INFORME:

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y VIVERO (SEMILLA)

CAMILO ALEJANDRO CORREGIDOR FONSECA

TECNICO EN PRESERVACION DE RECURSOS NATURALES

FIRAVITOBA (BOY)
SENA- CEDEAGRO
2013
 INFORME:
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y VIVERO (SEMILLA)

CAMILO ALEJANDRO CORREGIDOR FONSECA

INFORME DE LABORATORIO

ING. OMAR ARIEL CAMARGO GONZALEZ

TECNICO EN PRESERVACION DE RECURSOS NATURALES

FIRAVITOBA (BOY)
SENA-CEDEAGRO
2013
 PREAMBULO

En los procedimientos de cultivo descritos hasta la década de los ochenta, no se hace ninguna
referencia al control ambiental en el desarrollo de las plantas in vitro. Sin embargo, las tasas de
crecimiento, desarrollo y muchas de las características fisiológicas y morfológicas de las
plantas formadas in vitro están influenciadas por el ambiente físico, químico y gaseoso de los
recipientes. El incremento de conocimientos acerca del control ambiental del cultivo de tejidos
en condiciones estériles, está provocando una evolución de las distintas técnicas empleadas en
la micropropagación de plantas. El ambiente in vitro en recipientes con baja tasa de ventilación
presenta unas tasas bajas de flujo de materia y energía, con mínimas variaciones de
temperatura, elevada humedad relativa y grandes cambios diarios de la concentración de CO2
en el interior de los recipientes. El tipo de recipiente de cultivo (tamaño, forma, material y
sistema de cierre) puede condicionar la evolución de la composición gaseosa en su interior
durante el período de cultivo. Ante los distintos factores de estrés que tienen que soportar
durante las fases de la micropropagación las plantas producidas en recipientes con nulo o
escaso intercambio gaseoso, pueden manifestar alteraciones o déficit en cuanto a su estructura
anatómica, morfológica y fisiológica. Como consecuencia, estas plantas presentan un fenotipo
incapaz de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo. Actualmente se pueden
utilizar diferentes métodos para controlar el ambiente en las distintas fases de la
microopropagacion, ya sean cultivos heterótrofos, mixótrofos o autótrofos. La elección de la
mejor estrategia va a depender de varios factores, destacando la especie, el número de
trasplantes requerido y la relación calidad precio entre otros.
 INTRODUCCION

El cultivo in vitro, microopropagacion o propagación vegetal in vitro, es el cultivo de células,

tejidos u órganos de plantas en un medio aséptico que le aporta los nutrientes necesarios para
su desarrollo. En este medio y con algunas condiciones físicas y químicas apropiadas, las
células tienen la habilidad de desarrollarse, diferenciarse, producir metabolitos, multiplicarse y
hasta regenerar un organismo entero" en cuyo caso, la nueva planta será genéticamente
idéntica a la planta madre, y su desarrollo se dará en un periodo de tiempo mucho más corto.
Así pues, para lograr cualquiera de estos propósitos se debe iniciar con la utilización de
pequeñas muestras de tejidos vegetales (explante) que tras una adecuada desinfección
superficial, son transferidos asépticamente a medios nutritivos líquidos o semisólidos y
almacenados bajo condiciones ideales de temperatura y fotoperíodicidad que garanticen un
rápido desarrollo. Los medios de cultivo, líquidos o semisólidos, difieren básicamente por la
presencia de un gelificante, contienen carbohidratos como fuente de carbono y energía
(generalmente sacarosa), sumado a minerales, vitaminas, aminoácidos, suplementos orgánicos
y en muchos casos fitohormonas o compuestos sintéticos conocidos como reguladores de
crecimiento, son mensajeros químicos vegetales secretados en un determinado tejido y que
actúan en el mismo tejido, o en otro distinto de la planta y por ello, se les considera
biocatalizadores junto con los enzimas y las vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a
cinco grupos cada uno de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulación del crecimiento
en plantas y pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta, estos grupos
son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscísico y Etileno.
 OBJETIVO GENERAL

 Esta práctica busca el conocimiento e implementación de algunas técnicas básicas del

cultivo de tejidos vegetales.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Inducir diferenciación tisular en explantos provenientes de diferentes tejidos

vegetales.
 Acelerar el crecimiento de plantas utilizando medios nutritivos suplementado con
fitohormonas.
 Desarrollar el protocolo de tratamiento y desinfección de semillas.
 Implementar el manejo adecuado de semillas en laboratorio y vivero.
 Conocer la utilidad y el manejo del equipo básico, instrumentos y herramientas de un
laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
 EXPLANTE

Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la elección del explante apropiado para el
establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:

OBJETIVO DEL CULTIVO

Si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos,
se podría esquematizarlas en aplicaciones para:

• Estudios básicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo único que
se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algún proceso fisiológico, se puede
cultivar cualquier órgano, tejido o célula viva. En este caso en que lo único que se busca es la
inducción de callos, lo ideal es cultivar explantes jóvenes, derivados de semillas en
germinación, donde se obtienen respuestas rápidas y, en general, hay menores problemas de
contaminación con microorganismos. A veces se hace uso del cultivo de tejidos porque
representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los fenómenos
de correlación entre las distintas partes que normalmente están presentes en una planta
entera. El explante que se usará estará condicionado por lo que se quiere estudiar. Ej: Lulo de
la selva.

• Obtención de plantas con sanidad controlada. Es muy común la utilización del cultivo de
tejidos para la obtención de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema
(dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de
primordios foliares.

• Micropropagación. En este caso dependerá del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se
quiere explotar es la brotación de meristemas, los ápices terminales y los segmentos
uninodales de ramas jóvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de
tejidos debe conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para aprovechar
aquellos explantes que en forma natural son propágulos. En cambio, si se pretende
micropropagar mediante el empleo de semillas sintéticas) el explante original deberá posibilitar
la inducción de la embriogénesis somática. En este caso, la utilización de embriones zigóticos
inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes.

• Obtención de híbridos interespecíficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos
en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda para la obtención de híbridos derivados
de cruzamientos interespecíficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En
estos casos, el explante cultivado es el embrión cigótico en estadios tempranos de su
desarrollo. Con la misma finalidad también se utilizan ovarios u óvulos fecundados.

• Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los
explantes pueden ser semillas (por ej. orquídeas) o bien, se aíslan los embriones en un estado
temprano de desarrollo («corazón») como en el caso de yerba mate o de algunas variedades
de duraznero.

• Obtención de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que

contiene el complemento gamético de cromosomas). En este caso, los explantes más utilizados
son las anteras, aunque también pueden emplearse microsporas aisladas, óvulos y ovarios no
fertilizados.

• Inducción de variación somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la
finalidad de su utilización es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas, los
explantes utilizados deben posibilitar la regeneración de plantas enteras.
• Producción y/o conversión de sustancias útiles. Se puede utilizar una gran variedad de
explantes. Los de raíces suelen ser muy utilizados.

• Obtención de híbridos somáticos. Para esta finalidad se recurre a la fusión de protoplastos.

En la mayoría de los casos se aíslan los protoplastos de mesófilos de hojas y de suspensiones
celulares.

• Conservación e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos

para el desarrollo de sistemas de conservación a mediano y largo plazo (críoconservación con
nitrógeno líquido) y para el intercambio de material genético.

• Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a

partir de explantes extraídos de semillas en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledones,
raíces).

POSIBILIDAD DE CONTAMINACION CON MICROORGANISMOS.

De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones de
invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminación. Por otra parte, es
recomendable evitar el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas) que provienen de plantas
crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayoría de los casos no es posible
conseguir una buena desinfección de los mismos.

EDAD FISIOLOGICA

Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis. Como regla general se puede decir
que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su
respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados
en numerosas especies. En el caso de la micropropagación de plantas leñosas, la edad del
explante es un factor crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropropagación tiene mayores
posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de
realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes.

TAMAÑO

En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la
proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de
explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con
microorganismos. También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del
explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fácil
lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeños suelen requerir del
empleo de medios más complejos o de los denominados medios acondicionados.

EPOCA DEL AÑO

Es un factor que suelen tener mucha importancia en la microopropagacion y que generalmente

está asociado al grado de dormición que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y
también con la posibilidad de mayor o menor proliferación de microorganismos.
ASEPCIA

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos
es el de la contaminación de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos,
levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente generado por explante medio de cultivo
condiciones físicas de incubación es altamente propicio para la proliferación de muchos de
estos microorganismos que pueden provocar la destrucción de los cultivos. Es difícil cuantificar
el impacto de estas pérdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la
micropropagación se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos
microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del
medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difícil conseguir cultivos estrictamente asépticos
dado que en la mayoría de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y
fitoplasmas, por lo que en la práctica, cuando se refiere a cultivos asépticos, en general se
quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferación de hongos y bacterias.

MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo puede ser definido como una formulación de sales inorgánicas y
compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos. Existen
numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para
dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col, luego de revisar más
de 3.000 trabajos científicos describen en dos tomos (casi 1.000 páginas en total) más de 2.000
medios de cultivo. También dos empresas multinacionales ofrecen para la venta más de 60
medios cada una, listos para su utilización especialmente en la micropropagación comercial de
plantas. En la siguiente tabla se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad.
Básicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran:

• Una fuente de carbono

• Nutrientes minerales
• ·Sustancias vitamínicas
• Sustancias reguladoras del crecimiento
• Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos)
CONDICIONES AMBIENTALES PARA LA INCUBACION

La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos
en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad
atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o
cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y uniforme
circulación de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la
iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son
incubados a temperatura constante de 25-28 ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La
luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con una irradiancia
de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad atmosférica debe ser elevada (80- 90%).

ACLIMATACION DE LAS PLANTAS REGENERADAS IN VITRO

Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales

disímiles al ambiente externo. La atmósfera interna se caracteriza por presentar una
considerable variación diurna en la concentración de CO2, humedad relativa elevada,
temperatura constante e intensidad lumínica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por
concentraciones elevadas de azúcares (en aquellos sistemas heterótrofos y semiautótrofos de
micropropagación), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de
microorganismos, generan anormalidades morfológicas, anatómicas y fisiológicas que las
plantas deberán corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este período de
adaptación al nuevo hábitat es llamado fase o etapa de aclimatación. La estrategia a
implementarse durante el mencionado ciclo deberá contemplar el control minucioso de los
parámetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la
deshidratación y, al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de generar un rápido
crecimiento de los plantines. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad
del aparato estomático que presentan las hojas de la mayoría de las especies cultivadas in
vitro, determinan una alta tasa de transpiración que puede ocasionar la muerte por
deshidratación.

PROCEDIMIENTO

Preparación de los medios de cultivo: Para esta práctica se deben preparar y esterilizar bajo
condiciones de calor húmedo (15 psi/ 121 ºC/ 20 minutos) los siguientes medios de cultivo:

1.Inducción de callos: preparar 60 ml de MS (pH: 5.7-5.8), suplementado con sacarosa (3%),

vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio
control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por la instructora. Se sugiere
relación auxina:citoquinina (1:1 o 2:1)

2.Crecimiento: preparar 60 ml de MS (pH: 5.7-5.8), enriquecido con sacarosa (3%), vitaminas,

gar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control
enriquecido con las condiciones hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relación
auxina:citoquinina (1:1 o 1:2)

3. Proceso de desinfección del material vegetal: Una vez lavado el material vegetal con agua y
jabón, se sumerge inicialmente en etanol (70%, 2 min) y posteriormente en 50 ml hipoclorito de
sodio (2%, 15 min.). Pasado este período de tiempo, de elimina el desinfectante, se hacen tres
lavados consecutivos (5 min. cada uno), se transfiere en condiciones estériles a los medios de
cultivo y se almacena bajo condiciones controladas de temperatura y fotoperiodicidad.

SEGUIMIENTO A REALIZAR EN LA PRÁCTICA

1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales y anotar los avances que estos presenten,
incluyendo aparición de callos, contaminaciones, organogénesis y aumento en longitud o
tamaño.

2. Realizar subcultivos rutinarios y continuar el desarrollo de estos.

 Manual de laboratorio de Biotecnología

NORMAS DE SEGURIDAD PARA LA UTILIZACIÓN DEL ESPACIO EN PRÁCTICAS DE

LABORATORIO

*Use bata de laboratorio para cada práctica y no utilice calzado destapado

*Use guantes, tapaboca, lentes de protección, y máscara con filtros, cuando se requieran.

*No pipetee con la boca, use un pipeteador

*No se lleve los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respire directamente sobre ningún reactivo
pues sus vapores pueden ser tóxicos

*No ingiera alimentos o bebidas en el laboratorio

*No use durante las prácticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o collares

*No deposite alimentos en las neveras, ni consuma el hielo que allí se produce

*No se admiten en el laboratorio personas que no estén matriculadas en el respectivo curso,

por favor no reciba visitas

*No ubique bolsos, tulas, maletines o paquetes, en los lugares de trabajo.

UTILIZACIÓN DE REACTIVOS

*Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona que lo preparó
y la fecha de preparación

*No arroje por los sumideros ácidos, bases o algún otro reactivo, por favor depositelos en los
recipientes de desecho

*Evite derrames de sustancias en las mesas de trabajo, así se previene que algún compañero
se queme la piel o se deteriore la ropa.

*No arroje al piso ningún reactivo

*No arroje al piso papeles u otros elementos. Por favor utilice el recipiente para la basura.
 VENTAJAS

 A partir de un individuo de alto vigor genético se pueden obtener miles de descendientes en un

mismo periodo.
 La propagación se realiza independientemente de las condiciones ambientales.
 Es el método más eficaz para la obtención de plantas totalmente libres de enfermedades.
 Producto del saneamiento y rejuvenecimiento que provoca el cultivo in vitro se aumenta el
rendimiento en un 20% a un 40%.
 Permite en el campo ciclos productivos sincrónicos que facilitan la planificación de las
actividades de siembra y cosecha.
 GLOSARIO

Auxinas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que producen elongación

celular, y en algunos casos división celular; frecuentemente inducen la aparición de raíces
adventicias e inhiben el desarrollo de yemas adventicias (en los vástagos). Ejemplo el ácido 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D)

Citoquininas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que inducen la división

celular y frecuentemente la formación yemas adventicias (en los vástagos). En la mayor parte
de los casos inhiben el desarrollo de raíces adventicias. Las citoquininas disminuyen la
dominancia apical. Ejemplo: 6-benzilaminopurina (BA).

Callo: Tejidos no organizados, formados por células diferenciadas y no diferenciadas, que se

dividen de forma activa y que generalmente se originan en zonas dañadas (por heridas), o en
cultivo de tejidos.
 BIBLIOGRAFIA

farmacia.udea.edu.co/~fsegura/tejidos.zip

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Plant Tissue Cultura, Cambridge University Press, 122-132.

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ANEXOS