4 106 celule/ ml) în 30 de minute de
testare.

5.3 Amperometrie

Tehnicile amperometrice au fost aplicate și la măsurarea biomasei microbiene, iar

sistemul de detectare se bazează pe măsurarea curentului care circulă prin electrodul de lucru
al unei celule electrice.

Pentru detectarea microbiană au fost aplicate mai multe dispozitive bazate pe

amperometrie. S-au utilizat mediatori Redox (cum ar fi hexacianoferratul de potasiu (III),
benzochinona și 2,6 diclorfenolindofenolul), care sunt reduse de micoorganisme ca urmare a
metabolismului substratului. Kaláb și Skládal (1994) au evaluat utilizarea diferitor mediatori
pentru dezvoltarea de bioelectrode microbiene amperometrice. Mediatoarele reduse difuzează
la electrodul de lucru unde este ulterior reoxidat. Fluxul curent măsurat s-a dovedit a fi
proporțional cu concentrația redusă de mediator și, prin urmare, concentrația microbiană.
Acest dispozitiv poate detecta 5 104 celule/ ml E. coli în 15 minute.

11
 Mai multe dispozitive au fost dezvoltate pe baza acestui principiu și instrumente
comerciale au fost, de asemenea, comercializate, dar apoi au fost retrase din cauza
reproductibilității slabe la testarea unei serii de microorganisme. Hitchens și colab. , (1993) a
măsurat activitatea bacteriană folosind amperometrie mediată într-un sistem de injecție cu
flux. Analizatorul Medeci (Medeci Developments Ltd, Harpenden, Marea Britanie) este în
curs de dezvoltare pentru aplicare medicală .

Dispozitivul se bazează pe utilizarea cu trei electrozi printați pe ecran configurație

încorporată într-un nou design de celule cu flux de jet de perete, cu măsurarea electrochimică
a concentrației bacteriene prin coulometrie hidrodinamică . Acest proces este similar cu
amperometria prin faptul că măsoară curentul, dar în loc de curent la un moment dat măsoară
curentul pe o perioadă de timp, de aici încărcarea totală trecută Pentru detectarea microbiană
au fost dezvoltate dispozitive bazate pe utilizarea electrodului de oxigen Clark.

5.4 Voltmetrie ciclică și cu undă pătrată

Un sistem cu trei electrozi care utilizează electrodul de lucru, electrodul de referință

(SCE sau Ag / AgCl) și contra electrodul (platină) au fost dezvoltați utilizând voltammetrie
ciclică (CV) pentru detectarea drojdiei și bacteriilor. A fost aplicată, de asemenea, aplicarea
coloranților pentru detectarea bacteriilor folosind voltammetria de undă pătrată (SWV) (Lafis,
1992). Au fost studiați coloranți precum carbocianină, 3,30- dihexiloxa - carbocianină și
safranină O cu concentrații în intervalul de 104 ... 108 celule /ml.

6. Imunosenzori:senzori amperometrici, potențiometrici,

bazati pe undă acustică și optică

Detectarea microbiană folosind configurația imunului și a senzorului de afinitate a fost

utilizată pentru o serie de microorganisme. Diferite tipuri de traductoare au fost, de asemenea,
aplicate în dezvoltarea acestor senzori pentru detectarea microbilor.

6.1 Senzori amperometrici

Detecția microorganismelor care utilizează traductorul amperometric este utilizată pe

scară largă și implică măsurarea curentului produs printr-un mecanism de oxidare / reducere

12
catalizat de enzimele microbiene. Traductoarele amperometrice au fost, de asemenea, aplicate
în format senzori de afinitate pentru a detecta micoorganisme în care markerul de anticorp
produce un semnal electrochimic. Pentru detectarea E. coli au fost utilizate dispozitive bazate
pe un flux, imunofiltrare și imuno-enzimă împreună cu un senzor amperometric. A fost
dezvoltat un imunosenzor canalizant al enzimei amperometrice și a fost capabil să detecteze
celule S. aureus în cultură pură la concentrații de 1000 celule/ ml.

Ivnitski și colab. (2000) a dezvoltat un imunosenzor amperometric bazat pe bicapa de

lipide plană pentru detectarea Campylobactor . Senzorii pentru E coli O157 ce folosesc
perlele paramagnetice au fost dezvoltați împreună cu detectarea electrochimică. Sistemul s-a
bazat pe analiza injecției de flux (FIA), detectarea bacteriilor viabile. Folosind o soluție ce
conține E. coli O157, răspunsul electrochimic cu diferiți mediatori ( hexacianoferrat de
potasiu (III) și 2,6-diclorfenolin-dopenol) a fost evaluat mai întâi în sistemul FIA. Dynabead-
urile derivate cu anticorpi au fost utilizate pentru a separa selectiv E. coli de matrice.
Separarea imunomagnetică a fost apoi utilizată împreună cu detectarea electrochimică pentru
a măsura concentrația bacteriilor viabile. S-a obținut o curbă de calibrare a unităților de
formare a coloniei (cfu) față de răspunsul electrochimic și a fost atinsă o limită de detecție de
105 cfu mlÿ1 în 2 ore de testare. Analiza injecției fluxului de cuplare cu configurația
imunosenzorului este foarte atractivă pentru dezvoltarea sistemului de detectare on-line și
mulți cercetători au utilizat acest sistem pentru detectarea alimentelor.

6.2 Senzori potențiometrici

Pentru detectarea microorganismelor a fost utilizat un senzor potențiometric care se

poate adresa la lumină (LAPS) bazat pe un tranzistor cu efect de câmp (FET). Senzorul este
bazat pe un semiconductor de siliciu și folosește anticorp ca receptor. Un LAPS disponibil în
comerț (ThresholdÕ Immunoassay System) comercializat de Molecular Devices (SUA)
folosește semiconductorul de siliciu și o enzimă generează semnal potențiometric (urează) ca
marker al enzimei. Acest sistem a fost utilizat de mai mulți cercetători pentru detectarea
celulelor microbiene. O concentrație de celule de 2,5 104 celule ml1 de E. coli O157: H7 a
fost detectată folosind acest sistem.

13
 6.3 Senzori pe bază de undă acustică

Dispozitive bazate pe unde acustice au fost aplicate pentru detectarea microbiană.

Acestea funcționează pe baza unui cristal oscilant, care rezoneaza la o frecvență
fundamentală. Anticorpii sau moleculele receptorului sunt de obicei imobilizați pe suprafața
cristalului, iar senzorul este apoi expus la proba care conține microorganismul de interes. O
modificare a frecvenței de rezonanță a suprafeței cristalului în legătură cu modificarea masei
este cuantificabilă și depinde de concentrația microbiană din eșantion .Aceste tipuri de senzori
oferă o analiză gratuită și on-line a microorganismelor.

Traductoarele cu unde acustice de masă pot fi clasificate în:

 dispozitive cu undă în vrac (BW)

 dispozitive cu undă acustică de suprafață (SAW).

Pe piață există de asemenea imunosenzorii cu cristale piezoelectrice pentru detectarea

enterobacteriei în apa de băut, biosenzori piezoelectrici pentru detectarea Salmonella
Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes, Legionella și E. coli care folosesc anticorpi ca
receptori.

6.4 Senzori optici

Traductoarele optice sunt de obicei foarte atractive, deoarece permit detectarea în timp
real și fără „etichetă” a microorganismelor.

Detectarea rezonanței plasmonice (SPR) și unda evanescentă (EW) au arătat o

promisiune în detectarea microbiană.

BIAcoreTM (BIAcore AB, Uppsala, Suedia) a fost aplicată pentru E coli de detectare
și de asemenea , pentru detecția bacteriilor din genul Salmonella și Listeria. Un număr mare
de instrumente sunt comercializate astăzi de BIAcore AB, care oferă grade diferite de
automatizare și costuri, iar acestea includ BIAcore 1000, 2000, 3000 și BIAliteTM, BIAcore
XTM, BIAQuadratTM, BIAcore S51 și BIAcore J. În aceste dispozitive, evenimentele de
legare sunt monitorizate între două molecule, cum ar fi un anticorp și antigenul acestuia (în

14
acest caz este celula microbiană) folosind tehnologia SPR . Detecția microbiană directă
folosind BIAcoreTM a atins o limită de detecție pentru E.coli O157: H7 de 5 107 UFC/ ml.

Sistemul IAsysÕ (Affinity Sensors, Cambridge, Marea Britanie), care este, de

asemenea, un biosenzor optic bazat pe o oglindă rezonantă, este utilizat pentru detectarea
microbiană prin imobilizarea anticorpului pe suprafața cipului. Compania comercializează
astăzi mai multe produse, printre care IASys plusTM și IASys Auto + AdvantageTM.

Dispozitivele optice așa cum sunt cele enumerate mai sus tind să utilizeze probe mici,
iar prezența microorganismelor în matricele alimentare complexe este problematică. Prin
urmare, este necesară o îmbogățire prealabilă (ca în ISO 11290-1) și imunoseparea sau o etapă
de concentrare pentru a îmbunătăți limita de detectare a senzorilor pentru detectarea
patogenilor.

7. Detectarea mucegaiurilor prin metode biochimice

S-a utilizat o mare varietate de metode pentru cuantificarea activității fungice în

materii prime, precum cereale și alimente procesate. Chitină, ergosterol, adenină trifosfat,
imunofluorescență, imuno-analize și sonde ADN au fost dezvoltate. Întrucât ergosterolul este
sterolul predominant în majoritatea ciupercilor care se strică (ascomicetele și deuteromicetele)
și nu se găsește la dăunătorii insectelor, acesta a fost utilizat pe scară largă ca indicator al dacă
s-a produs deteriorarea în lanțul alimentar.

Metoda a fost descrisă pentru prima dată de Seitz și colab. (1977) și acum poate fi
efectuată relativ rapid și de rutină folosind extracție simplă și HPLC. Prin urmare, a fost
utilizat pe scară largă pentru cuantificarea biomasei de ciuperci de stropire care a demonstrat
că aceasta se schimbă odată cu vârsta culturii. Cahagnier și colab. (1991) a sugerat că
conținutul de ergosterol din ciupercile de depozitare nu a fost afectat în mod semnificativ de
factori de mediu, cum ar fi aw. Astfel, ei au sugerat că ergosterolul ar putea fi utilizat ca un
„indice” al nivelului de biomasă fungică și a lungimii de depozitare a materiilor prime
alimentare.

15
 Tothill și colab. (1993) a determinat relația dintre conținutul de ergosterol, CFU și
modelarea microscopică și vizibilă, atât în boabe inoculate cât și naturale, în regimuri diferite
de temperatură și aw . Aceste studii au arătat că a existat o corelație pozitivă semnificativă
între conținutul de ergosterol și CFU-uri totale la 0,95 ore, în timp ce la cereale mai uscate de
0,85 ore nu a existat o corelație semnificativă. Cerealele inoculate cu specii individuale
( Alternaria alternata , Eurotium amstelodami , Penicillium aurantiogriseum ) la 0,95 / 0,85 și
25 ° C au arătat o corelație semnificativă între CFU și ergosterol, deși conținutul unei specii
individuale a variat considerabil.

Modele bidimensionale pentru creștere și producție de fumonisină au fost deja

dezvoltate (Marin și colab. , 1999), iar aceste informații pot fi utile în dezvoltarea ulterioară a
modelelor predictive pentru evaluarea riscurilor de contaminare cu toxina și contaminarea
alimentelor. Poate că modelarea producției cumulate de ergosterol prin ciuperci de deteriorare
și micotoxine asociate în raport cu aw, temperatura, timpul, compoziția gazelor ( stocarea în
atmosferă modificată ) și timpul poate permite o evaluare mai eficientă și mai precisă a
riscului de contaminare a mucegaiului și apariția de micotoxine pentru consumator.

8.1 Modificările enzimelor ca indicator al deteriorării alimentelor prin mucegai

Modificările concentrațiilor enzimelor alimentare, de exemplu amilazele, datorate

deteriorării fungice sunt importante, deoarece acestea au un impact asupra procesării și creării
pâinii calității făinii și aluatului. Fleurat-Lessard (2002) a sugerat că pentru o serie de materii
prime (cereale) modificările enzimelor sunt prea mici și apar prea târziu ca funcții ale
condițiilor de depozitare și durată, mai ales ca un indicator rapid al stricării.

Cu toate acestea, există un corp de lucru destul de mare care sugerează contrariul.
Ciupercile care colonizează materiile prime alimentare bogate, precum cerealele în condiții
favorabile de mediu produc o baterie de enzime hidrolitice pentru degradarea alimentelor.
Atât Flannigan, cât și Bana (1980) și Magan (1993) au arătat că aw și temperatura afectează
producția de enzime de ciuperci în timpul colonizării boabelor, incluzând celuloze,
poliacturonază , pectină metilesterază, 1-4 - glucanază, -glucozidaza, -xilozidaza și lipaze.
Jain și colab. (1991) au fost primii care au demonstrat că prin utilizarea substraturilor
cromogene de 4-nitrofenol într-un format ELISA , s-a putut efectua o cuantificare rapidă

16
pentru o serie de enzime hidrolitice , cu condiția să fie disponibile pentru acestea substraturi.
Ei au demonstrat că atât la cereale de orz, cât și la grâu la niveluri aw diferite (0,85, 0,90,
0,95), au fost produse creșteri semnificative ale N-acetil-D-glucozaminidazei în comparație cu
boabele recoltate uscate neformate.

Magan (1993) a extins acest lucru și a examinat cerealele uscate depozitate cu acelea
la niveluri diferite de temperatură și temperaturi de incubație. Acest lucru a arătat că o
schimbare semnificativă în producția unor enzime a fost evidentă în momentele de modelare
microscopică și vizibilă. Din șapte enzime examinate modificări semnificative ale -D-
glucoaminidazei, -D-glactozidazei și -D-glucozidazei au fost observate până la momentul
apariției creșterii microscopice. Lucrul cu matrice alimentare pe bază de porumb în regimuri
diferite de temperatură și aw inoculate cu Fusaria producătoare de fumonisină ( F.
verticillioides , F. proliferatum ) a demonstrat că atât activitatea totală cât și specifică a
enzimelor pentru -D-galactosidaza, -D-glucozidaza și N-acetil - D-glucozaminidaza s-a
schimbat semnificativ. Modificările ar putea fi monitorizate în termen de 72 de ore de la
stocare. Ei au sugerat, de asemenea, că aceste enzime ar putea fi utilizate ca un indicator
timpuriu al infecției alimentelor de către astfel de specii de mucegai și că aceste enzime au
fost importante pentru a permite colonizarea rapidă pe o gamă largă de factori de mediu.
Lucrări recente ale lui Keshri și Magan (1998) și Keshri și colab. (2002) au sugerat, de
asemenea, că enzimele hidrolitice similare sunt un indicator timpuriu al activității fungice in
vitro pe mediile pe bază de făină de grâu și în substraturile de pâine. Astfel, există acum
potențial pentru utilizarea unor astfel de formate relativ simple de analiză enzimatică pentru a
fi utilizate ca un posibil instrument pentru detectarea timpurie a activității fungice în
substraturile alimentare.

8. Nasuri electronice

În ultimii ani, dezvoltarea rapidă a tehnologiei senzorilor a permis producerea de

diferite formate de matrice de senzori care pot interacționa cu diferite molecule volatile.
Rezistența materialului este schimbată oferind un semnal care poate fi utilizat eficient ca
amprentă a volatilelor produse. Oxidul de metal , polimerul conducător și cristalele discotice
au fost toate utilizate în diferite formate de matrice pentru a încerca și obține calitativ și
semicantitativ informații despre și pentru a diferenția modelele de producție volatile produse

17
de microorganismele de stricare din matricele alimentare. Cu toate acestea, este important ca
rezultatele să fie combinate cu sisteme de analiză a datelor multivariate pentru a permite o
interpretare rapidă a tiparelor volatile și pentru a obține răspunsuri ușor de utilizat. Deși
majoritatea sistemelor electronice de nas sunt calitative pentru QA, nivelul de detaliu necesar
determină utilizarea instrumentului. Dacă este nevoie de un răspuns simplu / nu, atunci poate
fi foarte adecvat. Studii recente au demonstrat că evaluarea în timp real a materiilor prime
alimentare se poate face în cca. 10 minute pe probă pentru discriminarea mucegaiului din
cereale bune. Studiile recente au demonstrat, de asemenea, că discriminarea între pâinea
contaminată cu mucegai și cea necontaminată a fost posibilă în 24-30 de ore după inoculare,
înainte de orice creștere vizibilă și mai sensibilă decât testele enzimelor sau măsurările
populației UFC.

Studiile au sugerat, de asemenea, că, deoarece căile biochimice ale tulpinilor

producătoare de micotoxine ale unei specii pot diferi de tulpinile care nu produc, volatilele
produse pot diferi și ele.

Keshri și Magan (2000) au demonstrat că tulpinile micotoxigenice și non-

micotoxigenice din speciile Fusarium ar putea fi discriminate folosind modele de producție
volatile cu un nas electronic folosind o serie de senzori de polimeri conducători. Studii recente
au sugerat, de asemenea, că modificările populațiilor bacteriene din lapte și apă pot fi
detectate între 103104 CFU/ml.

Adoptarea acestei tehnologii a fost lentă din cauza problemelor de consistență și a

prețului tehnologiei. Cu toate acestea, pe măsură ce dezvoltarea tablelor de senzori devine mai
ieftină, potențialul de exploatare a acestei tehnologii ar trebui să se îmbunătățească rapid.

9. Concluzii

Datorită nevoii crescute de detectare a microorganismelor din alimente și alte aplicații,

multe concepte au fost dezvoltate și comercializate. Succesul oricărui instrument se bazează
pe nivelul de detectare și cost.

Detectarea și analiza contaminării microbiene este un domeniu foarte important în

siguranța alimentelor. Metodele clasice au de obicei o lungă perioadă de analiză, dar oferă o

18
sensibilitate bună. Celelalte metode mai recent dezvoltate pot da rezultate mai rapide, dar de
obicei suferă de sensibilitate scăzută. Cu toate acestea, până în prezent , nici o metodă unică
nu a fost complet satisfăcătoare în determinarea conținutului microbian.

Dezavantajele întâlnite de diferitele tehnici de detecție includ timp de răspuns lung,

lipsa de sensibilitate și costul ridicat al instrumentelor. Lipsa discriminării între biomasă
viabilă și non-viabilă poate duce la erori.

O serie de laboratoare contractuale oferă o testare microbiană completă, cu regimuri de

testare a caracterizării fizico-chimice a ingredientelor și aplicarea lor în produse alimentare și
băuturi, de la bancă la fabrica pilot până la fabricile.

19
 10.BIBLIOGRAFIE

1. Rapid detection methods for microbial contamination I. E. Tothill and N. Magan,

Cranfield University, UK

20