AISLAMIENTO Y CULTIVO DE HONGOS Y PSEUDOHONGOS

Universidad Nacional de Colombia sede Medellín

Objetivo: Dar a conocer los principales métodos para el aislamiento de hongos y su

cultivo en medios axénicos.

Materiales: medio Agar extracto de malta, hipoclorito de sodio al 1,5%, agua destilada
estéril, plantas con tizones foliares, muestra de suelo.

Introducción: El aislamiento de los microorganismos es frecuentemente el primer paso

para el diagnóstico de los agentes causales de enfermedades ó de especies de
importancia industrial, ecológica o biológica. Para esto el hongo debe ser separado del
tejido/sustrato al cual esta asociado y permitir su crecimiento en un medio libre de
contaminación. La escogencia del medio de cultivo apropiado es fundamental para tener
éxito en el proceso de aislamiento y debe cumplir entre otras las siguientes
características: a) permitir que el m.o. presente todas sus estructuras somáticas y
reproductivas, b) inhibir el desarrollo de m.o. no deseados y c) ser de fácil preparación.
Los medios puedes clasificarse en: naturales, semisintéticos y sintéticos.
• Medios Naturales: compuestos por materiales de composición desconocida
como partes esterilizadas de plantas y animales. Son necesarios para aquellos
hongos que requieren de factores nutricionales específicos que son sólo
aportados por su hospedante o por el sustrato sobre el cual se desarrollan.
• Medios Semisintéticos: compuestos por parte de materiales conocidos y parte
desconocida, como aquellos derivados de fuentes naturales como peptona,
extracto de levadura o extracto de malta etc.
• Medios Sintéticos: todos sus componentes son conocidos, por lo que son útiles
para estudios fisiológicos.
Dada la particularidad de los hongos, es necesario tener en cuenta los siguientes
aspectos para su cultivo:
• Crecen usualmente mejor en medios ricos en carbohidratos, aunque su exceso
inhibe la esporulación. A diferencia de las bacterias no son tan exigentes en
fuentes de proteínas, aunque lógicamente las requieren para su desarrollo.
 • Prefieren soluciones ácidas (pH 5.5 a 6.o), mientras que las bacterias prefieren
soluciones con pH cercanos a la neutralidad (6.8 a 7.2)
• Usan como medio solidificante agar en proporciones de 1,5 a 2%.
• Es posible suplementar los medios con soluciones que reduzcan el pH (ej: ácido
láctico) ó con antibióticos que inhiban el desarrollo bacterial.
• Su temperatura de incubación óptima corresponde a aquella presente en el sitio
del cual fue obtenido, sin embargo como regla general crecen bien entre 25 y
28°C.
• La esporulación de los hongos se ve muy favorecida por condiciones de alta
humedad y períodos alternos de luz/oscuridad. Es posible que algunos hongos
requieran de tratamientos especiales como colocar el medio bajo luz negra (360
nm) ó fluorescente.
Aislamiento de hongos: Existen dos fuentes básicas de contaminación durante el
proceso de aislamiento de hongos: la superficie del tejido/sustrato puede presentar
esporas ó células bacteriales contaminantes o la lesión inducida por el hongo puede
estar acompañada de saprófitos oportunistas que aprovechan la muerte de los tejidos ó
descomposición de sustratos recalcitrantes por parte del hongo. Para evitar esto, las
fuentes de aislamiento deben ser tratadas por esterilización externa y se deben tomar
tejidos de las regiones de crecimiento activo del hongo.
Cuando el aislamiento del hongo no se logra a través de la siembra directa del sustrato
sobre medio de cultivo, es necesario inducir la esporulación del hongo mediante el
empleo de cámaras húmedas. Estas se preparan ubicando el tejido/sustrato sobre una
retícula de plástico/vidrio que descansa en papel filtro/servilleta humedecido y con una
mota de algodón con agua. Esta cámara es cubierta (permitiendo intercambio gaseoso) y
al cabo de 3-6 días se observa la presencia de estructuras reproductivas del hongo, que
son transferidas al medio de cultivo respectivo.

Procedimiento: Cada grupo en la práctica realizará el aislamiento de hongos a partir de

dos fuentes: una muestra de tejido foliar con síntomas de enfermedades micóticas y una
muestra de suelos.
A partir de tejido foliar se ubican trozos de 0,5 cm2 con parte necrosada y verde,
previamente esterilizados superficialmente con hipoclorito por 1 min y lavados dos
veces en agua estéril, en los cuatro puntos cardinales de la caja, e incubándose a
temperatura ambiente durante 3 días. Adicionalmente se ubicarán trozos de tejido
vegetal sin tratar en el medio, con el fin de evaluar el efecto de la esterilización
supercial.

Luego de este tiempo, cada grupo caracterizará las colonias mediante la determinación
del diámetro promedio, su coloración, apariencia del micelio y presencia de estructuras
de esporulación/modificación hifal a partir de montajes en láminas portaobjetos con
azul de lactofenol.

Las muestras de suelo serán preparadas mediante diluciones seriadas hasta 1 x10-5,
siguiendo las instrucciones del laboratorio anterior, pero realizando las siembras en
medio Extracto de malta, que favorece el crecimiento de hongos. Se cultivarán las
diluciones 1 x 10 -1 y -5

Bibliografía.
Baudoin A.B.A.M. (editor). Laboratory exercises in plant pathology: An instructional
Kit. APS Press. 1988. pp. 3.1 – 3.5.

Castaño-Zapata Jairo. Prácticas de laboratorio de Fitopatología. Universidad de Caldas.

2 ed. 1998. 103 p.

Capuccino, James & Sherman, Natalie. Microbiology: A Laboratory Manual (8th Ed).
Benjamin/Cummings Science Publishing. 2007. 544 p.

ANEXO. Composición de medios de cultivo para hongos

AGAR EXTRACTO DE MALTA

Extracto de malta 20 a 25 g
Agar 20 g
Agua 1 lt
Este medio se puede suplementar con 20 g de sacarosa ó dextrosa y 1 g de peptona ó
extracto levadura para enriquecerlo y lograr el crecimiento de hongos más exigentes en
nutrientes.