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Artículo de investigación

Degradación de 4-clorofenol y diversidad microbiana en suelos inoculados con un solo Pseudomonas

sp. CF600 y estenotrofomona maltofila KB2

Agnieszka Nowak * * Agnieszka Mrozik

Departamento de Bioquímica, Facultad de Biología y Protección del Medio Ambiente, Universidad de Silesia, Jagiello. nska 28, 40-032 Katowice, Polonia

información del artículo resumen

Historia del articulo: La contaminación del suelo con clorofenoles es un problema grave en todo el mundo debido a su uso común en diferentes ramas de la
Recibido el 21 de julio de 2017 Recibido industria y la agricultura. El objetivo de este estudio fue determinar si se bioaumenta el suelo con un solo Pseudomonas sp. CF600 y estenotrofomona
en forma revisada 6 de marzo de 2018
maltofila KB2 y fuentes de carbono adicionales como el fenol (P) y el benzoato de sodio (SB) podrían mejorar la degradación del 4-clorofenol
(4-CP). Durante el experimento de degradación, se determinó el número de bacterias, así como la diversidad estructural y funcional de las
Aceptado el 12 de marzo de 2018
comunidades microbianas del suelo. Se encontró que la degradación más efectiva de 4-CP en el suelo se observó después de que se inoculó
con CF600 y la adición de SB. La biodegradación de fi cinco dosis de 4-CP en este suelo procedieron dentro de los 100 días. Al mismo tiempo,
la tasa de desaparición de 4-CP en el suelo que había sido bioaumentado con CF600 y contaminado con 4-CP y P fue de 5 mi 6.5 veces menor
Palabras clave:
en comparación con su tasa de desaparición en el suelo que había sido contaminado con 4-CP. La biodegradación de 4-CP en todos los
Biodegradación
Bioaugmentación suelos tratados y no tratados fue acompañada por una disminución sistemática en el número de bacterias heterotróficas (THB) que oscila entre
Supervivencia de bacterias 13 y 40%. También se demostró que los compuestos aromáticos probados afectaron la estructura de la comunidad microbiana del suelo a
Diversidad estructural y funcional. través de un aumento en los ácidos grasos marcadores para bacterias Gram negativas (BG-) y hongos (F). Los cambios esenciales en los
patrones de los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs) para el suelo contaminado incluyeron un aumento en la saturación de ácidos
grasos y la abundancia de ácidos grasos hidroxilados. Los resultados obtenidos también indicaron que la introducción de CF600 en el suelo
contaminado con 4-CP y SB o P causó un aumento en la diversidad funcional de los microorganismos del suelo. En contraste, en el suelo que
había sido inoculado con KB2 y en el suelo no inoculado, la adición de 4-CP y P disminuyó la actividad microbiana. En conclusión, la
inoculación de ambas cepas en suelo contaminado con compuestos aromáticos causó cambios irreversibles en la diversidad funcional y
estructural de las comunidades microbianas del suelo.

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1. Introducción uso generalizado y liberación al medio ambiente principalmente a través de la eliminación

El desarrollo de muchas ramas de la industria como la química, farmacéutica, textil, re fi nery y
paper así como la agricultura no serían posibles sin el uso de compuestos fenólicos como los
clorofenoles ( Igbinosa et al., 2013; Olaniran e Igbinosa, 2011 ) La demanda mundial de clorofenoles
se estima en más de 100,000 toneladas por año ( Veenagayathri y Vasudevan, 2013 ) Debido a su
toxicidad aguda, sospecha de propiedades cancerígenas y endocrinas disruptivas, sabor y olor
desagradables, el
inadecuada, desechos o ef accidental fl Los componentes causan muchos problemas ecológicos ( Igbinosa
et al., 2013; Sinkkonen et al., 2013 ) Además, la estructura de los clorofenoles, sus diferentes
propiedades fisicoquímicas, que dependen de parámetros ambientales como el pH o la temperatura,
dan como resultado su comportamiento diverso, biodisponibilidad y efectos impredecibles en los
ecosistemas contaminados ( Caliz et al., 2011; Spagnuolo et al., 2010 ) Esta es la razón por la cual la
Organización Mundial de la Salud (OMS), la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos
(USEPA) y la Unión Europea (UE) consideran que los clorofenoles son contaminantes prioritarios.
Para evitar el impacto negativo de los clorofenoles en el funcionamiento del suelo, la creación e
implementación de

** Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: agnieszka.a.nowak@us.edu.pl (A. Nowak).

https://doi.org/10.1016/j.jenvman.2018.03.052
0301-4797 / © © 2018 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
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regulaciones como la Estrategia Temática del Suelo de la Unión Europea requieren que sus estados
miembros preparen instrumentos regulatorios y económicos para monitorear, controlar y prevenir la
contaminación del suelo COM (2012) 46).
Existen varios métodos físicos y químicos para recuperar clorofenoles del medio ambiente,
incluida la adsorción en carbón activado y organoclays, intercambio iónico, oxidación y
descomposición térmica ( Busca et al., 2008; Hamad, 2014; Lakshmi et al., 2013; Nafees y Waseem,
2014 ) A pesar del alto ef fi La eficiencia de los procesos fisicoquímicos puede conducir a la formación
de intermedios que son más dañinos que la contaminación primaria. Además, los contaminantes
extraídos y el suelo incinerado deben tratarse más o eliminarse. En comparación con estos métodos,
sus partidarios consideran que la biorremediación, que implica bioaugmentación, es un proceso más
atractivo, ecológico, rentable, ahorrador de energía y menos invasivo que no introduce químicos
peligrosos adicionales en el medio ambiente ( Ghaly et al., 2013 ) Bioaugmentation es de fi Ned como la
mejora de la capacidad de degradación de las áreas contaminadas a través de la introducción de
microorganismos altamente concentrados y especializados. Generalmente se practica en suelos
donde la cantidad de microorganismos es insuficiente. fi o en el que las poblaciones nativas no tienen
las vías metabólicas necesarias para metabolizar los contaminantes. Aunque la bioacumulación se
ha aplicado con éxito en la práctica, su estandarización y eficacia sigue siendo problemática y es
objeto de una gran cantidad de estudios ( Baha fi d et al., 2017; Benyahia y Embaby, 2016; Ghaly et
al., 2013; Ma et al., 2015; Roy et al., 2014 ) Estos dif fi Las culturas resultan de la complejidad de las
condiciones locales edáficas y climáticas, que fuertemente fl Influir en los resultados de la
bioacumulación y la baja tasa de supervivencia de los inoculantes después de su inoculación en el
suelo contaminado. Además, el suelo a menudo está contaminado con una mezcla de sustancias
que tienen diferentes propiedades fisicoquímicas y biodegradabilidad, que requieren la selección
precisa de microorganismos que tengan la capacidad de degradación deseable ( Lagana et al., 2002;
Micha ł owicz, 2005 )
Independientemente del método que se utilice para la descontaminación de clorofenoles, al
acceder a la calidad y el funcionamiento del suelo tratado, es importante controlar la actividad y la
diversidad microbiana del suelo. Debido a problemas metodológicos, es imposible un proceso directo
para identificar y contar el número de especies en el medio ambiente. Por lo tanto, la Dirección
General de Medio Ambiente de la Comisión Europea en el Informe Técnico titulado " Biodiversidad del
suelo: funciones, amenazas y herramientas para los responsables políticos. " recomienda el uso de
indicadores como una forma de presentar y administrar información compleja de manera simple y
clara. También se ha dicho que estos indicadores deben ser significativos, estandarizados, medibles
y rentables. Por ejemplo, conteo directo, pro fisiológico a nivel comunitario fi Los archivos (CLPP) y el
análisis de ácidos grasos se enumeran como indicadores simples de la diversidad microbiana en el
suelo ( Turb e et al., 2010 ) Los CLPP indican la actividad de las enzimas individuales o la respiración
inducida por sustrato en una muestra de suelo y permiten evaluar la diversidad funcional de los
microorganismos que se están adaptando a las condiciones de estrés ( Golondrina y Quideau, 2015 )
A su vez, los análisis de los ácidos grasos de éster metílico (FAMEs) y los ésteres metílicos de
ácidos grasos fosfolípidos (PLFA) son útiles para evaluar cualquier cambio en la diversidad
estructural de los microorganismos del suelo en función de la abundancia de ácidos grasos
marcadores para Gram-positivos y bacterias gramnegativas, Actinomicetales y hongos ( Piotrowska-Seget inducir las enzimas que están involucradas en la descomposición de 4-CP en presencia de una
y Mrozik, 2003 ) Como muchos estudios han indicado, los microorganismos pueden alterar la
composición e integridad de sus lípidos de membrana en respuesta a diversas perturbaciones
ambientales como la temperatura, la presión, el pH, la disponibilidad de nutrientes y productos
químicos nocivos ( Bla zina et al., 2010;
217
Murínov a y Dercov a, 2013; Segura et al., 2010 ) Nuestros estudios previos demostraron el potencial
degradativo de
Pseudomonas sp. CF600 y estenotrofomona maltofila KB2 sobre la degradación co-metabólica del
4-clorofenol (4-CP) en cultivos líquidos por lotes ( Nowak y Marzik, 2016; Nowak et al., 2016 ) En base
a estos resultados, en este estudio, se hizo un intento por determinar si la bioagregación del suelo
con estas bacterias podría mejorar la degradación del 4-CP solo, así como en presencia de fuentes
de carbono adicionales como el fenol (P) y el benzoato de sodio ( SB). Durante los estudios de
biodegradación, se analizó el número de bacterias heterotróficas totales, así como la diversidad
estructural y funcional del microbioma del suelo.
2. Materiales y métodos
2.1. Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio fueron Pseudomonas sp. CF600 (CCUG #
32333) y estenotrofomona maltofila KB2 (VTT E-113197). Ambas cepas se han descrito previamente
como capaces de degradar el 4-clorofenol (4-CP) en condiciones co-metabólicas en cultivos líquidos
( Nowak y Mrozik, 2016; Nowak et al., 2016 )
2.2. Suelo
El suelo se recogió de la capa superior (5 mi 20 cm) de un prado anegado ubicado en Da ˛ Browa
G ornicza, Alta Silesia, Polonia (N 50,38, E 19,25). Las propiedades fisicoquímicas seleccionadas del
suelo, que se determinaron de acuerdo con las normas polacas, se presentan en tabla 1 . El suelo
analizado estaba libre de contaminación por fenol.
2.3. Diseño experimental
Los experimentos de biodegradación fueron diseñados para su uso en suelos secados al aire a
temperatura ambiente y tamizados (1,5 mm). Porciones triplicadas del suelo se colocaron en
macetas (200 g) y se modificaron con 4-clorofenol (S þ 4-CP), así como con mezclas de dos
componentes que consisten en 4-CP y P (S þ 4-CP þ P) y 4-CP y SB (S þ 4CP þ SB) a las
concentraciones de 260 metro gg 1, 260 y 560 metro gg 1
y 260 y 860 metro gg 1 suelo, respectivamente. Las concentraciones de las soluciones madre de
4-CP, P y SB (en agua) fueron 0.6 gl 1, 38 gl 1 y 29 gl 1, respectivamente. Las concentraciones de
compuestos aromáticos añadidos al suelo se duplicaron en comparación con las concentraciones de
estos compuestos que se introdujeron en los cultivos líquidos de
Pseudomonas sp. CF600 y S. maltophilia KB2 en nuestros estudios anteriores ( Nowak y Mrozik,
2016; Nowak et al., 2016 ) y se eligieron en función de los resultados de la investigación preliminar
(datos no mostrados). La contaminación del suelo con una mezcla de sustancias con diferentes
propiedades fisicoquímicas y susceptibilidad a la biodegradación tenía la intención de restablecer fl Realice
las condiciones en muchas áreas contaminadas en las que los diferentes compuestos aromáticos
ocurren frecuentemente como una mezcla. Otra razón para usar compuestos aromáticos mixtos fue
fuente adicional de carbono aromático.
A continuación, algunas de las muestras de suelo contaminadas y no contaminadas se
bioagregaron con cepas individuales de la bacteria.
Pseudomonas sp. CF600 y S. maltophilia KB2. Antes de la inoculación en el suelo, ambas cepas se
cultivaron en un medio de sales minerales ( Mrozik et al., 2007 ) que contiene el sustrato aromático
correspondiente en 500 ml fl pregunta en un agitador rotativo (130 rpm) a 30 C.
Pseudomonas sp. CF600 se cultivó en P (280 mg l 1) o SB (430mg l 1) mientras S. maltophilia KB2 solo
se cultivó en el
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tabla 1
Propiedades fisicoquímicas seleccionadas del suelo.

Parámetro Valor Método / fuente

Fracción de arena: 2 mi 0.05 mm,% 88,0 ± 8.8 PN-R04032: 1998

Fracción de polvo: 0.05 mi 0.002 mm,% 6.0 ± 0.6 PN-R04032: 1998
Fracción de arcilla: < 0.002 mm,% 6.0 ± 0.6 PN-R04032: 1998
Contenido de agua, % 19,0 ± 1,5 PN-ISO 11465: 1999
pH 7.1 ± 0.2 0.2 PN-ISO 10390: 1997
Conductividad eléctrica, metro S cm 1 112 ± 3.0 PN-ISO 11265: 1997
C orgánica,% 1,96 ± 0.2 0.2 PN-Z-15011-3
Kjeldahl total N,% 0.008 ± 0,0008 PN-ISO 11261: 2000
Nitrógeno amónico N-NH 4, mg kg 1 21,8 ± 2,0 PN-ISO 14256 mi 2: 2010
Nitrato Nitrógeno N-NO 3-, mg kg 1 0.6 ± 0,06 PN-ISO 14256 mi 2: 2010
P disponible, mg P 2 O 5 5 sol 1 0,104 ± 0,01 PN-R-04023: 1996
K disponible, mg K 2 O g 1 0,08 ± 0.008 PN-R-04022: 1996
Capacidad de intercambio de cationes (CEC), cmol þ kg 1 2,71 ± 0.25 ISO 23470: 2007

presencia de P (280mg l 1) Fue debido a la investigación preliminar en los cultivos líquidos por lotes
que indicó que la degradación co-metabólica de 4-CP en presencia de SB por S. maltophilia KB2 era
inef fi cient (datos no mostrados). Las células se adaptaron a cada sustrato transfiriéndolas al mismo
sustrato tres veces sucesivas, como se describió anteriormente ( Nowak y Mrozik, 2016 ) Luego, los
cultivos se centrifugaron (4612 g, 20 min, 4 C), los gránulos se lavaron dos veces (NaCl al 0,9%) y se
resuspendieron en 20 ml de NaCl al 0,9%. Las suspensiones de bacterias obtenidas se agregaron al
suelo dando como resultado un número de células de 10 8 sol 1 suelo. Todas las muestras de suelo se
incubaron a temperatura ambiente (22.0 ± 1.0 C) dentro de 100 días. los fi El contenido de agua final
de los suelos se ajustó a aproximadamente el 25% de la capacidad máxima de retención de agua. El
esquema del diseño experimental se muestra en Figura 1 .
de acuerdo con el procedimiento descrito por Kozdr oj (2000) y fueron identi fi ed usando theMicrobial
Identi fi Sistema de cationes (MIS; Microbial ID Inc., Newark). Los ésteres metílicos de ácidos grasos
(FAME) se separaron usando un cromatógrafo de gases (Hewlett-Packard 6890) equipado con una
columna capilar HP-Ultra 2 (25 m, 0,22 mm de DI) con hidrógeno como gas portador. Las FAME se
detectaron utilizando un fl detector de ionización de ame (FID) e identi fi ed utilizando la identificación
microbiana MIDI
fi Software del sistema de cationes (método Sherlock TSBA 6.1 y biblioteca TSBA6; MIDI Inc.,
Newark, DE, EE. UU.). Para evitar el efecto de los ácidos grasos que solo se detectaron
ocasionalmente, el análisis de las FAME incluyó solo ácidos grasos con un contenido de al menos
1% en el FAME pro fi le.

Entre los identi fi ácidos grasos ed, 17: 0 cy, 19: 0 cy, 16: 1 tu 5 5 C, 16: 1
tu 7 7 C, 17: 1 tu 7 7 C, 18: 1 tu 7 7 C se agruparon como marcadores de bacterias Gram-negativas
(BG-) ( Moore-Kucera y Dick, 2008 ), mientras que 11: 0 Yo asi,

2.4. Extracción y determinación de la concentración de compuestos aromáticos. 11: 0 anteiso 13: 0 Yo asi, 13: 0 anteiso 14: 0 Yo asi, 15: 0 Yo asi, 15: 0 anteiso

16: 0 Yo asi, 17: 0 Yo asi, 17: 0 anteiso se agruparon como marcadores de bacterias grampositivas
(BG þ) ( Moore-Kucera y Dick, 2008 ) A su vez, 16: 0 10Me y 17: 0 10Me se consideraron de origen

Para estimar la concentración de 4-CP, P y SB, las muestras de suelo (5 g) se recolectaron a los actinomiceto (Ac) ( Moore-Kucera y Dick, 2008 ), mientras que 18: 2 tu 6,9 C, 18: 1

1, 4, 7 días y luego a intervalos de siete días. A continuación, se añadió una mezcla de HCl al 0,01%,
metanol y acetonitrilo (50:25:25, v / v / v) al suelo y se agitó (130 rpm) durante tu 9 9 C fueron utilizados como biomarcadores de hongos (F) ( Kaiser et al., 2010 )

1,5 h. Luego, las muestras se centrifugaron (4612 g, 10 min, 4 C) y el sobrenadante se analizó

cromatográficamente utilizando un HPLC Merck Hitachi equipado con un Ascentis ® Columna HPLC
Express C18 (100 4.6 mm), un Opti-Solw ® Precolumna EXP y un detector DAD (Merck Hitachi). La
fase móvil era una mezcla de acetonitrilo, metanol y ácido acético al 1% (20:20:60, v / v / v). los fl la
velocidad de flujo fue de 1 ml min 1) Los compuestos químicos en el sobrenadante fueron identi fi ed y
quanti fi ed comparando sus tiempos de retención de HPLC y UV mi espectros visibles con los de los
estándares externos. La longitud de onda de detección para la detección de 4-CP, P y SB se ajustó a
272 nm.
2.5. Determinar el número de células bacterianas
En todos los días de muestreo, se calculó el número total de bacterias heterotróficas (THB) en
los suelos bioaugulados y no bioaugulados. Para este propósito, se colocaron 2.5 g de tierra en un
Erlenmeyer fl pida que contenga 22,5 ml de NaCl al 0,9% para agitar (30 min, 130 rpm) y para
preparar diluciones en serie de diez veces para los recuentos en placa. Las placas inoculadas se
incubaron a 30 ° C durante 48 h. El número de bacterias se expresó como el log CFU g 1 suelo.
2.7. Pro fisiológica a nivel comunitario fi abadejo
La comunidad a nivel fisiológico pro fi los archivos (CLPP) en las muestras de suelo se obtuvieron
usando Biolog ® Ecoplacas ™ ( BIOLOG Inc., Hayward, EE. UU.). Cada placa contiene 96 pozos con
31 fuentes de carbono diferentes más un pozo en blanco en tres repeticiones. La tasa de utilización
de las fuentes de carbono se determinó mediante la reducción del colorante redox de violeta de
tetrazolio, que cambió de incoloro a púrpura cuando los microorganismos añadidos utilizaron el
sustrato apropiado ( Stefanowicz, 2006 ) Para preparar los EcoPlates ™, Se añadieron 10 g de cada
suelo analizado a 90 ml de NaCl al 0,9% y se agitó durante 1 h (130 rpm) los días 1, 60 y 100 del
experimento. A continuación, la suspensión del suelo se diluyó (1: 9) con NaCl al 0,9% y 120 metro l
de la suspensión preparada se usó para inocular cada pocillo. Las placas se incubaron a 22 ° C
durante fi cinco días El desarrollo del color fue seguido por la lectura de la absorbancia a 590 nmat a
intervalos de 12 h utilizando una MicroStation ™ lector ( Fra ˛ c et al., 2012 ) La actividad microbiana en
cada microplaca se expresó como el desarrollo promedio del color del pozo (AWCD) y el área bajo la
curva (AUC). Además, la riqueza de especies (R) se determinó como el número de sustratos
utilizados ( Stefanowicz, 2006 ) Para interpretar los resultados obtenidos, se dividieron 31 fuentes de
carbono en siete grupos: carbohidratos (Carb) (glucosa-1-fosfato, D, L- una- fosfato de glicerol, si- metil-D-glucósido
N-acetil- RE- glucosamina una- RE-

2.6. Análisis MIDI-FAME

Los análisis de ácidos grasos se realizaron los días 1, 60 y 100 del experimento. Se extrajeron lactosa, RE- celobiosa, D-manitol, RE- xilosa, i-eritritol), aminoácidos (AA), (glicil- L- ácido glutamico, L- arginina
muestras triplicadas de cada suelo (5 g) L- asparagina L-
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Figura 1. El esquema del diseño experimental: tratamiento del suelo (S) bioaugmentado con Pseudomonas sp. CF600
(A), S. maltophilia KB2 (B) y suelos no bioaugulados (C). Abreviaturas: 4-CP mi 4-clorofenol, P mi fenol, SB mi benzonato
de sodio; S þ CF600
mi S con Pseudomonas sp. CF600, S þ 4-CP þ CF600 mi S con 4-CP y Pseudomonas sp. CF600, S þ 4-CP þ PAGS þ CF600
mi S con 4-CP, P y Pseudomonas sp. CF600, S þ 4CP þ SB þ CF600 mi S con 4-CP, SB y Pseudomonas sp. CF600, S þ
KB2 - S con
S. maltophilia KB2, S þ 4-CP þ KB2 - S con 4-CP y S. maltophilia KB2, S þ 4CP þ PAGS þ KB2 - S con 4-CP, P y S.
maltophilia KB2, S þ 4-CP - S con 4-CP, S þ 4CP þ P - S con 4-CP y P, S þ 4-CP þ SB - S con 4-CP y SB.
219
feniloalanina L- treonina L- serina), aminas (A) (feniletilamina, putrescina), ácidos carboxílicos (CA) ( una-
ácido cetobutírico RE-
ácido glucosamínico RE- ácido galactónico sol- lactona RE- ácido galacturónico
RE- ácido málico, éster metílico del ácido pirúvico, ácido itacónico, sol- ácido hidroxibutírico), ácidos
fenólicos (PA) (ácido 2-hidroxibenzoico, ácido 4hidroxibenzoico), tensioactivos (Surf) (Tween 40,
Tween 80), polímeros (Poli) (glucógeno, una- ciclodextrina). Además, el índice de uso de nitrógeno
(índice N) y el índice de uso de fósforo (índice P) se calcularon como el porcentaje de utilización total
de sustrato de carbono, que estaba relacionado con los sustratos que contenían nitrógeno
(aminoácidos, aminas, N-acetil-). RE- glucosamina RE- ácido glucosamínico) y fósforo (glucosa-1-fosfato,
D, L- una- fosfato de glicerol), respectivamente.
2.8. Análisis de datos
La tasa de degradación constante ( k) del 4-CP en el suelo se determinó utilizando el algoritmo C t
/ C 0 0 ¼ mi- k t, donde C 0 0 fue la concentración de sustrato en el tiempo 0 y C t fue la concentración de
sustrato en el suelo en el tiempo t. Las tasas de degradación promedio ( V) de los sustratos
aromáticos se calcularon dividiendo la cantidad neta del compuesto degradado entre t y 0. El tiempo
de desaparición teórico 50 (DT 50) se calculó a partir de la ecuación lineal obtenida de la regresión
entre la concentración de 4-CP y el tiempo.
Todos los identi fi ed FAMEs así como los valores de absorbancia en las EcoPlates ™ se usaron
para calcular el índice de diversidad de Shannon según la ecuación (1) :
H 0 0 ¼? X norte pags yo Iniciar sesión pags yo (1)
yo ¼ 1
donde p yo fue un solo FAME o el valor de la absorbancia de cada sustrato dividido por la suma de la
absorbancia que se registró para todos los sustratos en la placa.
Además, el índice de uniformidad de Shannon (E) se calculó a partir de H ' y R como sigue
(ecuación (2) ):
mi ¼ H 0 0 (2)
lnR
Los datos para el análisis de conglomerados se normalizaron previamente según la ecuación (3) :
una min
norte ¼ una yo (3)
una max una min
donde N (datos normalizados) escala todas las variables numéricas en el rango entre 0 y 1, a yo mi los
datos sin procesar iniciales, un min mi el valor mínimo de cada parámetro y un max mi El valor máximo
de cada parámetro.
Para determinar si la fuente de carbono adicional o bioaugmentación en fl ueced el k, V, y DT 50 las
muestras independientes t- prueba (p < 0,05) se utilizó para comparar los valores de pares adecuados
de parámetros obtenidos. Los resultados obtenidos también se evaluaron mediante el análisis de
varianza (ANOVA). El significado estadístico fi cance (p < 0.05) de cualquier diferencia se trataron
utilizando un ANOVA unidireccional considerando el efecto del 4-CP o fuente de carbono adicional en
el suelo sobre los porcentajes de marcadores FAME distintos así como los índices de diversidad
funcional y evaluados mediante una comparación post-hoc de los medios usando el significado más
bajo fi prueba de diferencias de peralte (LSD). A fin de que fi y cualquier diferencia en el FAME pro fi Entre
los suelos analizados, se utilizó el análisis de componentes principales (PCA). Todos los análisis se
realizaron utilizando el Statistica ® 12.5 PL (StatSoft ® Inc., EE. UU.) Paquete de software. Para todos
los
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análisis, los datos se representaron como la media ± La desviación estándar (DE) de tres réplicas
independientes.
3. Resultados
3.1. Degradación de 4-CP y número de bacterias en el suelo.
En el experimento se evaluó si el suelo bio-
aumento con Pseudomonas sp. CF600 o S. maltophilia KB2 y la presencia de P y SB podrían mejorar
la tasa de eliminación de 4-CP en el suelo contaminado. Los estudios de biodegradación se
realizaron durante 100 días y se basaron en la premisa de que si se agotara el sustrato fi En el suelo,
se agregaría su dosis idéntica posterior. Se encontró que en el S þ 4-CP þ CF600, 4 dosis de este
compuesto se degradaron completamente y se utilizó el 75% de 5 dosis ( Figura 2 UNA). Al mismo
tiempo (100 días), se utilizaron 3 dosis y el 80% de 4 dosis de 4-CP en el S þ 4-CP þ KB2 ( Fig. 3 UNA).
En comparación, en el S þ 4-CP la eliminación de 3 dosis y el 58% de 4 dosis de 4-CP se estableció
durante este tiempo ( Fig. 3 UNA). La tasa de la fi primera dosis de desaparición de 4-CP ( V) la tasa
constante ( k) y DT 50 en todas las muestras de suelo tratadas alcanzaron valores similares y V y k fueron
signi fi muy superior, mientras que DT 50 fueron inferiores en comparación con los valores
correspondientes para dosis posteriores ( Tabla 2 ) También fue con fi rmed que la desaparición de
4-CP en el S þ 4-CP þ P tomó más tiempo en comparación con el S þ 4-CP. La utilización de la fi La
primera dosis de 4-CP en presencia de P en los suelos bioaugulados y de control tomó 28 días ( Figs.
2C y 3 C), mientras que el fi la primera dosis de 4-CP se degradó en 7 días ( Figs. 2A y 3 UNA). Las
tasas de desaparición de 4-CP en el suelo que había sido contaminado con 4-CP y P fueron 5 mi 6.5
veces menor en comparación con su desaparición en el suelo que había sido contaminado con 4CP
y DT 50 los valores fueron 3 veces mayores. El 70%, 35% y 30% de la segunda dosis de 4-CP en
presencia de bacterias P degradadas en el S þ 4-CP þ PAGS þ CF600 ( Figura 2 C), S þ 4-CP þ PAGS þ
KB2 y S þ 4CP þ P, respectivamente ( Fig. 3 C). También hubo diferencias en los parámetros de la
cinética de degradación ( Tabla 2 ) En otro experimento, se demostró que SB aceleró claramente la
eliminación de 4-CP en el S þ 4-CP þ SB þ CF600. La biodegradación completa de fi cinco dosis de
4-CP en este suelo fueron con fi rmed durante 100 días ( Figura 2 MI). Los parámetros calculados de la
cinética de degradación ( V
y DT 50) de las 5 dosis de 4-CP en S þ 4-CP þ SB þ CF600 y S þ 4CP þ CF600 también fueron signi fi muy
diferente ( Tabla 2 ) El análisis del número total de bacterias heterotróficas (THB) en todos los suelos
tratados y no tratados indicó una disminución sistemática en el número de células. En la S þ 4-CP þ CF600,positivamente con PC2. En el suelo contaminado con 4-CP y SB, la relación sat / unsat aumentó con
S þ 4-CP þ KB2 y S þ 4-CP, los números iniciales de THB fueron 1.0 10 8, 2.5 10 8 y
2.8 10 7 7 sol 1 suelo, respectivamente. La disminución en el recuento bacteriano en todos los suelos
analizados fue similar y varió del 20 al 26%. En comparación, la disminución en los números de THB
en el suelo de control (S) fue cercana al 50% ( Figs. 2B y 3 SI). Los análisis de datos de los recuentos
de THB en el suelo que había sido contaminado con las mezclas de 4-CP y P o 4-CP y SB mostraron
que, aunque el número de bacterias cultivables disminuyó con el tiempo, las bacterias sobrevivieron
mejor en el suelo que había sido contaminado. contaminado con las mezclas de estos compuestos
que en el suelo no contaminado. La disminución en el THB cuenta en el S þ 4-CP þ PAGS þ CF600, S þ
4-CP þ P y S þ 4CP þ PAGS þ KB2 constituía el 13%, 18% y 21% del número inicial de células,
respectivamente, al final del experimento ( Fig. 2D, F y 3 SI,
RE). A su vez, una disminución en los recuentos de THB en el S þ CF600, S þ KB2 y S se
establecieron a un nivel de aproximadamente el 40% ( Figs. 2B y 3 SI).
3.2. FAME pro fi abadejo
Paralelamente a los estudios de biodegradación, el impacto de 4-CP y la bioacumulación del
suelo con Pseudomonas sp. CF600
y S. maltophilia Se evaluó KB2 en la composición FAME. El análisis de PCA implicó 15 mi 19 ácidos
grasos y explicados
79,18 mi 85.59% de la varianza ( Fig. 4 ) Aunque el factor más importante que tuvo un fl La influencia
sobre las variaciones en los patrones de FAME fue el momento, la bioacumulación no distinguió los
ácidos grasos que se aislaron de los suelos ( Fig. 4 B, D, F). El análisis de PCA indicó que las FAME
que se aislaron de los suelos bioaugulados y no bioaugulados (S þ CF600, S þ KB2, S) en el día 1
fueron distintos en comparación con los que se aislaron de S þ 4CP þ CF600, S þ 4-CP þ KB2, S þ 4-CP,
S þ CF600, S þ KB2 y S en el día 100 a lo largo del fi primer eje y los extraídos de los mismos suelos
en el día 60 a lo largo del segundo eje ( Fig. 4 SI). Los ácidos grasos 10: 0 3OH, 12: 0 3OH, 16: 0 3OH
y 19: 0 cy tu 10 C correlacionó positivamente con PC1, mientras que 15: 0 Yo asi, 16: 0 Yo asi, 16: 1 tu 5
5 C, 16: 1 tu 7 7 C, 18: 1 tu 7 7 C, 18: 1
tu 9 9 C correlacionado negativamente Fig. 4 UNA). El resultado de los cambios observados en el
contenido de FAMEs fue un aumento en la relación sat / unsat con el tiempo ( Tabla 3 ) Se realizó un
análisis similar de las FAME para todos los suelos que habían sido contaminados con 4-CP y P ( Fig.
4 C y D). Se encontró que el S y S þ CF600 el día 1 se agruparon y se distinguieron de S þ 4CP þ PAGS
þ CF600, S þ 4-CP þ PAGS þ KB2, S þ 4-CP þ P, S þ CF600, S þ KB2 y S en el día 100 a lo largo del fi primer
eje ( Fig. 4 RE). La proyección del FAME pro fi Los archivos que se obtuvieron para el suelo que había
sido contaminado con 4-CP y P indicaron diferentes localizaciones de los suelos tratados y de control
a lo largo de los ejes PC1 y PC2. El S y S þ CF600 el día 1 se agruparon y se distinguieron de S þ 4-CP
þ PAGS þ CF600, S þ 4-CP þ PAGS þ KB2, S þ 4CP þ P, S þ CF600, S þ KB2 y S en el día 100 a lo
largo del fi primer eje ( Fig. 4 RE). The FAME pro fi los archivos en el día 100 se caracterizaron por un
mayor contenido de 10: 0 3OH, 12: 0 3OH, 16: 0 3OH, 17: 0 Yo asi 3OH y 19: 0 cy tu 10 C. Los
cambios observados fueron re fl efectuado en el aumento de la relación sat / unsat con el tiempo ( Tabla
3 ) Las variaciones en el FAME pro fi les de la S þ 4-CP þ SB no estaba tan fuertemente conectado con
el tiempo en comparación con el S þ 4-CP y S þ 4-CP þ P. Las FAME que se extrajeron de S y S þ CF600
el día 1 se agruparon y se diferenciaron de las FAME que se extrajeron de la S, S þ CF600 el día 60
y el S þ CF600 en el día 100 a lo largo del segundo eje y desde el S þ 4-CP þ SB þ CF600 el día 60 y S þ
4CP þ SB þ CF600 y S þ 4-CP þ SB en el día 100 a lo largo del fi primer eje ( Fig. 4 F). Como Fig. 4 E
indica, 16: 0, 18: 0, 20: 0, 15: 0 Yo asi, 16: 0 Yo asi, 16: 1
tu 5 5 C, 18: 1 tu 9 9 C, 18: 2 tu 6,9 C se correlacionaron positivamente con PC1, mientras que 10: 0
3OH, 12: 0 2OH, 12: 0 3OH tuvieron una correlación negativa. Solo 16: 1 tu 7 7 C se correlacionó
el tiempo, aunque los valores de esta relación para el S þ 4-CP, S þ 4-CP þ P y S þ 4-CP þ SB en el día
100 en los suelos bioaugulados y no bioaugulados no difirió signi fi cantly ( Tabla 3 ) El en fl Se evaluó la
influencia de los compuestos aromáticos y la bioacumulación del suelo sobre la diversidad
microbiana en los suelos analizados analizando el contenido de los marcadores de ácidos grasos
para las bacterias Gram-negativas (BG-), Gram-positivas (BG þ), actinomicetos (Ac) y hongos (F) ( Tabla
3 ) Se observó que la participación de los marcadores FAME para BG aumentó con el tiempo y fue la
más alta (28.42%) para el S þ 4-CP þ CF600 el día 100 ( Tabla 3 ) Por el contrario, el contenido de los
marcadores FAME para BG þ y F disminuyó con el tiempo. En la S þ 4-CP þ SB þ CF600, S þ 4-CP þ CF600
y S þ 4CP þ PAGS þ CF600, el contenido de la BG þ los marcadores disminuyeron un 29%, 22% y
16%, respectivamente, en el día 100, mientras que en todos los suelos bioaugulados con S.
maltophilia KB2 y en todos los suelos no bioaugulados, los cambios observados no fueron
significativos fi hipocresía. El contenido más bajo de marcadores fúngicos (2,82 y 3,17%) se registró
para el S þ 4-CP þ SB þ CF600 y S þ 4-CP þ SB en el día 100. Como H '
indicado, la S þ KB2 fueron los más diversos entre todos los suelos probados en el día 100, mientras
que ninguno de los suelos bioaugulados con
Pseudomonas sp. CF600 tenía algún significado fi no puede cambiar con el tiempo
 A. Nowak, A. Mrozik / Journal of Environmental Management 215 (2018) 216 mi 229 221

Figura 2. Dinámica de la degradación de 4-CP (A), 4-CP y P (C), 4-CP y SB (E) y el número de THB (B, D, F) en el suelo bioaumentado con Pseudomonas sp. CF600 y el suelo de control.
222 A. Nowak, A. Mrozik / Journal of Environmental Management 215 (2018) 216 mi 229

Fig. 3. Dinámica de la degradación de 4-CP (A), 4-CP y P (C) y número de THB (B, D) en el suelo bioaumentado con S. maltophilia KB2 y el suelo de control.

( Tabla 3 )
3.3. Actividad metabólica de los microorganismos del suelo.
La diversidad funcional de microorganismos en los suelos tratados y no tratados se presenta en Tabla observó 60% para el S þ 4-CP þ PAGS þ CF600 el día 60, el S þ 4-CP þ PAGS þ KB2 en el día 100 y
4 . Los valores calculados de AWCD y AUC indicaron que las bacterias en el S þ CF600, S þ KB2 y S
fueron más activos en el día 1, así como aquellos en el S þ 4-CP þ SB þ CF600, S þ 4-CP þ SB, S þ 4-CP
þ CF600, S þ 4CP þ CF600, S þ 4-CP en los días 60 y 100. El valor más alto de H 0 0
se calcularon su índice N y su índice P ( Fig. 5 ) Se descubrió que los aumentos de la intensidad del
uso de carbohidratos al final del experimento fueron 20, 30, 50 y 50% para el S þ KB2, S þ 4CP þ CF600,
S þ 4-CP þ KB2 y S þ CF600, respectivamente, en comparación con los valores iniciales. A su vez, se
registraron disminuciones de 20, 30 y 40% en la intensidad de la utilización de AA para el S þ CF600,
S y S þ KB2, respectivamente. Además, un alto nivel de utilización de CA en el rango de 40 mi Se
para el S þ 4-CP þ P en los días 60 y 100. Curiosamente, se registró un bajo nivel de utilización de
Poly, Surf y PA para todos los suelos tratados. Se calcularon valores altos de índice N (superiores al
50%) para el S þ CF600, S þ KB2 y S el día 1, para el S þ 4-CP þ SB þ CF600, S þ 4-CP þ SB, S þ 4CP þ CF600
en los días 60 y 100 y para el S þ 4-CP þ PAGS þ CF600 y S þ 4-CP el día 100.

se destacó por la S þ 4-CP þ PAGS þ CF600 y S en los días 60 y 100, mientras que el H más bajo ' valor
se registró para el S þ CF600 el día 1. Los valores de R fueron los más altos para el S þ 4-CP þ SB y
S þ 4-CP en el día 60 y el más bajo para el S þ 4-CP þ SB en el día 60. El valor E más alto se registró
para el S en los días 60 y 100, mientras que el valor E más bajo se calculó para el S þ CF600 y S þ KB2
el día 1. Se presenta un análisis de conglomerados de todos los suelos tratados en diferentes días de
muestreo, que se basó en la utilización del patrón de los siete gremios y los marcadores microbianos
Para determinar si el tipo de sustrato disponible afectó los patrones de utilización dependiendo FAME. Fig. 6 . Tal análisis permitió distinguir dos grupos separados de dominio. Un grupo incluía los
del tratamiento del suelo, todos los sustratos analizados se agruparon por su gremio bioquímico y marcadores microbianos A y AA, mientras que Surf, PA, Poly, CA
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Tabla 2
Tasa de degradación constante ( k) tasa de desaparición V) y tiempo de desaparición 50 (DT 50) de 4-CP en el suelo no bioaugulado y bioaugulado con Pseudomonas sp. CF600 o S. maltophilia KB2.

Tratos Número de dosis k, día 1 V, metro gg 1 día 1 DT 50 ( dias) Ecuación de regresión R2

Suelo bioaumentado con Pseudomonas sp. CF600 S þ 4-CP þ CF600

1 0.258 ± 0,038 yo 37,09 ± 0,29 yo 3,33 ± 0,14 yo ln ( C t / C 0) ¼ / 0.255t þ 5,56 0.824
2 0,106 ± 0.003 II 4.87 ± 0,49 II, a 10,84 ± 1.09 II, a ln ( C t / C 0) ¼ / 0.106t þ 5,64 0,987
3 0,190 ± 0.009 una 4.66 ± 0,86 si 4.89 ± III, b ln ( C t / C 0) ¼ / 0.268t þ 5.86 0.950
44 0,016 ± 0.007 si 11.01 ± 1,81 9.02 ± 2,27 C ln ( C t / C 0) ¼ / 0.051t þ 5.36 0.829
55 0,076 ± 0,010 9.58 ± 0,69 III 15.10 ± 0,38 IV ln ( C t / C 0) ¼ / 0.068t þ 5.63 0.955
S þ 4-CP þ PAGS þ CF600 1 0,036 ± 0,014 Yo c 5,67 ± 0,71 Yo c 10,42 ± 0,37 yo ln ( C t / C 0) ¼ / 0.043t þ 5.27 0,769
2 0,020 ± 0.001 II, d 2,88 ± 0,59 II, d 46,01 ± 6.51 II, d ln ( C t / C 0) ¼ / 0.019t þ 5.70 0.863
S þ 4-CP þ SB þ CF600 1 0.248 ± 0,015 36,61 ± 0,83 3.31 ± 0,07 ln ( C t / C 0) ¼ / 0.248t þ 5.55 0,885
2 0,084 ± 0,013 II 7.49 ± 1,15 II, e 11,21 ± 0,98 ln ( C t / C 0) ¼ / 0.083t þ 5,54 0,996
3 0,122 ± 0,064 7.49 ± 1,66 9.06 ± 0,63 III, e ln ( C t / C 0) ¼ / 0.096t þ 5,50 0.955
44 0,027 ± 0.007 18,17 ± 0.28 8.34 ± 0.23 ln ( C t / C 0) ¼ / 0.027t þ 5,53 0.990
55 0,071 ± 0.005 11.09 ± 0,13 III 11,96 ± 0,22 IV ln ( C t / C 0) ¼ / 0.071t þ 5,64 0.862
Suelo bioaumentado con S. maltophilia KB2 S þ 4-CP þ KB2
1 0,233 ± 0,025 III 36,71 ± 0.25 IV 3.40 ± 0,13 V ln ( C t / C 0) ¼ / 0.231t þ 5.55 0,996
2 0,098 ± 0.005 IV 2,46 ± 0,29 9.53 ± 1,17 Vía ln ( C t / C 0) ¼ / 0.097t þ 5,48 0.988
3 0,069 ± 0,039 7,98 ± 0,96 15,41 ± 1,83 ln ( C t / C 0) ¼ / 0.059t þ 5,58 0.969
44 0,085 ± 0.004 3.10 ± 0.28 10.07 ± 1,60 C ln ( C t / C 0) ¼ / 0.084t þ 5.37 0.968
S þ 4-CP þ PAGS þ KB2 1 0,040 ± 0.003 III, c 7.63 ± 0,52 IV 10.40 ± 1.10 V ln ( C t / C 0) ¼ / 0.089t þ 5,53 0,745
2 0.006 ± 0.001 IV, d 1,48 ± 0,32 re 78,70 ± 2,30 VI ln ( C t / C 0) ¼ / 0.006t þ 5,52 0,723
Suelos no bioaugulados S þ 4-CP
1 0.380 ± 0,124 V 36,49 ± 0,26 V 3.22 ± 0.24 VII ln ( C t / C 0) ¼ / 0.293t þ 5.55 0.876
2 0,097 ± 0.009 VI 2,47 ± 0,59 Vía 19,60 ± 1,97 VIII, a ln ( C t / C 0) ¼ / 0.128t þ 5,64 0.852
3 0,090 ± 0,014 VII, a 9.44 ± 0,18 VII, b 12,54 ± 0.25 IX, b ln ( C t / C 0) ¼ / 0.100t þ 5,77 0.939
44 0,063 ± 0,016 si 3,09 ± 0,49 30,50 ± 1,47 C ln ( C t / C 0) ¼ / 0.077t þ 5,79 0,883
S þ 4-CP þ PAGS 1 0,088 ± 0,023 V, c 6.60 ± 0,37 V, c 9,86 ± 1.02 VII ln ( C t / C 0) ¼ / 0.047t þ 5,66 0,940
2 0,013 ± 0.002 VI, d 0,50 ± 0,09 VI, d 83,88 ± 13,40 VIII, d ln ( C t / C 0) ¼ / 0.025t þ 6.22 0.979
S þ 4-CP þ SB 1 0.225 ± 0,014 36,61 ± 0,83 3.40 ± 0,09 ln ( C t / C 0) ¼ / 0.220t þ 5.55 0,982
2 0,084 ± 0,019 4.13 ± 0,33 Rivalizar 10,48 ± 0,44 VIII ln ( C t / C 0) ¼ / 0.077t þ 5.41 0,989
3 0,060 ± 0.004 VII 6.39 ± 0,15 VII 18,52 ± 0,43 IX, e ln ( C t / C 0) ¼ / 0.077t þ 5.59 0.898

Los valores más / menos representan SD. En columna con k, V y DT 50 los pares de medias con las mismas letras son signi fi muy diferente ( p < 0.05, las muestras independientes t- prueba) considerando el efecto de P y SB en comparación con el
suelo contaminado con una dosis adecuada de 4-CP (números romanos) y el efecto de bioaugmentación en comparación con el suelo no bioaugulado (letras minúsculas).

y Carb se agruparon en el segundo grupo. Además, un análisis de conglomerados de los suelos
estudiados en términos de tratamiento del suelo a lo largo del tiempo mostró tres conglomerados
separados. los fi el primero incluía el S þ CF600, S þ KB2 y S el día 1, el S þ 4-CP y S þ 4-CP þ SB el día
60 y el S þ 4-CP þ CF600, S þ 4-CP þ KB2 y S þ 4CP þ SB þ CF600 en los días 60 y 100. En el segundo
grupo, se distinguieron dos subgrupos y se agruparon. los fi primer subgrupo incluido el S þ 4-CP þ SB,
S þ 4-CP þ PAGS þ CF600, S þ 4-CP en el día 100 y el S þ CF600 y S el día 60, mientras que el
segundo subgrupo incluyó el S þ CF600 el día 100 y el S þ 4-CP þ P y S þ KB2 en los días 60 y 100. A
su vez, el S þ 4-CP þ PAGS þ CF600 el día 60, S þ 4-CP þ PAGS þ KB2 en los días 60 y 100 y el S en
el día 100 se agruparon de forma independiente.
CF600 y S. maltophilia KB2 pudo co-metabolizar 4-CP en presencia de fenol o benzoato de sodio en
cultivos líquidos por lotes ( Nowak et al., 2016; Nowak y Mrozik, 2016 ) Esto nos llevó a introducir
estas bacterias en el suelo. Los experimentos de degradación de 4-CP en el S mostraron que el fi La
primera dosis de este compuesto se metabolizó dentro del mismo período de tiempo en el suelo
bioaugmentado y no bioaumente. Esto indicó que una exposición a corto plazo de microorganismos
del suelo a 4-CP no afectó su actividad degradante y que los microorganismos autóctonos pudieron
metabolizar este compuesto. Similar, Lallai y Mura (2004)

informaron que en el suelo del bosque que no había estado expuesto previamente a ningún químico
sintético, la degradación del 2-clorofenol (2-CP) fue más lenta que en el suelo con un historial más
prolongado de contaminación. En este estudio, se registraron marcadas diferencias en la eliminación
de 4-CP en los suelos tratados durante la degradación de dosis sucesivas de 4-CP dentro de los 100

4. Discusión días. En este caso, la degradación más efectiva de 4-CP se observó en el suelo que había sido
bioaumentado con Pseudomonas sp. CF600, mientras que no signi fi No se observaron diferencias

La contaminación del suelo con clorofenoles es un problema persistente en muchos lugares del entre los S inoculados con

mundo y, por lo tanto, ha sido objeto de numerosos estudios ( Sinkkonen et al., 2013 ; Ivanciuc et al.,
2006 ) Aunque la atención de los científicos se centra principalmente en fenoles policlorados
resistentes y degradables ( Chen y col., 2012; Diez et al., 2012; Li et al., 2013 ), la contaminación con S. maltophilia KB2 y el suelo no bioaugulado. El efecto positivo de la bioacumulación del suelo con Arthrobacter

monoclorofenol no debe descuidarse. Dichos compuestos están muy extendidos no solo en el suelo chlorophenolicus

sino que también son contaminantes peligrosos de aguas residuales y ríos ( Micha ł owicz et al., 2005, A6 sobre la aceleración de la eliminación de 4-CP (175 metro gg 1 suelo) también fue observado por Elv
€ ang y col. (2001) . Similar, Teng y col. (2017)
2008 ) A pesar de muchos estudios, nuestro conocimiento sobre cómo aumentar el ef fi La eficacia de
la degradación de monoclorofenol en el suelo utilizando métodos biológicos es aún limitada. Además, indicó el efecto positivo de la inoculación del suelo con Cupriavidus

se sabe poco acerca de cómo los microorganismos que están expuestos a los monoclorofenoles
sobreviven en el suelo y cómo estos compuestos afectan su diversidad estructural y funcional.
sp. YNS-85 sobre la eliminación de pentacloronitrobenceno (2.5 metro gg 1
suelo) del suelo. A su vez, los resultados de Kauppi y col. (2011) no estafó fi rm una degradación
mejorada de los hidrocarburos de combustible diesel (2.7 g kg 1 suelo) en suelo boreal que había sido
bioaumentado con un puro Acinetobacter cultivo y un consorcio microbiano enriquecido. Como
muchos estudios han indicado, la efectividad de la bioaugmentación depende de muchos factores,
como el óptimo

En nuestros estudios anteriores, se indicó que Pseudomonas sp.

224 A. Nowak, A. Mrozik / Journal of Environmental Management 215 (2018) 216 mi 229

Fig.4. Proyección de ácidos grasos individuales a lo largo de PC1 y PC2 (A, C, E) y FAME pro fi archivos del suelo de control, S þ 4-CP, S þ 4-CP þ CF600, S þ 4-CP þ KB2 (B), S þ 4-CP þ P, S þ 4CP þ PAGS þ CF600, S þ 4-CP þ PAGS þ KB2 (D) y S þ 4-CP þ SB,
S þ 4-CP þ SB þ CF600 (F). Los números en los subtítulos después del subyacente significan el día de muestreo (B, D, F).
 A. Nowak, A. Mrozik / Journal of Environmental Management 215 (2018) 216 e 229 225

Tabla 3
Los porcentajes de marcadores FAME distintos, relación sat / unsat e índice de Shannon (H ') para los suelos tratados y no tratados.

Tratos BG- BG þ C.A F Sat / unsat H00

Suelo bioaumentado con Pseudomonas sp. CF600 S þ CF600_1

15,58 ± 0,20 16,66 ± 0,56 3.17 ± 0,68 8.08 ± 0.23 3.19 ± 0,09 2,69 ± 0,16
S þ CF600_60 25,10 ± 0,66 15,27 ± 1.99 2,69 ± 0,12 ab 7.02 ± 0,01 una 3.81 ± 0,02 2,89 ± 0,10
S þ 4-CP þ CF600_60 25,02 ± 0,84 13,13 ± 0,19 3,33 ± 0,21 una 4.65 ± 0,60 si 4.13 ± 0,20 2,64 ± 0,14
S þ 4-CP þ PAGS þ CF600_60 26,17 ± 0.28 14,22 ± 1,71 2,18 ± 0,26 si 6.20 ± 1,23 una 3,67 ± 0,18 2,82 ± 0,12
S þ 4-CP þ SB þ CF600_60 25,16 ± 0,58 12,84 ± 1,88 2,74 ± 0,60 ab 4.49 ± 0,49 si 3.98 ± 0,18 2,80 ± 0,16
S þ CF600_100 27,37 ± 2,16 14,96 ± 0,34 1,39 ± 0,58 ce 6.62 ± 1,75 C 4.54 ± 0,17 2,87 ± 0,01
S þ 4-CP þ CF600_100 28,42 ± 0,48 12,95 ± 1,15 3,58 ± 0,12 re 4.13 ± 0,36 discos compactos 5,56 ± 0,95 2,88 ± 0,10
S þ 4-CP þ PAGS þ CF600_100 26,75 ± 1,31 13,92 ± 1,41 0,80 ± 0,04 C 4.40 ± 0,18 discos compactos 5.24 ± 0,67 2,83 ± 0,14
S þ 4-CP þ SB þ CF600_100 25.15 ± 1,25 11,78 ± 1,60 2,25 ± 0,22 mi 2,82 ± 0,16 re 5,76 ± 1,34 2,66 ± 0,10
Suelo bioaumentado con S. maltophilia KB2 S þ KB2_1
22,02 ± 0,48 16,08 ± 1,26 3,43 ± 1.19 7.69 ± 1,60 3.88 ± 0,47 2,60 ± 0,12
S þ KB2_60 23,94 ± 0,50 13,40 ± 1,17 2,44 ± 0,90 5.38 ± 0,18 3.88 ± 0,20 una 3,02 ± 0.25
S þ 4-CP þ KB2_60 22,19 ± 2,27 11,52 ± 2,54 3,02 ± 0,78 5.09 ± 1,56 3.77 ± 0,18 una 2,69 ± 0,05
S þ 4-CP þ PAGS þ KB2_60 22,77 ± 0,75 15,26 ± 2,14 2,67 ± 0,45 5.32 ± 0,92 4.51 ± 0,12 si 2,87 ± 0.25
S þ KB2_100 23,94 ± 1,95 13,47 ± 1,76 2.10 ± 0,39 5.00 ± 1,37 4.75 ± 0,55 3,07 ± 0,03 una
S þ 4-CP þ KB2_100 25,92 ± 3.00 12,69 ± 0,07 2,68 ± 0,54 3.94 ± 0,71 5.55 ± 0,39 2,82 ± 0,07 si
S þ 4-CP þ PAGS þ KB2_100 27,66 ± 1.08 14.15 ± 2,14 1,43 ± 0,17 5.21 ± 1,36 4.68 ± 0,39 2,75 ± 0,06 si
Suelos no bioaugulados S_1
20.00 ± 6.47 16,49 ± 1,61 2,45 ± 0,13 7.49 ± 0,44 3.29 ± 0,36 2,46 ± 0,06
S_60 22,40 ± 2,73 16,98 ± 0,94 2,84 ± 0,18 fg 6.01 ± 0,50 mi 4.42 ± 0,21 2,98 ± 0,09
S þ 4-CP_60 23,21 ± 0,47 13,83 ± 1.05 3.80 ± 1,41 F 4.93 ± 0,82 ef 4.83 ± 0.27 2.91 ± 0,04
S þ 4-CP þ P_60 23,18 ± 1.03 15,34 ± 0,16 1,94 ± 0,57 sol 4.85 ± 0,77 ef 4.74 ± 0,66 3.00 ± 0,30
S þ 4-CP þ SB_60 19,86 ± 3,66 14.02 ± 1,70 3,49 ± 0,78 fg 4.39 ± 0,51 F 4.96 ± 0,06 2,87 ± 0,29
S_100 24.97 ± 2.52 15.53 ± 1.05 ab 0.98 ± 1.39 4.33 ± 0.11 gh 5.30 ± 0.16 2.97 ± 0.06
S þ 4-CP_100 28.30 ± 1.56 17.31 ± 0.79 a 2.89 ± 0.51 3.88 ± 0.40 g 4.11 ± 0.16 2.87 ± 0.05
S þ 4-CP þ P_100 25.90 ± 0.44 15.48 ± 1.41 ab 1.82 ± 0.13 5.23 ± 0.54 h 4.66 ± 0.87 2.82 ± 0.19
S þ 4-CP þ SB_100 26.37 ± 1.97 13.22 ± 1.43 b 2.89 ± 0.96 3.17 ± 0.51 g 5.13 ± 0.58 2.81 ± 0.14

In each column the means with different letters are signi fi cantly different ( p < 0.05, LSD test) considering the effect of 4-CP, P and SB in the soil bioaugmented with Pseudomonas sp. CF600, S. maltophilia KB2 and non-bioaugmented soil on days
60 and 100, analysed separately. The means without any letters did not differ among others in the adequate soil and sampling day.

Table 4
The functional diversity indices for the treated and untreated soils.

Treatments AWCD H0 R E AUC

Soil bioaugmented with Pseudomonas sp. CF600 S þ CF600_1

0.719 ± 0.067 1.047 ± 0.031 23.22 ± 2.68 0.768 ± 0.019 663.81 ± 20.01
S þ CF600_60 0.076 ± 0.017 a 1.291 ± 0.010 a 23.43 ± 2.50 a 0.945 ± 0.030 a 70.73 ± 12.94 a
S þ 4-CP þ CF600_60 1.013 ± 0.010 b 1.237 ± 0.012 a 29.11 ± 1.45 b 0.845 ± 0.008 b 512.88 ± 7.26 b
S þ 4-CP þ P þ CF600_60 0.008 ± 0.001 c 1.588 ± 0.220 b 19.00 ± 1.00 c 1.243 ± 0.180 c 6.63 ± 0.27 c
S þ 4-CP þ SB þ CF600_60 0.795 ± 0.049 d 1.159 ± 0.040 c 29.00 ± 1.93 b 0.793 ± 0.020 b 498.03 ± 6.78 d
S þ CF600_100 0.026 ± 0.004 e 1.450 ± 0.076 d 19.00 ± 3.93 d 1.147 ± 0.090 d 19.24 ± 9.34 e
S þ 4-CP þ CF600_100 1.010 ± 0.009 f 1.178 ± 0.009 e 24.56 ± 2.29 e 0.849 ± 0.020 e 511.51 ± 10.30 f
S þ 4-CP þ P þ CF600_100 0.737 ± 0.022 g 1.140 ± 0.015 e 27.33 ± 2.18 f 0.795 ± 0.012 f 582.74 ± 27.63 g
S þ 4-CP þ SB þ CF600_100 0.998 ± 0.090 f 1.304 ± 0.040 f 28.40 ± 2.19 f 0.898 ± 0.028 e 728.31 ± 61.56 h
Soil bioaugmented with S. maltophilia KB2 S þ KB2_1
0.710 ± 0.044 1.132 ± 0.040 27.11 ± 1.61 0.790 ± 0.019 439.55 ± 71.34
S þ KB2_60 0.015 ± 0.001 h 1.280 ± 0.020 24.20 ± 0.15 g 0.930 ± 0.020 g 137.31 ± 30.20 i
S þ 4-CP þ KB2_60 0.727 ± 0.020 i 1.271 ± 0.010 28.78 ± 0.44 h 0.871 ± 0.440 h 341.79 ± 9.46 j
S þ 4-CP þ P þ KB2_60 0.021 ± 0.003 h 1.307 ± 0.040 24.50 ± 4.80 g 0,948 ± 0.045 g 31.22 ± 4.14 k
S þ KB2_100 0.024 ± 0.006 j 1.364 ± 0.034 g 22.33 ± 2.25 ij 1.013 ± 0.013 i 32.13 ± 2.96 l
S þ 4-CP þ KB2_100 0.608 ± 0.030 k 1.155 ± 0.020 h 26.22 ± 2.22 i 0.815 ± 0.012 j 361.68 ± 17.83 m
S þ 4-CP þ P þ KB2_100 0.003 ± 0.001 l 1.185 ± 0.014 i 17.33 ± 6.10 j 0.981 ± 0.131 i 1.43 ± 0.09 n
Non-bioaugmented soil S_1
0.660 ± 0.050 1.200 ± 0.013 24.44 ± 2.12 0.866 ± 0.020 367.52 ± 31.28
S_60 0.025 ± 0.003 m 1.615 ± 0.100 j 17.75 ± 3.50 km 1.300 ± 0.040 k 47.64 ± 6.50
S þ 4-CP_60 1.036 ± 0.010 n 1.292 ± 0.006 k 29.00 ± 0.87 l 0.883 ± 0.004 l 550.28 ± 6.03 p
S þ 4-CP þ P_60 0.005 ± 0.000 m 1.350 ± 0.038 k 19.50 ± 2.12 k 1.048 ± 0.068 m 13.89 ± 0.19
S þ 4-CP þ SB_60 0.489 ± 0.030 1.136 ± 0.036 l 15.89 ± 1.60 m 0.949 ± 0.060 n 384.32 ± 35.12 r
S_100 0.035 ± 0.009 p 2.100 ± 0.160 m 20.33 ± 2.08 n 1.605 ± 0.060 29.97 ± 5.92 s
S þ 4-CP_100 0.591 ± 0.009 r 1.124 ± 0.011 n 21.22 ± 2.10 n 0.849 ± 0.020 p 412.20 ± 10.89 t
S þ 4-CP þ P_100 0.016 ± 0.002 p 1.260 ± 0.047 25.11 ± 1.90 0.900 ± 0.017 r 4.80 ± 0.62 s
S þ 4-CP þ SB_100 0.535 ± 0.093 s 1.314 ± 0.041 24.44 ± 2.74 0.937 ± 0.019 s 318.61 ± 44.11 u

In each column the means with different letters are signi fi cantly different ( p < 0.05, LSD test) considering the effect of 4-CP, P and SB in the soil bioaugmented with Pseudomonas sp. CF600, S. maltophilia KB2 and non-bioaugmented soil on days
60 and 100, analysed separately. The means without any letters did not differ among others in the adequate soil and sampling day.

condiciones fisicoquímicas, ecología microbiana indígena, el procedimiento utilizado para suministrar que a menudo sufren estrés cuando entran en contacto con la complejidad de los hábitats naturales ( Mrozik
los agentes de remediación al medio ambiente, así como las propiedades individuales de los et al., 2011; Tyagi et al., 2011; Nzila et al., 2016 )
inoculantes,
226 A. Nowak, A. Mrozik / Journal of Environmental Management 215 (2018) 216 e 229

have been exposed to monochlorophenol because there is not any new information available in this fi eld.

Soil contamination with 4-CP had a signi fi cant impact on the structural and functional diversity of
the soil microbial communities. A fatty acid analysis indicated that essential changes in the FAME
patterns for the polluted S included an increase in the saturation of fatty acids, which was re fl ected in
the membrane hydrophilicity, mainly through an increase of the content of 3-hydroxy fatty acids. An
increase of the saturated to unsaturated fatty acid ratio can be considered to be a good indicator of
stress conditions. Furthermore, the shifts in the proportion of the hydroxy, branched, cyclopropane
and straight-chain fatty acids allowed the optimum hydrophilic-lipophilic balance of the membrane to
be achieved, which is considered to be an important parameter in the adaptation of cells to aromatic
hydrocarbon stress ( Segura et al., 2010; Kaczorek et al., 2013 ). Additionally, during the degradation
of 4CP as well as 4-CP and P by soil microbial communities, a signi fi-

Fig. 5. The pattern of carbon sources utilisation, N and P - use indexes for the treated and untreated soils. The
percentage of the absorbance of each group of substrates and index with the reference to the total absorbance of the
plate was presented as a colour scale ranging from dark green (0 e 2%) to burgundy (62%). (For interpretation of the
references to colour in this fi gure legend, the reader is referred to the Web version of this article.)
cant increase in the 19:0 cy u 10 c percentages in the FAME pro fi les was recorded. The appearance of
19:0 cy u 10 c in the FAME patterns as an indicator of the removal of phenol from the soil was
described previously in several articles ( Mrozik et al., 2008, 2010, 2011 ). Interestingly, in the soil that
had been contaminated with 4-CP and SB, no cyclopropane fatty acids were detected. This could be
explained by the lower toxicity of SB compared to P and the different mechanisms for regulating the
membrane fl uidity in the presence of these compounds ( Grogan and Cronan, 1997 ). The increase in
the content of 3-hydroxy fatty acids, which are a typical structural component of the
lipopolysaccharides in the outer membrane of BG-, was in accordance with the increase in the
percentages of marker fatty acids for BG-in all of the studied soils. At the same time, the increase of
the BG-marker distribution was followed by a decrease in the abundance of the F markers.
Regardless of the soil treatment, the contribution of the microbial group markers over the course of
the experiment can be ordered as follows: BG- > BG þ> F > Ac. The domination of the BG-in
environments that have been contaminated with toxic compounds was revealed in many studies ( M € annist
€

o et al., 2001; Podio et al., 2008;

Our study also indicated that the presence of P inhibited the rate of the removal of 4-CP from the
Wasilkowski et al., 2017 ). As the reported data indicates, the types of environment and contamination
treated soil. This was contrary to the results that were obtained for the bacteria Pseudomonas sp.
usually determine the development of the speci fi ed microbial groups and their dominance in the
CF600 and S. maltophilia KB2 that were cultivated in liquid batch cultures in which the addition of P
ecosystem. However, an interpretation of the shifts in the distinguishedmicrobial groups that depend
accelerated 4-CP degradation ( Nowak and Mrozik, 2016; Nowak et al., 2016 ). This could be a result
on contaminationwith aromatic compounds has not yet beenwell documented. Moreover, the
of the competitive inhibition of these two compounds. Such a phenomenon was described by Hao et
observed changes in the FAME pro fi les of individual strains growing on pure hydrocarbons in liquid
al. (2002) , who studied the degradation kinetics of a self-inhibitory growth substrate (P) and a
cultures are often contradictory with regard to those obtained for soil. For example, in our previous
non-growth (4-CP) substrate in Acinetobacter sp. batch liquid cultures. On the other hand, an intensi fi cation
studies, an important change in the cellular fatty acid composition of S. maltophilia KB2 during the
of the removal of 4-CP in the presence of P by activated sludge that had been bioaugmented with Pseudomonas
co-metabolic degradation of monochlorophenols was an increase in the contribution of branched fatty
putida CECT 4064 was reported by
acids, which are considered to be markers of BG þ

Monsalvo et al. (2012) . Contrary to P, the addition of SB to the soil that had been bioaugmented with Pseudomonas
( Nowak et al., 2016 ).
sp. CF600 signi fi-
The analysis of the functional diversity of microorganisms in the treated soil showed distinct
cantly accelerated the removal of 4-CP compared to the control soil. This stimulation may have
differences in their activity, which was manifested in the various utilisation patterns of the seven
resulted from the less toxic effect of SB on microorganisms compared to P or its easier
biochemical guilds. The most active microorganisms were found in the soil that had been
biodegradability with the simultaneous induction of the enzymes that are involved in the catabolic
contaminated with 4-CP and SB and bioaugmented with Pseudomonas sp. CF600 as was evidenced
pathways ( WHO, 2000; Guzik et al., 2009 ). The decline of the total number of THB in all of the treated
by the high values of the AUC, AWCD and R. The introduction of Pseudomonas sp. CF600 into the
soils in the range of 13 e 21% that was observed in this work was smaller to that in
soil that had been contaminated with 4CP and P also caused an increase in the microbial activity but
phenol-contaminated soil (5mg g 1) that had been inoculated with Pseudomonas sp.
to a lesser extent than in the corresponding soil that had been polluted with 4-CP and SB. Meanwhile,
in the soil that had been inoculated with S. maltophilia KB2 and in the non-inoculated soil, the mixture
of 4-CP and P had a toxic effect on the microbial community
JS150 and PCP-contaminated soil
(0.75mg g 1) that had been bioaugmented with immobilised
R. chlorophenolicus PCP-1, whichwas about 30 and 10%, respectively ( Briglia et al., 1990; Mrozik et
al., 2011 ). It is dif fi cult to make a comparative analysis of the THB count in bioaugmented soils that
 A. Nowak, A. Mrozik / Journal of Environmental Management 215 (2018) 216 e 229 227

Fig. 6. Cluster display of the seven guilds of carbon sources and FAME microbial markers for the treated and untreated soils over time.

functions. The functional diversity of soil microorganisms that have been exposed to aromatic differences in the utilisation patterns of carbon substrates between the polluted and non-polluted soils
compounds is not well documented or discussed in the literature. The results of Qasemian et al. con fi rmed that the introduction of aromatic compounds into the soil caused irreversible changes in the
(2012) , who found that the microbial activity during three months of anthracene exposure remained functional diversity of the soil microbial communities.
constant, while H 0 decreased, thus indicating that the microbial communities were more specialised
and utilised carbon sources more intensively than those in the control soil. In our study, the addition of
4-CP or 4-CP and P to the bioaugmented soil did not result in changes in the H 0 values; however, the
5. Conclusions
H ’ index increased in the non-polluted soils on day 100 of the experiment. These results might
indicate that the functional diversity of the microorganisms was primarily affected by the enrichment of
Our work underscores the importance of soil bioaugmentation in the removal of 4-CP, which
the soil with the external carbon sources. A more detailed analysis of the carbon source utilisation
poses a threat for the environment and human health. This study demonstrated that soil inoculation
patterns indicated that the addition of 4-CP, P and SB to the soil caused a more intensive utilisation of
with Pseudomonas sp. CF600 or S. maltophilia KB2 as well as the addition of an additional aromatic
PA compared to the non-polluted soil. This may indicate the induction of the enzymes that are
carbon source (P or SB) enhanced the removal of 4-CP from the soil. Naturally occurring micro fl ora
involved in the degradation of aromatic compounds in microorganisms that exist in contaminated
also participated in the 4-CP degradation in the presence of additional carbon source but to a much
soils. Furthermore, the heterotrophic fraction of bacteria in the contaminated soils and the soil that
lesser extent up to 40% compared to bioaugmented soils. Soil autochthonous microorganisms
had been bioaugmented with Pseudomonas sp. CF600 as well as in the nonbioaugmented soil
enriched with Pseudomonas sp. CF600 exhibited better degradative abilities towards aromatic
metabolised AA and A more intensively than in the non-contaminated soils, whichwas re fl ected in the
compounds than microbial populations enriched with S. maltophilia KB2, what indicated a greater
higher Nuse index. This could suggest that these microorganisms were versatile and were able to use
usefulness of Pseudomonas sp. CF600 in the bioremediation of 4-CP contaminated soil. This can
unexpected inputs of various dissolved organic carbon sources in the environment. All of these
also mean that indigenous microorganisms in the soil bioaugmented with Pseudomonas sp. CF600
created more synergies between themselves than in the soil inoculated with S. maltophilia KB2. The
important fi nding of this study was also that all of the tested aromatic compounds affected the soil
microbial community structure as well as they caused
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irreversible changes in the functional diversity of the soil microbial populations. Future studies will be
focused on the increasing in the ef fi ciency of 4-CP degradation in soil as well as the survival of
inoculants through their immobilisation in different carriers.
Acknowledgment
This work was partly supported by National Science Centre N N305 061640. We thank Michele
Simmons for improving the English of the manuscript as well as Daniel Wasilkowski and Justyna
Michalska from the University of Silesia in Katowice for valuable consultation and collaboration.
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