21. Reactia de precipitare, Reactia de aglutinare.

Reactia de precipitare:

1. Precipitarea in solutie

Reactia de precipitare se produce atunci cand anticorpii reactioneaza cu antigene solubile, iar
rezultatul este un complex antigen-anticorp care isi pierde solubilitatea si precipita. Formarea unui
complex Ag-Ac solubil poate avea loc intr-un interval de doar cateva minute, pe cand formarea unui
precipitat necesita o perioada mult mai lunga de timp ( 1-2 zile). Explicatia pentru obtinerea unui
astfel de precipitat este data de necesitatea formarii de legari multivalente care conduc la aparitia unei
adevarate retele tridimensioanale. Atunci cand complexul ajunge la o anumita dimensiune isi pierde
solubilitatea si precipita.
Formarea acestui precipitat depinde nu doar de cantitatea de antigen si de anticorp, dar si de valenta
fiecaruia dintre reactanti. Antigenul trebuie sa fie in mod obligatoriu cel putin bivalent, deci trebuie sa
aiba cel putin doua copii ale aceluiasi epitop; multivalenta constituie un real avantaj pentru producerea
precipitarii.
Cantitatea maxima de precipitat este obtinuta atunci cand intre antigen si anticorp exista un raport
ideal, aceasta situatie fiind denumita “ zona de echivalenta”.

1
 2. Precipitarea in gel

Precipitatele imune se pot forma nu doar in solutie, ci si in medii semisolide, cum ar fi gelurile de
agar, care au proprietatea de a lasa solutiile apoase de antigen si de anticorp sa difuzeze liber.
Efectuarea acestor reactii in geluri a oferit posibilitatea de a distinge intre reactii antigen-anticorp
diferite, produse de diferiti anticorpi prezenti in ser. In aceasta maniera s-a putut realiza si examinarea
realtiei dintre diferite antigene.

2.1 Dubla imunodifuzie ( Ouctherlony)

2.2 Imunodifuzia radiala simpla ( Mancini)

Imunodifuzia radiala simpla este o varinta cantitativa a testului Ouchterlony . Este o metoda simpla si
eficienta de cuantificare a imunoglobulinelor ( inclusiv a subclaselor IgG), a compusilor sistemului
complement sau a altor proteine serice care se gasesc in concentratii relativ mari.

2
 3. Imunelectroforeza

Electroforeza proteinelor serului permite separarea acestora in 5 fractii majore: albumine, α1-, α2-, β-
si γ-globuline.
Diferentele de migrare al proteinelor in campul electric sunt datorate sarcinilor electrice distincte,
marimii si greutatii moleculare ale moleculelor, dar si unor caracteristici ale mediului de migrare ( in
special pH) sau unor conditii fizice ( de ex. temperatura).

3.1 Imunelectroforeza
Este efectuata de obicei in cazul in care este necesara confirmarea prezentei unui component
monoclonal, detectat prin electroforeza.

3.2 Electroforeza de imunofixare ( immunofixation electrophoresis - IFE)

Este utilizata ca o alternativa la imunelectroforeza si este destinata caracterizarii fractiilor proteice din
gammopatiile monoclonale din punct de vedere al specificitatii antigenului, mobilitatii elecrroforetice,
cantitatii fiecarei fractii proteice si raportului dintre aceste fractii.

3.3 Electroforeza contracurent ( countcurrent electrophoresis)

Este similara ca principiu dublei imunodifuzii, dar migragrea se realizeaza in camp electric. Aceasta
tehnica poate fi aplicata insa doar la pH ales in asa fel incat antigenul si anticorpul sa aiba sarcini
electrice diferite.

3.4 Electroforeza in racheta ( rocket electrophoresis)

Reprezinta o varianta a difuziei simple Mancini si permite cuantificarea nivelului antigenelor.

3.5 Focusarea isoelectrica ( isoelectric focusing)

Reprezinta o metoda alternativa pentru separarea proteinelor dintr-un amestec, care se bazeaza pe
existenta unor diferente foarte mici intre punctele isoelectrice ale acestor proteine.

3
 Reactia de aglutinare

Reactia de aglutinare apare atunci cand anticorpul reactioaneaza cu antigene particulate, insolubile,
cum ar fi celule sau molecule carrier multivalente inerte, si determina formarea unui complex
tridimensional stabil, cu o dimensiune mare, care devine vizibil sub forma unui agregat. Din acest
punct de vedere, reactia de aglutinare seamana cu cea de precipitare. Anticorpii care pot conduce la o
reactie de aglutinare sunt denumiti aglutinine.
Procesului de aglutinare i se descriu 2 etape:
- Etapa de sensibilizare vizeaza particulele antigenice si se poate produce in vivo sau in vitro.
Acest proces reversibil implica practic prima etapa a reactiei Ag-Ac in timpul careia un
anumit paratop se leaga la un epitop individual de pe suprafata antigenului multivalent.
Aceasta reactie de „ sensibilizare” nu este detectabila decat daca unul dintre cei doi reactivi
este marcat.
- Etapa de formare a agregatului este cea in care apare legarea incrucisata ( cross-linking)
dintre epitopii ramasi liberi si paratopii corespunzatori ai anticorpilor, ceea ce conduce la
formarea unui complex tridimensional. Agregatele pot fi vizibile microscopic sau chiar
macroscopic, in functie de marimea acestora.
Reactia de aglutinare poate fi influentata de mod particular de o serie de factori:
- Isotipul anticorpilor
- Sarcina electrica
- Numarul de epitopi ai antigenului
- Concentratia celor 2 reactivi
- Factori de mediu

Reactia de aglutinare poate fi realizata in mod direct sau indirect.

1. Aglutinarea directa este denumita ca atare deoarece intercatiunea dintre antigene si
anticorp conduce la aparitia unui agregat in mod direct.

4
Reactia poate fi folosita fie pentru identificarea unor antigene necunoscute, fie a unor anticorpi
necunoscuti, dar probabil cea mai cunoscuta reactie este cea de determinare a grupelor sanguine in
sistemul ABO.

2. Aglutinarea indirecta este reactia in care legarea anticorpilor la antigene nu determina

aglutinarea, concentratia epitopilor fiind una scazuta, iar anticorpii specifici fiind, cel mai
adesea, de clasa G. Este situatia intalnita in cazul grupului sanguin Rh, in care epitorpii
proteici se gasesc intr-un numar mult mai mic pe membranele eritrocitelor, comparativ cu
antigenele grupului ABO.

5
3. Aglutinarea pasiva este o metoda in care astfel de antigene solubile sunt atasate ferm la
suprafata unor particule solide, insolubile, care pot fi chiar hematiile. Acest lucru a fost
posibil prin tratarea suprafetei celulare cu diferite substante ( de exemplu acid tanic) sau
prin utilizarea unor agenti de legare bifuntionali ca bisdiazobenzidina.
O alta varianta a aglutinarii pasive utilizeaza anticorpi fixati la particule solide, iar acestea
vor fi incubate cu antigenele.
4. Testele de inhibitie a aglutinarii sunt utilizate atuncin cand se incearca identificarea unor
cantitati mici de antigen si se bazeaza pe competitia pentru acelasi anticorp dintre un
antigen fixat la un suport solid si un antigen solubil cunoscut.