Sunteți pe pagina 1din 4

Articolul scris de Alice B. Nongonierma și Richard J.

FitzGerald, Relația structurală dintre


peptidele derivate din proteinele de lapte și activitatea inhibitorie a dipeptidil-peptidazei IV
(DPP-IV), publicat online pe 15 martie 2016, vizează proprietățile de inhibare a dipeptidil-
peptidazei IV ale peptidelor derivate din proteinele din laptele ingerat de oameni. În acest
sens, s-au folosit modele care monitorizează activitatea din punct de vedere structural –
cantitativ, în încercarea de a descoperi principalele trăsături ale secvențelor de peptinde care
au activitate inhibitorie a dipeptidil-peptidazei IV.
Două astfel de modele, tip z și tip v, (cu p<0,05, R2 de 0,829 respectiv 0,815) au fost aplicate
la 56 de peptide derivate din proteinele din lapte despre care s-a scris în literatura de
specialitate că sunt prezente în tractul intestinal al oamenilor care au o trăsătură structurală de
peptide inhibitoare de DPP-IV (P la poziția N2). Zece dintre aceste peptide au fost sintetizate
și testate ulterior in vitro pentru propritățile inhibitoare ale DPP-IV. S-a descoperit că nu
există o concordanță între valorile prognozate ale concentrațiile maximale (IC50) ale
inhibitorilor de peptide și cele descoperite experimental. Cu toate acestea, nu s-a produs nicio
modificare în ierarhizarea peptidelor competitive în ceea ce privește eficacitatea în inhibarea
DPP-IV. Mai mult, s-a remarcat o activitate puternică de inhibare DPP-IV in vitro la două
peptide, LPVPQ (IC50= 43.8 ± 8.8 _M) și IPM (IC50= 69.5 ± 8.7 _M). Peptidele care se
găsesc în tractul intestinal al oamenilor au potențialul de a determina dezvoltarea unor
inhibitori naturali de DPP-IV pentru a asigura reglarea nivelului de glucoză.
Modelele care monitorizează activitatea structural-cantitativă (QSAR) au fost puse la punct în
încercarea de a descoperi principalele trăsături ale secvențelor de peptinde care au activitate
inhibitorie a dipeptidil-peptidazei IV. Ulterior, acestea au fost folosite pentru a analiza
potențialul peptidelor, despre care s-a stabilit în literatura de specialitate că sunt prezente în
tractul intestinal al oamenilor în urma ingerării produselor lactate și care funcționează ca
inhibitoare ale DPP-IV. Două astfel de modele, tip z și tip v, (cu p<0,05, R2 de 0,829
respectiv 0,815) au fost aplicate la 56 de peptide derivate din proteinele din lapte despre care
s-a scris că sunt prezente în tractul intestinal al oamenilor care au o trăsătură structurală de
peptide inhibitoare de DPP-IV (P la poziția N2). Zece dintre aceste peptide au fost sintetizate
și testate ulterior in vitro pentru propritățile inhibitoare ale DPP-IV. S-a descoperit că nu
există o concordanță între valorile prognozate ale concentrațiile maximale (IC50) ale
inhibitorilor de peptide și cele descoperite experimental. Cu toate acestea, nu s-a produs nicio
modificare în ierarhizarea peptidelor competitive în ceea ce privește eficacitatea în inhibarea
DPP-IV. Mai mult, s-a remarcat o activitate puternică de inhibare DPP-IV in vitro la două
peptide, LPVPQ (IC50= 43.8 ± 8.8 _M) și IPM (IC50= 69.5 ± 8.7 _M). Peptidele care se
găsesc în tractul intestinal al oamenilor au potențialul de a determina dezvoltarea unor
inhibitori naturali de DPP-IV pentru a asigura reglarea nivelului de glucoză.
Proteinele din lapte conțin anumite elemente peptidice, numite bio-activo-pepide (BAP), care
au fost izolate in vitro pentru potențialul lor rol benefic în modularea anumitor bio-markeri ai
sănătate. Până în prezent, s-au realizat mai multe studii despre intervenția dietară pentru a
investiga efectul peptidelor derivate din lapte asupra sănătății oamenilor. Deși unele studii au
demonstrat că BAP-urile din proteinele din lapte au un rol pozitiv asupra organismului
oamenilor, altele nu au reușit să identifice o îmbunătățire a biomarkerilor specifici pentru
starea de sănătate în urma consumului BAP-urilor sau a proteinelor din lapte în stare intactă.
În ultimii ani, s-au descoperit din cei în ce mai multe secvențe de peptide provenite din
proteine alimentare care, după cum s-a descoperit in vitro, au proprietăți bioactive. Acest fapt
se datorează de progresele înregistrate în tehnica separării cromatografice și a detectării
spectrometrice a peptidelor. În plus, studiile despre relația dintre activitatea cantitativ-
structurală (QSAR) au facilitat o înțelegere mai aprofundată a secvențelor de BAP-uri. În
general, QSAR reprezintă analiza mai multor descriptori multivariați ai peptidelor care sunt
legați de activitatea biologică folosind metode de calcul cum ar fi regresia parțială (PLSR),
regresia liniară multiplă (MLR), analiza componentelor principale (PCA) sau rețelele neurale
artificiale (ANN). QSAR a fost aplicată la studiul inhibitorului enzimei angiotensiconertoare
(ACE), al antimicrobilor, al antioxidanților și al peptidelor amare. Principalul avantaj al
folosirii abordării QSAR în defaviarea evaluării calitative a peptidelor pentru a le studia
proprietățile bioactive este că QSAR ne poate oferi mijloacele de a preconiza eficacitatea
anumitor secvențe de peptide. Deși s-au studiat mai multe proprietăți bioactive cu ajutorul
QSAR, se pare că, până în prezent, restul nu au fost evaluate din acest punct de vedere. După
cum am arătat deja, QSAR a fost folosită în cazul mai multor BAP-uri, însă, până în
momentul de față, se pare că nu a fost aplicată la secvențele cu proprietăți de inhibare a
dipeptidil-peptidazei IV. DPP-IV este o amino-dipeptidil peptidază care hidrolizează și
inactivează incretina, un hormon dependent de glucoză, polipeptida insulinotropică (JEEP),
peptida asemănătoare glucagonului 1 (GLP-1) și peptida YY (PYY). Inhibarea DPP-IV poate
preveni degradarea incretinei, permițând menținerea activitatea sa insulinotropică în faza
post-ingerare. Deși substanțele cu inhibitori de DPP-IV (de exemplu gliptinele) sunt folosite
în prezent în tratamentul diabetului de tip II (T2D), cercetătorii sunt din ce în ce mai
interesați de folosirea unor compuși derivați natural, cum ar fi peptidele din alimente, pentru
exploatarea proprietăților lor de inhibare a DPP-IV. În acest context, mai multe studii au
arătat că peptidele derivate din proteinele din lapte pot să inhibe DPP-IV in vitro. Au existat
lucrări științifice care raportează proprietățile anti-diabetice ale proteinelor din lapte, intacte
și hidrolizate.
Ulterior ingerării laptelui și a produselor lactate, în tractul intestinal al oamenilor au fost
identificate numeroase peptide derivate din proteinele din lapte. Cu toate acestea, contribuția
acestor peptide asupra stării de sănătate a organismului nu poate fi cuantificată deocamdată.
S-au organizat studii in vivo, care demonstrează efectul anti-diabetic al a peptidelor derivate
din proteinele din lapte care inhibă DPP-IV, folosind ca subiecți diferite animale de talie
mică. Din câte știm, până în momentul de față nici un studiu nu a demonstrat că peptidele
derivate din proteine din lapte prezente în tractul intestinal al oamenilor ar putea avea acțiune
inhibitoare a DPP-IV. Drept urmare, scopul acestui studiu era să demonstreze că pepidele
care pot fi generate în digestia proteinelor din lapte de către organismul uman poate
determina inhibarea DPP-IV. Acesta a fost realizat formând o bază de date de peptide din
proteine de lapte identificate anterior în tractul intestinal al oamenilor în urma ingerării
laptelui și a produselor lactate. Pentru a facilita evaluarea acestor secvențe de peptide, în acest
studiu au fost analizate in vitro un număr de 10 peptide sintetice, avându-se în vedere
proprietățile lor de inhibare a DPP-IV. Astfel, s-a folosit o combinație între cunoștințele
despre trăsăturile structurale ale peptidelor inhibitoare de DPP-IV (de exemplu, P la poziția
N2) și QSAR pentru a prevedea potențialul inhibitor al DPP-IV al mai mult de 250 de peptide
identificate în intestinele oamenilor.
Pentru testele in cauză, analiza inhibării DPP-IV a fost realizată după metoda descrisă de
Nongonierma and FitzGerald. Peptidele au fost testate în diferite concentrații, în intervalul
12.5 × 10−3–1.25 mg mL−1 (concentrația finală). Fiecare probă a fost analizată în triplu
exemplar (n = 3). Concentrațiile inhibitoare maxime de înjumătățire a DPP-IV (IC50) au fost
determinate prin calcularea procentajului de inhibare ca funcție a concentrației probei de test,
folosind regresie logistică. Modul inhibării DPP-IV a fost evaluat folosit reprezentarea dublă
Lineweaver și Burk, reprezentarea reciprocă dublă descrisă anterior de Nongonierma și
FitzGerald. Peptidele au fost evaluate la două valori ale concentrației, respectiv valorile IC50
împărțite la 8 și la 40. Concentrațiile de GP-pNA au variat de la 0.1 la 0.5 mM (concentrație
finală). Aceste concentrații de substrat au fost alese pentru că erau egale cu limitele de
detectare a pNA și permiteau obținerea unui răspuns liniar pentru analiza dublă reciprocă
Lineweaver și Burk.
Modelul QSAR a fost dezvoltat ca un instrument de prognozare a valențelor inhibitoare de
DPP-IV ale peptidelor necunoscute, de exemplu a peptidelor cunoscute pentru faptul că sunt
prezente în tractul intestinal ulterior ingerării laptelui și a produselor lactate. Toate valorile
IC50 au fost obținute prin aceeași analiză ca și cea descrisă anteriior pentru determinarea
inhibării DPP-IV. Peptidele folosite entru a pune la punct modelul QSAR sunt reprenentate
de inhibirori competitivi de DPP-IV care au fost identificați în studiile anterioare (vezi
Tabelul 1). Au fost testate in vitro și alte opt peptide prezente în proteinele din lapte, avându-
se în vedere potențialul lor inhibitor de DPP-IV și au fost incluse în setul de analiză. Despre
cinci dintre ele (FP, HP, RP, VP și LPP) s-a prognozat in silico că sunt importante pentru
inhibarea DPP-IV. Seria z (z1 (hidrofilicitatea), z2 (dimensiunea) și z3 (încărcătura)) din
analiza Hellberg și colaboratorii săi și seria structurală v(v1 (volumul van der Waals), v2
(indexul de încărcătură netă) și v3 (parametrii hidrofobici ai lanțurilor laterale)) dezvoltată de
Lin și colaboratorii săi au fost folosite pentru descriptorilor aminoacizilor. Secvențele scurte
de peptide din modelul QSAR variază de la 2 până la 5 reziduuri de aminoacizi. Drept
urmare, descriptorii peptidelor au fost generați printr-o metodă care permite analiza datelor
referitoare la peptide de lungimi diferite, după cum au fost descrise de Li și Li. Cei doi
aminoacizi terminali ai peptidelor, N- și C-, au fost folosiți pentru generarea descriptorilor
peptidelor. S-a folosit PLSR pentru a face legătura între valorile IC50 a DPP-IV cu
descriptorii peptidelor după cum se arată în Ecuația 1: Y reprezintă valoarea DPP-IV IC50; i:
poziția terminală N- sau C- a aminoacidului (1 sau 2); j: numărul descriptorului
aminoacidului (variind între 1 și 3); _ și _: coeficienții modelului; c, și _ constanta și
valoarea reziduală a modelului. Generarea descriptorilor peptidelor și PLSR au fost făcute
folosind Matlab (versiunea R2014b, MathWorks, Inc, Natick, MA, USA). Setul de analiză
pentru acest model a inclus 21 de peptide, iar 5 peptide (setul de test) au fost alese la
întâmplare (de 100 de ori) a algoritmul Matlab pentru verificare încrucișată.
S-a alcătuit o bază de date alcătuită din mai mult de 250 de peptide despre care s-a descoperit
că sunt produse în timpul digerării proteinelor din lapte în tractul intestinal al oamenilor.
Cinci peptide (YPFPG-PIPN, FPGPIPN, LPQNIPPL, IPPLTQTPV și LPLPL) identificare în
tractul intestinal al oamenolor au fost identificate anterior drept inhibitori DPP-IV, în cadrul
unor teste in vitro (Tabelul suplimentar S1). Din cele mai mult de 250 de peptide, 56 aveau
proprietatea de a inhiba DPP-IV reprezentată de un P în poziția N2. Zece din aceste 56
peptide (VPGEIVE, YPF-PGP, LPQNIPPLT, IPPLTQT, TPVVVPP, YPVEPF, LPLPLL,
QPHQPLPPT, QPLPPT, LPVPQ), care aveau secvențe parțial similare cu peptidele
identificate anterior drept inhibitoare de DPP-IV, au fost selectate pentru studii in vitro. La
momentul studiului, aceste 10 secvențe nu mai fuseseră prezentate în literatura de specialitate
pentru activitatea lor de inhibare a DPP-IV. Aceste zece peptide au fost sintetizate și evaluate
in vitro pentru capacitatea de inhibare a DPP-IV și modul în care se manifestă aceste
proprietăți inhibatorii.
Opt peptide sintetice scurte, derivate din proteinele din lapte (FP, HP, RP, VP, IPM, LPP,
IPPL și IPSK) au fost testate pentru proprietățile lor de inhibare a DPP-IV și modul în care se
manifestă acestea. Acest lucru s-a realizat cu scopul de a crește numărul de secvențe
peptidice disponibile pentru dezvoltarea modelului de activitate structurală. Valorile lor IC50
s-au situat între 69.5 ± 8.7 și 902.8 ± 93.8 _M pentru IPM și, respectiv, HP (Tabelul 1).
Dintre aceste peptide, una (IPPL, Fig. 1A) nu a avut rezultate relevante, două (FP și HP, Fig.
1B) s-au dovedit a fi mixte, una (LPP, Fig. 1C) a fost irelevantă și patru (IPM, VP, IPSK și
RP, Fig. 1D) s-au dovedit inhibitoare competitive ale DPP-IV. Când în setul de test s-au
inclus toate informațiile disponibile privind valorile IC50 ale DPP-IV (preluate din literatura
de specialitate și obținute prin diferite condiții de analiză) nu s-a descoperit nicio legătură
semnificativă (p > 0.05) între decriptorii peptidelor și valorile IC50 DPP-IV obținute
(informațiile nu sunt afișate). Mai mult, nu a reieșit nicio corelare semnificativă (p > 0.05)
între descriptori și valirile IC50 (informațiile nu sunt afișate) când în setul de test au fost
incluse valorile tuturor peptidelor obținute în aceleași condiții de analiză. Drept urmare,
valorile IC50 DPP-IV ale peptidelor incluse ulterior în setul de test au fost cele obținute legat
de peptidele inhibitore competitive prezentate în Tabelul 1. În consecință, toate valorile IC50
(26 secvențe) ale inhibitoarelor competitive folosite pentru stabilirea modelului QSAR au fost
obținute în aceleași condiții experimentale.
În acest studiu, QSAR a fost folosit pentru a ierarhiza peptidele eliberate în tractul intestinal
al oamenilor în legătură cu capacitatea lor de a inhiba DPP-IV. Lucru interesant, modelele
semnificative din punct de vedere statistic (p < 0.05) au fost obținute numai prin încorporarea
informațiilor despre peptidele inhibitoare competitive de DPP-IV și pentru date inhibitorii
folosind condiții experimentale similare. Acest lucru poate fi pus în legătură cu faptul că toate
condițiile folosite în analizele inhibitorii de enzime afectează efectele finale. Drept urmare,
pentru a evita devierile datorate condițiilor experimentale, pe viitor ar putea fi mai potrivit ca
modelul să fie pus la punct cu valori inhibitorii constante (Ki) pentru DPP-IV, care nu depin
de condițiile de analiză folosite.
În concluzie, abordarea prin analiză QSAR a acestei chestiuni a permis ierarhizarea
peptidelor după eficiența în inhibarea competitivă a DPP-IV. Modelele au fost folosite ca
instrument pentru a preconiza proprietățile inhibitoare de DPP-IV ale peptidelor care au fost
identificate anterior în tractul intestinal al oamenilor în urma ingestiei laptelui și a produselor
lactate. Rezultatele privind cele mai puternice peptide în această privință pot avea importanță
în starea generală de sănătate a organismului uman. Este probabil ca și alte peptide
identificate în tractul intestinal al oamenilor ulterior ingerării laptelui și a produselor lactate și
care nu au fost incluse în acest studiu să aibă proprietăți de inhibare a DPP-IV. Deși modelele
QSAR din contextul prezent au limitările lor (legat de informațiile despre dimensiunile și
diversitatea peptidelor), e totuși evidentă că această abordare s-a dovedit promițătoare în ceea
ce privește descoperirea unor noi secvențe de peptide cu proprietăți inhibitoare de DPP-IV.
Impactul peptidelor derivate din proteinele din lapte identificate în tubul digestiv trebuie
evaluat prin teste in vivo pentru a înțelege mai bine rolul lor ca agenți de reglare a glucozei
serice.