IOD ACADEMIA ROMÂNĂ

ICA Institutul de Virusologie Ştefan S. Nicolau Bucureşti

TEZĂ DE DOCTORAT

MODIFICĂRI GENETICE, EPIGENETICE ȘI HORMONALE

ÎN INFERTILITATEA MASCULINĂ
- REZUMAT -

Coordonator ştiinţific:
Dr. Gabriela Anton, CSI

Doctorand:
Susana Vilma Vlădoiu

2018
 INTRODUCERE

Infertilitatea masculină, definită ca patologie majoră de sănătate publică globală în contextul

scăderii dramatice a natalității, reprezintă un tablou complex de factori hormonali, genetici și epigenetici.
În pofida tuturor cercetărilor din acest domeniu, cauzele care stau la baza infertilității de sex masculin
rămân în multe cazuri necunoscute.
La nivel global, se estimează că aproximativ 48,5 milioane de cupluri de vârstă fertilă (8-12%),
adică 1 din 10 cupluri, se confruntă cu probleme de infertilitate în ultimele decenii. Cercetările statistice
indică faptul că partenerul de sex masculin este responsabil de 40% din eșecurile de reproducere. Rata
fertilității la bărbații mai tineri de 30 de ani a scăzut cu 15% în întreaga lume, fiind afectați 1 din 20
bărbați. Infertilitatea masculină reprezintă modificarea parametrilor spermatici prin reducerea sub
valorile normale recomandate de World Health Organization (WHO) în 2010, a concentrației și/sau
motilității și/sau morfologiei spermatozoizilor. În America de Nord, 4,5-6% din bărbați sunt infertili,
procent similar celui din Australia (8-9%), dar și din Europa (8-12%).
Screeningul genetic depistează existența anomaliilor genetice într-un cuplu și permite studiul
aprofundat al modului în care acestea pot influența calitatea vieții cuplului dar și al descendenților.
Analiza microdeleţiilor cromozomului Y este considerată esenţială pentru diagnosticul infertilităţii
masculine. Microdelețiile cromozomului Y pot constitui cauza defectului de spermatogeneză și pot fi un
factor etiologic pentru 10-15 % din azoospermiile idiopatice și oligozoospermiile severe. Frecvența
delețiilor AZF (azoospermia factor) la subiecții infertili variază de la 5 - 20 %. În ultimele decenii s-a
înregistrat scăderea ratei fertilității masculine în strânsă legătură cu stilul de viață și cu factorii de mediu
(poluarea, disruptori endocrini). Modificările epigenetice controlează o serie de procese în cadrul
organismului, între care și fertilitatea masculină. Rolul modificărilor epigenetice în oligozoospermie și
alte tulburări ale spermatogenezei nu este încă pe deplin elucidat. Cercetări recente au evidențiat profiluri
epigenetice modificate în spermatozoizii subiecților cu oligozoospermie și oligoastenoteratozoospermie.
Un alt aspect neexplorat pe deplin este influența vitaminei D asupra sănătății reproducerii care în
pofida numeroaselor cercetări rămâne în continuare ambiguă. Activitatea vitaminei D, considerată în
prezent hormon steroid, este mediată prin receptorul de vitamină D, modulând astfel transcrierea genică.
În cadrul prezentei teze s-au studiat polimorfismele receptorului de vitamină D (VDR),
corelațiile acestuia cu nivelul de vitamină D la subiecții infertili în contextul unui panel hormonal extins,
precum și pattern-ul de metilare al promotorului genei VDR și expresia acesteia în infertilitatea
masculină.
Scopul acestei teze a constat ȋn evaluarea modificărilor genetice, epigenetice și hormonale
implicate ȋn tulburările de reproducere la bărbați și vizează îmbunătățirea protocoalelor de diagnostic

2
pentru infertilitatea masculină în vederea unui management terapeutic personalizat. Modificările
epigenetice de la nivelul spermatozoizilor sunt importante pentru siguranța procedurilor de reproducere
asistată, având în vedere faptul că acest tip de alterări ar putea afecta fertilitatea generațiilor viitoare.

Folosind o abordare complexă şi apelând la tehnici moleculare, prezenta teză îşi propune analiza
unor factori genetici, epigenetici şi hormonali care se asociază cu statusul infertil, în scopul înţelegerii
cauzelor acestei patologii cât şi, în perspectivă, pentru evaluarea prognosticului și abordarea unui
management adecvat.
Obiective
 Determinarea profilului hormonal și a parametrilor spermatici pentru subiecții cu infertilitate înrolați în
studiu.
 Analiza modificărilor genetice la subiecți cu infertilitate și corelarea cu statusul hormonal.
 Studiul relației dintre infertilitatea masculină și alterări epigenetice ale materialului seminal.
 Evaluarea vitaminei D ȋn infertilitatea masculină (nivelul seric, polimorfismele şi statusul de metilare
ale receptorului de vitamină D).

3
 MATERIAL ȘI METODE

Eșantionul populațional.
Subiecții au fost selectați dintre pacienții care s-au adresat Cabinetului de Andrologie și au fost înrolați de
medicul androlog, în urma consultului de specialitate. Studiul a fost efectuat în cadrul Laboratorului de
Cercetare al Institutului Național de Endocrinologie "C.I. Parhon". Acest studiu a fost aprobat de
Comitetul Etic, iar subiecții au semnat consimțământul informat și au fost recrutați conform Declarației
de la Helsinki. Evaluarea acestora a inclus examenul andrologic, spermograma, spermocultura,
ultrasonografia testiculară și prostatică.
În studiu au fost incluși subiecți infertili, selectați în funcție de criterii de includere stricte:
- vârsta între 20 și 50 de ani, cu status de infertilitate și eșec de reproducere naturală sau asistată de
peste 1 an;
- cariotip normal (46XY).
Criterii de excludere:
- vârsta sub 20 de ani și peste 50 de ani;
- microdeleții de cromozom Y;
- radioterapie și/sau chimioterapie pelvină în ultimele 6 luni;
- aberații genetice cunoscute;
- infecții urogenitale;
- orchiectomie bilaterală;
- vasectomie;
- expunere la noxe profesionale: hidrocarburi organofosforice nocive, radiații ionizante și metale
grele.
În studiu au fost incluși și subiecți care au constituit lotul control, selectați pe baza următoarelor criterii:
- parametrii spermatici cu valori normale conform standardelor OMS din 2010 (World Health
Organisation, 2010);
- vârsta între 20 și 50 ani;
- semnarea consimțământului informat de participare în studiu.

Analiza lichidului seminal

Lichidul seminal s-a recoltat prin ejacularea într-un recipient steril, în cadrul vizitei la medic, după
minim 2 și maxim 5 zile de abstinență. Probele au fost lichefiate cel puţin 20 de minute înainte de analiza
parametrilor spermatici cu ajutorul unui microscop Leica și a camerei Mackler. Rezultatele analizei se
raportează la limitele de referinţă minime ale parametrilor spermatici elaboraţi de WHO pentru evaluarea
caracteristicilor spermei şi, implicit, a fertilităţii masculine.
4
Evidențierea microdelețiilor cromozomului Y
Investigațiile pentru evidenţierea microdeleţiilor cromozomului Y au fost efectuate pe ADN izolat
din sânge proaspăt recoltat, prin venipunctură, în tuburi cu anticoagulant (EDTA). Kitul pentru detecția
microdelețiilor cromozomului Y (Y Chromosome Deletion Detection System, Version 2.0, Promega
Corporation,USA) este destinat detecției delețiilor în YqAZF.

Evaluarea nivelului hormonal

Investigațiile hormonale au fost efectuate din sânge proaspăt recoltat, prin venipunctură, în tuburi
cu gel separator. Nivelurile de testosteron, FSH, LH, prolactină, DHEA-S, estradiol, cortizol și SHBG și
25(OH)vitamina D s-au dozat în ser pentru toți subiecții utilizând metoda electrochemiluminiscenței cu
autoanalizorul Roche Cobas E601 folosind kituri de reactivi conform recomandărilor producătorului
(Roche Diagnostics, Basel, Elveția). Coeficienții de variație intra- și inter-lot au fost sub 5%. Precizia a
fost determinată în conform cu protocolul EP5-A2 al CLSI (Institutul de Standard Clinic și de Laborator).
Metoda ELISA (DRG Diagnostics, Novatec, Demeditec, Beckman Coulter) a fost utilizată pentru
determinarea nivelului de testosteron liber, inhibina B, 17-hidroxiprogesteron și androstendion.

Identificarea polimorfismelor

Pentru identificarea polimorfismelor estrogen α, β, FSHR, VDR, MTHFR, PSA și CYP 17

metodele se bazează pe amplificarea polimerazică cu primeri specifici a unui fragment din gena de
interes, urmată de digestia ampliconului cu enzimele de restricție specifice.

Evidențierea repetițiilor CAG în gena receptorului de androgen

Principiul metodei constă într-o reacție de amplificare PCR cu primerii corespunzători, urmată
purificare cu kit-ul GenomeLab™ DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter, Marea Britanie),
amplificarea în vederea secvențializării, purificare cu reactivul CleanSeq și secvențiere.

Evaluarea statusului de metilare a promotorului unor gene

Pentru reacțiile de metilare s-a folosit PCR specific pentru metilare (MS-PCR -methylation
specific PCR) care constă în două reacții de amplificare polimerazică diferite care amplifică cu ajutorul
primerilor specifici pentru secvențele metilate/nemetilate probele de ADN tratate cu bisulfit. Pentru
evaluarea cantitativă a gradului de metilare a unei probe s-a folosit metoda Direct Q-MSP. Procentul de
metilare a fost calculat conform metodei descrise de Fackler și colab. (Fackler et al. 2004). Concentrația
de molecule de ADN metilate/nemetilate pentru fiecare probă a fost extrapolată utilizand curbele
standard. Procentul de metilare a fost calculat utilizând formula:

ng molecule metilate gena A

𝑀 = 100 ×
(ng molecule metilate gena A + ng molecule nemetilate gena A)

numărul total de molecule ADN țintă fiind reprezentat de suma moleculelor M+U.
5
 REZULTATE

În studiu au fost incluși initial 80 de subiecți infertili cu vârsta cuprinsă între 23 și 45 de ani. Lotul
control a fost format din 37 subiecți fertili cu vârsta între 22-46 ani.
Ţinând cont de faptul că unul dintre criteriile de excludere din studiu a fost prezenţa
microdelețiilor în cromozomul Y, subiecții infertili au fost testați pentru acest parametru conform metodei
descrise. Din totalul de 80 subiecți cu infertilitate testați, 11 au prezentat microdeleții în cromozomul Y
și au fost excluși din studiu.
Investigațiile pentru evidenţierea microdeleţiilor cromozomului Y au fost efectuate pe ADN izolat
din sânge proaspăt recoltat, prin venipunctură, în tuburi cu anticoagulant (EDTA). Kitul pentru detecția
microdelețiilor cromozomului Y (Y Chromosome Deletion Detection System, Version 2.0, Promega
Corporation,USA) oferă o metodă rapidă de evidențiere a regiunilor specifice din cromozomul uman Y.
Între grupul control și grupul cu infertilitate s-au constatat diferențe semnificative statistic în ceea
ce priveste concentrația spermatozoizilor (p=0,0009), procentul de mobilitate (p=0,0053) și morfologia
acestora (p=0,0009).
Ţinând cont de severitatea diagnosticului estimată pe baza parametrilor spermatici, grupul de
subiecţi cu infertilitate selectaţi a fost împărțit în 3 loturi:
 Lot I: subiecţi cu oligoastenospermie, oligospermie, oligoastenoteratospermie, teratospermie şi
astenospermie (n = 12);
 Lot II: subiecţi cu oligoastenospermie severă şi oligoastenoteratospermie severă (n = 38);
 Lot III: subiecti cu azoospermie (absența spermatozoizilor în ejaculat) (n = 19).
I. Studiul modificărilor hormonale la subiecți cu infertilitate. Analiza nivelelor serice ale
hormonilor studiati a aratat o relație directă între descreșterea calității lichidului seminal și creșterea
concentrației de cortizol din sânge. De asemenea, nivelul de 17-OHP scade progresiv in grupel
investigate, cele mai mici valori fiind identificate în lotul subiecților cu azoospermie comparativ cu lotul
control. Evaluarea nivelului de androstendion în prezentul studiu arată o scădere semnificativă în lotul
de subiecți infertili comparativ cu lotul control (p=0,0032), dar și între grupurile de infertili și lotul
control (Fig. 1). Cea mai semnificativă scădere se înregistrează în lotul II (p=0,0028).
p * * = 0 .0 0 2 2

8
p * * = 0 .0 0 2 8
A n d r o s t e n d io n ( n g /m l)

p * * = 0 .0 1 7 0
6

0
I
II
I
l

II
o

t
tr

t
o

o
L
n

L
o
C

Fig. 1. Nivelul de androstendion în loturile I, II și III comparativ cu grupul control

6
 În ceea ce privește nivelul estradiolului la subiecții înrolați în acest studiu, se constată că între
infertili și lot control există diferențe semnificative statistic (p=0,0136). Cele mai scăzute valori s-au
înregistrat la subiecții din lotul II în comparație cu lotul martor. Valorile testosteronului total în grupul
subiecților infertili comparativ cu lotul control sunt diminuate (p=0,0128), la fel ca și cele ale
testosteronului liber (p=0,0460). În grupurile subiecților infertili se constată scăderea testosteronului
total (p=0,0021) proporțional cu severitatea diagnosticului, în lotul III notându-se cele mai scăzute
niveluri serice. Același trend descendent îl au și valorile testosteronului liber în grupurile de infertili,
scăderea fiind semnificativă în cazul subiecților din lotul III față de lotul martor (p=0,0315).
Evaluarea FSH seric a arătat o strânsă corelație între creșterea nivelurilor sale și severitatea
diagnosticului (Fig. 2). Cele mai ridicate valori se întâlnesc în cazul subiecților din lotul III în comparație
cu lotul martor, diferența fiind semnificativă statistic (p=0,001). Nivelurile serice ale LH urmează un
trend similar cu cele de FSH, creșterea valorilor sale fiind semnificativă la subiecții infertili (p<0,0001),
cele mai mari valori întâlnindu-se la lotul III vs. control (p<0,0001) (Fig. 2). Nivelurile de inhibină B
par a avea o valoare predictivă mai mare pentru spermatogeneză (Jungwirth et al. 2016) astfel încât
alterări ale acestora pot fi asociate cu infertilitatea. Scăderea nivelului de inhibină se corelează cu
severitatea diagnosticului, cele mai mici valori înregistrându-se pentru loturile II și III, diferențele față de
lotul control (Fig. 2). Diferența obținută între valorile la infertili și control arată că inhibina B este un
marker mult mai sensibil pentru evaluarea funcției testiculare și a spermatogenezei și poate servi atât ca
un criteriu de diagnostic, cât și pentru evaluarea metodelor terapeutice.
p * * *= 0 .0 0 0 2
40 p * * * * < 0 .0 0 0 1
p * * = 0 .0 0 1 20
p * * * < 0 .0 0 0 1 p * * * * < 0 .0 0 0 1
p * = 0 .0 2 6
30
15
F S H ( m U I/m L )

400
L H ( m U I/m L )

In h ib in a B ( p g /m L )

20 300
10

200
10 5
100

0 0 0
I
II
I
l

I
II
I
l
III
II
I
l
II

II
o

o
o
t

t
t
t

t
tr

tr

o
t
t

t
tr

o
o

o
t
o

o
L

L
n

n
o
L

L
L
n

L
L

o
o

L
o

C
C

Fig. 2. Nivelul de FSH, LH şi inhibina B în loturile de infertili comparativ cu lotul control

În studiul de față, valorile prolactinei cresc semnificativ la subiecții infertili în comparație cu lotul
control. Analiza datelor arată diferențe semnificative statistic și între grupurile de infertili vs. lot control
(Fig. 3), cele mai mari valori fiind înregistrate la subiecții din lotul II (p<0,0001), iar valorile în celelate
grupe de infertili fiind relativ similare. Creșterea nivelului de prolactină este raportată la subiecții cu
infertilitate, nivelurile serice fiind corelate cu parametrii spermatici (Singh et al. 2011).

7
 Rezultatele sunt în concordanță cu alte determinări,
p * * * < 0 .0 0 0 1

30 p * * * < 0 .0 0 0 1
deși boala pituitară este o cauză rară a infertilității masculine,
P R L ( n g /m L )
p * * * < 0 .0 0 0 1
fiind prezentă la cca. 10% dintre bărbați (Esteves et al.
20

2011).
10
Numeroase studii transversale au arătat că deficiența
0 (<25 nmol/l) sau insuficiența (<50 nmol/l) de vitamină D la

I
II
I
l

II
o

bărbați determină scăderea semnificativă a mobilității

t
tr

t
o

o
L
n

L
o
C

Fig.3. Nivelul de prolactină în loturile spermatozoizilor (Blomberg et al. 2011; Blomberg et al.
de infertili vs. grupul control 2012; Yang et al.2012)

În cazul acestui studiu s-a constat că nivelul de vitamină D este scăzut la subiecții infertili față de
lotul control, iar analiza celor trei grupe de infertili vs. control arată diferențe semnificative statistic
(p=0,0252). Cele mai mici valori de vitamină D au fost identificate la subiecții din lotul III.
În urma analizei de regresie multivariată cele mai importante corelații directe au fost observate în
cazul testosteronului total și a SHBG (p<0,0001), precum și intre FSH si LH (p<0,0001). O asociere
notabilă (p=0,008) a fost stabilită între DHEAS și androstendion. Un număr mare de hormoni se asociază
cu testosteronul total, fie direct ( SHBG și testosteron liber), fie invers (FSH și DHEA-S).
Dat fiind că la subiecţii cu inferilitate s-a observat o variabilitate mare între parametrii spermatici
și nivelurile serice ale hormonilor, în continuarea acestui studiu s-a urmarit stabilirea unei relaţii între
acești parametri. Pentru început s-a investigat potenţiala asociere între nivelurile hormonale şi
concentraţia spermatozoizilor. Astfel, grupul de subiecţi cu infertilitate a fost divizat în patru grupe în
funcţie de concentraţia spermatozoizilor. Datele obţinute arată că, în cazul subiecţilor infertili incluşi în
acest studiu, nivelurile testosteronului total, ale SHBG şi inhibinei B variază semnificativ intragrup în
raport cu parametrul concentraţia spermatozoizilor. Semnificaţia statistică cea mai mare a fost înregistrată
pentru inhibina B (p=0,0066). În studiul de faţă FSH nu s-a corelat semnificativ între grupurile cu
infertilitate ci numai raportat la lotul control (test Anova, p=0,0139).
Pentru evaluarea profilului hormonal în funcţie de mobilitatea spermatozoizilor, subiecţii
infertili au fost divizaţi în 3 grupe. Intervalele de mobilitate au fost stabilite în funcţie de parametrii
statistici precum media şi a 75-a percentilă, scopul studiului constând în identificarea unor posibile
diferenţe intre grupurile de subiecţii cu infertilitate.
Utilizând Anova între toate grupurile sau t-test între două grupuri se constată că nivelul de cortizol
se corelează pozitiv cu mobilitatea spermatozoizilor (p=0,039). În schimb, nivelul androstendionului este
semnificativ crescut în grupul I față de grupul III (p=0,0488). Nivelul testosteronului scade în grupul
subiecților cu mobilitate < 10%, scădere care poate fi observată și în evaluarea nivelului de testosteron
liber, chiar dacă nu are semnificație statistică. Ca răspuns la scăderea nivelului testosteronului în grupul
subiecților cu mobilitate scăzută se observă și scăderea semnificativă a SHBG în grupul I (p=0,0173).
Nivelul de inhibină B urmează un traseu ondulatoriu și, deși se pot stabili diferențe semnificative între

8
grupuri (p=0,0174), acest factor nu poate fi corelat cu mobilitatea spermatozoizilor. În mod paradoxal
nivelul prolactinei scade odată cu scăderea procentului de spermatozoizi mobili, această scădere fiind
semnificativă (p=0,0432) în special între grupul II cu mobilitate între 11 ÷ 32% și grupul cu mobilitate
>32% (fig 4).

Fig 4. Asocierea între mobilitatea spermatozoizilor (%) din grupul I, II și III si nivelul seric al
hormonilor cortizol, androstendion, SHBG, prolactină și inhibină B

Pentru a analiza o posibilă corelație între nivelele hormonale și morfologia spermatozoizilor, am

împărțit subiecții infertili în 3 grupe (intervalele de mobilitate au fost stabilite în funcție de parametrii
statistici precum media și a 75-a percentilă). Acesta împărțire are ca scop observarea posibilelor diferențe
existente intragrup de infertili. Din datele obținute se constată că nivelul testosteronului total scade
semnificativ odată cu scăderea procentului morfologiei spermatice (p=0,0369), lucru observat și în cazul
testosteronului liber (p=0,0035), fapt care subliniază importanța acestui hormon în morfologia
spermatozoizilor. O asociere semnificativă statistic se notează (aplicând t-test) între nivelurile
testosteronului la grupul cu morfologie a spermatozoizilor < 4% comparativ cu subiecții cu morfologie
>30% (p=0,0183) în timp ce diferențele nivelurilor testosteronului liber între aceleași grupuri au
semnificație statistică mult mai pregnantă (p=0,0005).
Pe de altă parte se observă că și valorile de SHBG scad semnificativ (p=0,0014) la subiecții cu
procent scăzut al morfologiei spermatice în timp ce nivelul FSH este mai crescut la grupul I cu
morfologie <4% față de grupul cu morfologie >30% (t-test, p=0,026). Deși există o diferență între aceste
grupuri nu se poate spune ca nivelurile de FSH și LH au o influență puternică asupra morfologiei
spermatice. De asemenea se constată că valorile prolactinei, inhibinei B și ale vitaminei D scad
semnificativ la grupurile cu procent mic al morfologiei spermatice. De remarcat că aplicând t-test,
valorile prolactinei și ale inhibinei B sunt semnificativ diferite între grupul I și grupul III de subiecți
infertili (p= 0,0194 respectiv p= 0,0148) (Fig 5).

9
 Fig 5. Asocierea între nivelurile hormonale și morfologia spermatozoizilor (%)

II. Studiul modificărilor genetice asociate cu infertilitatea masculină. Un alt obiectiv acestui
studiu a constat în investigarea polimorfismelor unor gene şi a repetițiilor CAG din receptorul de
androgeni, la subiecți cu infertilitate. In acest sens s-a urmarit:
- investigarea polimorfismelor unor gene (estrogen α, β, FSHR, VDR, MTHFR, PSA și CYP 17),
repetițiie CAG din receptorul de androgeni în infertilitatea masculină;
- identificarea unor corelații între polimorfismele studiate, nivelul hormonal și statusul de
infertilitate al subiecților luați în studiu.
În urma analizei tabelelor de contingență (control vs. infertilitate), frecvența genotipurilor
polimorfismelor ESR-α XbaI (p=0.0242) și PvuII (p=0.0116) a fost semnificativ modificată. Tot o
distribuție semnificativ modificată s-a observat ȋn cazul polimorfismelor RsaI și AluI ale ESR-β, în grupul
cu infertilitate versus control (ESR βRsaI p=0.0003; ESR β AluI p=0.0005). Frecvența alelei G a
polimorfismului ESR-β RsaI (p=0.0061) precum și a alelei G a polimorfismului ESR-β AluI (p=0.0024)
au fost modificate în grupul cu infertilitate.
Analiza datelor obținute în studiul de față arată o asociere între alela G XbaI și infertilitate, în lotul
subiecților infertili predominând genotipul AG. Acest rezultat este similar cu cel obţinut ȋntr-un studiu
realizat de Yu-Zheng Ge şi colab care au găsit o asociere ȋntre alela G a polimorfismului XbaI al ESR-α şi
un risc mai mic de infertilitate masculină în populația asiatică dar nu şi ȋn cazul populatiei caucaziene (Ge
et al. 2014). Frecvențele alelelor T și A ale polimorfismelor PvuII și XbaI ER-α au fost mai mari în cazul
subiecților fertili în comparație cu cei infertili diagnosticați cu OAT. Pe de alta parte, prezența alelelor C

10
și G a fost asociată cu o incidență crescută a infertilității masculine în cazul genotipurilor CC şi GG
comparativ cu TT și AA (Zalata et al. 2014).
Aşa cum am menţionat anterior, studiul de față a arătat o deviație de la echilibrul Hardy-Weinberg în
cazul polimorfismului ESR-α XbaI dar și pentru polimorfismul PvuII, aceleași deviații fiind raportate și
de Liaqat si colab. (Liaqat et al. 2015). În plus faţă de acest studiu, care nu au găsit o diferență între
frecvența alelor T și C (polimorfismul ESR-α PvuII) la subiecții infertili versus control, lucrarea de față a
identificat faptul că alela C se asociază cu infertilitatea, mai exact genotipul TC. Abundența alelei C în
grupul subiecților infertili este totuşi indicată și de studiul lui Liaqat și colab. prin evaluarea cumulată a
genotipurilor TC și CC. Astfel, se poate concluziona că subiecții care prezintă genotip heterozigot TC
sunt mult mai predispuși la infertilitate masculină față de subiecții care prezintă genotip CC sau TT.
Riscul prezenţei acestor genotipuri pare să fie dependent de populația studiată; astfel, în populația turcă,
genotipurile TC și CC au fost asociate cu infertilitatea masculină (Ayvaz et al. 2009). Un alt studiu
realizat în populația iraniană a subliniat faptul că subiecții cu genotip CC au un risc mai redus de
infertilitate comparativ cu subiecții cu genotip TT (Safarinejad et al. 2010).
Yu-Zheng Ge si colab. au concluzionat într-o meta-analiză că, în populaţia asiatică, polimorfismele
ESR-α PvuII și XbaI precum și ESR-β RsaI au fost asociate semnificativ cu risc scăzut de infertilitate, în
timp ce la caucazieni aceste polimorfisme au crescut susceptibilitatea la infertilitate masculină. În ceea ce
privește polimorfismul ESR-β AluI, nu s-a găsit nicio asociere semnificativă nici în analiza globală dar
nici în analiza subgrupurilor etnice (Ge et al. 2014). Prezența alelei A a polimorfismului ESR-β RsaI a
fost corelată cu un risc scăzut de infertilitate masculină la homozigoți (AA vs. GG) și risc crescut la
heterozigoți (AG vs. GG). Analiza subgrupurilor etnice a demonstrat reducerea riscului de afectare a
procesului de spermatogeneză în populaţia asiatică (AA vs GG; AA vs AG + GG) și creșterea riscului la
caucazieni (A versus G, AG față de GG și AA + AG față de GG) (Ge et al. 2014).
Un alt aspect analizat s-a adresat modificărilor genetice ȋn receptorul pentru vitamina D. Receptorii de
vitamina D au fost identificaţi atȃt în testiculele umane (Habib et al. 1990), cȃt și în spermatozoizi (Aquila
et al. 2008;Corbett et al. 2006). În pofida numeroaselor publicații, influența vitaminei D asupra sănătății
reproducerii rămâne ambiguă. Ȋn capitolul 4 am arătat că subiecții infertili prezintă nivele serice scăzute
de vitamină D, diferenţe semnificative statistic fiind observate ȋn raport cu morfologia spermatozoizilor
(p=0,0187). Ȋn acest moment există foarte puţine date legate de studiul polimorfismelor receptorului
pentru vitamina D. Ȋntre grupul control și grupul cu infertilitate a fost observată o diferență semnificativă
ȋn distribuţia genotipurilor polimorfismelor VDR, respectiv BsmI (p=0.0314), FokI (p=0.0451), TaqI
(p=0,029) și ApaI (p=0,0234). Frecvența alelei T a polimorfismului FokI a fost semnificativ crescută în
grupul cu infertilitate (p=0,024).
La subiecții infertili, analiza polimorfismul Cdx-2 VDR a aratat o frecvență modificată a alelei G -
0.29 şi a alelei A-0.71, prin comparație cu lotul control la care frecvența alelei G a fost 0.53, iar a alelei A
0.47. Prezența alelei A în grupul infertil a fost crescută (OR = 2.730, p=0.0006). Frecvența alelei T
(p=0,0197) în cazul polimorfismului PvuII și a alelei A în cazul BsmI (p=0,0465) au fost caracteristice
11
grupului martor. Rezultatelor noastre au arătat ca polimorfismule VDR BsmI, VDR ApaI si VDR CDX-2
pot reprezenta un potențial risc pentru infertilitate.
Studiul polimorfismelor genei FSHR a indicat diferențe semnificative între distribuția genotipurilor
între control şi infertili (polimorfismul FSHR Thr307Ala p=0,0227, polimorfismul FSHR Asn680Ser
p=0,0049, polimorfismul din promotorul genei FSHR -211 p=0,05). Aceste diferențe s-au tradus prin
creșterea în grupul cu infertilitate a frecvenței alelei A a polimorfismului Thr307Ala (p=0,0031) și a
frecvenței alelei S - polimorfismul Asn680Ser (p=0,009).
Și în cazul polimorfismelor PSA G158A și CYP17T/C s-au observat diferențe semnificative între
grupul cu infertilitate și grupul martor (PSAG158A, p=0.0054 și CYP 17T/C,p=0.0146). La PSA G158A
frecvența alelei A a fost semnificativ crescută în grupul cu infertilitate (p<0,0001).
Citocrom P450C17α (CYP-17) este o enzimă cheie, codificată de gena P450c17a (CYP-17), implicată
în metabolizarea estrogenilor prin medierea activității 17 α-hidroxilazei și 17,20-liazei. Polimorfismul
CYP17 -34T/C (rs743572) implică substituția timinei (T) cu citozina (C) la cea de-a 34-a pereche de baze
ȋn amonte (upstream) de promotorul CYP17. Polimorfismele genei CYP-17 sunt asociate cu nivele serice
modificate ale estrogenilor și au fost studiate în diverse patologii (Falconer et al. 2007), dar nu se cunosc
studii în infertilitatea masculină. Alela A1 CYP17 a fost asociată cu creșterea riscului de cancer de
prostată și hiperplazie benignă de prostată (Habuchi et al. 2000). S-a raportat o frecvență crescută a
acestei alele în China (Lu et al. 2008) și Iran (Salehi et al. 2012) și o frecvență scăzută în Rusia (Yarosh et
al. 2013) și în India (Vani et al. 2009). Subiecții incluși în acest studiu au prezentat o frecvență crescută a
alelei T (control și infertili). Pe de altă parte, am observat o creştere a genotipului heterozigot TC ȋn cazul
pacienţilor infertili, fără semnificaţie statistică.
Antigenul specific de prostată (PSA) sau peptidaza 3 legată de kalikreină (KLK3) este una dintre cele
mai abundente proteine secretate de epiteliul prostatic uman normal și din plasma seminală (Shaw et al.
2007). Nu s-a efectuat niciun studiu care să investigheze variațiile genetice ale genei KLK3/PSA în
fertilitatea masculină. Gupta și colab. au analizat complet regiunea codificatoare a genei KLK3 și au
identificat 28 de substituții dintre care 8 au fost noi. Corelând frecvențele genotipurilor cu riscul de
infertilitate s-a obținut corelație semnificativă pentru cinci SNP: rs266881, rs174776, rs266875,
rs35192866 și rs1810020 (Gupta et al. 2017). Studiul de faţă a arătat că subiecţii infertili au fost cu
precădere heterozigoţi GA, prezentȃnd o frecvență crescută a alelei A dar la limita semnificaţiei statistice.
Cele două polimorfisme cunoscute ale genei MTHFR (C667T şi A1298C) prezintă pattern-uri diferite
la subiecții infertili față de grupul control. Ȋn cazul polimorfismului MTHFR C6777T se poate observa o
creștere semnificativă (p=0,002) a prezenței heterozigotilor (CT) şi a homozigoţilor (TT) la infertili, alela
T fiind caracteristică acestui grup. Deși nu există o modificare semnificativă a frecvenței alelor
polimorfismului MTHFR C1298A, se poate observa o creştere a frecvenței alelei C la grupul de subiecți
cu infertilitate. Bezold și colab. au fost primii care au susținut încă din 2001 un posibil rol al mutației
MTHFR C677T în patogeneza infertilității masculine în populația germană (Bezold et al. 2001). În
lucrarea de faţă a fost indicată o creştere a frecvenţei alelei T ȋn grupul subiecţilor infertili şi o prezenţă
12
crescută a heterozigoţilor (CT) şi (TT). Singh și colab. (Singh et al. 2005) au demonstrat o asociere
semnificativă a genotipurilor mutante cu infertilitatea masculină. Deşi nu există o modificare
semnificativă, prezentul studiu a arătat o creştere a frecvenţei alelei C ȋn grupul subiecţilor cu infertilitate,
şi implicit a prezenţei genotipului CC.
Datele experimentale arată că există o asociere semnificativă între statusul de infertilitate și
polimorfismele ESR-α (XbaI, p=0,0269 și PvuII, p=0,0064), polimorfismul RsaI ESR-β (p=0,0033),
polimorfismele VDR BsmI și ApaI (p=0,041 respectiv p=0,0279) și polimorfismele Thr307Ala
(p=0,0001) și Asn680Ser (p=0,0366) ale FSHR.
Ȋn grupul investigat ȋn cadrul acestui studiu se constată ȋnsă o dimiuare semnificativă a frecvenţei
AA ȋn lotul III (azoospermie). Alela C a polimorfismului PvuII al ESR-α s-a asociat semnificativ cu risc
scăzut de infertilitate; analiza subgrupurilor etnice a arătat ȋnsa asocierea acestui polimorfism cu risc
scăzut de infertilitate la populaţia asiatică și risc crescut la caucazieni (Ge et al. 2014), fapt dovedit și în
lucrarea de față, subiecții înrolați fiind caucazieni.
Nu sunt foarte numeroase studiile referitoare la variantele genetice ale ESR-β și implicațiile
acestora în infertilitatea masculină. În studiul de față, analiza polimorfismului ER-β RsaI a indicat faptul
că există o frecvență mai mare a alelei G în lotul subiecților infertili față de lotul control. Pe de altă parte,
subiecții infertili au fost preponderent homozigoți GG, frecvenţa crescȃnd cu severitatea diagnosticului.
Studiul realizat de Aschim și colab. (2005) a fost primul care a arătat o asociere între ESR-β și
infertilitatea masculină, raportȃnd o frecvență de trei ori mai mare a genotipului heterozigot RsaI GA la
subiecții infertili comparativ cu grupul control (p<0,01), dar nicio diferență în privința polimorfismului
AluI (Aschim et al. 2005). Studiile polimorfismului AluI al ESR-β efectuate în populaţia asiatică (Khattri
et al. 2009; Meng et al. 2013; Omrani MD et al. 2006; Safarinejad et al. 2010) și la caucazieni (Aschim
et al. 2005; Galan et al. 2005; Lazaros et al. 2010), nu au arătat nicio asociere semnificativă între
infertilitatea masculină și acest polimorfism, ȋn acord cu rezultatele obținute în cadrul acestui studiu.
În legatură cu polimorfismele VDR, pentru BsmI, în grupul de subiecți infertili față de control,
studiul de față raportează o creștere semnificativă a alelei A (p=0,041); la polimorfismele ApaI si Cdx-2
alelele T respectiv A sunt discriminatorii pentru subiecţii cu azoospermie, creşterea frecvenţei lor fiind
asociată cu severitatea diagnosticului.
În cazul MTHFR 677, Gupta și colab. au constatat o frecvență crescută a alelei mutante (T) la
bărbați infertili comparativ cu subiecții fertili (Gupta et al. 2011). În acest studiu s-a constatat că
genotipul TT al polimorfismului MTHFR C667T este caracteristic subiecţilor cu azoospermie (lot III),
frecvenţa acestuia fiind de circa 9 ori mai mare faţă de control şi de circa 6 ori mai mare decȃt la loturile I
şi II, confirmȃnd studiile lui Gava şi colab şi al lui Liu și colab.
Rezultate discordante au apărut și în cazul mutației MTHFR A1298C. Într-o meta-analiză Shen O
și colab. au constatat că mutația MTHFR A1298C este implicată în infertilitatea masculină în special în
azoospermie (Shen et al. 2012), în timp ce Wei B și colab. au avut o opinie opusă, constatând că
polimorfismele 677C>T și 1298A> C nu s-au asociat semnificativ cu riscul de infertilitate masculină;
13
totuși într-o analiză stratificată după etnie, au constatat că polimorfismul 677C>T s-a asociat semnificativ
cu riscul de infertilitate masculină în populația asiatică (Wei et al. 2012). De asemenea Liu si colab. au
aratat ca mutația MTHFR A1298C nu a fost legată de infertilitatea masculină (Liu et al. 2015). Eloualid A
și colab. au demonstrat că C677T nu se asociază cu infertilitatea masculină, în schimb, polimorfismul
homozigot MTHFR A1298C CC a fost semnificativ crescut în grupul cu oligozoospermie severă
comparativ cu grupul martor (Eloualid et al. 2012). Singh K și colab. au demonstrat că genotipul
homozigot MTHFR A1298C CC a avut o semnificație statistică crescută în cazul subiecților azoospermici
idiopatici, acest genotip reprezentând un factor de risc pentru infertilitatea masculină idiopatică în
populația indiană (Singh et al. 2010).
În ansamblu, rezultatele meta-analizei publicate în 2017 de Zhengju Ren și colab. au evidențiat o
asociere semnificativă între polimorfismul MTHFR C677T și riscul de infertilitate masculină în populația
din China, dar nici o asociere între polimorfismul MTHFR A1298C și riscul de infertilitate masculină atât
în model alelic, dominant, aditiv sau recesiv (Ren et al. 2017)
Ȋn studiul de faţă, prin explorarea asocierii dintre hormonii serici și parametrii spermatici, am
ȋncercat să evaluăm rolul polimorfismelor în funcția de reproducere masculină.. Este primul studiu axat
pe studiul polimorfismelor ESR-α și ESR-β, FSHR, VDR, PSA G158A, CYP17 T/C, MTHFR 677 și
MTHFR 1298 la subiecții infertili români. Printr-o analiză multivariată s-a identificat efectul cumulativ al
unor variante genetice specifice şi a profilului hormonal asupra statusului infertil. Datele rezultate au
permis evidenţierea unor factori care ar putea afecta spermatogeneza umană.
După cum se poate observă în tabelul 15, în cazul ESRβ RsaI s-au obținut corelații semnificative
directe cu nivelele de cortizol (p=0,007) și LH (p=0,042) şi o corelaţie negativă cu 17-hidroxiprogesteron
(p=0,008). Cele mai multe corelaţii s-au obținut ȋn cazul polimorfismului VDR BsmI cu cortizol
(p=0,02), estradiol (p=0,013), 17-hidroxiprogesteron (p=0,042) dar și cu statusul de infertilitate
(p=0,05). Polimorfismul VDR Fok I s-a asociat semnificativ cu testosteron total (p=0,019) și invers cu
SHBG (p=0,013). De notat este faptul că polimorfismul VDR TaqI s-a asociat cu cortizol (p=0,031) și cu
estradiol (p=0,018), similar cu polimorfismul VDR BsmI. Polimorfismul VDR ApaI s-a asociat
semnificativ cu SHBG prolactina (p=0,035), (p=0,048) dar și cu statusul de infertilitate (p=0,047).
Corelații semnificative s-au obținut și în cazul polimorfismului VDR Cdx-2 din promotorul genei care s-a
asociat cu cortizol (p=0,035), SHBG (p=0,044) și LH (p=0,05).
De menţionat este faptul că polimorfismul FSHB-211 s-a asociat cu nivelul vitaminei D (p=0,05).
Multiple corelaţii s-au obţinut ȋn cazul polimorfismului MTHFR C677T cu nivelul de testosteron total
(p=0,038), testosteron liber (p=0,021) DHEA-S (p=0,05), și SHBG (p=0,05).
În următoarea parte a tezei au fost analizate nivelurile hormonilor pentru fiecare polimorfism
studiat (în funcție de genotipul specific) în lotul subiecților infertili. În tabelele de mai jos pot fi observate
medianele valorilor, minimele și maximele fiecărui hormon studiat, precum și valorile p obținute cu
ANOVA și t-test.

14
 Studiu repetițiilor CAG ale genei receptorului pentru androgeni a fost realizat prin secvențiere
clasică (Sanger).

Fig 6. Repetiții CAG în receptorul de androgeni în grupul control și grupurile cu infertilitate: OAS, OASS
și azoospermie

Subiecții cu OAS au prezentat o mediană de 23 de repetiții CAG (interval:18-30), iar subiecții cu

OASS (interval:17-26) și azoospermie (interval:19-25) au avut o mediană de 22 de repetiții CAG față de
lotul martor unde s-a ȋnregistrat o mediană a repetițiilor CAG de 27 (interval:22-29), obținând
semnificație statistică cu p<0,001.
III. Studiul modificărilor epigenetice în infertilitatea masculină. În ultima parte a tezei,
obiectivele studiului au fost:
 investigarea statusul de metilare al promotorului genei MTHFR la subiecți infertili prin PCR de
metilare specific cantitativ, în scopul indentificării posibilelor asocieri cu anomaliile spermatice;
 evaluarea gradului de metilare a regiunii promotor a receptorilor de vitamină D (VDR);
 identificarea unor corelații între gradul de metilare al VDR, polimorfismul Cdx-2 (rs17883968) și
nivelele serice ale 25-hidroxivitaminei D (25 (OH) D) în infertilitatea masculină;
 cuantificarea expresiei genei VDR la pacienții studiați.
Studiile epigenetice au inclus un grup de 27 subiecți infertili, cu vârsta cuprinsă între 26 şi 41 de
ani și 11 subiecți control, cu vârsta cuprinsă între 24 şi 37 de ani.
Din lotul de 27 subiecți infertili, 15 (56%) au fost diagnosticați cu azoospermie, 5 (18%) cu
oligoastenospermie severă (OASS), 7 (26%) cu oligoastenoteratospermie severă (OATS).
Lotul control a fost constituit din 11 subiecți cu parametri spermatici normali.
M THFR
150
P r o c e n t u l d e m e t ila r e ( % )

p = 0 ,0 0 1 2

100

50

0
l
il

o
rt

tr
fe

n
in

o
C
p
ru
G

Fig. 7. Procentul de metilare al promotorului genei MTHFR în grupul control vs. grup infertil

15
 Analiza metilării promotorului genei MTHFR a prezentat o mediană de 45,16% la subiecții din
grupul control (interval: 27,8-62,52%), iar la subiecții infertili o mediană de 99,94% (interval: 35,43-
100%). Diferențele dintre cele două grupuri investigate au fost calculate folosind testul Mann-Whitney,
rezultatul având o semnificație statistică importantă cu p=0,0012. Procentul hipermetilării MTHFR la
subiecții infertili este semnificativ crescut față de grupul control.
S-au obținut corelații semnificative între metilarea promotorului genei MTHFR și parametrii
spermatici, indicând o tendință pentru hipermetilarea promotorului MTHFR la subiecții cu infertilitate
față de grupul control.
Analiza statistică a condus la obținerea unor corelații între:
 gradul de metilare și mobilitatea scăzută (p=0,0130, r2=0,3886),
 gradul de metilare și morfologia atipică (p=0,0138, r2=0,3833)
 gradul de metilare și numărul scăzut de spermatozoizi (p=0,0092, r2=0,4184) la subiecții cu
infertilitate versus grup control
Infertilitatea masculină se corelează cu parametrii spermatici (numărul de spermatozoizi, mobilitatea,
morfologia, viabilitatea) și integritatea nucleului. Botezatu și colab. au găsit corelații semnificative între
hipermetilarea genei MTHFR, mobilitatea și morfologia spermatozoizilor, dar nicio corelație
semnificativă între metilarea ADN și numărul de spermatozoizi, datele sugerând că metilarea MTHFR
este legată de anomaliile spermatice de mobilitate și morfologie și, deci, de infertilitatea masculină
(Botezatu et al. 2014).
Promotorul genei VDR prezintă trei insule CpG supuse metilării ADN (insula 1 - 192 bp, insula 2
- 187 bp, insula 3 - 160 bp). Pentru evaluarea legăturii dintre metilarea promotorului genei VDR și
statusul infertil, s-au cuantificat nivelele de metilare prin qMS-PCR în grupurile studiate. După cum se
observă în figura 8, procentul de metilare VDR crește cu severitatea diagnosticului. Diferențele în
procentul de metilare dintre grupurile infertil și control sunt semnificative (p=0,0280), grupul control
prezentând o metilare VDR scăzută (mediană: 6,41%, interval: 1,12 ÷ 8,32%) față de celelalte grupuri
(mediană grup OATS = 23,09% , interval: 9,216 ÷ 42,67%, mediană grup OASS = 35,76%, interval:
23,41 ÷ 75,2%, mediană grup azoospermie = 41,52%, interval: 25,36 ÷ 85,46%,).
100
p * = 0 .0 2 8 0
P r o c e n t d e m e t ila r e ( % )

80

60

40

20

0
ia

l
S

o
S

T
rm

tr
A

n
e

o
p

C
s
o
zo
A

Fig. 8 Procentul de metilare al promotorului VDR în grupurile cu infertilitate vs. grup control

16
 Mai mult, s-a comparat procentul de metilare a promotorului VDR cu parametrii spermatici și s-au găsit
diferențe semnificative legate de numărul, mobilitatea și morfologia spermatozoizilor (p=0,0026 pentru
numărul de spermatozoizi, p=0,0396 pentru mobilitate și p=0,0264 pentru morfologie).
80 p * = 0 .0 2 8 3
80 80

P r o c e n t d e m e t ila r e ( % )

P r o c e n t d e m e t ila r e ( % )
P r o c e n t d e m e t ila r e ( % )
60
60 p * = 0 .0 3 9 6 60
p * = 0 .0 2 6 4

40
40 40

20
20 20

0
5 0 0

7
7
0

0
1

-1

-1

%
%

%
<

0
%
%

%
>

0
0

4
0

0
-1

-5
-3
1

-1

>
1

-4
>

2
0
0
x

6
2
2

C o n c e n t r a t ia s p e r m a t o z o iz ilo r M o t ilita te M o rfo lo g ie

Fig 9 Reprezentarea grafică a procentului de metilare în funcție de parametrii spermatici

Un alt aspect al acestui studiu a constat în realizarea curbei de tip ROC (receiver operating
characteristic curve) pentru a stabili un cut-off pentru metilare în functie de parametrii spermatici specifici
fiecarui subiect infertil fig.10. Valorile curbei ROC au fost semnificative în toate cazurile analizate
(concentrația spermatozoizilor- aria:0,916, p=0,0038, motilitate- aria:0,8824, p=0,0109, morfologie-
aria:0,9235, p=0,0048)
R O C c u r v e : C o n c e n t r a t ie s p e r m a to z o iz i
R O C c u r v e : M o t ilit a t e R O C c u rv e : M o r fo lo g ie
150
100 150

80
S e n s ib ilit a t e %

S e n s ib ilita t e %
S e n s ib ilita t e %

100
100
60

40
50 50

20

0 0 0
0

20

40

60

80

0
0

0
10

0
2

1
1

1 0 0 % - S p e c ific ita te % 1 0 0 % - S p e c if ic it a t e % 1 0 0 % - S p e c if ic it a t e %

Fig 10. Reprezentarea grafică de tip curbă ROC a procentului de metilare în funcție de parametrii
spermatici
S-au ales valorile specifice pentru fiecare parametru :
- concentrație spermatozoizi:
cut-off procent metilare=8,768%; specificitate=100%, sensibilitate= 84%;
- motilitate:
cut-off procent metilare= 9,394%; specificitate=100%, sensibilitate=82,35%;
- morfologie:
cut-off procent metilare=8,768; specificitate=100%, sensibilitate=88,24%
În functie de semnificația statistică obținută se poate concluziona că un cut-off de 8.768%
constituie limita maximă a procentului de metilare în cazul subiecților control.
Metilarea promotorului genei VDR este crescută la subiecții infertili (<30 ng / ml - control-
mediana: 14,90%, interval: 10,47 ÷ 19,32% față de grupul infertil: mediana: 34,90%, interval 10,47 ÷
85,46%). Subiecții cu niveluri mai mari de vitamina D au avut un procent mai mic de metilare în ambele

17
grupuri (>30ng/ml mediană grup control: 1,62%, interval: 0,12 ÷ 3,12% vs. mediană grup infertil: 9,22%,
interval: 2.36 ÷ 13.46%).
80 p * = 0 .0 1 3 5

P r o c e n t d e m e t ila r e ( % )
60

40
p * = 0 .0 2 1 2

20

l
il

il
o

o
rt

rt
tr

tr
fe

fe
n

n
in

in
o

o
c

c
t

t
t

t
o

o
o

o
L

L
L

L
< 3 0 n g /m L > 3 0 n g /m L

Fig. 11. Reprezentarea grafică a nivelului de vitamină D și a procentului de metilare în grupul infertil
comparativ cu grupul control
Nivelurile de vitamină D sunt influențate în mod semnificativ de metilarea promotorului genei
VDR. Acest lucru reiese şi din figura 11, procentul de metilare este mai mare la subiecții cu niveluri
scăzute de vitamina D (p=0,0135).
Valorile procentului de metilare variază în funcție de genotipurile fiecărui polimorfism al genei
VDR (fig.12). În cazul VDR BsmI deși se poate observa o creștere a valorilor procentului de metilare a
promotorului genei VDR în cazul genotipului AA, diferența nu a avut semnificație statistică. Rezultate
similare sunt și în cazul polimorfismului ApaI a genei VDR la care cel mai mare procent de metilare s-a
înregistrat în cazul homozigoților GG. Notabilă este diferența dintre valorile procentului de metilare a
genotipurilor polimorfismului FokI (p=0,0017). Se poate observa că cele mai crescute valori ale
procentului de metilare se regăsesc în cazul homozigoților CC. De asemenea, polimorfismul VDRTaqI
prezintă diferențe importante (p=0,0115) între valorile procentului de metilare al promotorului VDR, cea
mai crescută valoare obținându-se în cazul genotipului TT.
VD R B sm l VD R Fokl VDR Taql

100 100 100

p=ns.
p = 0 .0 0 1 7 p = 0 .0 1 1 5
80 80 80
M e t ila r e V D R 1
M e t ila r e V D R 1

M e t ila r e V D R 1

60 60 60

40 40 40

20 20 20

0 0 0
A
A
G

C
T
T
C

C
T
A

T
C

T
G

C
G

T
C

V D R A pal
C d x -2 p * * = 0 .0 0 1
100
100
P r o c e n t d e m e t ila r e ( % )

p=ns.
80
80
M e t ila r e V D R 1

60
60

40
40

20 20

0 0
A
A
G
T

T
G

A
G
T
G

G
G

Fig. 12. Reprezentarea grafică a a procentului de metilare în grupul infertil în funcție de genotipurile
polimorfismelor studiate ale genei VDR
18
 În continuare, deoarece polimorfismul Cdx-2 afectează promotorul şi poate afecta în consecinţă
gradul de metilare, s-a evaluat posibila legătură între procentul de metilare și genotipurile Cdx-2 VDR la
subiecți infertili vs. control. În figura 13 se observă că genotipul AA se caracterizează prin valori
procentuale mai mari ale metilării față de celelate două genotipuri, GG și GA, subiecții infertili
prezentând valori crescute de metilare comparativ cu grupul control (p=0,0432) (mediană control:
18,32%, interval: 11,47 ÷19,32%, vs. mediană subiecți infertili: 39,21% interval: 25,36 ÷ 85,46%).
Comparând grupul control cu întreg grupul cu infertilitate, la subiecții homozigoți GG au fost observate
cele mai scăzute procente de metilare (control-mediană: 1,12%, interval: 0,12 ÷ 2,12%, vs. mediană
subiecți infertili: 10,87%, interval: 2,36 ÷ 30,55%).

80 p * = 0 .0 4 3 2

P r o c e n t d e m e t ila r e ( % ) 60
p * = 0 .0 1 6 3

40
p * = 0 .0 4 9 4

20

0
l

l
il

il

il
o

o
rt

rt

rt
tr

tr

tr
fe

fe

fe
n

n
in

in

in
o

o
c

c
t

t
t

t
o

o
o

o
L

L
L

G G GA AA

Fig. 13. Comparație între procentul de metilare a promotorului VDR și genotipurile Cdx-2

Un alt aspect interesant al acestui studiu, este faptul că subiecții homozigoți (GG) și heterozigoți
(GA) infertili au prezentat valori semnificativ mai mari ale nivelelor de vitamină D față de subiecții
homozigoți AA (p=0,0304). Subiecții homozigoți GG au prezentat cele mai mari valori de vitamină D
(mediana: 34,25 ng/ml, interval: 24,96 ÷ 50,29ng/ml), comparativ cu subiecții heterozigoți GA (mediană:
20,66 ng/ml, interval: 8,79 ÷ 42,23 ng/ml) și cu subiecții homozigoți AA (mediană: 22 ng/ml, interval:
10,23 ÷ 36,71 ng/ml).
60
N iv e lu l v it a m in e i D (n g /m l)

p * = 0 .0 3 0 4

40

20

0
A
A
G

A
G
G

Fig. 14. Comparație între nivelul de vitamină D și genotipurile Cdx-2 din VDR
Pentru a evalua dacă metilarea promotorului genei VDR are ecou la nivelul expresiei genice a fost
cuantificată expresia acesteia. Gena VDR a fost găsită hipoexprimată în probele provenite de la subiecții
cu infertilitate. Scăderea expresiei genei VDR este semnificativă (p<0,0001) mai ales în grupul
subiecților cu azoospermie (control-mediană: 1,492, interval:-1,507 ÷ 3,010, vs mediană subiecți
azoospermie: -2,853, interval: -4,033 ÷ 0,8026).

19
 VDR
4
p * * * < 0 .0 0 0 1

n - f o ld ( lo g 1 0 )
0

-2

-4

-6

ie
l

S
S
o

S
A

rm
tr

A
O
n

e
O
o

p
C

s
o
zo
A
Fig. 15 Expresia genei care codifică pentru receptorul vitaminei D în loturile cu infertilitate
studiate: OATS, OASS și azoospermie vs. control
Implicarea proceselor epigenetice în infertilitatea masculină este susținută și de hipermetilarea
genei MTHFR la subiecții infertili față de grupul control p=0,0012, corelându-se cu parametrii spermatici.
În cazul metilării VDR diferențele în procentul de metilare dintre grupurile infertile și control sunt
semnificative (p=0,0335), grupul martor prezentând o metilare VDR scăzută față de grupurile cu
infertilitate. Comparând procentul de metilare a promotorului VDR cu parametrii spermatici s-au găsit
diferențe semnificative legate de numărul, motilitatea și morfologia spermatozoizilor (p=0,0026 pentru
numărul de spermatozoizi, p=0,0396 pentru mobilitate și p=0,0264 pentru morfologie). Procentul de
metilare este crescut la subiecții cu niveluri scăzute de vitamina D (p=0,0135), subiecții cu niveluri
crescute de vitamină D având un procent mai mic de metilare.
Genotipul AA al Cdx-2 se caracterizează prin valori procentuale mai mari ale metilării față de
celelate două genotipuri, GG și GA, subiecții infertili prezentând valori crescute de metilare comparativ
cu grupul control (p=0,0432). Subiecții homozigoți (GG) și heterozigoți (GA) infertili au prezentat valori
semnificativ crescute ale nivelurilor de vitamină D față de subiecții homozigoți AA (p=0,0304).
În acest studiu s-a arătat că subiecții infertili au prezentat cele mai scăzute niveluri de vitamină D,
fiind astfel în consens cu datele prezentate anterior, despre influența nivelurilor de vitamină D asupra
parametrilor spermatici (Blomberg et al. 2011; Blomberg 2014). Promotorul genei VDR prezintă o insulă
bogată în GC care conține multe elemente de reglare importante în transcripție (Miyamoto et al. 997).
Întreruperea activității promotorului prin metilarea ADN este un mecanism epigenetic observat frecvent
în cancer prin inactivarea genelor supresoare tumorale (Rodriguez-Paredes et al. 2011), în contrast cu
hipometilarea care a fost asociată cu activarea oncogenelor.
Până în acest moment nu se cunosc studii care să asocieze polimorfismul Cdx-2 și deficitul de
vitamină D cu infertilitatea masculină. Rezultatele obținute și prezentate arată că acestă lucrare
constituie o prioritate.
Nivelurile de vitamină D s-au dovedit a fi scăzute semnificativ în grupurile infertili comparativ cu
grupul control. Procentul genotipului GG a fost mai mare în grupul martor, în timp ce procentul
genotipului AA a fost mai mare în grupul infertil. Conform rezultatelor noastre, alela A poate reprezenta
o alelă de risc potențial pentru infertilitate. În plus, s-a constatat că subiecții homozigoți (GG) și

20
heterozigoți (GA) infertili au avut niveluri semnificativ mai mari de vitamină D decât homozigoții AA. Pe
de altă parte, metilarea promotorului genei VDR s-a asociat cu o concentrație scăzută de spermatozoizi,
și, de asemenea, cu o mobilitate și o morfologie scăzută.
Procentul de metilare este crescut la subiecții cu niveluri scăzute de vitamina D, în special în
grupul infertil. Genotipul AA este caracterizat prin valori mai mari ale procentului de metilare. Foarte
important, acesta este primul studiu care a raportat asocierea între metilarea promotorului genei vitaminei
D și infertilitatea masculină.
Metilarea promotorului genei receptorului de vitamina D are un efect important asupra numărului
de spermatozoizi, dar a fost asociat și cu morfologia și motilitatea scăzute. Un procent mai mare de
metilare a fost legat de deficitul de vitamină D. Subiecții care au avut genotip AA a polimorfismului Cdx-
2 se caracterizează prin valori procentuale mai mari de metilare. Pe de altă parte notabilă este diferența
dintre valorile procentului de metilare a genotipurilor polimorfismului FokI (p=0,0017) mai ales pentru
homozigoții CC, precum și în cazul polimorfismului VDRTaqI (p=0,0115) la care valorile crescute ale
procentului de metilare sunt asociate genotipului TT.

CONCLUZII

Prezenta teză a urmarit sa creioneze profilul subiecților infertili, punând în lumină implicarea unor
factori hormonali, genetici și epigenetici în această patologie.

1. Rezultatele obținute sugerează rolul deosebit al hormonilor în procesul de spermatogeneză.

Modificări semnificative statistic ale nivelurilor serice de FSH (p=0,004), LH (p=0,0005), prolactină
(p=0,0001), DHEA-S (p=0,0009) și inhibină B (0,0001) s-au corelat cu severitatea diagnosticului.
Caracteristica subiecților cu azoospermie în comparație cu lotul control, este creșterea semnificativa a
nivelurilor FSH şi LH, și scăderea celor de testosteron, inhibina B, estradiol și vitamina D.
2. În grupul de subiecți infertili, nivelurile serice ale unor hormoni s-au corelat pozitiv cu parametrii
spermatici:
 inhibina B cu concentrația și mobilitatea spermatozoizilor,
 testosteronul total, SHBG cu concentrația și morfologia spermatozoizilor
 vitamina D cu morfologia spermatozoizilor.
3. Studiul genetic al unor mutații în gene cu susceptibilitate pentru infertilitatea masculină au permis
construirea unui tablou al predispoziției genetice individuale pentru această patologie.
4. Alela G și alela A a polimorfismelor ESR-α XbaI și respectiv ESRβ AluI au prezentat o asociere
cu statusul infertil (în lotul subiecților infertili predominând heterozigoții). Caracteristici pentru subiecţii
cu azoospermie din lotul investigat:
 Predominanţa alelelor T respectiv A ale polimorfismelor ApaI și Cdx-2 ale
VDR (element discriminatoriu)
 Predominanţa genotipului TT al polimorfismului MTHFR C667T.
21
 5. La subiecţii infertili luaţi în studiu, unele polimorfisme s-au asociat semnificativ cu parametrii
spermatici:
 polimorfismul MTHFR A1298C cu numărul de spermatozoizi,
 polimorfismele XbaI și PvuII ale ESR α, cu morfologia spermatozoizilor (%).
6. Analiza multivariată a stabilit efectul cumulativ al influenței unor polimorfisme și a profilului
hormonal asupra infertilității. Polimorfismul ApaI al VDR a fost asociat semnificativ cu SHBG
(p=0,035), prolactina (p=0,048) și cu statusul de infertilitate (p=0,047), reprezentand un potential marker.
7. Asocierea semnificativă între polimorfismele XbaI şi PvuII ale genei ESR-α şi polimorfismele
Thr307Ala şi Asn680Ser ale genei FSHR la același subiect sugerează, prin analiza statistica, existenţa
unor haplogrupuri caracteristice bărbaților infertili.
8. Niveluri serice scăzute de vitamina D în grupul de infertili s-au asociat cu alela A a
polimorfismului XbaI al genei ESR α, alela T a polimorfismului PvuII al ESR α și prezența alelelor A și
T ale polimorfismelor Cdx-2 și CYP-17.
9. Hipermetilarea promotorilor genelor MTHFR și VDR s-a corelat semnificativ cu parametrii
spermatici ai subiecților cu infertilitate (mobilitate, morfologie și concentrația spermatozoizilor).
10. Pattern-ul de metilare a promotorului VDR poate fi sugestiv pentru patologia investigată, un cut-
off de 8,768% constituind limita maximă a procentului de metilare în cazul subiecților din lotul control
investigat.
11. Un procent ridicat de metilare a promotorului VDR a fost asociat deficitulului de vitamina D si
genotipului AA al polimorfismului Cdx-2.
12. Homozigoții CC ai polimorfismului VDR FokI (p=0,0017) și homozigoții TT ai polimorfismului
TaqI al VDR (p=0,0115) au prezentat procente ridicate de metilare a promotorului VDR.
13. Studiile intreprinse sugereaza un rol important al vitaminei D si al VDR in infertilitatea la barbati.
Studii suplimentare funcționale și (epi)genetice vor ajuta la înțelegerea mai bună a semnificației biologice
și importanței vitaminei D în aceasta patologie.
14. Investigarea modificărilor epigenetice la nivelul spermatozoizilor este importantă pentru
siguranța procedurilor de reproducere asistată, având în vedere faptul că alterări de acest tip ar putea
afecta fertilitatea generațiilor viitoare.

22