Medios Potenciadores y otros reactivos

utilizados en Inmunohematología

TM FRANCO DEL VALLE

2018
La inmunogenicidad de los antígenos
 Anticuerpos
 Son proteínas plasmáticas que se producen en
respuesta a un Antígeno
 Pertenecen a la fracción de la Globulinas y por su
participación en la inmunidad se les ha llamado
Inmunoglobulinas

.
14 nm 35 nm

24 nm
 Anticuerpos según Origen
 Naturales: Aparecen sin estimulación
detectable. La mayoría son IgM, o bien mezclas
de IgM + IgG
 Regulares: Aparecen siempre que se carece del
Ag correspondiente (ABO)
 Irregulares: No siempre aparecen cuando no se
posee el Ag (P1, Le, E)
 Inmunes: Se detectan después de un estímulo
antigénico: transfusión, embarazo
Siempre son IgG
 Son Irregulares
 Anticuerpos Según Importancia
Importancia

Clínicamente Clínicamente Significativos

significativos si reaccionan a 37 º C
 ABO  Lewis
 Rh  M
 Kell  N
 Duffy  P1
 Kidd  Lutheran
 SsU  A1

Ac Clinicamente Pueden causar reacciones transfusionales

Significativo Pueden producir EHRN
Reacciones antígeno - anticuerpo

La reacción depende de:

 Clase de la inmunoglobulina
 Número de lugares antigénicos en la
membrana del Glóbulo rojo
 Localización de los antígenos en la
membrana (superficie interna, externa,
transmembrana..)
 Medio de la reacción
 Características de los Acs. => Efecto de
dosis
Significado clínico de los aloanticuerpos
de grupos sanguíneos

 El enfermo transfundido se expone a un nº importante de

ags. capaces de estimular en él la formación de acs

 Un 10- 15% de los enfermos politransfundidos desarrollan

aloanticuerpos.

 En Chile es tan sólo del 1,02% Transfus Med Hemother 2015;42:4–7

 En reacciones hemolíticas transfusionales los acs.

Implicados por orden de frecuencia son:
A, B, D, c, E, e, Kell, Kidd, Duffy, MSs
 Significado clínico de los aloanticuerpos
de grupos sanguíneos

 La frecuencia con que un receptor se aloinmuniza

depende de:
- la prevalencia de los individuos negativos para un
determinado antígeno
- la inmunogenicidad de los diferentes antígenos
- la capacidad de respuesta inmune del receptor

 Casi todos los acs. frente a ags. eritrocitarios son

inmunoglobulinas IgM o IgG

 La IgM es más eficaz en la activación del complemento =>

Hemólisis intravascular
Significado clínico de los aloanticuerpos de
grupos sanguíneos

 Las subclases IgG1 e IgG 3 activan el C fuertemente, débilmente la

IgG2, y probablemente no lo activa la IgG4

 Los acs. activos a 37ºC son capaces de mediar la destrucción o

secuestro de los hematíes alogénicos incompatibles transfundidos

 Los acs. IgG son capaces de atravesar la placenta y causar EHRN

 Significado clínico de los
aloanticuerpos de grupos sanguíneos

Clínicamente Clínicamente Significativos

significativos si reaccionan a 37 º C
 ABO  Lewis
 Rh  M
 Kell  N
 Duffy  P1
 Kidd  Lutheran
 SsU  A1

Ac Clinicamente Pueden causar reacciones transfusionales

Significativo Pueden producir EHRN
Factores que afectan la fase de
sensibilización
Temperatura: IgG => 37 ºC
IgM => 4º a 20º C

pH: Optimo de reacción => 6,9 a 7,2

Tiempo de Incubación: Sin potenciadores 15 a 60 min
Tipo de Anticuerpo: IgM aglutina en solución salina
IgG: Necesita potenciadores
Proporción Ag – Ac: Debe existir una proporción
entre el Nº de moléculas de Ac
y el Nº de sitios antigénicose
Constante de afinidad: A mayor afinidad del Ac con
el ag mayor es la velocidad de asociación y más lenta
la de disociación
 Factores que afectan la fase de
Aglutinación
Fuerza iónica el medio (Potencial Z): Es la diferencia
de potencial entre el GR cargado negativamente y la
nube de cargas positivas del medio. Es el responsable
de la fuerza de repulsión de los GR.
Tipo de Anticuerpo: IgM aglutina en solución salina
IgG: Necesita potenciadores
Potenciadores de la Reacción Ag _ Ac

 Centrifugación:
 Albúmina:
 Enzimas
 Test de antiglobulina humana
1. CENTRIFUGACIÓN
Al aplicar fuerza
centrifuga, se
acercan los glóbulos
rojos y algunos ac.
Pueden unirse al gl
rojo.
 2. ALBUMINA
Reduce las cargas
negativas, dispersa los
cationes alrededor del
+ + GR
+ + +
Ξ
Ξ Ξ
Ξ Ξ Ξ
+

Alterando la tensión
superficial inter-celular
Reduce el potencial Zeta
+
Ξ

+
Ξ
Se dispone de albúmina
sérica bovina en solución
al 30% , 22%, 6% o 3% y
polimerizada

En concentraciones del 30% o

mayor favorece rouleaux
 +

+
+
3. LISS
Reduce la fuerza iónica del
+ medio, Baja el Potencial Z y
+
aumenta de la absorción de
+
anticuerpos en las células
+ + rojas
+
+
Solución LISS 0,03 M,
+
+ Para prevenir la lisis del GR se
incorpora glicina

“ La solución salina normal tiene una concentración de 0.17 M “

 4. ENZYMA
Reduce las cargas negativas
de la superficie del GR ,
enzimas proteolíticas que
actúan a nivel de ácido
siálico
Disminuyendo la tensión
superficial
Desnaturalizan los antígenos
Sistema MNS y Fy a Fy b

Ficina, Bromelina,
Papaína y Tripsina
++ 5. POLYBRENE, PROTAMINE
++
Suministra cationes, dispersa
las cargas negativas del GR
++ ++ y causa agregación
++ ++
++ ++ ++ ++ ++
++ ++ ++ ++ ++
++ ++ Sensibilidad disminuída en
++ ++ la detección de
anti-K
++ ++
++ ++

En la actualidad
poco uso
 6. Polietilenglicol PEG
Polímero lineal
hidrosoluble, su
acción es eliminar el
+ + + agua intercelular,
Ξ
Ξ Ξ Ξ
+
favoreciendo el
acercamiento de los
GR
+

+
Ξ
Test de Anti Globulina Humana

2. IgG + Anti -IgG

Test de Anti Globulina Humana

4. Complement +
Anti- C3, C4
Test de Anti Globulina Humana

 Test de Antiglobulina Humana

 Directo
 Indirecto
 Es un test extraordinariamente sensible:
puede detectar tan sólo 100 moléculas de IgG y 400
moléculas de C3d por hematíe
 Es capaz de detectar la mayor cantidad de
Anticuerpos irregulares diferentes.
 Se puede realizar con diferentes metodologías y
Medios
Suero Antiglobulina Anti-Humana

 Preparada a partir de suero de animales (ej. conejo,

ratón) immunizados con IgG humana purificada o
componentes del complemento (C3b, C3d)

 Anti-IgG Monospecífico o anti-C3b;- C3d detectará uno

pero no los dos.

 Anti-IgG y anti-C3b; -C3d pueden ir conjuntamente en un

antisuero reactivo como AHG polyspecífico.
 Detectará tanto IgG y C3b; C3d unido a los RBCs.
Concentración de Gl Rojos Reactivos
Depende de la Técnica empleada

Tubo……………..……. 3 %
Microplaca………….. 1 a 2 %
Gel………………..….. 0,8 %
 Técnicas en microplacas
Microplaca: Puede considerarse como una gradilla de
96 microtubos dispuestos en 8 filas horizontales y 12
filas verticales

Tipo microplacas:  rígidas

 flexibles
 fondo U
 fondo V
 fondo
 con Ag o Ac prefijado
Montaje
Tipificación ABO Completa
Hemático-sérico
Lectura-interpretación
Ventajas microplacas sobre las
técnicas en tubo

 Igual o superior sensibilidad

 Ahorro reactivos. Micrométodo
- pequeña cantidad
- dilución
 Rapidez ejecución
 Reducido material preciso
 Reutilizables.
 Microplacas

Manual

Procedimiento Semiautomático

Automático
Consideraciones técnicas
1. Micrométodo: baja concentración proteica de
viscosidad y de anticuerpos
-Dilución con albúmina al 3%
2. Estandarizar volúmenes
“ centrifugación
3. Para evitar fibrina: preferentemente usar
suero
4. Tapar la microplaca en técnicas que deben
incubarse a 37ºC para evitar evaporación
5. Son reutilizables (salvo las que tienen Ag o
Ac prefijado)
Microcolumnas de Gel
¿Qué es el gel?

 El gel fue patentado en 1.986

por Y. Lapierre.
• Las partículas de gel, a modo
de filtro, atrapan los hemo-
aglutinados en su matriz
durante la centrifugación de la
microcolumna.
•
Fases de la reacción en gel(1)

 Fase Sensibilización
Se añaden hematíes y
suero/plasma en la parte
superior del microtubo.
CÁMARA DE
INCUBACIÓN o
SENSIBILIZACIÓN
Fases de la reacción en gel
(2)

Fase depositivizaciónde la
lectura.
La centrifugación favorece el
paso de los hematíes a través
del gel.
Si hay reacción de Ag-Ac, se
producen aglutinados que no
pasan a través del gel,
quedando atrapados en él.
GEL-CENTRIFUGACIÓN
Fases de la reacción en gel (3)

 Fase de Antiglobulina
El suero de Coombs o antiglobulina humana (AGH)
no es preciso añadirla, está incluida en la matriz
de gel.

Por las características de la microtubo y del

proceso de centrifugación, el suero/plasma
añadido a la cámara de sensibilización o
incubación no inactiva la AGH.
La columna de gel sólo es atravesada por los
hematíes y los Ac. fijados a su superficie, no los
Ac libres del suero.

Es innecesario añadir células coombs control

positivo a las reacciones coombs negativas.
 Reacciones de aglutinación en Gel-
Aglutinación.

 REACCIÓN POSITIVA.
Las células aglutinadas forman en
la superficie del gel una línea roja
o bien se dispersan a lo largo del
microtubo de gel.
 REACCIÓN NEGATIVA
Las células se sedimentan en el
fondo del microtubo formando un
botón compacto.
Reacción positiva (+4) en Gel.
Reacción negativa en Gel
Reacción positiva (+2 /+3).
 Doble población
(DP) en Gel.
Determinación de una PAI (coombs
indirecto) en ID-Gel
Determinación de una Prueba Cruzada
(Coombs Indirecto) en ID-Gel
GRUPO ABO-RH

 ID Tarjeta de
identificación de grupo

 Dos perfiles en una

única tarjeta
ABD combinado con la
clasificación inversa
 GRUPO A-B-O
 DETECCIÓN Rh-D
 CLASIFICACIÓN
INVERSA DEL
GRUPO A-B-O
 UNA COLUMNA
CONTROL
Sub-grupos de A
 Determinación de
los subgrupos de
A, AB.

 Confirmar A1, A2,

A3, Ax, .
 Confirmar A1B,
A2B.
NaCl / Enzyme card
Se puede utilizar en diferentes combinaciones

 Clasificación inversa
 Salino Temperatura
Ambiente
 Salino a 37 C
 Salino 4 C
 Detección de anticuerpos
con enzima.
 Identificación de anticuerpos
con enzima.
 Reacción cruzada con
enzima.
Pruebas de compatibilidad
completa
 A-B-D y confirmación.
 Enfrenta las células
ABD grupo de
confirmación para el
paciente y donante.
 Enzima, prueba cruzada
 AHG
 Auto-control.
 Todo en una sola
tarjeta
RH-Fenotipos +Kell

 Detección de
antígenos Rh: C,
c, E, e.

 Detección de
antígeno kell.
LISS/COOMBS
Se puede utilizar en diferentes combinaciones

 TAD
 TAI
 “6” pruebas de compatibilidad
 Screening de anticuerpos
 Identificación de anticuerpos
 Confirmación de “D” débil.
 Valoracion de anticuerpos
 Auto Control
Errores en las técnicas
Inmunohematológicas

1. Problemas con las muestras: Crioaglutininas ,

Gelatina de Warton, Rouleaux
2. Relación suero – glóbulos => exceso de glóbulos
rojos en recontrol en lámina
3. No uso de gota control
4. No uso de controles en general
5. Falla en la contraprueba por mal manejo de los
glóbulos reactivos
6. Error de tipificación Rh por : TAGD +
7. Cambio de orden de los reactivos
8. Uso de reactivos no controlados
 Errores en las técnicas
nmunohematológicas = TAGH
1. Falla en los lavados = > Neutralización
2. Resuspensión demasiado entusiasta durante el lavado puede
perturbar la frágil aglutinación encontrada en reacciones débiles.
3. Elución de anticuerpos por demora en los lavados (Café – cigarro)
4. Solución salina residual muy diluido el AHG reactivo y, por tanto,
disminuirá la sensibilidad de la prueba.
5. Pérdida de células con cada uno de los descartes de solución
salina.
6. Disminución pH en solución salina de lavado Ej: <6,8 puede
aumentar la tasa de elución de anticuerpos durante el proceso de
lavado, especialmente con suero monoclonal AHG, tienen rango
muy estrecho de pH para una reactividad óptima.
7. Niveles significativos de contaminación bacteriana en solución
salina se ha informado, y esto puede contribuir a falsos resultados
positivos.
8. Falla en la tº del incubador
9. No uso de controles
10. Uso de controles fuertemente reactivos ++++
 IMPORTANCIA DE LAVAR
(1) Presencia de otros anticuerpos libres.
Fase de lavado(2)
Se adiciona AHG (3)
IgG formación de puentes(4)
aglutinación (5)
Demostración(Manifestación) de lavado incorrecto
(1) Presencia de otros IgG
Ningún lavado apropiado (2)
AHG consumidos por otros IgG (3)
No aglutinan, falsos negativos (4)
Calidad en Inmunohematología
Orientaciones

 Es importante que todos los BS; UMT; CS

tengan un sistema de calidad establecido
para asegurar que no sólo los test se llevan
a cabo apropiadamente, sino también que
los reactivos, las muestras y los equipos que
se utilizan cumplen su objetivo, y los
resultados se interpretan e informan
correctamente
Calidad en Banco de Sangre

 Creciente demanda de calidad y seguridad

transfusional.
 Garantizar que la transfusión cumple su
función.
 Medidas de seguridad rigurosas.
 Legislación para aspectos organizativos y
aspectos técnicos.
 Requerimientos clásicos y mínimos
para Laboratorios

 Técnicas protocolizadas escritas

 Calibración de Equipos

 Controles de calidad:
 Externos

 Internos
Calidad en Medicina Transfusional

 Creciente demanda de Calidad y Seguridad

Transfusional

 Legislación y Recomendaciones.
 Mejora de las prácticas.
 Controles a lo largo de toda la cadena transfusional.
 Protocolos de actuación.
 Control de Calidad.

Garantía de Calidad
 Garantía de Calidad

Control de
Calidad
Gestión de la calidad en Transfusión

 Seguridad de los pacientes

 Prevención de efectos adversos

 Calidad en la utilización clínica de
la sangre y derivados

 Implica la administración de la cantidad y la forma

correcta del hemoderivado, en el momento
adecuado y al paciente pertinente, así como la
existencia de documentación exhaustiva tanto del
proceso como de los resultados
Aspectos Imprescindibles para
garantizar el resultado

 Reactivos utilizados.
 Precisión de instrumentos y equipos.
 Técnica utilizada protocolizada
 Formación y destreza del personal.
 Organización que impida o minimice el error:
 Identificación de las muestras
 Protocolos
 Transcripción de resultados.
 Asignación de tareas y responsabilidades.
•Controles de Calidad internos
•Controles de Calidad externos
Mecanismos para eliminar errores

 Barreras al error
 Organización.
 Métodos de trabajo.
 Recogida y estudio de los errores
cometidos y de los “casi error”.
Errores de origen organizativo

 Déficit formativo.
 Errores de identificación.
 Errores de no coincidencia del tubo piloto
con la bolsa del mismo número.
 Errores por falta de identificación del
tubo para estudios pretransfusionales.
 Errores en la transcripción de resultados
a los registros.
Cómo evitar errores de tipo
organizativo
 Formación del personal al ingreso y de
forma continuada.
 Errores de identificación:
Procedimientos.
 Errores de transcripción:
 Manual:
 Firma del técnico.
 Control entre 2 personas.

 Informatizado:
 Conexión on-line.
Errores de origen técnico
 Reactivos
 Caducidad.
 Incorrecto almacenamiento.
 Calidad de las muestras
 Mala técnica de extracción.
 Incorrecta conservación.
 Equipos
 Defectos.
 Falta de calibración, verificación y mantenimiento.
 Métodos
 Práctica inadecuada.
 No seguir las instrucciones del fabricante.
 Control de Calidad en
Inmunohematología
1. Elaboración de un Manual de calidad
2. POES escritas y validadas en uso por todo el
personal técnico
3. Esquematización de Técnicas para un mejor
seguimiento = Flujogramas
4. Seguimiento estricto de POES
5. Sanción al no seguimiento de POES
6. Control de Reactivos
 Control de lote de todos
 Estandarización de reactivos de casa
 Uso de controles diarios Internos
 Participación en programa de control de calidad externo
 Uso de Células control de Coombs a todos los TAGH
Negativos
Control de Calidad en
Inmunohematología

6. Control de Técnicas
 Seguimiento de POES
 Incorporaciòn de cambios para todo el personal
 Uso de controles diarios de reactividad
 Validación de las técnicas nuevas
 Revisión Periódica de los manuales
7. Control de RRHH
 Validación y firma de seguimiento de técnicas
 Test de proeficiencia semestral = Nota
 Control con muestras ciegas
Control de Calidad en
Inmunohematología

8. Control de Equipos
 Control diario de tº
 Hoja de vida de reparaciones
 Programa de mantención
 Centrífugas calibradas
 Programa de emergencias
 Red eléctrica de emergencia
Técnica en tubo
Ventajas Desventajas
 Técnica Estándar  Aglutinación inestable
 Se pueden añadir con acs débiles
aditivos  Se deben lavar tubos
 Permite la o eliminarlos y gastar
manipulación mucho $
 Se pueden incorporar  Requiere experiencia
cambios en la manipulación
 La hemólisis es visible  Requiere lectura
cuidadosa
 Requiere mucho
espacio
 Técnica en Microplaca
Ventajas Desventajas
 Bajo Costo
 Requiere equipamiento
 Igual o mejor especial
sensibilidad que el  Se deben tratar las placas
tubo para evitar la estática del
 Requiere poco plástico
espscio  Las microplacas
 Se puede procesar predispensadas tienen un
una gran cantidad de alto valor
muestras en poco
espacio
 Técnica en microcolumnas de gel
Ventajas
 Técnica muy sensible
 Permite corroborar los resultados se
puede sacar fotocopias
 Los test de AGH NO se lavan, por
lo que son más rápidos además de
sensibles
 Utilizan aditivos de LISS por lo que
las incubaciones son más cortas
 La técnica no permite cambios por lo
que hay sólo una manera de trabajar
 Existe equipamiento que permite la
automatización
Desventajas
 Requiere equipamiento
especial
 Precio muy alto
 Permite trabajar con un nº
restringido de muestras.
 Algunos pueden dar
resultados falsos positivos
por crioaglutinias y por
muestras sin anticoagulante