Sunteți pe pagina 1din 6

LP. 7. Prelevarea produselor patologice pentru diagnos-ticul virusologic.

Cultivarea virusurilor. Reacţii antigen-anticorp. Tehnici de biologie


moleculară.

A. Prelevarea produselor patologice pentru diagnosticul virusologic.


Cultivarea virusurilor

1. Virusuri = particule infecţioase formate dintr-un singur tip de acid nucleic


(ARN/ADN), metabolic inerte, lipsite de orice mecanisme necesare producerii şi stocării
de energie, nu cresc, nu se divid

Reguli de prelevare a produselor patologice


Alegerea produsului patologic → în funcţie de sindromul investigat putem examina:
-aspirate (exsudate, secreţii, excrete)
-lichid de spălătura nazală sau/şi faringiană
-materii fecale
-secreţii prelevate cu tamponul de pe mucoase şi din leziuni cutanate
-fragmente de ţesuturi
-sânge
-LCR, etc
Alegerea metodei de recoltare şi a momentului prelevării
- probele pentru diagnosticul virusologic direct trebuie examinate cât mai precoce, în faza
acută a bolii (primele 2-3 zile de boală) Explicaţie: depistarea virusului la poarta de
intrare
Asigurarea condiţiilor optime de transport şi conservare:
- recipient cu medii de transport (la care se adaugă antibiotice şi antifungice) pentru:
- menţinerea viabilităţii virusurilor
- împiedicarea dezvoltării altor microorganisme
-refrigerarea probelor (cu unele excepţii)
Sisteme de diagnostic:
- culturi de celule;
- cultivarea pe embrioni, în dezvoltare;
- izolarea pe animale de laborator susceptibile;

1
IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA VIRUSURILOR

I. Izolarea virusurilor în culturi de celule


Tipuri de culturi de celule:
Culturi primare :- obtinute din tesuturi adulte, supravietuiesc 5-6 cicluri de subcultivare
Linii de celule diploide : - obtinute din tesuturi embrionare, au morfologie si cariotip normal,
pot fi subcultivate 40-50 de generatii
Linii permanente : - provin din tumori canceroasa sau celule normale modificate malign, au
morfologie alterata si pot fi subcultivate indefinit
Etape:
-pregătirea suspensiei virale
-inocularea filmului celular
-incubarea

Depistarea şi cuantificarea virusului replicat:


a. efectul citopatic – rotunjirea şi desprinderea celulelor de pe suport, apariţia de sinciţii, etc
→ cuantificarea virusurilor prin metoda plajelor - unităţi formatoare de plaje
b. apariţia în supernatant a unor proteine codificate de virus (e.g., hemaglutinine)
c. adsorbţia eritrocitelor pe membrana modificată a celulelor care au replicat virus
d. incluziuni virale = acumulări de virioni sau componente virale în aria celulară de replicare şi
asamblare a unor virusuri (citoplasmă, nucleu) ; ex.: formaţiuni rotunde sau ovalare, bazofile
sau acidofile, IC sau/şi IN.
e. interferenţa virală = replicarea virusurilor care cultivă fără efect citopatic este depistată
indirect prin incapacitatea celulelor infectate de a replica un virus cunoscut citopatogen.
f. Depistarea antigenelor prin IF (reactii antigen-anticorp car efolosesc marcajul cu
fluoresceină)
g. transformarea celulelor normale în celule canceroase printr-un virus oncogen.

II. Izolarea pe ouă embrionate în dezvoltare


Indicată pentru izolarea virusurilor gripale, paragripale, herpetice, poxvirusuri.
Etape:
Indicată pentru izolarea virusurilor gripale, paragripale, herpetice, poxvirusurilor.
Etape:
 Inocularea embrionilor (în vârstă de 6-14 zile)
-în cavitatea amniotică (adaptare)
- pe membrana corioalantoidă
- in cavitatea alantoidă (LA –produs final pentru indentificare) – pasaje repetate
 Incubare la 35 ºC, 3-5 zile

Depistarea virusului replicat :


2
 moartea embrionului
 apariţia de pustule pe membrana corioalantoidă (MCA) - poxvirusuri
 acumularea de virus în lichidul amniotic / alantoidian

III. Izolarea pe animale de laborator de mici dimensiuni (şoarece alb, hamsteri, etc sau gazde
unice: maimuţe, cimpanzei); rar utilizate (vezi dezavantaje)
Produsul patologic recoltat in funcţie de sindromul clinic, prelucrat, se inoculează ic, sc, im, etc

Urmărirea replicării virusului :


- moartea animalului
- reproducerea bolii la animal (ex.: paralizii, tremor determinat de enterovirusuri)
- evidenţierea de leziuni histopatologice caracteristice la nivelul organelor ţintă;
Dezavantaje:
- costuri ridicate
- timp îndelungat pentru rezultatul final
- infecţii virale latente cu propriile virusuri care pot interfera cu replicarea virusului
inoculat
- reactivităţi diferite ale animalelor
- producerea de ac care împiedică expresia clinică.

Reacţii antigen-anticorp

Antigen substanţă străină care, pătrunsă într-un organism competent, determină


răspuns imun (imunogenitate) şi reacţionează specific cu efectorii imunitari apăruţi ca
rezultat al acestui răspuns (specificitate).

Anticorp imunoglobulină produsă în organism sub acţiunea unui antigen şi care are
proprietatea de a reacţiona specific cu antigenul corespondent.

Reacţia antigen-anticorp este stabilă în zona de echivalenţă (cantităţile celor doi


reactivi sunt aproximativ egale).

Fenomen de prozonă = absenţa reacţiei în prezenţa unui exces de anticorpi rezultat fals
negativ.

Aplicaţiile practice ale reacţiei antigen-anticorp


se bazează pe s
Se pot urmări:
- identificarea unui antigen necunoscut (în produse patologice sau tulpini
izolate în laborator) prin anticorpul omolog prezent în seruri imune de
pecificitateareferinţă
cuplării celor două elemente
3
- identificarea unui anticorp necunoscut prin antigenul omolog (diagnostic
serologic) Se pot obţine:
- relaţii calitative simpla identificare a unui reactiv
- relaţii cantitative determinarea titrului reactivului cercetat

Titru inversul diluţiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibilă reacţia cu cantităţi
constante şi definite ale reactivului omolog.

Principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp:

A. Reacţii de precipitare- sensibilitate scăzută


Principiu: un antigen solubil formează cu anticorpul omolog un complex insolubil.

B. Reacţii de aglutinare - Reacţii sensibile


Principiu cuplarea unui antigen în suspensie cu anticorpul omolog determină apariţia unui
aglutinat sub formă de mase vizibile, care se depun şi lasă supernatantul limpede.

4
Ag de referinţă – Ac necunoscut
C. Reacţia de fixare a complementului Ag necunoscut – Ser imun
Principiu două complexe antigen-anticorp îşi dispută complementul
Cuplu hemolitic
Hematii de oaie – Ser antihematii

complexul format în prima reacţie fixează complementul, încât a doua reacţie


nu mai are loc şi hematiile rămân intacte.

reacţie ( ) = lipsa
hemolizei reacţie ( ) =
hemoliză

D. Reacţii de neutralizare
Principiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a căror legare de receptori celulari
este urmată de efecte definite
= după reacţia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe
receptorii celulari, sunt neutralizate.
Clasificare:
Neutralizări = supravieţuirea animalelor receptive după injectarea amestecului imunoser-
virus /
toxină.
Reacţii de inhibare a hemaglutinării → identificarea virusurilor hemaglutinante
→ serodiagnosticul infecţiilor determinate de
virusurile hemaglutinante

hemaglutinine hematii hemaglutinare ( )


hemaglutinine Ac omologi hematii
sedimentare ( )

Principiu RIH (reacţia de inhibare a hemaglutinării): unele virusuri posedă


capacitatea de a aglutina hematii (RH). Reacţia este împiedicată de prezenţa Ac
prezenţi în serul de testat (post-infecţie sau post-vaccinare), în prezenţa antigenului
omolog.
RIH:
- oferă posibilitatea identificării unui virus hemaglutinant (diagnostic direct);
- permite stabilirea diagnosticului unei viroze, prin evidenţierea anticorpilor
specifici inhibitori ai hemaglutinării în serurile testate (seruri perechi:
acut si de convalescent); dezavantajul legat de timp (scop epidemiologic si
mai putinpentru pacienti)
- permite aprecierea eficientei vaccinarii si studierea Ac-lor anamnestici,
dupa trecerea prin infectie, pentru populatii largi (serograme) –
seroarheologie (istoria circulatiei virusurilor gripale, de-a lungul timpul, prin
determinarea Ac-lor in seruri obtinute de la varstnici)

Interpretare: - reacţie pozitivă (sedimentarea hematiilor -buton);


- reacţie negativă (hemaglutinare).

E. Reacţii cu anticorpi marcaţi:


Imunofluorescenţa
5
Reacţiile imunoenzimatice
(EIA)
Principiu: anticorpul poate fi marcat cu o enzimă; după formarea complexului cu
antigenul şi îndepărtarea reactivului necuplat, pentru estimarea activităţii
enzimatice, se adaugă substratul cromogen al enzimei → reacţia de culoare
dezvoltată este apreciată vizual sau spectrofotometric.
- ELISA

a. pentru detectarea antigenului – direct

Ac specific adsorbit pe suport insolubil proba în care urmărim Ag Ac marcat cu enzimă

b.pentru detectarea anticorpului – indirect

Ag adsorbit pe suport insolubil ser în care urmărim Ac anti-Ag Ac anti-Ig marcat cu enzimă

Immunoblotting (Western blot) – confirmarea infecţiei cu HIV

II. Tehnicile de biologie moleculară


- studiază genomul independent de cultivare
- utilizate pentru: - identificarea rapidă a microorganismelor direct în produsul patologic
-detecţia genelor de rezistenţă
-genotipare
- reprezentate de:
A) Hibridizarea cu sonde ADN complementare secvenţei nucleotidice cercetate (Southern blot)
B) Reacţia de polimerizare în lanţ (polymerase chain reaction-PCR) - constă în amplificarea unei
secvenţe de ADN ţintă cu ajutorul unei polimeraze şi a unor amorse care delimitează regiunea
genică ţintită. Ampliconul rezultat este apoi evidenţiat prin electroforeză în gel.
PCR poate evidenţia şi ARN dar necesită o etapă intermediară de revers transcriere a ARN în ADN
înainte de ampificare (Reverse Transcriptase – PCR sau RT-PCR).
PCR în timp real (qRT–PCR sau Real Time PCR) permite evidenţierea şi cuantificarea acidului
nucleic amplificat pe măsură ce are loc amplificarea.
C) Secvenţierea ADN – determină ordinea în care sunt aşezate bazele azotate în secvenţa
nucleotidică. Tehnica utilizează enzime de restricţie şi detecţie prin electroforeză capilară a
fragmentelor sintetic