UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

FUNDAMENTOS DE BIOPROCESOS

Análisis del artículo “Hidrólisis enzimática

de celulosa bacteriana para la producción
de nanocristales para la industria del
envasado de alimentos”
Autores
Batallanes Bautista Oscar
Canazas Rosas Fabiola
Tapia Ataucure Lysseth

URL DEL VIDEO EXPLICATIVO: https://www.youtube.com/watch?v=LxIsu0hC1Z0

Problema de ingeniería que pretende
resolver el artículo
Evaluación del uso de nanocristales de celulosa
bacteriana (BCNC) obtenidos por hidrólisis enzimática
cargadas en biopolímeros de pululano para uso como
nanopartículas en la generación de recubrimientos
barrera de alto oxígeno destinados a aplicaciones de
envasado de alimentos.
 ESTRUCTURA Y CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS
Complejo de enzimas celulóticas
CELULOSA:
(No son selectivas) • ENDOGLUCANASAS (EG)
• EXOGLUCANASAS (CBH)
• Β-GLUCOSIDASA
Todas las celulasas se unen enlace químico, el β -l, 4-glicosídico enlace, pero
hay variación en el microambiente de estos enlaces en sustratos naturales

Poseen en el dominio catalítico, un residuo aminoacídico

que funciona como nucleófilo catalítico que está cargado
negativamente al pH óptimo para la enzima y otro residuo
que actúa como donador de protones.
Este par de residuos, dependiendo del organismo que
exprese la enzima, pueden ser dos aspartatos, dos
glutamatos o uno de cada uno.

• Knowles, J., Lehtovaara, P. y Teeri, T. (1987). Familias de celulasa y sus genes. Tendencias en biotecnología, 5 (9), pag 256
• https://www.elsevier.es/es-revista-revista-iberoamericana-micologia-290-articulo-mecanismos-regulacion-hidrolisis-enzimatica-celulosa-
S1130140614000138
ENDOGLUCANASAS (endo‐1,4‐β‐ glucanasa; EG; EC 3.2.1.4):
• Hidrolizan enlaces glucosidicos interiores de la cadena de
celulosa
• Hidrolizan al azar en sitios amorfos del polisacárido de
cadena celulosa, generando oligosacáridos de varias
longitudes y, en consecuencia, nuevos extremos de la
cadena.

EXOGLUCANASAS (exo‐1,4‐β‐glucanasa; CBH; EC 3.2.1.91)

• Actuan de manera posesiva en los extremos reductores o no
reductores de cadenas de polisacáridos de celulosa,
liberando glucosa (glucanohidrolasas) o celobiosa
(celobiohidrolasa) como productos principales.
• Estas enzimas son activas contra el cristalino,
degradandolas.
Β-GLUCOSIDASA (β‐1,4‐glucosidasa; EC 3.2.1.21)
• Hidroliza las celodextrinas solubles y la celobiosa a glucosa
de forma no reductora final.
• Es inactivo contra la celulosa cristalina o amorfa.

FUENTE: Sadhu, S., & Maiti, T. K. (2013). Cellulase Production by Bacteria: A Review. British Microbiology Research Journal, 3(3), 235–258.
PROCESO DE TRANSFORMACIÓN BIOQUÍMICO
El procedimiento experimental se desdobla en dos puntos:
a) Producción de celulosa bacteriana
El microorganismo (bacterias del género Acetobacter) incrementa su
población gracias al consumo de oxígeno disuelto que se encuentra en el
medio de cultivo y producen celulosa, la cual forma capas superpuestas; a
medida que transcurre el tiempo de fermentación.
Se producen etapas:
• La primera etapa inicia con el ingreso del sustrato al microorganismo y su
conversión a glucosa-6-fosfato (G6P) por la enzima glucoquinasa.
𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 + 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑞𝑢𝑖𝑛𝑎𝑠𝑎 ↔ 𝐺6𝑃
• Posteriormente, la glucosa-6-fosfato pasa a glucosa-1-fosfato por la acción
de la enzima fosfoglucomutasa (PGM1).
𝐺6𝑃 + 𝑃𝐺𝑀1 ↔ 𝐺1𝑃
• Luego la Glucosa-1-Fosfato (G1P) se convierte en Uridina Difosfato glucosa
(UDP-glucosa) con la ayuda de UDPG pirofosforilasa y el nucleótido Uridina
Trifosfato (UTP).
𝐺1𝑃 + 𝑈𝑇𝑃 + 𝑈𝐷𝑃𝐺 𝑝𝑖𝑟𝑜𝑓𝑜𝑠𝑓𝑜𝑟𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 ↔ 𝑈𝐷𝑃𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
• En la segunda etapa, el UDP-glucosa con la ayuda de la enzima celulasa-
sintasa, encargada de la polimerización de la glucosa, se forma la celulosa.
FUENTE: Carreño Pineda, Caicedo Mesa, Martínez R. (2012). Técnicas de fermentación y aplicaciones de la celulosa bacteriana: una revisión. Ing. cienc., vol 8,
no16, pp. 307–335.
• El microorganismo (Acetobacter) posee una serie de poros de 3.5 nm alineados diametralmente en la membrana
celular por donde es secretada al medio de cultivo como una subfibrilla. La unión de las subfibrillas fuera de la
membrana se empaqueta como cintas de celulosa.

FUENTE: Carreño Pineda, Caicedo Mesa, Martínez R. (2012). Técnicas de fermentación y aplicaciones de la celulosa bacteriana: una revisión. Ing. cienc., vol 8,
no16, pp. 307–335.
b) Hidrólisis enzimática
Implica la acción secuencial de un grupo de enzimas, conocidas como celulasas, que pertenecen a la familia de las
glicosil hidrolasas y catalizan la hidrólisis del enlace glucosídico entre 2 o más hidratos de carbono y una fracción que no
sea un hidrato de carbono.
• En general, la hidrólisis del enlace glucosídico es catalizada por 2 aminoácidos en el sitio catalítico, uno ácido general
(donante de protones) y otro nucleófilo/base (aspartato y glutamato); además se describen dos mecanismos de
hidrólisis para las glicosil hidrolasas, de conservación y de inversión.
• Dependiendo de la posición espacial de estos aminoácidos la hidrólisis se produce a través de un mecanismo o de
otro. Si estos están dispuestos a una distancia de ≈5,5Å se da el mecanismo de conservación, si por el contrario esta
distancia es de ≈10Å sucede el mecanismo de inversión.
Para el mecanismo de conservación se da 2 etapas, la
primera llamada glucosilación en donde el nucleófilo
ataca el centro anomérico, dando como resultado la
formación de una enzima glucosídica intermedia con
un carácter ácido provisto por el carboxilato ácido,
luego en la segunda etapa llamada deglucosilación, el
ahora desprotonado carboxilato ácido actúa como
base y se une a una molécula de agua nucleofílica para
hidrolizar la enzima intermedia, obteniéndose así el
producto hidrolizado.

FUENTE: Gutiérrez-Rojas, Moreno-Sarmiento, Montoya (2015). Mecanismos y regulación de la hidrólisis enzimática de celulosa en hongos filamentosos: casos
clásicos y nuevos modelos. Revista Iberoamericana de Micología, Vol. 32. Núm. 1.
 Por otro lado, el mecanismo de inversión la hidrólisis es alcanzada en una sola
etapa, ya que debido a la mayor distancia entre los residuos catalíticos la
molécula de agua puede ser acomodada entre la base y el azúcar.

FUENTE: Gutiérrez-Rojas, Moreno-Sarmiento, Montoya (2015). Mecanismos y regulación de la hidrólisis enzimática de celulosa en hongos filamentosos: casos
clásicos y nuevos modelos. Revista Iberoamericana de Micología, Vol. 32. Núm. 1.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y MÉTODOS
DE ANÁLISIS QUE USA EL ARTÍCULO

Producción de celulosa bacteriana de tamaño macro (BC)

La producción de BC se produjo por fermentación estática (siete días a 30 ° C en un medio de cultivo Hestrin
y Schramm).
Las películas de BC se lavaron con agua desionizada y se hirvieron en una solución alcalina (NaOH 1 M)
durante 30 minutos para eliminar las células bacterianas residuales. Después de lavar varias veces con agua
destilada, el material celulósico se homogenizó durante 15 minutos con un homogeneizador básico con una
herramienta de dispersión a 12,000 rpm y finalmente liofilizado a -55 ° C y 0,63 mbar durante 24 h.

FUENTE: Cesare Rovera, Filippo Fior, Silvia Trabattoni, Diego Romano y Stefano Farris, abril de 2020. Hidrólisis enzimática de celulosa bacteriana para la
producción de nanocristales para la industria del envasado de alimentos . Artículo, pág.3.
 Hidrólisis enzimática de celulosa bacteriana (BC)
La hidrólisis de BC se realizó utilizando dos enzimas diferentes: una endo-1,4-β-glucanasa de Halotolerans
termobífidos en forma líquida concentrada y una celulasa de Trichoderma reesei en forma de polvo.
En ambos casos, se preparó un stock de BC en agua añadiendo 12 g de BC liofilizado a 88 g de agua destilada.
Luego, se añadió 1 g de la dispersión a 30 g de solución tampón Tris (0,05 M pH 8,5) para el medio endo-1,4-β-
glucanasa hidrólisis, mientras que se usó una solución tampón de acetato de sodio (0,1 M, pH 5) para la
hidrólisis mediada por células.
Antes de la adición de las enzimas, las dispersiones BC se homogeneizaron utilizando un homogeneizador
básico con una herramienta de dispersión a 8000 rpm durante 5 min.
Las dispersiones se mantuvieron durante la noche en una incubadora a 60 ± 1 ° C y 55 ± 1 ° C para las
dispersiones que contienen endo-1,4-β-glucanasa y celulasa, respectivamente, destinadas a promover la
difusión de moléculas de agua en la red celulósica.
La hidrólisis enzimática de BC, independientemente de la enzima utilizada, se realizó durante un mínimo de 2
h y un máximo de 145 h.

FUENTE: Cesare Rovera, Filippo Fior, Silvia Trabattoni, Diego Romano y Stefano Farris, abril de 2020. Hidrólisis enzimática de celulosa bacteriana para la
producción de nanocristales para la industria del envasado de alimentos . Artículo, pág.3.
 Preparación de recubrimiento de nanocompuestos

Polvo de pululano (10% en peso) y BCNC (10% en peso) se

mezclaron con agua a 25 ° C durante 30 min. bajo agitación suave
(800 rpm).
La dispersión de agua pullulan/ BCNC se colocó sobre un sustrato
plástico de PET, 12.0 ± 0.5 µm de espesor.
Polvo de pululano
El proceso de recubrimiento fue llevado a una velocidad constante
de 150 mm · min −1, utilizando una varilla de acero horizontal con
un patrón grabado, que produjo recubrimientos finales de espesor
seco nominal comparable de ≈1 µm.
La evaporación del agua se logró utilizando un flujo constante y
perpendicular de aire suave (25.0 ± 0.3 ° C durante 2 min) a una
distancia de 40 cm del aplicador. Las películas recubiertas se
almacenaron a 23,0 ± 0,5 ° C en un desecador durante 1 semana
antes de la caracterización.

Nanocristales de celulosa bacteriana

FUENTE: Cesare Rovera, Filippo Fior, Silvia Trabattoni, Diego Romano y Stefano Farris, abril de 2020. Hidrólisis enzimática de celulosa bacteriana para la
producción de nanocristales para la industria del envasado de alimentos . Artículo, pág.3,4.
Análisis
La evolución de la hidrólisis enzimática se controló a intervalos de 3 h
en experimentos de turbidez, durante una ventana temporal de 145 h.
Las mediciones espectrofotométricas se realizaron utilizando un
espectrofotómetro a longitudes de onda entre 380 y 800 nm en modo
de transmitancia. Para todas las muestras, el área bajo el espectro de
transmitancia se calculó mediante el software Perkin Elmer UV WinLab
y se trazó con el tiempo.
Después del análisis turbidimétrico, se produjo un proceso de Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda
eliminación de agregados macroscópicos de celulosa hidrolizada,
posiblemente presente en las soluciones finales de agua, que dependía
de un sistema de filtración Buchner utilizando papel de filtro; esta
eliminación se realizó en todas las mezclas.
Los experimentos de microscopía de fuerza atómica (AFM) se
realizaron usando un Nanoscope V Multimodo en modo de contacto
intermitente después de colocar 10 µL de dispersión BCNC diluida 1:10
sobre un sustrato de mica.
Las imágenes se recogieron a una resolución de 512 × 512 píxeles
utilizando puntas de silicio (fuerza constante, 3 N / m; frecuencia de
resonancia, ≈75 kHz). Los cálculos dimensionales para las imágenes
adquiridas se realizaron con el software Nanoscope. Nanoscope V Multimodo
FUENTE: Cesare Rovera, Filippo Fior, Silvia Trabattoni, Diego Romano y Stefano Farris, abril de 2020. Hidrólisis enzimática de celulosa bacteriana para la
producción de nanocristales para la industria del envasado de alimentos . Artículo, pág.4.
 Análisis
Se usó un microscopio electrónico de transmisión (TEM)
para capturar imágenes de los BCN. Las imágenes digitales
se grabaron con una cámara CCD ProScan 1K de escaneo
lento.
Las muestras para los análisis TEM se prepararon, de
acuerdo con la técnica de tinción negativa, mediante
moldeo por goteo de unos pocos microlitros de dispersión
en una rejilla de Cu con recubrimiento de Formvarcoated Microscopio Electrónico de Transmisión de 100 kV
con descarga luminosa (malla 400) y se dejaron reposar las
muestras durante 1 a 2 min, luego se secaron y eliminar el
exceso de suspensión y contrastar con acetato de uranilo.
La información sobre la distribución de tamaños de BCNC se
obtuvo mediante espectroscopía de correlación de fotones,
utilizando un analizador de dispersión de luz dinámica
(DLS).
Los análisis se llevaron a cabo a 25 ° C, con un tiempo de
estabilización de 60 s y utilizando los valores de viscosidad
del agua (v = 0,8872 cP) e índice de refracción (n = 1,330). Nanotrac Flex, dispersión de luz dinámica (DLS)
FUENTE: Cesare Rovera, Filippo Fior, Silvia Trabattoni, Diego Romano y Stefano Farris, abril de 2020. Hidrólisis enzimática de celulosa bacteriana para la
producción de nanocristales para la industria del envasado de alimentos . Artículo, pág.4.
Imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) de partículas
BC después de la hidrólisis mediada por EG y EGs + celulasa.

Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanocristales

de celulosa bacteriana después de 145 h de hidrólisis
enzimática utilizando EG y enzimas de celulasa.
 Los datos se analizaron con el software Statgraphics Plus 4.0 y se utilizó un análisis
Análisis estadístico de varianza unidireccional para verificar las diferencias entre las muestras. El nivel
de significación se fijó en 0.05.

• Análisis de varianza
unidireccional es una prueba
estadística para analizar si más
de dos grupos difieren entre sí
en cuanto a sus medidas y
varianzas.
• El nivel de significación se
define como la probabilidad
de tomar la decisión de
rechazar la hipótesis nula
cuando ésta es verdadera.

FUENTE: Cesare Rovera, Filippo Fior, Silvia Trabattoni, Diego Romano y Stefano Farris, abril de 2020. Hidrólisis enzimática de celulosa bacteriana para la
producción de nanocristales para la industria del envasado de alimentos . Artículo, pág.5.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La experimentación se muestra como una alternativa para hidrolizar celulosa con el uso de
enzimas, pero cabe resaltar que el proceso con endo-1,4-β-glucanasa no dio resultados
significativos fue por ello que se necesitó adicionar celulasa, con lo cual la curva de hidrólisis
logró aumentar significativamente, pero al ser corroborado con las imágenes el grosor de las
partículas adicionando celulasa disminuía ya que el ataque fue periférico; sin embargo, el
número de nanopartículas fue mayor y se distinguía la forma esférica prevalente de estas.
El uso de BCNC en el artículo fue novedoso puesto que va añadido al biopolímero Pullulan que
se usa en envasados de alto rendimiento y forma barreras para el oxígeno, lo cual sería
beneficioso en muchos campos.
El uso de esta nueva metodología permite disminuir los impactos ambientales y las condiciones
del proceso, pero resulta ineficiente ya que las enzimas celulasas atacan no selectivamente y se
produce un porcentaje pequeño de nanopartículas (1.5% del peso total).
Si se logra controlar la acción de las enzimas, bajar el costo de los insumos e procedimientos y
optimizar el tiempo de trabajo, ya que tarda tiempo en obtener el producto, brindaría una
alternativa ecológica puesto que se podría utilizar los desechos de la cosecha de verduras, frutas
o plantas para producir envases resistentes que puedan preservar oxígeno en excelentes
condiciones o poder ser usadas para construir bloques que sirvan como aislante térmico.
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Samejima, M., Sugiyama, J., Igarashi, K. y Eriksson, K.-EL (1997). Hidrólisis enzimática de celulosa bacteriana.
Investigación de carbohidratos, 305 (2), 281–288.
https://sci-hub.tw/https://doi.org/10.1016/S0008-6215(97)10034-9
George, J., Ramana, KV, Bawa, AS y Siddaramaiah. (2011) Nanocristales de celulosa bacteriana que exhiben una alta
estabilidad térmica y sus nanocompuestos poliméricos. Revista Internacional de Macromoléculas Biológicas, 48 ​(1),
50–57
https://sci-hub.tw/https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2010.09.013

BIBLIOGRAFÍA ADICIONAL
• https://sci-hub.tw/https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.8b00600
• http://www.scielo.org.co/pdf/ince/v8n16/v8n16a12.pdf
• https://www.researchgate.net/publication/301566066_Factores_para_el_Escalado_del_Proceso_de_Produccion
_de_Celulosa_por_Fermentacion_Estatica
• https://www.elsevier.es/es-revista-revista-iberoamericana-micologia-290-articulo-mecanismos-regulacion-
hidrolisis-enzimatica-celulosa-S1130140614000138