Jurnal de pre-dovadă

Evaluarea activită•ilor antioxidante •i dermoprotectoare ale nanoparticulelor de aur ca

ingredient cosmetic sigur

Maroua Ben Haddada, Elise Gerometta, Rachid Chawech, Jonathan Sorres,

Anne Bialecki, Sabrina Pesnel, Jolanda Spadavecchia, Anne-Laure Morel

PII: S0927-7765 (20) 30085-0

DOI: https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2020.110855

Referinţă: COLSUB 110855

Pentru a apărea în: Coloizi și suprafețe B: Biointerfețe

Data primirii: 20 iulie 2019

Data revizuită: 13 ianuarie 2020

Data acceptată: 6 februarie 2020

Vă rugăm să cita•i acest articol ca: Haddada MB, Gerometta E, Chawech R, Sorres J, Bialecki A, Pesnel S, Spadavecchia J,
Morel A-Laure, Evaluarea activită•ilor antioxidante •i dermoprotectoare ale nanoparticulelor de aur ca ingredient cosmetic
sigur, Coloide și suprafețe B: Biointerfețe ( 2020), doi: https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2020.110855

Acesta este un fi•ier PDF al unui articol care a suferit îmbunătă•iri după acceptare, cum ar fi adăugarea unei pagini de
acoperire •i a metadatelor •i formatarea pentru lizibilitate, dar nu este încă versiunea definitivă a înregistrării. Această versiune
va fi supusă copierii, compunerii •i revizuirii înainte de a fi publicată sub forma finală, dar oferim această versiune pentru a da
vizibilitate timpurie a articolului. Vă rugăm să re•ine•i că, în timpul procesului de produc•ie, pot fi descoperite erori care ar putea
afecta con•inutul, precum •i toate excep•iile legale care se aplică jurnalului.

© 2020 Publicat de Elsevier.

 Evaluarea activităților antioxidante și dermoprotectoare ale aurului

nanoparticule ca ingredient cosmetic sigur

Maroua Ben Haddada 1,2, Elise Gerometta 1,3, Rachid Chawech 1, Jonathan Sorres 1, Anne Bialecki 3, Sabrina Pesnel 1, Jolanda
Spadavecchia 2, Anne-Laure Morel 1

1 TORSKAL nano•tiin•e, 2 rue Maxime Rivière, 97490 Sainte-Clotilde, La Réunion Fran•a

2 CNRS, UMR 7244, CSPBAT, Laboratoire de Chimie, Structures et Propriétés de Biomateriaux et d’Agents

Thérapeutiques, Université Paris 13, Sorbonne Paris Cité, Bobigny, Fran•a

3 LCSNSA - Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et des Sciences des Aliments - UR, 15 avenue René Cassin,

Faculté de Sciences et Technologies, Université de la Réunion

Autori corespondenți: annelaure.morel@torskal.fr

Autorul corespunzator: annelaure.morel@torskal.fr *

dă
va
Abstract grafic
do
e-

SINTEZA CONVENȚIONALĂ
Reducere controlată la 330 K
pr
de

Δ / N2
TESTE BIOLOGICE
Efectele AuNP asupra produc•iei de MMP-1 indusă de UV-A

CAuNP
al

SINTEZA VERDE
rn

Bio-reducere prin compu•i

polifenolici în H. ambavilla
Ju

polifenoli Δ / H2 O

H. ambavilla GAuNP

Extract de HAuCl acid AuNP-uri testate

Citrat de trisodiu
polifenoli cloroauric 4

1
 Repere

• Reducerea sării de aur efectuată de polifenol con•inut în Hubertia ambavilla extracte

• Verde nanoparticulele de aur sunt ingrediente cosmetice sigure

• Dermoprotective verde nanoparticulele de aur previn deteriorarea ultravioletei A, a radicalilor liberi

• Verde nanoparticulele de aur nu sunt genotoxice, nu irită •i nu sensibilizează

Abstract
Hubertia ambavilla, o plantă endemică originară din Insula Reunion din Oceanul Indian, este utilizată în mod tradi•ional ca
antiinflamator •i în vindecare, atât pentru uz intern cât •i extern. Compu•ii polifenolici din extrac•iile apoase de fază pot reduce
sărurile metalice în nanoparticule •i le pot stabiliza într-o singură etapă. De•i nanoparticulele de aur sunt bine descrise în literatura
de specialitate ca ingrediente antiageing, nanoparticulele prezentate aici sunt inedite •i sunt sintetizate folosind un proces verde. Îi

dă
demonstrăm eficien•a lor ca dermoprotectoare, exfoliante de radicali liberi •i ingrediente cosmetice antioxidante. Compara•ia cu
nanoparticulele obi•nuite ob•inute prin metoda Turkevich subliniază clar necesitatea de a ecraniza cu aten•ie produsele utilizate
pentru acoperirea nanoparticulelor, deoarece acestea joacă un rol major în proprietă•ile biologice ale produsului. Hubertia
va
ambavilla Nanoparticulele de aur mediate sunt non-toxice pentru fibroblastele dermice umane, posedă poten•ial de scăpare a
radicalilor liberi •i protejează împotriva deteriorării fibrelor •i a celulelor dermice cauzate de radia•iile ultraviolete A.
do
e-

CUVINTE CHEIE: Nanoparticula, nanoparticula de aur, extract de plante, plantă medicinală, antioxidant, dermoprotector, chimie
pr

verde, ingrediente cosmetice

de

1. Introducere
al

Nanoparticulele sunt utilizate pe scară largă •i cercetate în mai multe domenii precum medicamente, cercetări de mediu sau produse

cosmetice [1-3]. Comisia Europeană define•te un nanomaterial drept „un particule natural, incidental sau fabricat •i în care, pentru 50% sau
rn

mai multe particule din distribu•ia mărimii numărului, una sau mai multe dimensiuni exterioare se situează în intervalul de mărimi 1-100

nm" [4] .
Ju

Au fost descrise anterior două protocoale diferite [5] pentru sinteza nanoparticulelor de aur, fie din extractul brut
hidrosolubil al plantelor medicinale, fie din totalul flavonoidelor. Utilizarea extractelor brute hidrosolubile a condus la
particule sub formă de nanofloră, în timp ce totumul a produs nanoparticule sferice monodispersate mai mici. Natura •i
raportul frac•iilor fitochimice au o semnifica•ie deosebită pentru formarea nanoparticulelor. Compu•ii principali ai Hubertia
ambavilla sunt flavonoide, taninuri, proantocianidine •i complexe de carbohidra•i care pot conferi

2
proprietă•i antiinflamatorii •i vindecătoare terapeutice •i alte activită•i terapeutice utilizate pentru tratarea infec•iilor renale, astmului
•i diabetului [6-8].

Nanoparticulele de aur sunt utilizate în produse cosmetice, mai ales ca dezinfectan•i ai plăgii, anti-inflama•ie •i creme
anti-îmbătrânire. Pielea este expusă multor factori care o deteriorează, inclusiv poluarea, expunerea la razele ultraviolete solare
(UV), fumul de •igară etc. Ace•ti factori sunt responsabili de producerea speciilor reactive de oxigen (ROS). Un exces de ROS
induce stres oxidativ care dăunează celulelor, ADN-ului •i proteinelor, ducând astfel la îmbătrânirea pielii prin reglarea expresiei
metaloproteinazelor matrice degradante de colagen •i elastină (MMP) [9]. Este important să ajutăm pielea să se protejeze, oferind o
sursă suplimentară de antioxidan•i [10].

În studiul de fa•ă, am studiat poten•ialul aplicare al nanoparticulelor de aur verde ca ingredient cosmetic. Am evaluat efectele acestora

asupra celulelor normale ale fibroblastului uman, precum •i asupra activită•ilor antioxidante •i le-am comparat cu rezultatele ob•inute cu cea

mai veche metodă Turkevich [11].

2. Experimental
2.1. Reactivi și substanțe chimice

Acidul tetracloroauric (HAuCl4) a fost achizi•ionat de la Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, Fran•a) •i citrat de potasiu

dă
de la ACROS Organics (Geel, Belgia). Plantele provin din habitatele naturale din Insula Reunion •i au fost colectate cu
permisiunile necesare.
va
2.2. Sinteza nanoparticulelor de aur
2.2.1. Sinteza verde a nanoparticulelor de aur folosind extracte de plante [ 5]
do

Au fost preparate nanoparticule de aur verde (GAuNP) conform procedurii descrise anterior (5). Pe scurt, 50 ml de
solu•ie apoasă de HAuCl 4, 1 mM, a fost refluxat cu agitare viguroasă, într-un balon echipat cu condensator de reflux •i
e-

protejat de lumină. Apoi, după ce picăturile fine au apărut pe pere•i, s-au adăugat foarte repede 20 ml de solu•ie apoasă
acidă din extract total de plante brute. Solu•ia s-a albastru rapid în 1 min.
pr

2.2.2. Sinteza nanoparticulelor de aur prin metoda Turkevich

de

100 ml de solu•ie apoasă de 1 mM HAuCl4 au fost refluxate cu agitare viguroasă într-un balon echipat cu
condensator de reflux •i protejat de lumină. Apoi, după ce au apărut picături fine pe pere•i, s-au adăugat 10 ml citrat de
potasiu (38,8 mM).
al

2.3. Caracterizarea AuNP

rn

Toate măsurătorile au fost efectuate cel pu•in în trei exemplare.

Ju

Spectrele de absorb•ie UV-Vis (lungimea de undă: 200-900 nm) au fost înregistrate de un Perkin Elmer Lambda UV / Vis 950
folosind celule de plastic de 1 cm la temperatura camerei.
3µl picătură de solu•ie AuNP depusă pe o re•ea de cupru acoperită cu carbon, au fost analizate prin microscopie electronică de transmisie (TEM)

dobândită pe un microscop TEM / STEM Technai Osiris (FEI) echipat cu un detector de câmp întunecat cu unghi înalt care func•ionează la 200 kV.

Distribu•iile de dimensiuni ale particulelor hidrodinamice •i poten•ialul zeta au fost măsurate pe un Zetasizer NanoZSP (Malvern Instruments) la

25 ° C.

3
 2.4. Stabilitatea suspensiilor GAuNP

Stabilitatea suspensiilor de nanoparticule de aur verde (GAuNP) stocate la 4 ° C timp de peste o lună a fost evaluată pe baza
modificărilor spectrelor de absorb•ie ale solu•iilor GAuNP. În plus, am comparat distribu•iile de dimensiuni ale particulelor
hidrodinamice de suspensii proaspete •i în vârstă (4 luni păstrate la 4 ° C).

2.5. Caracterizarea extractelor de plante medicinale pentru sinteza nanoparticulelor de aur verde

2.5.1. Analiza HPLC-UV-ESI-HR-MS / MS

Extractul (10 mg) a fost preluat în 500 ui dintr-un amestec de apă / acetonă 4/1 v: v, deoarece adăugarea de apă
singură a lăsat reziduuri nedizolvate. 1 µL din acest extract a fost injectat în ma•ina noastră LC-MS / HRMS (lan•ul Dionex
Ultimate 3000 HPLC cu detector de diodă vizibilă UV •i spectrometru de masă Q-TOF Impact II Bruker) pe o coloană
Nucleoshell RP18 50 mm × 4 mm id, 2,7 μm, cu un gradient între următoarele faze mobile: H 2 O + 0,1% acid formic /
acetonitril + 0,1% acid formic. Analiza a fost realizată în mod negativ cu o sursă electrospray. S-au făcut două injec•ii: o
simplă analiză a modului MS •i o analiză a modului dependentă de date, numită autoMS / MS (adică alternând între SM •i
MS / MS pe majoritatea ionilor din spectrul MS anterior).

Analiza RMN H

dă
1
2.5.2.

1 Spectrele H-RMN au fost ob•inute folosind un spectrometru Bruker Ascend 600 NMR care func•ionează la 600 MHz în CD 3 OD.

Într-un experiment tipic, 5 mg din frac•ia C s-au dizolvat în 1 ml CD 3 OD într-un tub RMN •i citirile au fost luate între 0-14 ppm.
va
Rezonan•a internă a metanolului a fost utilizată ca referin•ă internă. Constante de cuplare sunt date în Hertz. Schimbările chimice

sunt exprimate în δ (ppm).

do

2.6. Activități biologice

2.6.1.
e-

In vitro cultură de celule

Au fost utilizate fibroblastele dermale umane normale (NHDF) izolate de prepu•ul nou-născut. NHDF au fost cultivate în DMEM
pr

(GIBCO®, Invitrogen TM) completat cu 10% ser de vi•el fetal (FCS) •i antibiotice într-o atmosferă umidificată la 37 ° C •i 5% CO 2. Celulele
au fost cultivate în mod obi•nuit în baloane de cultură de 25-75 cm² •i subcultivate în mod regulat înainte de confluen•ă.
de

2.6.2. In vitro citotoxicitate

al

Toxicitatea AuNP a fost evaluată la NHDF însămân•ate în placi cu 96 de godeuri la 20x10 3 celule pe godeu. Viabilitatea celulară a fost

evaluată prin analiza neutră a absorb•iei ro•ii neutre (NRU). Solu•iile AuNP au fost preparate în mediu complet (DMEM + 1% FCS) după
rn

omogenizarea cu ultrasunete (3 cicluri de 5 s la 20 kHz). A fost testată o gamă largă de concentra•ii (de la 0,005 până la 100 pg / ml),

exprimată în greutate / greutate de material activ. Testele NRU au fost efectuate după 24 de ore •i 72 de ore de incubare.
Ju

2.6.3. In vitro Test DPPH

Procentul de activitate antioxidantă a fost evaluat folosind analiza radicalilor liberi 2,2-difenil-1-picrililhidrazil (DPPH).
Solu•iile AuNP au fost preparate în etanol după omogenizarea cu ultrasunete (3 cicluri de 5 s la 20 kHz). Au fost testate
concentra•ii cuprinse între 0,05% •i 10%. Reducerea DPPH a fost evaluată prin schimbarea absorban•ei la 540 nm a unei
solu•ii DPPH (0,126 Mm în etanol) după 30 de minute de incubare la 37 ° C cu AuNP. Fiecare măsură a fost efectuată în trei
exemplare •i

4
în test a fost inclus un control pozitiv (α-tocoferol la 50 pM). Activitatea DPPH (%) a fost calculată conform formulei:
[DPPH] = [Abs Treated / Abs Control] x 100.
2.6.4. In vitro activitate anti-colagenază

Testul s-a bazat pe evaluarea produc•iei de metaloproteinază matricială 1 (MMP-1 sau colagenază) prin cultura NHDF în
absen•a sau prezen•a GAuNP •i expusă la razele ultraviolete A (UV-A). Ultravioletul A (UVA) are o lungime de undă mai lungă •i
este asociat cu îmbătrânirea pielii. După numărare, celulele au fost suspendate în mediu complet (DMEM + FCS) •i însămân•ate în
plăci cu 24 de godeuri la o densitate de 75x10 3 celule pe godeu. 72 ore după placare, mediul a fost îndepărtat •i înlocuit cu mediu
proaspăt suplimentat cu 1% FCS •i con•inând diferite concentra•ii de GAuNP. Celulele NHDF au fost apoi incubate timp de 24 de
ore. Înainte de iradiere, monostraturile celulare au fost spălate cu HBSS •i expuse la UV-A în prezen•a HBSS care con•ine solu•ia
AuNP la diferite concentra•ii cu o bancă paralelă de tuburi Philips TL-K 40W ACTINIC BL REFLECTOR. Imediat după iradiere,
solu•iile HBSS au fost retrase •i înlocuite cu mediu proaspăt suplimentat cu 1% FCS •i con•inând solu•ia AuNP. Celulele NHDF au
fost apoi înlocuite în incubator la 37 ° C timp de 24 de ore. La sfâr•itul testului, mediul condi•ionat din culturile NHDF a fost colectat
•i păstrat la -20 ° C până la analiza MMP-1. Concomitent, monostraturile NHDF corespunzătoare au fost extrase pentru a cuantifica
con•inutul de proteine. Nivelurile de proteine ​au fost determinate folosind kitul de analiză a proteinei BCA. După clătirea celulelor cu
HBSS, s-a adăugat solu•ie de NaOH (0,1 N) în fiecare godeu. După 10 min de incubare la temperatura camerei, alicotele de lizat
au fost transferate într-o microplată cu 96 de godeuri •i s-a adăugat reactiv BCA. După o perioadă de 30 de minute, densită•ile
optice au fost măsurate la 570 nm.

dă
Activitatea MMP-1 a fost determinată folosind un test ELISA (Human Pro-MMP-1 Quantikine; R&D Systems®) pentru
va
detectarea •i măsurarea cantitativă a MMP-1 în supernatan•ii de cultură celulară, conform instruc•iunilor producătorului.
Fiecare măsură a fost efectuată în trei exemplare •i a fost inclus un test pozitiv (α-tocoferol la 1 mM) pe test.
do

2.6.5. Ex vivo evaluarea activității antioxidante pe explantele pielii umane

e-

Au fost preparate 15 explante de piele dintr-o abdominoplastie a unei femei caucaziene, fototipul II, în vârstă de 55 de ani. Au
pr

fost cultivate în BEM într-o atmosferă umidificată la 37 ° C •i 5% CO 2. Aplicarea topică a GAuNP a fost realizată cu 2 pL de solu•ie
per explant (2mg / cm²). După 4 zile, unele explante au fost plasate în HBSS •i expuse la UV-A (18J / cm²). Imediat după iradiere,
solu•iile HBSS au fost retrase •i înlocuite cu mediu proaspăt •i apoi înlocuite în incubator la 37 ° C timp de 24 de ore. Exploratele
de

au fost apoi tăiate la jumătate. O parte a fost fixată într-o solu•ie tamponată de formalină •i a doua parte a fost congelată •i păstrată
la -80 ° C. După 24 de ore, 5 µm felii au fost preparate pentru a observa viabilitatea celulară (pata trichromă a lui Masson) •i
proteine ​oxidate (imunolabelling).
al
rn

2.7. Studii de securitate

2.7.1. Studii de toxicitate

Ju

2.7.1.1. Toxicitate acuta

Studiul de toxicitate acută AuNP s-a bazat pe documentul de orientare nr. 129 al OCDE. Toxicitatea a fost evaluată la fibroblastele de

•oarece Balb / c 3T3 însămân•ate pe microplaci cu 96 de godeuri la 2x10 3 celule pe godeu. Viabilitatea celulară a fost evaluată prin analiza

neutră a absorb•iei ro•ii neutre (NRU). Solu•iile AuNP au fost preparate în DMEM după omogenizarea cu ultrasunete. A fost testată o gamă

largă de concentra•ii (de la 0,01 la 125000 pg / ml). Testul NRU a fost efectuat după incubare de 48 de ore.

2.7.1.2. Testele de fototoxicitate 3T3 NRU

5
 Testul compară citotoxicitatea substan•elor chimice aplicate fibroblastelor de •oarece (Balb / c 3T3, clona A31) în prezen•a sau
absen•a unei expuneri la un nivel non-citotoxic de lumină UV-A (5 J / cm2). Citotoxicitatea a fost măsurată ca inhibarea capacită•ii
de a prelua colorantul vital, Ro•u Neutral (NR), la o zi după tratamentul cu UV. Acest studiu s-a bazat pe Ghidul OCDE nr. 432.
Fototoxicitatea a fost evaluată în fibroblastele de •oarece Balb / c 3T3 însămân•ate în placi cu 96 de godeuri la 1x10 4 celule pe
godeu. Plăcile au fost incubate timp de 24 de ore, apoi mediul de cultură a fost îndepărtat •i celulele au fost spălate cu HBSS
preîncălzit. Apoi, pentru fiecare placă, au fost aplicate celulelor opt concentra•ii de AuNP •i CPZ (control pozitiv) (•ase replici /
concentra•ie). Celulele au fost expuse la produs timp de o oră. La sfâr•itul perioadei de tratament, o placă per element de test sau
control pozitiv a fost expusă la lumina UV, în timp ce cealaltă placă a rămas la întuneric. Pentru plăcile iradiate, celulele au fost
iradiate cu 5 J / cm2 la temperatura camerei într-un UVACUBE 400 (Sol-500) echipat cu un filtru H1 prin capacul plăcii cu 96 de
godeuri. La 50 de minute de la începerea tratamentelor u•oare, solu•iile din fiecare godeu din toate plăcile au fost îndepărtate •i
celulele au fost spălate de două ori cu HBSS preîncălzit. Testul NRU a fost utilizat pentru a evalua modificările viabilită•ii celulare
după ce celulele NHDF au fost incubate cu AuNP la diferite concentra•ii (de la 0,01 la 200 pg / ml) pentru incubare de 24 sau 72
ore. Celulele martor au fost incubate cu mediu complet (DMEM + 1% FCS) •i experimentele au fost repetate de •ase ori.

2.7.2. Analize de sensibilizare

2.7.2.1. Testul keratinosens

dă
Celulele KeratinoSens au fost placate pentru prima dată pe plăci cu 96 de godeuri •i cultivate timp de 24 de ore la 37 ° C. Apoi,
mediul a fost îndepărtat •i celulele au fost expuse controlului vehiculului sau la diferite concentra•ii de AuNP •i ale unor controale
va
pozitive. Plăcile tratate au fost apoi incubate timp de 48 de ore la 37 ° C. La sfâr•itul tratamentului, celulele au fost spălate, iar
produc•ia de luciferază a fost măsurată prin luminiscen•ă flash. În paralel, citotoxicitatea a fost măsurată prin testul de reducere a
MTT •i a fost luată în considerare în interpretarea rezultatelor sensibilizării.
do
e-

2.7.2.2. Test SENS-IS

pr

Solu•ia AuNP s-a depus pe suprafa•a epidermei •i s-a răspândit u•or pe întreaga suprafa•ă. După 15 minute de
expunere, Episkin TM a fost clătit cu PBS •i apoi incubat la 37 ° C timp de 6 ore. După incubare, epiderma reconstruită a fost
îndepărtată de inser•ii cu forceps •i plasată într-un criotub pentru înghe•area în azot lichid. Epiderma a fost transferată
de

într-un tub care con•ine 1mL de reactiv Qiazol •i 2 perle de o•el, apoi omogenizată folosind TissueLyser II. După
centrifugare, supernatantul a fost colectat •i păstrat la -20 ° C până la extragerea ARN •i analiza a 61 de gene legate de
procesul de iritare, SENS-IS •i ARE.
al
rn

2.7.3. Testele de iritație

Ju

2.7.3.1. In vitro test de iritare a pielii

Proiectul studiului s-a bazat pe Orientarea OCDE nr. 439. Poten•ialul de iritare a pielii AuNP a fost evaluat folosind
Episkin TM model de epidermă umană reconstruită. AuNP •i ambele controale negative •i pozitive au fost aplicate topic pe
•esuturi triplicate •i incubate la temperatura camerei timp de 15 minute. La sfâr•itul perioadei de tratament, fiecare •esut a fost
clătit cu D-PBS •i incubat timp de 42 de ore la + 37 ° C, 5% CO 2 într-un incubator umidificat. Viabilitatea celulară a fost apoi
evaluată prin testul de reducere a MTT colorimetric.

6
 2.7.3.2. In vitro test de iritare a ochilor

Poten•ialul de irita•ie acută a AuNP a fost evaluat prin măsurarea efectului lor citotoxic asupra EpiOcular TM model epitelial
cornee. AuNP •i ambele controale negative •i pozitive au fost aplicate topic pe •esuturi duplicate •i incubate la 37 ° C timp de
30 de minute. La sfâr•itul perioadei de tratament, fiecare •esut a fost clătit cu D-PBS, incubat timp de 12 minute la
temperatura camerei, pentru a îndepărta orice element de test rămas din •esut, a fost eliminat pe material absorbant, apoi
incubat pentru încă 2 ore la 37 ° C. , 5% CO 2 într-un incubator umidificat. Viabilitatea celulară a fost apoi evaluată prin testul
de reducere a MTT colorimetric.

2.7.4. Testele de mutație și micronucleu

2.7.4.1. In vitro test de mutație a genelor celulelor de mamifer

Proiectul studiului s-a bazat pe Ghidul OCDE nr. 490. AuNP, diluat în apă pentru injec•ii, a fost testat într-un singur
experiment, cu •i fără un sistem de activare metabolică (amestec S9) preparat din frac•ia microsomală hepatică (frac•ia S9) din
•obolan indus cu Aroclor 1254. Culturi de 20 ml la 5 x 10 5 L5178Y TK +/- celule de limfom de •oarece / mL au fost expuse la
AuNP sau controale în prezen•a sau absen•a amestecului S9 (concentra•ia finală a frac•iei S9 2%). Pe parcursul perioadei de
tratament de 3 ore, celulele au fost men•inute sub formă de cultură de suspensie în mediul de cultură RPMI 1640, suplimentat
de ser de cal inactivat prin căldură la 5% într-un incubator umidificat de 37 ° C, 5% CO2. Citotoxicitatea a fost măsurată prin
evaluarea cre•terii totale ajustate, cre•terea relativă a suspensiei ajustată •i eficien•a clonării după timpul de exprimare.

dă
Numărul de clone mutante (diferen•iat de coloniile mici •i mari) a fost evaluat după exprimarea fenotipului mutant.
va
2.7.4.2. In vitro test micronucleu
do

Obiectivul acestui studiu a fost de a evalua poten•ialul AuNP de a induce o cre•tere a frecven•ei celulelor micronucleate pe linia
de celule de •oarece L5178Y TK +/-. Proiectul studiului s-a bazat pe Orientarea OCDE nr. 487. După un test preliminar de
e-

citotoxicitate, AuNP diluat în apă pentru injec•ii a fost testat într-un singur experiment citogenetic, cu •i fără un sistem de activare
metabolică, amestecul S9, preparat dintr-un microsomal hepatic frac•ie (frac•ie S9) de •obolani indusă cu Aroclor 1254. Fiecare
pr

tratament a fost cuplat la o evaluare a citotoxicită•ii la acelea•i doze. Citotoxicitatea a fost evaluată prin determinarea PD (dublarea
popula•iei) a celulelor. După numărarea finală a celulelor, celulele au fost spălate •i fixate. Apoi, celulele din trei niveluri de doză de
de

culturi tratate cu AuNP au fost aruncate pe lamele de sticlă curate. Glisierele au fost uscate în aer înainte de a fi colorate în Giemsa
5%. Alunecările de la vehicul •i controlul pozitiv culturi au fost, de asemenea, pregătite a•a cum este descris mai sus. Pentru fiecare
experiment principal (cu sau fără amestec S9), micronucleii au fost analiza•i pentru trei niveluri de doză de AuNP, pentru vehicul •i
al

controalele pozitive, în 1000 de celule mononucleate pe cultură (în total 2000 de celule mononucleate pe doză).
rn
Ju

2.8. analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SD a trei probe. Testul t al elevului a fost utilizat pentru a evalua semnifica•ia statistică
a rezultatelor. Diferen•ele dintre grupuri au fost considerate semnificative statistic atunci când p valoare <0,001.

7
 3.1. rezultate si discutii
3.1. Sinteza și caracterizarea nanoparticulelor de aur verde

GAuNP au fost sintetizate a•a cum au fost descrise anterior de Morel •i colab. [5]. Adăugarea extractelor de plante la solu•iile
precursoare de aur încălzite a indus o schimbare de culoare de la galben pal la albastru. Această schimbare de culoare atribuită
excita•iei Plasmonului de suprafa•ă (SP) este prima dovadă a formării AuNP. În spectrele UV UV, am observat dispari•ia bandei SP
a Au (III) la 290nm în favoarea SP între 524-550 nm, ceea ce se datorează reducerii sărurilor de aur •i formării Au (0), în prezen•ă
agen•i de bioreduc•ie din extractele vegetale [12].

Spectroscopia UV-Vis permite evaluarea formării •i stabilită•ii nanoparticulelor în solu•ie apoasă. Figura 1a prezintă
un spectru tipic; absorb•ia maximă a fost ob•inută pentru λ max
între 524-550 nm, ceea ce corespunde nanoparticulelor de dimensiuni de 40-80 nm, conform literaturii [13].

Diametrul mediu hidrodinamic al GAuNP este de 97,7 ± 7,1 nm. Indicele de polidispersitate (PDI) este
0,25 ± 0,04. Acest diametru se bazează pe mi•carea browniană •i ia în considerare stratul de extract de plante format în jurul
nanoparticulei. Diametrul hidrodinamic este mai mare decât diametrul „uscat” datorită solvării, legării de hidrogen •i efectelor van
der Waals. Poten•ialul zeta este de -33,8 ± 7,4 mV datorită încărcării negative a grupului hidroxil de flavonoizi care acoperă
nanoparticulele, care este responsabil pentru stabilitatea lor.

dă
În Figurile 1b și d, GAuNP apar în TEM sub formă de particule sub formă de flori polidispersice cu dimensiunea medie de 50 nm.
va
Aceste particule sunt asociate cu componente organice provenite din extracte de plante. Flavonoidele prezente în extractul vegetal sunt

capabile să reducă ionii de aur •i să ac•ioneze ca agen•i de captare eficien•i, stabilizând GAuNP. Imaginile TEM prezintă nanoparticule
do

înconjurate de un strat sub•ire cu o densitate electronică slabă atribuită unui strat organic, care stabilizează AuNP.
e-

Studiile de stabilitate au fost efectuate pe suspensia de nanoparticule ( Figura 1c). Nu s-a observat nicio redshift timp de o
lună, ceea ce indică absen•a agregării.
pr

3.2. Caracterizarea extractelor de plante medicinale pentru sinteza nanoparticulelor de aur verde
de

Extractul brut al plantei medicinale a arătat o solubilitate mai mare în apă decât flavonoidele izolate atunci când au fost
introduse în amestecul de reac•ie. Acest lucru sugerează o interac•iune sinergică între flavonoide care duce la o reac•ie eficientă
de reducere.
al

În primul rând, extractul apos a fost analizat prin HPLC-HR-MS-ESI-MS / MS. Aceste extracte brute au fost apoi frac•ionate
prin MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) în 5 frac•ii AE ( Figura 2a). Strategia în fitochimie a constat în
rn

identificarea frac•iilor fundamentale necesare pentru reducerea aurului, sinteza nanoparticulelor •i stabilizarea acestora.
Obiectivul este de a efectua o elucidare preliminară a mecanismului de reac•ie prin analizarea compu•ilor principali (18
Ju

molecule).

Am efectuat sinteza nanoparticulelor cu diferite frac•ii AE. Spectrul de absorb•ie al GAuNP ob•inut cu frac•ii
polifenolice (BE) sunt prezentate în Figura 3. Frac•iile A •i B au dus la formarea de particule foarte mari •i instabile
(culoare gri) care se precipită rapid. Redshift-ul bandei plasmonice spre 580 nm cu absorb•ie ridicată în jurul valorii de
780 nm a indicat formarea de agregate. Frac•ia C a demonstrat interesant o bandă plasmonică la 530 nm •i
nanoparticule similare ob•inute cu extractele întregi brute. În cele din urmă, GAuNP ob•inut cu frac•iile D •i E au dat

8
respectiv o bandă plasmonică la 538 nm (mai intensă decât C) •i la 540 nm (aceea•i intensitate ca D). O altă diferen•ă cu D
este că nu avem aceea•i cinetică de formare a NP-urilor, E necesită mai mult timp decât D (60 s fa•ă de 30 s).

HPLC-UV din extractul apos din frunzele Hubertiei ambavilla a fost prezentat în Figura 2b. La lungimile de undă de 190,
220, 325 •i 354 nm, care au fost utilizate pentru detectarea deriva•ilor de acizi clorogenici •i a flavonoidelor, extractul apos a
prezentat o diversitate mai mare de compu•i polifenoli. Analiza fitochimică a acestui extract prin HPLC-ESI-HR-MS / MS în
mod negativ a arătat prezen•a a două familii de compu•i fenolici. Compu•ii au fost identifica•i •i cuantifica•i prin compararea
timpilor de reten•ie, a datelor spectrale (LC-ESI-MS / MS) •i conform literaturii [14-17]. Un total de optsprezece compu•i
fenolici din care •aisprezece apar•inând familiei acizilor clorogenici ( 1-8, 11-18) •i doi flavonoizi ( 9, 10) au fost identificate în
acest studiu ( Tabelul 1). Structurile tuturor compu•ilor au fost prezentate în Figura 4.

Alocările relevante ale schimbărilor chimice în 1 Spectrul RMN al frac•iei C este prezentat în Figura 5. Semnalele
principale au fost observate în por•iune aromatică (δ> 6 ppm) sub formă de dublete la δ H = 9.17 (d, J = 15,9 Hz, D 1); 9.10 (d, J
= 15,8 Hz, D 2); 7,90 (d, J = 15,9 Hz, D 3) •i 7,77 ppm (d, J = 15,8 Hz, D 4). Ace•ti protoni sunt cupla•i •i dau trans-olefine care
confirmă prezen•a acizilor cafeici. Celelalte semnale ale păr•ii aromatice (între δ H = 6,70 •i 8,62 ppm) dezvăluie prezen•a
ciclurilor aromatice care confirmă prezen•a flavonoidelor. Mai mult, partea alifatică dintre δ H = 2,90 •i 5,00 ppm au fost
atribuite protonilor acidului chinic. Semnalul de 9,83 ppm atribuit grupărilor hidroxil ale compu•ilor fenolici.

dă
va
3.3. Sinteza și caracterizarea nanoparticulelor din aur citrat
do

Citratul a fost utilizat ca reductor (CAuNP) în metoda Turkevich (Figura I în fi•ierul suplimentar). S-a ob•inut o solu•ie ro•ie la
sfâr•itul sintezei [11] care a dus la nanoparticule de aur de 15 nm (Figura II în fi•ierul suplimentar). Nanoparticulele ob•inute sunt
e-

stabilizate prin citrat într-o solu•ie apoasă.

pr

3.4. Activități biologice

Testul NRU a fost utilizat pentru a evalua modificările viabilită•ii celulare. După 24 de ore de incuba•ie, GAuNP •i CAuNP nu au avut un
de

efect citotoxic semnificativ asupra viabilită•ii NDHF pentru concentra•ii cuprinse între 0,005 •i 50 pg / ml. După 72 de ore de incubare, după cum

se arată în Figura 6a, GAuNP nu a avut un efect citotoxic semnificativ asupra viabilită•ii celulelor NHDF până la 25 pg / ml, în timp ce un efect

citotoxic dependent de doză a fost observat de la 50 pg / ml. Concentra•ia de 30 pg / ml a fost men•inută ca cea mai mare doză testată pentru a
al

studia activitatea biologică a GAuNP. După 72 de ore de incubare, CAuNP nu a avut niciun efect citotoxic semnificativ asupra viabilită•ii

celulelor NHDF până la 40 pg / ml, în timp ce un efect citotoxic a fost observat la 80 pg / ml.
rn
Ju

Au fost evaluate proprietă•ile anti-radicale ale AuNP. A•a cum se arată în Figura 7a, GAuNP a avut o activitate semnificativă
de epurare a radicalilor DPPH. S-a observat o inhibare dependentă de doză a DPPH în intervalul de concentra•ii testate care
permite calcularea IC 50 din regresie [DPPH (%) = f (concentra•ie)]. IC 50 valoarea pentru activitatea antioxidantă a GAuNP a fost
găsită a fi de 16,5 pg / ml. În acelea•i condi•ii experimentale, semnalul DPPH a fost inhibat cu 96% cu 50 uM α-tocoferol
(denumit în mod obi•nuit Vitamina E) •i nu a fost observată nicio inhibare cu CAuNP ( Figura 7b). Acest lucru sugerează puternic
că sunt necesare acoperiri active de nanoparticule care nu sunt produse prin metoda Turkevich pentru activitatea antioxidantă.
În plus, interac•iunile electrostatice între încărcate negativ

9
fitochimicele •i GAuNP par să contribuie sinergic la îmbunătă•irea bioactivită•ii inerente a plantelor medicinale [18, 19]. Putem
concluziona că GAuNP din aceste extracte de plante a avut activitate antioxidantă mult mai mare decât vitamina E.

A fost evaluat poten•ialul dermoprotector al NPs pentru celulele pielii umane. A•a cum se arată în Figura 6b, Iradierea UVA a
crescut semnificativ produc•ia de MMP-1 în celulele NHDF de control. O cre•tere de 8 ori a MMP-1 bazal a fost observată după
expunerea la UV-A. Tratamentul celulelor cu GAuNP •i CAuNP a arătat o scădere semnificativă a produc•iei de MMP-1 într-un mod
dependent de doză. IC 50 valorile pentru activitatea antioxidantă a GAuNP •i CAuNP s-au dovedit a fi de 9,25 pg / ml •i respectiv 30,1
pg / ml. În acelea•i condi•ii experimentale, α-tocoferolul a redus activitatea de colagenază indusă de iradiere UV-A cu 52%.

Aplicarea topică a GAuNP nu a modificat viabilitatea celulelor în compara•ie cu explantele de control (neexpuse
sau expuse la UV-A fără GAuNP), dar formarea proteinelor oxidate este mai mică. În absen•a iradierii UV-A, GAuNP
a scăzut rata proteinelor oxidate endogene din derm. În plus, au împiedicat formarea proteinelor oxidate induse de
iradierea UV-A, oferind astfel protec•ie antioxidantă în derm.

3.5. Studii de securitate

Obiectivele acestor teste au constat în evaluarea siguran•ei AuNP ca ingrediente prime pentru produse cosmetice. De când a intrat în

dă
vigoare interdic•ia mondială de testare pe produse cosmetice pe animale, câteva in vitro

au fost stabilite teste pentru a evalua: toxicitatea, in vitro sensibilizarea pielii, in vitro iritatie si toxicologie genetica.
va
Pentru testul de toxicitate acută, după 48 de ore de incubare cu AuNP, nu s-a observat nicio scădere a viabilită•ii celulare la nici
do

o concentra•ie, deci nu a fost identificată IC 50 •i ca urmare nu există LD 50 a fost estimat Deci, conform acestui studiu, AuNP nu sunt
considerate citotoxice. Mai multe concentra•ii într-un interval cuprins între 0,32 •i 1000 pg / ml au fost apoi utilizate pentru a evalua
fototoxicitatea. Fototoxicitatea este definită ca un răspuns toxic de la o substan•ă care este declan•ată sau crescută după expunerea
e-

la lumină. La 24 de ore de la expunerea la lumină, nu s-a observat nicio modificare a morfologiei celulare •i nu s-a înregistrat
pr

scăderea absorb•iei de NR la concentra•iile testate pe plăcile iradiate •i iradiate. În condi•iile experimentale ale acestui studiu, AuNP
testat până la 1000 pg / ml a fost determinat să nu fie fototoxic, conform clasificărilor prezentate în orientarea O2D 432.
de

A doua serie de teste a fost evaluarea poten•ialului de sensibilizare a pielii AuNP. Cu testul KeratinoSens, a fost
al

evaluat poten•ialul AuNP de a activa factorul de transcrip•ie Nrf2. Patru faze au fost efectuate utilizând concentra•ii
diferite de la 0,2 până la 400 pg / ml. Rezultatul final este negativ în acord cu ghidul OCDE, astfel încât AuNP a fost
rn

considerat că nu are poten•ial de a activa factorul de transcrip•ie Nrf2. În plus pentru acest test, a fost efectuată o analiză
SENS-IS pentru a evalua capacitatea AuNP de a induce expresia biomarkerilor de iritare •i sensibilizare specifici într-un
Ju

model de epidermă reconstruit 3D. Au fost analizate profilul de expresie al 61 de gene împăr•ite în trei seturi: unul dintre
cele 23 de gene legate de procesul de irita•ie •i celelalte două seturi de gene, denumite „SENS-IS” •i „ARE”, cu 21 •i 17
biomarkeri, implica•i în sensibilizarea pielii [20, 21]. În prezen•a AuNP, mai pu•in de 7 gene din grupele de gene
„SENS-IS” •i „ARE” au fost exprimate, ceea ce a dus la un test negativ. În concluzie, AuNP poate fi clasificat ca un
sensibilizator.

10
 A treia serie de teste a fost de a evalua irita•ia pielii •i a ochilor. Pentru iritarea pielii, principiul testului se bazează
pe faptul că substan•ele chimice iritante sunt citotoxice pentru Episkin TM

model de epidermă umană reconstruită după o expunere pe termen scurt. Produsele chimice iritante pot pătrunde în stratul cornos •i
sunt suficient de citotoxice pentru a provoca moartea celulelor în straturile celulare subiacente. După o expunere de 15 min •i o
recuperare de 42 de ore, viabilitatea medie relativă a •esuturilor tratate cu AuNP a fost de 95%, cu o abatere standard de 3%. În
condi•iile experimentale ale acestui studiu, AuNP este considerat a fi non-iritant pentru piele. Pentru celulele corneene, viabilitatea
medie relativă a •esuturilor tratate cu AuNP a fost de 96% cu o diferen•ă de 4% între •esuturile duplicate. Deoarece viabilitatea medie
a fost> 60% după reducerea MTT, rezultatele au îndeplinit criteriile pentru un răspuns non-iritant. În condi•iile experimentale ale
acestui studiu, AuNP nu este iritant la epiteliile reconstituite asemănătoare corneei umane.

A patra serie de teste a fost evaluarea genotoxicită•ii AuNP. Pentru cercetarea muta•iilor genelor celulare, folosind o solu•ie AuNP
la concentra•ia de 500 mg / ml în vehicul •i un volum de tratament de 1% (v / v) în mediu de cultură, nivelurile de doză selectate au
fost 156,3, 312,5, 625, 1250, 2500 •i 5000 pg / ml, atât cu •i fără amestec S9. Nu s-a observat niciun precipitat în mediul de cultură, la
niveluri de doză, nici la începutul, nici la sfâr•itul perioadei de tratament de 3 ore. Nu a fost remarcată o cre•tere notabilă a frecven•ei
muta•iei în raport cu controlul vehiculului corespunzător, la orice nivel de doză cu sau fără amestec S9 (FMI <GEF de 126 x 10- 6). Mai
mult, nicio rela•ie doză-răspuns nu a fost demonstrată de regresia liniară. Astfel, aceste rezultate au îndeplinit criteriile pentru un
răspuns negativ. În condi•iile experimentale ale acestui studiu, AuNP nu a arătat nicio activitate mutagenă în analiza limfomului de

dă
•oarece, nici în prezen•a sau absen•a unui sistem de metabolizare a ficatului de •obolan. Pentru analiza micronucleului, nivelurile de
doză selectate pentru analiza micronucleului au fost: 1250, 2500 •i 5000 pg / ml, acesta din urmă fiind cel mai ridicat nivel de doză
recomandat. După tratamentele de 3 ore cu •i fără amestec S9 sau tratamentul de 24 de ore fără amestecul de S9, nici o cre•tere
va
semnificativă din punct de vedere statistic •i nici în ceea ce prive•te doza în frecven•a celulelor micronucleate nu a fost observată la
oricare dintre nivelurile de doză analizate în raport cu controlul vehiculului corespunzător . În plus, niciunul dintre nivelurile de doză
do

analizate nu a arătat o frecven•ă a celulelor micronucleate peste nivelul istoric al vehiculului corespunzător. Astfel, aceste rezultate au
îndeplinit criteriile unui răspuns negativ. În condi•iile experimentale ale studiului, AuNP nu a indus nici o deteriorare cromozomială sau
deteriorarea aparatului de divizare a celulelor în celulele somatice de mamifere cultivate, folosind celule de limfom L5178Y TK +/-
e-

mouse, fie în prezen•a sau absen•a unui metabolizare a ficatului de •obolan. sistem.
pr
de

4. Concluzie
al

Acest studiu demonstrează poten•ialul nanoparticulelor ca material pentru aplica•ii cosmetice.

rn

Hubertia ambavilla extractul con•ine constituen•i bioactivi folosi•i pentru sinteza nanoparticulelor de aur cu proprietă•i interesante, în special

pentru aplica•ii cosmetice. GAuNP sunt non-toxice pentru celulele fibroblaste •i celulele dermice, sunt capabile să elimine eficient radicalii liberi,
Ju

de asemenea, protejează împotriva deteriorarii celulelor fibroblaste •i a celulelor dermice de către UV-A. Testele de reglementare pentru a

asigura siguran•a nanoparticulelor de aur, ca ingrediente în produsele cosmetice, au demonstrat că AuNP nu este toxic, nu este fototoxic, nu

genotoxic, neiritant •i nesensibilizant în conformitate cu orientările OCDE. Aceste rezultate sugerează că AuNP verde este un ingredient

promi•ător pentru aplica•ii cosmetice.

CONȚINUTUL ASOCIAT

11
Informatii justificative. Sunt furnizate cifre suplimentare și tabel.

Declarația de interese

Autorii declară că nu au cunoscute interese financiare concuren•e sau rela•ii personale care ar fi putut părea să
influen•eze lucrările raportate în această lucrare.

Contribuții ale autorului

Manuscrisul a fost scris prin contribu•iile tuturor autorilor. To•i autorii au dat aprobarea versiunii finale a
manuscrisului.

Secțiunea de contribuție a autorilor

Conceptualizarea acestui studiu a fost realizată de ALM.

MBH •i ALM au sintetizat •i caracterizat nanoparticulele de aur. MBH a furnizat figurile 1a, 1c, 3. ALM a furnizat cifrele

dă
1b, 1d •i Figurile I •i II din fi•ierul suplimentar.

JSp a supravegheat caracterizarea fizică a nanoparticulelor în CSPBAT.

va
ALM a scris partea chimică fizică (nanoparticule) din manuscris.

SP a scris partea biologică a manuscrisului. Ea a furnizat analizele statistice •i cifrele 6,

do

7.

EG •i RC au scris partea fitochimică a manuscrisului.

e-

RC a furnizat tabelul 1, figura 4, figura 5.

pr

EG •i JSo au furnizat figura 2, •i date despre figura 4.

AB a supravegheat analizele fitochimice din LCSNSA.

de

To•i autorii au examinat manuscrisul final.

al
rn

Confirmare
Ju

Această lucrare a fost realizată la Torskal, CSPBAT / Universitatea Paris XIII, LCSNSA / University La Réunion, GIP CYROI, BioHC,

BioEC •i IJPB.

Mul•umim Dr. M. Cesari de la platforma CYROI, Dr. F. Perreau •i Dr. G. Mouille de la IJPB. Sprijinul a fost oferit de Sandra Casale
de la Universitatea din Paris VI. Plantele sunt originare din CAHEB.

Această lucrare a fost par•ial finan•ată de BPIFrance.

12
Referințe

[1] M. Ben Haddada, E. Gerometta, A. Bialecki, W. Fu, Y. Zhang, M. Lamy de La Chapelle, N. Djaker, S. Pesnel, AL
Morel, J. Spadavecchia, Endemic Plants: From Design to a Noua cale a nanomaterialelor hibride inteligente pentru
aplica•ii de nanomedicină verde. J Nanomed Nanotechnol, 9 (2018) 518. [2] V. Kumar, SC Yadav, SK Yadav, Syzygium
Cumini Extras de frunze •i semin•e mediat

Biosinteza nanoparticulelor de argint •i caracterizarea lor, J Chem Techno Biotechno, 85 (2010) 1301-1309. [3] MS
Akhtar, J. Panwar, YS Yun, Sinteza biogenă a nanoparticulelor metalice prin extracte vegetale. ACS sus•ine.
Chem Eng, 1 (2013) 591–602. [4] Recomandarea Comisiei din 18 octombrie 2011 privind defini•ia
nanomaterialului, Off.

J. UE 2011, L275, 38.

[5] AL Morel, S. Giraud, A. Bialecki, H. Moustaoui, M. Lamy de La Chapelle, J. Spadavecchia, Extrac•ia verde a
plantelor endemice pentru a sintetiza nanoparticule de aur pentru aplica•ii theranostice. Front Lab Med, 1 (2017)
158-171. [6] A. Adsersen, H. Adsersen, Plante din Insula Réunion cu presupuse efecte antihipertensive •i

dă
diuretice - o evaluare experimentală •i etnobotanică. J Ethnopharmacol, 53 (3) (2017) 189-206. [7] OI Aruoma, T.
Bahorun, LS Jen, Neuroprotec•ie prin componente bioactive în extracte de plante medicinale •i alimentare.
Mutat Res, 544 (2) (2003) 203-15. [8] C. Poullain, E. Girard-Valenciennes, J. Smadja, Plantele din Insula
va
Reuniunii: evaluarea exfolierii radicalilor liberi •i a activită•ilor antioxidante. J Ethnopharmacol, 95 (1) (2004)
19-22. [9] KE Burke, Mecanisme de îmbătrânire •i dezvoltare - O nouă în•elegere a afectării mediului la nivelul
do

pielii •i prevenirea cu antioxidan•i de actualitate. Mecanisme de îmbătrânire •i dezvoltare, 172 (2018) 123-130.
[10] KE Burke, Fotodamajul pielii: protec•ie •i inversare cu antioxidan•i de actualitate. J Cosmet Dermatol, 3 (3)
e-

(2004) 149-55. [11] J. Turkevich, PC Stevenson, J. Hillier, Studiu al proceselor de nucleare •i cre•tere în sinteza
aurului coloidal. Discuta•i Faraday Soc, 11 (1951) 55-75. [12] H. Zhu, M. Du, M. Zou, C. Xu, N. Li, Y. Fu, Facile •i
pr

verde sinteza de nanoparticule Au bine dispersate în nanofibrele PAN de către polifenoli de ceai. J Mat Chem,
22 (18) (2012) 9301-
de
al
rn
Ju

9307.
[13] W. Haiss, NTK Thanh, J. Aveyard, DG Fernig, Determinarea mărimii •i concentra•ia nanoparticulelor de aur din
spectrul UV-Vis. Anal. Chem, 79 (11) (2007) 4215-4221. [14] K. Sprogøe, D. Stærk, AK Jäger, A. Adsersen, SH
Hansen, M. Witt, AK Landbo, AS Meyer, JW Jaroszewski. Izolarea direc•ionată a produsului natural ghidată de
HPLC – SPE – RMN: constituen•i ai Hubertia specii. J Nat Prod, 70 (9) (2007) 1472-1477.

13
[15] R. Jaiswal, H. Müller, A. Müller, MG Karar, N. Kuhnert, Identificarea •i caracterizarea acizilor clorogenici, a
glicozidelor acidului clorogenic •i a flavonoidelor din Lonicera henryi L. (Caprifoliaceae) frunze de LC – MSn.
Fitochimie 108 (2014) 252-263. [16] H. Jian, Y. Min, Q. Xue, X. Man, W. Bao-Rong, G. De-An, Caracterizarea
compu•ilor fenolici din medicamentul pe bază de plante chinezesc Artemisia annua prin cromatografie lichidă
cuplată cu spectrometrie de masă cu ionizare cu electrospray. J Pharma Biomed 47 (2008) 516-525. [17] MN
Clifford, Analiza •i caracterizarea acizilor clorogenici •i a altor cinamate. În C. Santos-Buelga •i G. Williamson
(Eds.), Metode în analiza polifenolului, (2003) 314–337. Cambridge: Royal Society of Chemistry. [18] B. Kumar,
K. Smita, L. Cumbal, A. Debut, Sinteza nanoparticulelor de argint folosind Sacha inchi ( Plukenetia volubilis L.)
extracte de frunze. Saudi J Biol Sci, 21 (2014) 605–609.

[19] MK Swamy, MS Akhtar, SK Mohanty, UR Sinniah, Sinteza •i caracterizarea nanoparticulelor de argint folosind
extract de fructe din Momordica cymbalaria •i evaluarea acestora
in vitro activită•i antimicrobiene, antioxidante •i citotoxicitate. Spectrochim Acta Partea A: Mol Biomol Spectrosc,
151 (2015) 939–944. [20] F. Cottrez, E. Boitel, P. Aeby, H. Groux, Genele modulate în mod specific în pielea
sensibilizată permit detectarea sensibilizan•ilor într-un model de piele umană reconstruită. Dezvoltarea fundului

dă
SENS-IS. Toxicol In Vitro, 29 (4) (2015) 787-802. [21] F. Cottrez, E. Boitel, JC Ourlin, JL Peiffer, I. Fabre, IS
Henaoui, B. Mari, A. Vallauri, A. Paquet, P. Barbry, C. Aurialut, P. Aeby, H. Groux. SENS-IS, un model bazat pe
epidermă 3D reconstituit pentru cuantificarea poten•ei de sensibilizare chimică: reproductibilitatea •i predictivitatea
va
rezultă dintr-un studiu inter-laborator. Toxicol In Vitro, 32 (2016) 248-260.
do
e-
pr
de
al
rn
Ju

14
Figurile din legendă

Figura 1. (a) Spectrul de absorb•ie al unei solu•ii apoase de GAuNP dispersate, ( b) este
caracterizare prin microscopie electronică cu transmisie, ( c) histograma de distribu•ie a mărimii •i ( d) un studiu de stabilitate timp

de 25 de zile

Figura 2. (a) Cromatograma HPLC a unui extract vegetal din Hubertia ambavilla folosind Aerosol încărcat

Detectare. Extractul a fost separat în 5 frac•iuni AE, ( b) Cromatograme LC-MS / MS (ro•u) •i UV (verde) din
extractul apos de plante.

Figura 3. Spectre de absorb•ie ale GAuNP ob•inute cu frac•ii polifenolice AE.

Figura 4. Structuri chimice ale compu•ilor identifica•i 1-18.

Figura 5. 1 Spectrul RMN H al frac•iei C ob•inut dintr-un extract apos de H. ambavilla la 600 MHz in
CD 3 OD.

Figura 6. (a) Citotoxicitatea AuNP pe celulele NHDF după 72 ore de incubare. Rezultatele sunt exprimate ca medie ±

SD (n = 6) ( b) Efectele AuNP asupra produc•iei de MMP-1 indusă de UV-A. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SD (n = 3).

Solu•ia de vitamina E (VE 1 mM) a fost utilizată ca standard de referin•ă. * p <0,001 (testul studentului).

dă
Figura 7. Activitatea antioxidantă prin metoda DPPH măsurată pe GAuNP ( A) •i ( b) CAuNP. Rezultatele sunt
va
exprimat ca medie ± SD (n = 3).
do
e-
pr
de
al
rn
Ju

15
 0,8

0,75

0,7
5

0.65

0,6
4

Abs (au)
0.55

0,5
3

0,45

Număr de particule (%)

Abs (au)

0,4
2

0,35

0,3
1

450 500 550 600 650 700

0
20nm Wavelenth (nm)

400 500 600 700 800 900

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 0 5 10 15 20 25
Lungime de undă (nm) J2 J3 J5 J6
Dimensiunea particulelor (nm)
J13 J15 J25

A b c
d

Figura 1.

dă
va
do
e-
pr
de
al
rn
Ju

16
 Ju
rn
al
de
pr

Figura 2.
e-
do
va
dă

17
 După sinteză După centrifugare
2.0 2.0

NP-ED26-A
1.8 1.8 NP-TSK26-B
NP-ED26-B
NPTSK26-C
NP-ED26-C
1.6 1.6 NPTSK26-D
NP-ED26-D
NP-ED26-E NPTSK26-E
1.4 1.4

1.2 1.2
Abs (au)

1.0 1.0

Abs (au)
0,8 C 0,8 DE

0.6 0.6
C
BDE
0.4 0.4
B
A
0.2 0.2

0.0 0.0
400 500 600 700 800 400 500 600 700 800

Lungime de undă (nm) Lungime de undă (nm)

BCDE

Figura 3.

dă
va
do
e-
pr
de
al
rn
Ju

18
 Ju
rn
al
de
pr
e-
do
va
dă

19
 Figura 4.

dă
va
do
e-

Figura 5.
pr
de
al
rn
Ju

20
 0.5
120

100 0.4
*

MMP-1 (ng / µg proteine)

80
Viabilitatea celulară (% din control)

0.3 *
* *

60
0.2
*

*
40
*
0.1

20
CAuNP
CAuNP 0.0
Ctrl (-) UV Ctrl (+) UV 3 15 30 2.4 12 24 VE
0

GAuNP CAuNP
0,1 1 10 100 1000
Concentra•ia AuNP (µg / ml)
Concentra•ia AuNP (µg / ml)

(A) (B)

Figura 6.

dă
va
do
e-
pr
de
al
rn
Ju

21
 80

70

60

50
Activitate anti-DPPH (%)

40

30

20

10

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

Concentra•ia GAuNP (%)

Activitate anti-DPPH (%)

40

0 20

- 20

dă
va
- 40

0 2 4 6 8 10 12
do

Concentra•ia CAuNP (%)

(A) (B)
e-

Figura 7.
pr
de
al
rn
Ju

22
Masa

Tabelul 1 : Compu•i identifica•i din Hubertia ambavilla extract apos

Formula
N° Denumirea compușilor
chimica

1 C 16 H 18 O 9
2 C 16 H 18 O 10
3 C 16 H 18 O 9
4 C 24 H 24 O 13
5 C 24 H 24 O 13
6 C 24 H 24 O 12
7 C 30 H 30 O 15
8 C 24 H 24 O 12
9 C 21 H 20 O 12
10 C 21 H 20 O 12
11
Acid 3-O-cafeoylquinic
Acidul 3-O-cafeil-2-Hidroxi-chinic
Acid 4-O-cafeoylquinic
Acid 4-O-cafeoil-2-hidroxi-3-O - [(1-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5dienil) acetil]
chinic
Acid 3-O-cafeil-4-O - [(1-hidroxi-2-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5dienil) acetil]
chinic
Acid 3-O-cafeil-5-O - [(1-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5-dienil) acetil] chinic
5-O-caffeoyl-3-O-succinil-4-O - [(1-hidroxi-4-oxocyclohexa-2,5dienyl) acetil]
methyquinate
Acid 3-O-cafeil-4-O - [(1-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5-dienil) acetil] chinic
hiperin
Isoquercetin
Acid 3,5-O-diferuloil-4-O - [(1-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5-dienil) acetil] -1metoxi-oxiquinic

dă
C 38 H 36 O 18

12 C 25 H 24 O 12 3,4-di-O-caffeoyl acid chinic

Acid 3,4-O-diferuloil-5-O - [(1-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5-dienil) acetil] -1metoxi-oxiquinic
va
13 C 38 H 36 O 18

Acidul 3,5-di-O-cafeil-2-hidroxi-4-O - [(1-hidroxi-4-oxociclohexa-2,5denil) acetil]

14 C 33 H 30 O 16
do

chinic
15 C 25 H 24 O 12 Acidul chinic 4,5-di-O-caffeoyl

16 C 33 H 30 O 15 Acid 3,4-di-O-cafeil-5-O - [(1-hidroxi-5-oxociclohexa-2,5-denil) acetil] chinic

e-

17 C 33 H 30 O 15 Acidul 4,5-di-O-cafeil-2-hidroxi-3-O - [(4-hidroxifenil] chinic

18 C 33 H 30 O 14 Acid 3,4-di-O-cafeil-5-O - [(4-hidroxifenil) acetil] chinic
pr
de
al
rn
Ju

23