https://www.youtube.com/watch?

v=JaO7hrZ7b4Y

Determinarea capacitatii antioxidante totale a unor probe de natura alimentara,

prin metoda DPPH

Radicalii liberi sunt specii chimice (atomi sau grupuri de atomi) care au un electron
neimperecheat (un număr impar de electroni), fiind specii foarte reactive. Acestia transforma alte
molecule în radicali liberi, cu generarea si propagarea unor reactii in lanț (r. de deteriorare).
Prin diferite reactii de oxidare se pot forma radicali liberi, atat in mediul inconjurator (ex: arderea
deseurilor, fumul de tigara etc), dar si in mediul endogen (radicali produsi in organism). Radicalii liberi
sunt inevitabil produși si în sistemele biologice, daunele provocate de acestia fiind de tipul tulburărilor
degenerative, cum ar fi mutageneza, carcinogeneza, tulburările cardiovasculare și îmbătrânirea (Singh
and Singh 2008).
Antioxidantii sunt substante care sunt capabile sa neutralizeze/inhibe moleculele reactive (ex:
radicalii liberi) si sa reduca daunele oxidative aparute ca urmare a producerii de radicali liberi.
Acestia sunt compuși care combat radicalii liberi, respectiv stopeaza reactiile in lant prin
indepartarea intermediarilor de tip radical liber (ex: prin intervenția in oricare dintre cele trei etape
majore ale procesului oxidativ, adică inițierea, propagarea și întreruperea, Cui et al. 2004), dar si prin
inhibarea altor reactii de oxidare.
Prin reactia antioxidantului cu un radical liber se realizeaza transferal unui electron (de la
antioxidant) catre electronul neimperechiat al radicalului liber. Astfel, va rezulta:
 neutralizarea radicalului (acesta va prezenta o pereche de electroni stabila);
 convertirea antioxidantului intr-un radical liber stabil (radical carea poate fi stabilizat
printr-o conjugare interna).

Antioxidanții pot proveni din doua surse:

 surse endogene - rezulta din procesele metabolice, fiind sintetizati de organism (ex: superoxid
dismutaza (SOD), catalaze (CAT), glutation peroxidaze (GPx);
 surse exogene (apar în mod natural în legume si fructe cu continut ridicat in vitamine C, E,
polifenoli, b-caroteni, flavone, antociani; minerale - Se, Fe, Zn, Cu si Mn etc.)
Echilibrul dintre oxidanți și antioxidanți din organism joaca un rol esential in sanatatea fiecarui
individ.

1. Aspecte teoretice – metoda DPPH

Metoda DPPH a fost dezvoltată de Blois (1958) pentru a determina activitatea antioxidantă,
folosind un radical liber stabil de tip 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). În general, metoda DPPH a
fost si este utilizată pentru evaluarea caracterului antioxidant al compusilor chimici de origine naturala
(Villano D şi colab. 2007).
DPPH este o substanta solida (pulbere cristalină de culoare închisă, compusă din molecule
stabile de radicali liberi), fiind cunoscuta drept un radical “capcană” eficient pentru neutralizarea sau
inhibarea radicalilor liberi. DPPH este caracterizat drept un radical liber stabil prin virtutea
delocalizării electronului de rezervă/neimperecheat asupra moleculei în ansamblu, astfel încât
molecula să nu dimerizeze, cum se intampla la majoritatea radicalilor liberi.
DPPH are două aplicații majore, ambele în cercetarea de laborator:
 este un monitor al reacțiilor chimice care implică radicali, fiind un antioxidant utilizat
frecvent;
 este un standard al poziției și intensității semnalelor de rezonanță paramagnetica electronica.

Prin urmare, reducerea vitezei unei reacții chimice la adăugarea de DPPH este utilizată ca
indicator a starii de radical a reacției respective. Datorită unei benzi de absorbție puternică, situata la 517
nm, radicalul DPPH are o culoare violet intens în soluție și devine incolor sau galben pal atunci când
este neutralizat (de un antioxidant). Această proprietate permite monitorizarea vizuală a reacției, iar
numărul radicalilor inițiali poate fi calculat din modificarea absorbției optice de la 517 nm a DPPH.
La amestecarea soluției DPPH (Z•) cu o substanță care poate dona un atom de hidrogen (A – H),
dă naștere formei reduse (Z-H) odată cu pierderea culorii violet (Kedare si Singh, 2011).
Reprezentând molecula donor prin AH, reacția primară este:

Z• + A–H ZH + A• (1)

Z• (DPPH) ZH (forma redusa a DPPH)

Fig. 1.
Z• = molecula de DPPH; este concepută astfel incat să reprezinte radicalii liberi formați în
sistem, a căror activitate trebuie sa fie suprimată de substanța A – H.
ZH = forma redusă, iar A• este radicalul liber produs în prima etapă.
Cel din urmă radical (A•) va suferi apoi reacții suplimentare care controlează stoichiometria
generala. Reacția (1) este, prin urmare, destinată să asigure legătura cu reacțiile care au loc într-un
sistem oxidant, cum ar fi autoxidarea unor lipide sau a altore substanțe nesaturate.
Asadar DPPH poate accepta un electron sau un radical de hidrogen pentru a deveni o moleculă
stabilă, diamagnetică, ea putand fi oxidată doar cu dificultate, și ulterior ireversibil.
DPPH prezintă o bandă de absorbție puternică la 517 nm datorită electronului său
neimperecheat (soluția fiind de culoare violetă profundă), absorbția dispărând pe măsură ce electronii
se imperechează (Fig. 2). Decolorarea rezultată este stoechiometrică în raport cu numărul de electroni
preluati. Soluțiile alcoolice de 0,5 mM sunt intens colorate și la această concentrație legea Lambert-Beer
este respectată.

Fig. 2. Inhibarea lantului polimeric, R, de catre DPPH

Aplicabilitate
Este o metodă rapidă, simplă, ieftină și folosită pe scară largă pentru a măsura capacitatea
compușilor de a acționa drept “captatori” de radicali liberi sau donori de hidrogen și de a evalua
activitatea antioxidantă a alimentelor. Metoda DPPH poate fi folosita și pentru cuantificarea
antioxidanților în sisteme biologice complexe, pentru probe solide sau lichide.
Metoda se aplică si pentru a determina capacitatea totala antioxidanta și activitatea de
captare/indepartare a radicalilor liberi, a sucurilor de fructe și a legumelor (Sendra și colab. 2006). Acest
test a fost utilizat cu succes pentru investigarea proprietăților antioxidante ale boabelor de grâu și tărâțe,
legume, acizi linoleici conjugati, condimente, uleiuri din semințe comestibile etc., în diferite sisteme de
solvent (ex: etanol, acetonă apoasă, metanol, alcool apos și benzen). (Yu 2001; Parry și colab., 2005).
Este o metodă convenabilă pentru testul antioxidant al cisteinei, glutationului, acidului ascorbic,
tocoferolului și al compușilor polifenolici (Masahiro și colab. 2005), pentru uleiul de măsline, fructe,
sucuri și vinuri (Sanchez-Moreno 2002).
Metoda este unică în realizarea reacției unei probe specifice cu DPPH, utilizant drept solvent
metanol/apă, ceea ce facilitează extragerea compușilor antioxidanți din probă. Determinarea activității
antioxidante a diferitelor tipuri de alimente folosind DPPH este comparabilă cu alte metode. Analiza
antioxidanților prin alte metode poate fi limitată la acei compuși solubili în solvenții selectați. Avantajul
acestei metode este că DPPH este lăsat să reacționeze cu întreaga proba; timpul suficient dat în metodă
permite DPPH să reacționeze lent chiar și cu antioxidanți slabi (Prakash 2001). Metoda DPPH poate fi
utilizată în solvenți organici apoși și nonpolari și poate fi utilizată pentru a examina atât antioxidanții
hidrofili cât și cei liofili (Prior și colab., 2005).
Metoda DPPH este considerata o metodă corectă, ușoară și economică valabilă pentru a evalua
activitatea de indepartare/captare a radicalilor, manifestata de diferiti antioxidanți, deoarece compusul
radical (DPPH) este stabil și nu trebuie să fie generat. Metoda prezinta totusi cateva limitari în ceea ce
privesc sistemele de emulsie și nu este utilă pentru măsurarea activității antioxidante a plasmei, deoarece
proteinele sunt precipitate în mediul de reacție alcoolic.

2. Principiul metodei

Metoda DPPH (test antioxidant bazat pe transfer de electroni) oferă o modalitate simplă și rapidă
de a evalua activitatea antioxidanta prin spectrofotometrie (masuratori colorimetrice).
Principiul metodei se bazează pe reducerea radicalului stabil DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)
de către un antioxidant, reducere evidenţiată prin modificarea culorii violet a soluţiei etanolice a
radicalului DPPH (Duh PD şi colab. 2004).
Soluţia etanolică de DPPH, de culoarea violet prezintă un maxim de absorbţie la 517 nm iar prin
amestecarea cu soluţia probei de analizat, DPPH-ul poate fi redus, reducere pusă în evidenţă prin
disparitia culorii violet.

Fig. 3. Schimbarea culorii DPPH de la violet la incolor/slab galbui, atunci cand este expus la
actiunea unui antioxidant (AOH)

2. Experimental

2.1. Materiale

Materii prime
1. Proba alimentara, solida sau lichida (ex: ulei
de măsline, fructe, sucuri, vinuri etc)
2. Metanol, 99% (Merck, Germany)
3. DPPH (Sigma Chemical, USA), 1M
4. Acid ascorbic ca standard (Merck, Germany)

2.2. Ustensile si echipamente

 - Balanta
- Baie de apa cu agitare
- Centrifuga; tuburi de centrifugare
- Micropipete
- Pahare bezelius, baloane cotate
- Spectrofotometru UV

2.3. Preparare reactive si solutii de lucru

 Preparare solutie 0,004% DPPH (w/v); se dizolva 4mg DPPH in 100 mL methanol, intr-o camera
intunecata;
 Drept standard se foloseste acidul ascorbic. Preparare solutie stoc de acid ascorbic 800 mg/mL;
2.5 mg acid ascorbic se dizolva in 2.5 mL apa distilata;
 Realizare dilutii consecutive din solutia stoc de acid ascorbic, pentru a prepara solutii de
concentratii diferite: 25 mg/mL, 50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 si 400 mg/mL;
 Preparare solutie stoc de proba de analizat, 400 mg/mL: se dizolva 4mg extract vegetal in 10
mL methanol; din solutia stoc de proba se prepara dilutii cu concentratii corespunzatoare
 Preparare solutie control. 3 mL sol DPPH se utilizeaza drept control negativ. Blank-ul pentru
aceasta solutie este etanolul.

2.4. Mod de lucru

1. 2 mL de sol. metanolica de extract de plante, de diferite concentratii se introduc intr-un pahar
erlenmayer
2. Se adauga 3mL solutie metanolica de DPPH in paharul erlenmayer;
3. Pastrare timp de 30 min, la intuneric pentru definitivarea/completarea reactiei;
4. Se masoara absorbanta solutiei la 517 nm utilizand un spectrofotometru; se foloseste in paralel o
solutie blanc;
5. O solutie blanc uzuala contine toti reactivii, cu exceptia extractului de plante sau solutia
standard;
6. Procentul activitatii de inhibitie (I, %) se calculeaza utilizand ecuatia:
I (%) = [(Abscontrol − Absproba/standard)]/(Abscontrol)] × 100
unde: Abs proba/standard = absorbanţa probei de extract/standardului de testat ce conţine DPPH;
Abs control = absorbanța controlului (a soluţiei de DPPH, fără probă).

7. Se construieste graficul prin reprezentarea % Inhibitie versus concentratie si se calculeaza din

grafic valoarea IC 50.
IC50 reprezintă activitatea antioxidantă calculată când concentraţia probei captează 50% din
radicalii DPPH în aceeleaşi condiţii (Huang DJ şi colab. 2007).
IC50 este o măsură cantitativă care indică cât de mult dintr-o anumită substanță inhibitoare (de
exemplu, un medicament) este necesară pentru a inhiba, in vitro, un proces biologic dat sau o
componentă biologică cu 50%.
 IC50 = Concentrația la care o substanță marker reduce viabilitatea celulara cu 50 % după o
perioadă fixă de expunere.

Prezentarea rezultatelor:

1. Se notează absorbanţa martorului, a probelor si a standardelor si se introduce intr-un table de

tipul:

Solutie de extract Concentratie, Absorbanta Inhibitia,

de plante (mL) mg/mL (A) %
control 12.5 ……..
1 25
2 50
3 100
4 200
5 400

2. Se reprezintă grafic curba de calibrare; se determina ecuatia dreptei.

3. Se exprima activitatea antioxidantă a probelor studiate.

Bibliografie

1. Kedare S.B., Singh R. P., Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay, J Food Sci
Technol. 2011, 48(4): 412–422.
2. Cui K, Luo X, Murthy MRV. Role of oxidative stress in neurodegeneration: recent developments in assay
methods for oxidative stress and nutraceutical antioxidants. Prog Neuropsychopharmacol Biol
Psych. 2004; 28:771–799.
3. Masahiro N, Masahiro K, Minemitsu N, Akio K, Yoshimi N. Non-reductive Scavenging of 1, 1-
Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) by Peroxyradical: A Useful Method for Quantitative Analysis of
Peroxyradical. Chem Pharm Bull. 2005; 53(6):714–716.
1. Parry J, Su L, Luther M, Zhou KQ, Yurawecz MP, Whittaker P, Yu LL. Fatty acid composition and
antioxidant properties of cold-pressed marionberry, boysenberry, red raspberry, and blueberry seed oils.  J
Agric Food Chem. 2005; 53:566–573.
2. Prakash A. Antioxidant activity. Med Lab Anal Prog. 2001; 19(2):1–6. 
3. Prior RL, Wu X, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and
phenolics in foods and dietary supplements. J Agri Food Chem. 2005; 53:4290–4302.
4. Sanchez-Moreno C. Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in foods and biological
systems. Food Sci Technol Int. 2002; 8(3):121–137. 
5. Sendra JM, Sentandreu E, Navarro JL. Reduction kinetics of the free stable radical 2, 2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl (DPPH•) for determination of the antiradical activity of citrus juices. Eur Food Res
Technol. 2006; 223:615–624.
6. Singh S, Singh RP. In vitro methods of assay of antioxidants: An overview. Food Rev Int. 2008;
24(4):392–415.
7. Yu LL. Free radical scavenging properties of conjugated linoleic acids. J Agric Food Chem. 2001;
49:3452–3456.