Sunteți pe pagina 1din 56

CUPRINS

Introducere……………………………………..................2

CAPITOLUL I. Bacterii care produc infecţii urinare.

1.1 Particularităţi generale ale bacteriilor care produc infecţii...................................................3

1.2 Particularităţi specifice bacteriilor ce produc infecţii urinare...............................................5

1.3 Infecţiile tractului urinar. Patogenitatea bacteriilor implicate...............................................7

CAPITOLUL II. Rezistenţa la antibiotice a bacteriilor.

2.1 Mecanisme de rezistenţă la antibiotice a bacteriilor...........................................................11

2.2 Mecanisme genetice de rezistenţă a bacteriilor la antibiotice............................................14

2.3 Mecanisme biochimice.......................................................................................................16

2.4 Rezistenţa la antibiotice mediate de gene cromosomiale...................................................20

CAPITOLUL III. Metode de punere in evidenţă a microorganismelor.

3.1. Obiectivele lucrării............................................................................................................23

3.2. Materiale,metode si medii de cultură................................................................................24

3.3. Descrierea mijloacelor paraclinice de punere in evidenţă a microorganismelor...............28

3.4. Rezultate si discuţii...........................................................................................................40

CONCLUZII......................................................................................................................53

BIBLIOGRAFIE...............................................................................................................54

1
INTRODUCERE

In decursul celor sapte decenii de existenta, terapia antimicrobiana a schimbat fundamental


relatia omului cu mediul inconjurator, diminuand semnificativ una din angoasele majore ale finite
umane: aceea a mortii prin infectie. Inca din 1940, antibioticele au adus cele mai mari beneficii
reprezentand medicatia cu cea mai frecventa prescriere. Avantajele utilizarii lor rezida in actiunea pe
care o exercita asupra majoritatii bolilor infectioase cunoscute, in sensul vindecarii sau controlului
evolutiei acestora. Descoperirea antibioticelor a redus enorm mortalitatea globala prin posibilitatea
tratarii bolilor infectioase. Nici pacientii, nici farmacistii si din pacate nici medicii nu au inteles ca
utilizarea acestor arme in lupta impotriva infectiilor trebuie facuta cu chibzuinta. Prin nesabuinta
noastra, acesti inamici invizibili – bacteriile – au ajuns sa capete rezistenta fata de toate noile molecule
sintetizate de cercetatori. Insa asa cum declara Fleming, in 1945, pentru New York Times “Cel mai
mare pericol este ca…oamenii vor lua antibiotice prea des…” “…si in doze prea mici, astfel incat in
loc de eradicarea bacteriilor se vor obtine tulpini rezistente si nu vom mai putea trata pneumonia cu
penicilina …” preluat din cartea lui Stuart Levi “The Antibiotic Paradox”.

Rezistenta la antibiotic este o problema actuala al carei interes creste pe masura ce sunt aduse
dovezi asupra inmultirii alarmante a cazurilor de rezistenta atat in spital cat si in comunitate. Astfel
aceasta devine o preocupare a comunitatii mondiale care dureaza de mai bine de 15 ani, de a realiza
harti epidemiologice, pentru o supraveghere sistematica a multirezistentei. Cu toate progresele
realizate in cercetarea antimicrobiana, infectiile bacteriene au ramas o amenintare importanta pentru
sanatate si chiar viata omului modern. Speciile bacteriene si-au dezvoltat mecanisme de rezistenta ce
include modificarea structurii antibioticului, mutatii la nivelul unor situsuri cheie aminoacide ale
tintelor specifice pentru chimioterapie, activarea pompelor de eflux, etc.

Aceasta lucrare se ocupa cu studiul tulpinilor izolate din infectii urinare in Centrul Medical
Mediurg Ploiesti si urmareste realizarea unei analize comparative privind sensibilitatea la antibiotice si
chimioterapice a tulpinilor bacteriene, raspunzatoare de infectii urinare, izolate in 2016.

2
CAPITOLUL I

Bacterii care produc infectii urinare

1.1 Particularitati generale ale bacteriilor care produc infectii

Din punct de vedere biofizic orice celula vie este un complex autoorganizat de molecule
organice care schimba energie si materie cu mediul inconjurator functionand pe baza principiului de
maxima economie si care este capabil sa reactioneze la actiunea mediului, sa creasca si sa se
reproduca. Bacteriile sunt organisme vii de dimensiuni foarte mici, alcatuite dintr-o singura
celula de tip procariot, prin a carei diviziune directa iau nastere doua celule noi, identice cu cea
parenterala. Desi mult mai mici si mai simple decat celule eucariote, bacteriile sunt asemanatoare cu
acestea in ceea ce priveste mecanismele functionale celulare, prezentand o organizare complexa cu o
arhitectura externa si interna distincta.

Marimea si forma bacteriilor

Dimensiunile bacteriilor sunt de ordinul micronilor, fiind cuprinse intre 0,1 - 20 µ. Forma lor
este variata, sferica - numindu-se in acest caz, coci; in forma de bastonase - purtand numele de
bacterium; iar daca poarta cili se numesc bacili. Mai pot fi in forma de virgula - vibrioni sau rasuciti in
spirala - spirili. Cocii se pot grupa cate 2 sau se inlantuiesc in forma unei salbe (streptococi), ori se
dispun in forma unui ciorchine de strugure (stafilococi). Intr-o reprezentare schematica, pornind de la
interior spre exterior, celula bacteriana este alcatuita in general din urmatoarele componente
structurale:

- material nuclear

- citoplasma

- structuri membranoase care deriva din membrana citoplasmatica

- structuri de invelis

- apendici bacterieni (cili,pili)

- structuri extracelulare care constituie glicocalixul (structuri regulate de suprafata, microcapsule,


capsula, strat mucos).

3
Figura 1.1 Schema alcatuirii unei celule bacteriene

https://ecomareaneagra.wordpress.com/ecosistemul/bacteria/

O parte dintre aceste structuri fine, cum ar fi peretele celular, membrana citoplasmatica,
ribozomii materialului nuclear sunt obligatorii pentru toate bacteriile iar restul sunt facultative. Acestea
din urma prezinta un grad diferit de dezvoltare in functie de specie,iar altele sunt prezente numai la
unele specii. Unele specii bacteriene poseda si alte structuri particulare diferite , de cele mentionate
cum ar fi: sporul ( la bacterii sporulate ), filamentele axiale (la Spirochetales), coada (la Caulobacter) si
spinii (un tip de apendici bacterieni descrisi la unele bacterii acvatice). Materialul nuclear bacterian are
o organizare primitiva in comparatie cu nucleul celulelor eucariote in sensul ca nu constituie o
structura marginita de o membrana nucleara si nici nu prezinta nucleoli. Aceasta organizare nucleara
observabila prin microscopia electronica reprezinta, de altfel, principala caracteristica a celulelor
procariote. Pe sectiuni fine prin bacterii fixate chimic materialul nuclear apare localizat in mod
obisnuit in parte centrala a celulei, constituind o zona de dimensiune si forma variabila, cu densitate
electron-optica, mai scazuta decat citoplasma. El poate fi in legatura cu membrana citoplasmatica prin
intermediul a unu-doi mezozomi. Densitatea electron-optica mai scazuta a zonei nucleare este
explicata prin faptul ca desi ea reprezinta cam 10% din volumul celulei, ADN-ul care alcatuieste

4
materialul nuclear reprezinta numai 2-3% din greutatea uscata a celulei si deci componentele ce
alcatuiesc aceasta zona sunt mai spatiate comparativ cu cele din citoplasma. Pe sectiuni fine aspectul
continutului acestei zone este diferit in functie de fixatorul chimic folosit, fixator care determina
diverse grade de condensare a materialului nuclear. Astfel, pot aparea agregate electron-optic dense,
ghemuri de fibrile (prin fixarea Ryter-Kellenberger sau fibre foarte fine prin fixarea glutaraldehida).
Prin tehnica criodecaparii, deci in celule nesupuse actiunii fixatorilor chimici, materialul nuclear este
greu de observat, ceea ce demonstreaza ca in celulele vii nu formeaza agregate sau structuri fibrilare
suficient de groase pentru a fi evidentiate. Desi materialul nuclear nu este marginit de o membrana
nucleara el este destul de compact, fiind bine delimitat in citoplasma, cauzele acestei delimitari nefiind
bine cunoscute. Ca urmare a acestei delimitari, in regiunea nucleoidului nu exista ribozomi. Forma
zonei ocupata de materialul nuclear este neregulata prezentand lobuli. Materialul nuclear bacterian
contine 60% ADN, 30% ARN nou sintetizat si restul proteine. ADN-ul este organizat intr-o singura
molecula dublu helicoidala, circular inchisa cu diametrul 20A si o lungime de aproximativ 100
micrometri, numita cromozom bacterian. In celula cromozomul bacterian este impachetat, probabil sub
forma unor bucle superinfasurate care sunt unite la baza.

1.2 Particularitati specifice bacteriilor raspunzatoare de infectii urinare

Spectrul etiologic al infectiilor de tract urinar este larg si are tendinta de a se extinde, cu
precadere in mediul spitalicesc. Principalul agent etiologic este Escherichia coli, dar sunt izolate
frecvent si tulpini de Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Citrobacterii. In tabelul 1 prezentam frecventa
bacteriilor patogene implicate in infectii ale cailor urinare (Nebreda-Mayoral si colab. 1994; Kunin,
1979).

5
Tabelul 1.1

Frecventa bacteriilor patogene implicate in infectii ale cailor urinare

SPECII PACIENTI PACIENTI SPITALIZATI


AMBULATORI
(%) (%)
Escherichia coli 89,2% 52,7%
Proteus mirabilis 3,2% 12,7%
Klebsiella pneumoniae 2,4% 9,3%
Enterococi 2,0% 7,3%
Enterobacter aerogenes 0,8% 4%
Pseudomonas aeruginosa 0,4% 6%
Proteus 0,4% 3,3%
Serratia marcescens <0,1% 3,3%
Stafilicoci 1,6% 0,7%
Staphylococcus aureus <0,1% 0,7%

Restul enterobacteriilor,enterococi sau Pseudomonas aeruginosa determina infectii cornice sau


recurente pe fondul unor uropatii obstructive,disfunctii neurogene ale vezicii urinare sau dupa
instrumentatii ale cailor urinare. Staphylococus saprophyticus este o cauza a cistitelor mai frecventa la
femei tinere active sexual. Corynebacterium urealyticum a fost semnalat la pacientii in conditii de risc
determinate de spitalizare, tratament prelungit cu antibiotice sau interventii urologice. Candida albicans
determina uretrocistite la diabeticii necontrolati metabolic. Bacteriile anaerobe nesporulate sunt
ocazional cauza de infectii la pacientii cu cancer vezical. Speciile ureazo-pozitive (Proteus, Klebsiella,
etc) alcalinizeaza urina si favorizeaza producerea de calculi, ceea ce creeaza dificultati majore in
eradicarea pielonefritelor determinate.

1.3 Infectii ale tractului urinar. Patogenitatea bacteriilor implicate.

6
Infectiile de tract urinar se asociaza pe tot globul cu morbiditati ridicate, reprezentand in
prezent o serioasa problema de sanatate publica. Infectia de tract urinar este data de colonizarea cu
germeni a tractului urinar la orice nivel, urmata de eliminarea microorganismelor prin urina.

Infectiile tractului urinar pot fi impartite in doua categorii anatomice general:

- infectii urinare inalte (pielonefrite, abcese intrarenale si perinefritice);

- infectii urinare joase (uretrite, cistite, prostatice).

Bacteriurie semnificativa - prezenta microorganismelor in urina.

Cei mai multi autori considera o bacteriurie > 100.000 germeni/ml ca fiind o bacteriurie semnificativa,
reprezentand o infectie urinara. S-au formulat criterii de evaluare mai complexe si cu aplicabilitate
clinica pentru aprecierea bacteriuriei semnificative:

- germeni coliformi/ml > 100, germeni necoliformi > 100.000 la femeile simptomatice;

- > 1000 germeni/ml la barbatii simptomatici;

- > 100.000 germeni/ml in cazul bacteriuriei asimptomatice dar in care sunt necesare doua probe
pozitive cu acelasi germen;

- bacteriurie > 100 ml la bolnavii cateterizati;

Patogenitatea bacteriilor implicate.

Infectia tractului urinar este una dintre cele mai frecvente conditii patologice. Un numar
apreciabil de infectii ale tractului urinar evolueaza asimptomatic, iar la copilul sub 2 ani
simptomatologia este nespecifica. Sistemul urinar este format din cei doi rinichi, caile urinare intra si
extrarenale. Partea glandulara a rinichiului coafeaza sinusul, o mare cavitate adiacenta a hilului renal.
Sinusul contine bazinetul renal, tesut conjunctiv lax si tesut adipos prin care trec spre si dinspre
portiunea glandulara nervii, arterele, respectiv venele si vasele limfatice.

Bazinetul renal se continua la nivelul hilului cu ureterul prin care urina ajunge in vezica
urinara, de unde este eliminata periodic prin uretra. In bazinet se deschid calicele mari care reunesc
calicele mici. Partea glandulara este concentrata in cortexul renal, care acopera zona medulara formata
din 8-18 piramide renale conice. Baza piramidelor este dispusa spre cortex, iar varful sau papila
proemina in lumenul fiecarui calice mic. Varful papilei este perforat de 10-25 orificii prin care se
deschid tubii uriniferi. Nefronul, unitatea secretorie a rinichiului, este format din segmente repartizate

7
intre cortex si medulara. La limita dintre corticala si medulara, fiecare tub contort distal se continua cu
un scurt tub colector. Tubii colectori strabat radiar externa medularei si fuzioneaza repetat cu alti
similari in zona interna pentru a forma ducturile papilare. Din arterele arciforme de la jonctiunea
corticalei cu medulara radiaza spre periferie arterele interlobulare ale caror mici ramificatii formeaza
glomerulii renali. Circulatia venoasa, de retur, paralelizeaza arterele. Aspectul striat al medularei
renale este dat de tubii uriniferi si vasele sanguine aferente lor. Bogata retea vasculara limfatica din
musculatura si corionul bazinetului si cailor urinare extrarenale are anastomoze cu reteaua limfatica a
rinichiului. Tractul urinar, de la calice si bazinet pana la uretra proximala, este acoperit de un epiteliu
"tranzitional" cu aspect variat al celulelor in raport cu gradul de distensie a mucoasei. Uretra masculina
are 18-20 cm lungine. Partea distala si cea mijlocie sunt acoperite de un epiteliu colimnar stratificat
sau pseudostratificat. In uretra distala apar insule de epiteliu malpighian, care devine continuu la
nivelul fosetei naviculare. Glandele tubulare ramificate se deschid pe partea dorsala a uretrei distale si
in profunzimea anfractuozitatilor uretrei mijlocii, produc mucus. Uretra proximala este acoperita de un
epiteliu "tranzitional".

Pe peretele posterior al acestui segment se deschid cele doua canale ejaculatoare si 16 - 32


canale excretoare ale prostatei. Uretra feminina are numai 2,5 - 3 cm lungime si este acoperita de un
epiteliu malpighian in care apar insule cu epiteliu columnar pseudostratificat. In profunzimea
numeroaselor invaginatii ale mucoasei sunt frecvente celulele producatoare de mucus. Limfocite
izolate pot migra printre celulele epiteliale, impreuna cu leucocitele eliminate prin rinichi, normal nu
depasesc 400.000 celule/ora. Exceptand uretra, tractul urinar ramane normal necolonizat, desi
contaminari ocazionale ale urinei vezicale sunt posibile, mai ales la femei din cauza traiectului scurt si
direct al uretrei.

8
Figura 1.2 Aparat genital la femei si barbati

http://fizic-astral-cauzal.blogspot.ro/2011/08/aparatul-genital-semnificatia-subtila.html

In ordinea importantei, barierele antimicrobiene ale tractului urinar sunt:

-continuitatea uroepiteliului dublat de mucopolizaharid, un glicosaminoglican, care antagonizeaza


aderenta bacteriilor lipsite de liganzi speciali;

- spalarea mucoasei prin fluxul normal de urina cu un spatiu mort minim prin evacuarea completa a
vezicii in cursul mictiunii normale;

- marea osmolaritate si marea concentratie de uree si pH-ul scazut al urinii fac din aceasta un
mediu nefavorabil dezvoltarii multor bacterii;

- efecte antibacteriene ale secretiei prostatice si glandelor periureterale

Uretra distala este normal colonizata cu bacterii provenite de pe tegumentul perineal, din
colon si vulva. Astfel in uretra distala, in cantitati moderate, sunt foarte frecventi stafilococii
coagulazo-negativi, comunibacilii difteriformi, enterobacteriacee, enterococi neisserii nepretentioase,
micoplasme si ocazional prezente specii de Candida, Propionibacterium, clostridia, coci anaerobi
gram-pozitivi si gram-negativi, lactobacili, micobacterii saprofite, stafilococi aurii. Infectia tractului
urinar poate fi inaparenta sau manifesta. Afecteaza oricare segment al cailor urinare si datorita
raporturilor anatomice, odata instalata intr-un segment se extinde si la celelalte: ureterite, prostatite,
cistite, pielonefrite. Barierele antiinfectioase ale cailor urinare sunt labile: spre deosebie de alte
tesuturi, pe mucoasa vezicala fagocitoza de suprafata este practic absenta; in pelicula de urina

9
reziduala bacteriile se pot multiplica in intervalul dintre mictiuni; efectorii complementului si
fagocitoza sunt ineficienti in mediul hiperton din medulara renala. Variate conditii rup echilibrul
microorganism-gazda in defavoarea gazdei cu aparitia colonizarii sau infectiei cailor urinare.

- cresterea spatiului mort urinar prin pertubarea fluxului urinar: fie din cauza mecanica, fie din
cauza functionala;

- reflux vezico-ureteral;

- modificarea compozitiei urinare, care favorizeaza cresterea bacteriana (sarcina,diabet zaharat);


lezarea mucoasei prin instrumentatii;

- corpii straini devin o nisa pentru bacteriile care initiaza si intretin infectia.

Tractul urinar este steril in mod normal pana la nivelul uretrei distale si poseda mecanisme de aparare
ce nu permit microorganismelor patogene sa-l invadeze. Totusi in anumite conditii germenii pot
produce o infectie urinara pe diverse cai.

Calea ascendenta este cea mai importanta pentru accesul bacteriilor conditionat patogene in tractusul
urinar. Evident, Escherichia coli este cel mai frecvent agent etiologic al infectiilor tractului urinar.

Calea limfatica. Propagarea pe cale limfatica a infectiilor tractului urinar inferior spre bazinet si rinichi
este o posibilitate demonstrata experimental.

Calea hematogena presupune evolutia prealabila a unei infectii sistematice cu bacteriemie sau
septicemie. Localizarea renala poate fi o etapa constanta, cu Haemophilus influenzae, abcese renale
stafilococice, tuberculoza renala, bruceloza s.a.

CAPITOLUL II

10
Rezistenta la antibiotice a bacteriilor

2.1 Mecanisme de rezistenta a bacteriilor la antibiotice

Antibioticele sunt substante chimice organice produse de microorganisme sau obtinute prin
sinteza sau semisinteza care in doze mici, inhiba dezvoltarea microorganismelor patogene. Dupa
descoperirea microbilor de Pasteur, s-a observat ca unele specii microbiene se apara de alte specii prin
elaborarea unor substante chimice nocive. Acest fenomen este numit antibioza, iar substantele chimice
rezultate din metabolismul celular viu poarta numele numele de antibiotic. Primul care a semnalat in
1885 actiunea inhibanta a substantelor elaborate de microorganisme a fost savantul Victor Babes; tot el
a sugerat ca aceste substante ar putea fi utilizate in scop terapeutic pentru distrugerea agentilor
patogeni. Aceste fapte constituie o anticipatie geniala a savantului roman care, cu 50 de ani inaintea
descoperirii epocale a lui Fleming (obtinerea penicilinei), a intuit efectele practice ce le-ar putea avea
pentru terapeutica antagonismul microbian. Introducerea, in 1941, in practica medicala a antibioticelor
de biosinteza caracterizate prin spectrul larg de actiune, eficacitate ridicata si toxicitate redusa,
constituie cea de-a doua etapa extrem de importanta in dezvoltarea chimioterapiei. Succesele
exceptionale obtinute in tratarea maladiilor infectioase cu ajutorul penicilinei G au declansat cercetari
foarte minutioase pentru a gasi noi antibiotice de biosinteza. Asa se explica faptul ca intr-un interval
extrem de scurt sunt descoperite si introduse in terapeutica penicilina V, tetraciclinele, streptomicina,
griseofulvina, eritromicina, oleandomicina, iar mai tarziu cefalosporinele si rifampicina. Utilizarea
excesiva a penicilinei G a generat insa fenomenul de penicilino-rezistenta , fenomen manifestat prin
pierderea eficacitatii terapeutice. Rezistenta la drog intereseaza toate categoriile de microorganisme;
se manifesta fata de toate categoriile de agenti microbieni; Paul Ehrilch, in timpul neobositelor sale
cercetari pe soareci a constatat ca, sub tratament, protozoarul Trypanosoma gambiense devenea
rezistent fata de fiecare din compusii activi experimentati. El a constatat stabilitatea noului caracter in
400 de generatii, pe soareci si existenta rezistentei incrucisate manifestata fata de compusii activi
apatinand aceluiasi grup chimic. Fenomenul de instalare a rezistentei la drog incepe odata ce
fenomenul devine de interes clinic major prin ineficienta terapeutica in infectii date de bacterii anterior
sensibile. In 1946 se stia deja ca 10% pana la 90% din tulpinile de N. gonorrhoeae devenisera
rezistente la sulfamide; din 1950 au fost observate tulpini multirezistente, intai la S. aureus, iar din
1955 si la bacilii gram negativi; in 1963 se cita ca 79% din izolate de E. coli erau deja rezistente la
unul sau mai multe antibiotice. Daca in 1971 se mai putea scrie cu privire la penicilina ca, exceptand
stafilococii, "alte specii natural sensibile nu au aratat o crestere evidenta a rezistentei", in 1976

11
gonococul infirma aceasta afirmatie. Azi sunt tot mai adesea mentionate tulpini bacteriene rezistente la
toate antibioticele de uz terapeutic.

Definitia rezistentei la antibiotice

Rezistenta la antibiotic este exprimata cantitativ si raportata la parametrii farmacodinamici si


la concentratiile inhibitorii sau bactericide ale antibioticului.

- Rezistenta naturala

Sau "insensibilitatea" la antibiotice este numita capacitatea bacteriilor de a creste si de a se


inmulti in prezenta dozelor maximale tolerate fara risc de organismul tratat, doze care pot inhiba
cresterea sau omori alte specii bacteriene. Se cunoaste ca toate tulpinile de Pseudomonas aeruginosa
sunt rezistente la tetraciclina si ampicilina, speciile genului Proteus sunt rezistente la tetraciclina, iar
Mycobacterium tuberculosis este in mod natural rezistent la penicilina, cloramfenicol si tetraciclina.
Insensibilitatea naturala este o caracteristica intrinseca a speciei , stabile avand ca determinanti genetici
gene existente pe cromozom si se explica cel mai adesea prin permeabilitatea scazuta a invelisurilor
celulare pentru antibiotic. Spectrul de rezistenta naturala al unei bacterii la antibiotic este reversal
spectrului ei de sensibilitate.

- Rezistenta dobandita

Se refera la starea aparuta la o celula bacteriana, tulpina, sau un numar de tulpini apartinand
unei specii natural sensibile, dupa introducerea antibioticului respectiv in terapie si consta in scaderea
sau anularea sensibilitatii la antibiotic. Acest caracter fenotipic este corelat cu o alterare a materialului
genetic. Bacteria devenita rezistenta tolereaza concentratii de antibiotic mai mari decat dozele
suportate fara risc de organismul tratat. In practica bacteria este considerata rezistenta cand raportul
intre nivelul seric mediu suportat de bolnav si CMI (sau CMC) este subunitar: nivelul seric de
antibiotic, fara risc pentru bolnav, nu duce la sterilizarea mediului intern al organismului de bacteria
infectanta. Spectrul de rezistenta a unui agent infectant trebuie determinat prin antibiograma.
Termenul de rezistenta primara la antibiotic, mai corect "initiala", este folosit pentru starea de
rezistenta a bacteriei in momentul in care initiaza o infectie; spre deosebire de rezistenta secundara
dobandita de tulpina infectanta pe parcursul tratarii unui bolnav.

- Rezistenta adaptiva

12
Este numita starea care, fara a interesa genomul, este uneori transmisa in generatii succesive
si care apare sub influenta unor doze subinhibitorii de antibiotic; ca rezistenta la penicilina a bacteriilor
cu perete alterat, aparute in cursul unor terapii cu doze nebactericide. Transmiterea caracterului de
rezistenta intr-un numar mare de generatii, in absenta drogului, s-ar explica prin aceea ca un
component a carui sinteza este alterata de Pen este necesar ca primer pentru ca acelasi component sa
fie sintetizat apoi normal. Ca regula insa, rezistenta fenotipica prin mecanisme adaptive nu este
transmisa la descendenti, bacteriile revenind la starea anterioara dupa cateva generatii de la disparitia
factorului inductor.

- Rezistenta incrucisata

Este numita capacitatea unor tulpini de a se manifesta ca rezistente si fata de unele


antibiotice inrudite chimic cu acela care reprezinta substratul tipic.

- Rezistenta constitutiva

Este capacitatea unei gene de a-si exprima continuu rezistenta, independent de prezenta sau
absenta drogului antimicrobian.

- Rezistenta inductibila

Este aceea exprimata numai in prezenta factorului depresor sau "efectorul" antibioticului;
declansarea sintezei in prezenta antibioticului fiind rapida. Ambele tipuri ale rezistentei - constitutiva
sau inductibila - pot fi codificate fie cromozomal, fie plasmidic. "Inventarea" de catre bacterii a
mecanismelor de rezistenta la antibiotic, la fel ca aparitia tulpinilor producatoare de antibiotice si a
celor tolerante, face parte din ansamblul fenomenelor de antagonism, una dintre caracteristicile
evolutiei la microorganisme ancestral elaborate. Fenomenele genetice initiale care au dus la aparitia
caracterelor de rezistenta la antibiotice sunt, desigur, mutatiile cromozomale care sunt relative
numeroase in conditiile marii viteze de succesiune a generatiilor la bacterii. In prezent, se cunoaste ca
rezistenta la antibiotice este codificata atat de gene cromosomale cat si de plasmidiale, existand
posibilitatea schimbarii determinantilor respectivi intre cromosom si plasmide, pe baza omologiei de
ADN. Rezistenta codificata de gene cromosomale poate aparea in urma transductiei, mutatiilor,
transformarii sau translocatii a unor gene de pe plasmide. Indiferent de mecanismul genetic prin care a
fost dobandita rezistenta la antibiotic, aceasta se exprima prin modificarea sau castigarea de catre
bacterie a unei noi proprietati biochimice, structurala sau enzimatica. Selectia mutantilor a functionat
la randul ei dintotdeauna in baza substantelor antibacteriene naturale, elaborate de asemenea de

13
bacterii si micete in dealungul proces de evolutie in conditiile coexistentei in nise ecologice extreme de
complexe; cu cat o bacterie este mai dotata cu proprietati de rezistenta la agenti antimicrobieni, cu atat
mai usor isi asigura supravietuirea in cadrul competitiei intre specii.

Rezistenta la antibiotice este data de:

1) mecanisme genetice de dobandire;

2) mecanisme biochimice;

3) selectia variantelor rezistentei la antibiotice.

2.2 Mecanisme genetice de rezistenta a bacteriilor la antibiotice

Toate mecanismele de variatie genetica cunoscute la bacterii pot induce si rezistenta la


antibiotice, atat cele endogene cat si cele prin material genetic exogen dar nu au aceeasi importanta
medicala. In perioada in care in general mecanismele variabilitatii la microorganisme erau
controversate, si in cazul dobandirii rezistentei la antibiotice una dintre ipoteze a fost adaptarea
bacteriilor la conditii noi de existenta in prezenta drogului bacteriostatic sau bactericid. Folosind
metodele experimentale ale lui Luria si Delbruck si ale sotilor Lenderberg, Demerc in 1957, a
demonstrat ca rezistenta la sulfamide poate apare independent de prezenta sau absenta acesteia in
mediul de cultivare a bacteriei, prin mutatie, si ca streptomicina are numai rolul de factor de selectie.
Pana in 1959, a existat opinia ca rezistenta la antibiotice este numai rezultatul mutatiilor si rareori a
recombinarilor cromozomiale. In 1959 - 1962 a fost descoperita existenta plasmidelor de rezistenta.
Din 1974, este cunoscuta si existenta elementelor sau segmentelor de insertie si a transpozonilor.
Deseori, rezistenta se datoreaza unor mutatii spontane produse in timpil diviziunii bacteriilor.
Rezultatul este ca intr-o populatie apar celule bacteriene ce contin gene de rezistenta, bacterii ce vor fi
selectate in conditiile existentei in mediu a antibioticelor. Se cunoaste ca rezistenta cromozomala este
datorata nu numai mutatiei si recombinarilor cromozomiale ci si integrarii stabile in cromozom a unor
gene R plasmidice prin recombinari sau prin insertii de elemente transpozabile. De rapiditatea
dobandirii si raspandirii tulpinilor R la Gram-negativi si Gram-pozitivi, in unitati inchise si pe glob,
este responsabil in primul rand transferul de plasmide, in al doilea rand mutatiile si apoi recombinarile
cromozomiale. La specii acid-alcoolo-rezistente este cunoscuta numai rezistenta dobandita prin mutatii
cromozomiale. Mutatiile induc mai ales monorezistenta, plasmidele transfera mai ales rezistenta la
multe antibiotice multirezistente. De marea diversitate a spectrelor de rezistenta la tulpini

14
multirezistente sunt responsabile elemente transpozabile si plasmidele R. Rezistenta unor specii fata de
unele antibiotice poate fi numai plasmidica - cum este rezistenta la tetraciclina la Enterobacteriaceae.
Rezistenta la un acelasi antibiotic sau clasa de antibiotice poate fi codificata prin ambele mecanisme
genetice. O aceeasi tulpina poate fi dotata cu mai multi determinanti cromozomali si/sau plasmidici de
una sau mai multe plasmide.

Modificari ale genomului

Mutatia este o modificare in structura unei gene care apare spontan, poate fi indusa
experimental si evidentiata fenotipic ca un nou caracter stabil. Alterarea genomului consta din
schimbarea unui singur nucleotid dintr-o anumita secventa cu altul, mutatie punctiforma, sau mai rar,
intereseaza secvente nucleotidice,prin deletii, aditii,inversii. Mutatiile de rezistenta la antibiotice sunt
practic numai punctiforme; rareori, antibioticul insusi ar juca un rol de factor mutagen. Mutatii prin
deletii au fost uneori afirmate drept cauza rezistentei la antibiotice; aparitia lor ar fi favorizata de
integrarea in cromozom a unor segmente de ADN translocabile, "mobile" cu caracter mutagen, numite
elemente sau segmente de insertie. O alta posibilitate de variatie a materialului cromozomal este
inserarea de transpozoni plasmidici, secvente de ADN alcatuite dintr-un segment de insertie si unul sau
mai multi determinanti de rezistenta. Mutatia de rezistenta la antibiotic poate antrena concomitant si
modificari ale altor caractere importante din punct de vedere medical ca pierderea completa sau
partiala a vitalitatii, sau a virulentei; rezistenta mutationala la P. aeruginosa s-ar insoti de o scadere a
virulentei pentru om. Aparitia mutatiei cromozomale de rezistenta in cursul terapiei la bolnav poate fi
afirmata nuami prin evidentiere in focare infectioase inchise, monobacteriene, putand fi exclus
transferul de exogen de gene; proba se face prin demonstrarea:

a) mentinerii caracterului de rezistenta in multe generatii in absenta antibioticului;

b) a lipsei plasmidelor.

Mutatia ca mecanism de dobandire a rezistentei la antibiotice este probata pentru M. tuberculosis fata
de toate drogurile antituberculoase. La bacteriile Gram-negative si Gram-pozitive la care este
cunoscuta sau probabila prezenta plasmidelor, demonstrarea rezistentei prin mutatie si mai ales
diferentierea de recombinari, este mai dificila.

15
Frecventa mutatiei

Rata de aparitie a mutatiei variaza pentru fiecare bacterie si antibiotic:

- La M. tuberculosis, rata mutatiei este de 1/100.000 pentru HIN si de 1/1.000.000.000 sau chiar mai
mica pentru streptomicina;

- la N. gonorrhoeae mutatia de rezistenta apare cu frecventa mare la sulfamide si cu frecventa mica la


penicilina;

- la S. pyogenes apare cu frecventa mare la sulfamide si nu a aparut pana acum pe cale naturala la
penicilina.

O data aparut un mutant de rezistenta viabil, rata lui in vitro ramane fixa in generatii
succesive, formand o clona rezistenta in sanul populatiei sensibile. In general, rata mutatiei variaza
intre 0.00001 si 0.00000000001; ea poate fi crescuta experimental prin factori mutageni. Reiese ca
evidentierea lor este posibila cu cat populatia testata este mai mare; ca in tuberculoza cavitara in care
bacilii eliminati intr-o zi prin sputa pot fi, in medie intre 11.390.625 si 64.000.000. Rata mutatiilor este
usor de stabilit datorita existentei factorului de selectie - antibioticul - care poate fi inclus in mediul de
cultura.

2.3 Mecanisme biochimice

Variatiile de frecventa a mutatiilor de rezistenta depind si de mecanismul biochimic prin care


induc rezistenta: la E. Coli K12 mutantii cu rezistenta enzimatica apar cu frecventa de 0.00001
comparativ cu numai 0.00000000001 pentru cei prin alterarea tintei ribozomale. Aceasta rata scazuta
s-ar explica prin natura pleomorfa a mutatiei; modificarile structurale ale tintei ribozomale a
antibioticului altereaza uneori si alte functii, adesea vitale pentru celula; ca urmare din aceste tipuri de
mutatii sunt letale. Prezenta intr-o populatie bacteriana infectata de 0.000001 - 0.0000001 mutanti cu
rezistenta la nivel inalt se asociaza frecvent cu insuccese terapeutice, recaderi ale infectiei. De aceea, in
infectii date de bacterii ca M. tuberculosis la care rezistenta sunt numai mutatii, asociatiile de
antibiotice sunt indicate in terapie, mai ales a acelora cu mecanisme diferite de actiune antibacteriana,
sansa aparitiei unor mutatii duble scazand considerabil. Calculul este teoretic, deoarece atat vitalitatea
mai redusa a unor mutanti cat si posibilitatea revers-mutatie pot modifica acest calcul.

16
Ritmul mutatiei si nivelul de rezistenta la antibiotic

Rezistenta mutationala fata de un antibiotic poate fi joasa sau inalta: ambele pot aparea prin
mutatie unica sau o succesiune de mutatii.

Mutatia unica (one step) induce fie nivele inalte de rezistenta (cresteri de 100x>1000x ale
CMI) fie joase (cresteri mici ale CMI), diferente datorate mecanismelor biochimice diferite care le
induc. Nivelele joase de rezistenta pot aparea prin mutatii care determina unele modificari de
permeabilitate ale bacteriei ce influenteaza numai indirect actiunea drogului, rezultand cresteri mici ale
rezistentei; asa s-ar explica si originea unor tulpini pe pneumoccoc rezistent la penicilina, raportate ca
fenomene inca izolate pe glob. Mutatii cu grade mai joase decat nivelul de eficienta terapeutica al
antibioticului pot fi selectati numai prin administrarile de doze mici, ineficiente terapeutic, dar
periculoase prin acest efect. Nivele inalte de rezistenta prin mutatie unica apar "peste noapte" in vitro
si in vivo: au fost evidentiate la E. coli si N. meningitides fata de rifampicina sau la S. aureus fata de
acid fusidic. Frecventa mare de aparitie rapida - one step - a unor nivele inalte de rezistenta la
novobiocina, acid fusidic, rifampicina, in infectii cornice ale tractului urinar, sunt surse de reusita si le-
au limitat folosirea in terapie unica. Mutatii care determina cresterea cantitativa a cantitatii de  β-
lactamaza la Enterobacter pot induce rezistenta inalta; mutatii care altereaza tinta ribozomala a
actiunii streptomicinei au ca rezultat rezistenta totala (cresteri de 1000x a CMI). Astfel de mutanti sunt
intotdeauna selectati de dozele terapeutice ale antibioticelor.

Mutatii succesive cu cresteri mici ale rezistentei pentru fiecare, pot duce treptat la instalarea
rezistentei la nivel inalt. Cresterile mari sunt greu de remarcat la un singur bolnav, iar daca sunt
inregistrate aceasta se intampla dupa un numar de zile de terapie. Fata de cele mai multe antibiotice,
rezistenta inalta apare evidenta numai in ani de la introducerea lor in terapie; se constata la un moment
dat ca tot mai multe tulpini sunt deja rezistente; este cazul la tetraciclina, vancomicina, antibiotice
polipeptidice; a cresterii treptate a rezistentei neenzimatice a gonococului la penicilina astfel:

- in 1942 cand penicilina era introdusa in terapia gonoreei, gonococii erau sensibili la 0,002-
0,005 U/ml;

- in 1955, CMI pentru majoritatea tulpinilor era de 0,03 U/ml;

- in 1975, pentru cele mai multe tulpini CMI varia intre 0,1-0,6 U/ml si aparusera tulpini cu
CMI=1-2 si chiar 3,6 U/ml.

17
Uneori rezistenta ramane indelung moderata: nu s-au intalnit mutanti de E. coli cu nivel inalt de
rezistenta la nolicin si kanamicina.

Expresia fenotipica a rezistentei prin mutatie.

Mutatiile de rezistenta la antibiotice fiind de obicei punctiforme, mecanismele biochimice care le


corespund se exprima cel mai adesea prin monorezistenta; uneori se manifesta ca rezistenta incrucisata
fata de antibiotice cu structuri similare.

Revers-mutatia.

Mutatia spontana de la rezistenta la sensibilitate este biologic posibila si a fost demonstrata in populatii
de bacterii rezistente. Rata aparitiei lor este mai greu de definit, deoarece selectia poate fi numai
indirect realizata; astfel de mutatii sunt usor eliminate la intalnirea cu antibioticul, fiind fara
semnificatie medicala.

Recombinari cromozomiale ca mecanisme de rezistenta la antibiotic

ADN-cromozomal strain poate patrunde intr-o bacterie prin mecanismele de transformare,


transductie si conjugare; integrarea in cromozomul bacteriilor primitoare are loc prin procesele de
recombinare limitate de gradul de omologie intre ADN-ul gazda si ADN-ul strain. Aceste mecanisme
permit patrunderi si integrare de secvente nucleotidice mai mari, fiind posibila formarea de
recombinatii care manifesta dintr-odata multirezistenta. Bine demonstrate experimental si folosite
pentru a introduce markeri de la rezistenta la antibiotice, aceste mecanisme par sa opereze mai rar in
natura, frecventa aparitiei lor fiind limitata de faptul ca au loc numai intre bacterii inrudite. Este
cunoscut faptul ca mucoasele si continutul intestinal ofera conditii optime pentru mecanismele de
recombinare, dar proba aparitiei lor este greu de facut.

Plasmidele

Sunt elemente genetice extracromosomale ce pot codifica, intre altele, rezistenta multipla la
antibiotice si, de asemenea, propriul lor transfer ceea ce le asigura raspandirea in populatiile
bacteriene. In afara plasmidelor, genele de rezistenta la antibiotice pot fi localizate la nivelul
transpozonolor. Acestia sunt secvente de ADN ce isi pot schimba pozitia de pe o plasmida pe alta sau
pe cromosom, astfel ca genele care se afla in asemenea secvente sunt rapid diseminate printre bacterii.
De asemenea, transpozomii pot modifica functiile genelor in preajma carora se afla, activandu-le sau
din contra, inhibandu-le. De obicei transpozomii identificati la multe bacterii pot determina rezistenta

18
multipla la antibiotice, acest caracter putand fi pierdut sau dobandit in urma unui fenomen de
transpozitie.

Selectia variantelor rezistentei la antibiotice

Mecanismele de rezistenta la antibiotice implica cel putin patru strategii prin care se
realizeaza neutralizarea actiunii toxice a substantelor respective:

1. distrugerea enzimatica a antibioticului asa cum este cazul penicilinei, cloramfenicolului si a


antibioticelor aminoglicozidice;

2. blocarea accesului antibioticelor la tintele lor specifice din interiorul celulei bacteriene prin alterari
ale permeabilitatii celulare;

3. modificarea situsului tinta al antibioticelor asa cum se intampla in cazul rezistentei la eritromicina
cand are loc metilarea ARNr astfel ca antibioticul este ineficient;

4. substituirea componentelor sensibile la antibiotice cu altele ce au aceeasi functie dar sunt rezistente
la antibioticul respectiv. Asa este cazul rezistentei la sulfamide care blocheaza de obicei enizmele ce
participa la sinteza acidului folic in celulele sensibile. Mecanismul genetic dominant de dobandire a
rezistentei la antibiotic la bacteriile Gram-pozitive, mai ales la stafilococi, si mult mai raspandit la
bacteriile Gram-negative, la care a si fost descoperit este transferul de plasmide rezistente, numite si
factori de transfer ai rezistentei multiple la antibiotice. Nu au fost gasite plasmide la bacilii acido-
alcoolo-rezistenti. "Factorul de transfer al rezistentei multiple la antibiotice" a fost descoperit in
Japonia la bacilii Gram-negativi. In 1959, Akiba a sugerat posibilitatea transferului rezistentei multiple
de la E. coli, prezent in flora normala a intestinului, la Shigella. Aceasta ipoteza a fost confirmata in
vitro prin contact celula-celula de Ochiai si Akiba (1960) si apoi in intestin la voluntari. Plasmidele de
rezistenta sunt gasite in toata lumea, la multe specii. Watanbe, Fukasawa (1963) si Mitshuashi au
demonstrat ca factorul responsabil de transferul multirezistentei este un episom-ADN existand
autonom in citoplasma bacteriei care poate fi integrat in cromozom, transferabil de la bacterie la
bacterie cel mai adesea prin conjugare. Novick le-a dat numele de plasmide de rezistenta. Plasmide cu
proprietati moleculare diferite pot avea spectre identice de rezistenta la antibiotice. Existenta
plasmidelor cu alte functii sau cu functii necunoscute a fost demonstrate la unele bacterii anterior
aparitiei plasmidelor de rezistenta.

19
Structura plasmidelor de rezistenta

Plasmidele de rezistenta sunt molecule de ADN dublu spiralat, formand anse inchise
covalent, existand independent de citoplasma bacteriei. Au sistem propriu de replicare putand exista in
mai multe copii. Poseda unul sau mai multi determinanti ai rezistentei, completand informatia genetica
la bacterii. Se pot transfera vertical, la descendenti, ceea ce se numeste si "ereditate
extracromozomala" si orizontal, de la specie la specie; pot fi pierdute de bacterii. Ca si ADN-
cromozomal, ADN-plasmadic codifica sinteze de proteine prin intermediul ARNm. Exista plasmide
conjugative si neconjugative. Plasmidele conjugative sunt mari, alcatuite din 3 secvente nucleotidice
cointegrate cu functii diferite. Uneori in plasmoid pot fi integrati unul sau mai multe elemente
translocabile. Numarul determinantilor de rezistenta variaza la un plasmoid de la 1 pana la 8-10.
Tinand seama de rezistenta incrucisata, unele plasmide induc rezistenta la 10-15 sau la toate
antibioticele. Replicarea plasmidelor mari au loc mai lent incat ele exista in una-doua copii per
cromozom in bacteria-gazda. Plasmidele neconjugative sunt molecule ADN circulare, mici ca
dimensiuni, cele mai mici pot fi reduse la secventele care asigura functia de autoreplicare. In general,
codifica rezistenta la una-doua antibiotice, rara mai mult. Replicarea lor este mai rapida per generatie,
incat se confectioneaza usor copii multiple.

2.4 Rezistenta la antibiotice mediate de gene cromosomiale

Rezistenta bacteriilor la antibiotice este, dupa toate probabilitatile, caracteristica ce este


consecinta directa a descoperirii si utilizarii antibioticelor. Astfel au fot descoperiti spori de Bacillus
sp. producator de penicilaza atasati la speciile de plante conservate in herbar colectate din sec. XVII.
De asemenea,s-a izolat o tulpina de E. coli pastrata in colectie din 1930 care prezinta rezistenta la
streptomicina. O explicatie a acestui fenomen ar putea fi aceea ca antibioticele sunt produse naturale
care se pot acumula in mediu in cantitate suficient de mare pentru a actiona ca factori selectivi. Totusi,
tulpinile de bacterii rezistente la antibiotice erau rare inainte de introducerea in practica a
antibioticelor. Se cunoaste ca rezistenta bacteriilor la antibiotice poate fi determinata atat de gene
cromosomale cat si plasmidiale, pentru stabilirea localizarii fiind elaborate mai multe metode:

- evidentierea posibilitatii pierderii rezistentei prin tratarea bacteriilor cu agenti de eliminare;

- detectarea sau nu a moleculelor de ADN plasmidial;

- studiul posibilitatii de transfer a rezistentei;

20
- stabilirea hartilor genetice cromosomale si plasmidiale.

Rezistenta data de mutatii ale genelor cromozomale se realizeaza prin diferite mecanisme biochimice
si este mai putin raspandita in natura comparativ cu cea plasmidiala. In plus, o distinctie neta intre
rezistenta codificata de gene plasmidiale sau cromozomale nu se poate realiza datorita existentei
elementelor transpozabile care se pot integra fie in cromozom fie in plasmide si care au fost
identificate in diferite tulpini bacteriene izolate din produse patologice. Exista o serie de diferente intre
antibiotice in ceea ce priveste tipul de rezistenta pe care il determina - cromosomala sau plasmidiala.
Daca in cazul  β-lactamilor, aminoglicozidelor, tetraciclinei sau cloramfenicolului rezistenta poate fi
determinata atat de gene plasmidiale cat si cromosomale, in cazul altor antibiotice cum sunt
nitrofuranii, novobiocina, rifampicina sau quinolonele se pare ca rezistenta este datorata exclusiv unor
mutatii cromozomale. In cazul antibioticelor  β-lactamice rezistenta cromozomala implica in cele mai
multe cazuri, modificarea permeabilitatii celulare pentru antibiotic, alterarea tintei de care se leaga sau
modificari in sinteza enzimelor ce inactiveaza antibioticul. Mecanismele de rezistenta par a fi aceleasi
si pentru alte antibiotice, variatiile aparand in functie de natura antibioticului.

Modificarea permeabilitatii celulare

Pentru a ajunge la tinta,  β-lactamii trebuie sa strabata, in cazul bacteriilor Gram negative
membrana externa bogata in lipide. Aceasta patrundere este posibila datorita unor canale
transmembranare alcatuite din proteine denumite porine. Numarul, proprietatile acestor porine variaza
la diferite microorganisme. La E. coli sunt produse de obicei doua porine, OmpF si OmpC,
antibioticele patrunzand mai usor prin canalele alcatuite din OmpF. Tulpinile bacteriene cu mutatii la
nivelul genei OmpF sau la nivelul genelor reglatoare prezinta o rezistenta mai mare la ampicilina si
unele cefalosporine care se pare ca sunt antibiotice a caror patrundere este cea mai dependenta de
canalul OmpF. In cazul tulpinilor de P. aeruginosa rezistente la  β-lactami s-a evidentiat faptul ca
mutantele cu permeabilitate celulara modificata prezinta variatii in ceea ce priveste compozitia in
lipopolizaharide a membranei externe.

Modificarea proteinelor de legare a penicilinei

Se cunoaste ca pentru a afecta celulele bacteriene,  β-lactamii trebuie sa se lege in mod


specific de unele proteine aflate la nivelul membranei plasmatice. Alterarea naturala a PBP reprezinta
cauza principala a rezistentei intrinseci a unor isolate clinice dar ea poate fi produsa si prin mutatii "in
vitro". De exemplu rezistenta unor tulpini de E. coli la unele antibiotice  β-lactamice cu o mare
afinitate pentru PBP2 se poate produce in urma unor mutatii ce afecteaza aceasta afinitate de legare la

21
tinta. Asemenea mutante sunt rezistente in acelasi timp la imipenem, aceste datorandu-se in special
mutatiilor in genel cromosomale crp ce codifica proteina receptor pentru AMPc si cy ace codifica
pentru adenilat ciclaza. Deoarece cele mai multe antibiotice  β-lactamice isi manifesta efectul
bactericid prin inactivarea PBP rezistenta la aceste antibiotice nu se realizeaza intr-o singura etapa ci
presupune mai multe. Spre exemplu, la toate tulpinile de S. aureus rezistente la meticilina s-a
identificat o gena comosomala mec ce codifica pentru PBP2A; aceste tulpini prezinta rezistenta la
actiunea antibioticelor  β-lactamice dar faptul ca s-a abservat o mare varietate a gradului de rezistenta
presupune ca aceasta este controlata de un set suplimentar de gene. La numeroase isolate clinice de
Haemophilus influenzae, S. aureus, Neisseria gonorrhhoeae, Streptococcus pneumoniae rezistenta la
β-lactami este de asemenea asociata cu modificari ale PBP, ea fiind determinate de numerosi loci
cromosomali. In cazul tulpinilor de N. gonorrhhoeae rezistenta la penicilina este determinata de gene
cromosomale care determina modificari atat ale PBP1 si PBP2 cat si o reducere a permeabilitatii
celulare. Rezistenta se realizeaza in mai multe trepte; tulpinile cu o rezistenta mai scazuta prezinta
mutatii la nivelul genei penA in timp ce o rezistenta maxima presupune interventia a inca 4 gene: mtr,
penB, pem si tem.

Prevenirea rezistentei microorganismelor la antibiotic

Mutatia nu poate fi prevenita dar selectia produsilor poate fi. Prin mentinerea antibioticelor
la un nivel suficient de inalt, cand fiecare mutatie succesiva contribuie la cresteri ale rezistentei,
treptele precoce sunt abolite. Terapia combinata este o solutie pentru prevenirea rezistentei. In timp
plasmidele pot capata gene aditionale de rezistenta. Reactivii care inlatura plasmidele din bacterii au
rezultate favorabile in culturi, dar nu par eficienti in practica clinica. Rezultatele pozitive in domeniul
prevenirii rezistentei par sa se limiteze doar la dezvoltarea continua a agentilor antimicrobieni noi in
industria farmaceutica. Un rol important il are si evitarea folosirii nejustificate a antibioticelor
pentru infectii minore sau pentru acelea in care antibioticele sunt ineficace.

22
CAPITOLUL III

Metode de punere in evidenta a microorganismelor

3.1 Obiectivele lucrarii

Aceasta lucrare analizeaza si compara rezultatele obtinute in urma efectuarii uroculturilor cu


antibiograma pentru germeni izolati din urina bolnavilor sectiilor Centrului Medical Mediurg Ploiesti
in anul 2016.

Studiul a avut urmatoarele obiective specifice:

1. Determinarea nivelului rezistentei la antibiotice a germenilor izolati in 2016 cu estimarea ratei


modificarii rezistentei germenilor la antibiotice pe perioada studiului;

2. Identificarea unor situatii de "alerta epidemiologica" - cresterea brusca a nivelului rezistentei unui
anumit germen intr-o regiune - care impune evaluarea cauzelor si masuri pentru indepartarea lor;

3. Definirea rezistentei microbiene pentru principalele binoame microorganism/antibiotic si


surprinderea eventualelor modificari in raport cu studiul retrospectiv;

4. Identificarea problemelor de rezistenta la antibiotice a microorganismelor testate;

5. Prezentarea investigatiilor de laborator efectuate si caracteristicile la pacientii cu infectii urinare;

6. Stabilirea ponderii infectiilor urinare la pacientii suspectati;

7. Stabilirea influentei clinicii si a sexului asupra frecventei infectiilor tractului urinar;

8. Stabilirea etiologiei in infectiile urinare;

9. Studiul sensibilitatii si rezistentei microorganismelor implicate in infectiile diagnosticate;

23
3.2 Materiale si metode

DESCRIEREA METODELOR FOLOSITE

Scopul studiului retrospectiv efectuat a constatat in analiza rezistentei la substante


antimicrobiene a germenilor implicati in producerea infectiilor de tract urinar ( ITU ).

Pentru realizarea obiectivelor mentionate anterior au fost izolate in urina pacientilor internati in
Centrul Medical Mediurg Ploiesti diferite tulpini de microorganisme.

METODE DE LUCRU

Metodele de lucru folosite la realizarea acestui proiect sunt:

- consemnarea datelor si intocmirea unui tabel care contine pentru fiecare bolnav urmatoarele campuri:
sex, sectie, numarul foii de observatie, microorganism izolat, numar de tulpini/ml si antibiograma.

- consultarea foii de observatie acolo unde a fost nevoie de date suplimentare;

- observarea si participarea la obtinerea de sedimente urinare si examinare microscopica a urinilor, in


cazul suspicionarii unor infectii micobacteriene;

- identificarea tulpinilor implicate patogenic pe baza caracterelor: morfologice, de cultura, biochimice,


antigenice, de patogenitate.

- realizarea antibiogramei;

- cultivarea pe medii de cultura a produsului patologic pentru obtinerea de colonii izolate si ulterior a
unei culturi pure in vederea identificarii microorgansimului.

24
Medii de cultura

Pentru izolarea in vitro a germenilor patogeni au fost utilizate urmatoarele medii de cultura:

mediul Agar - Sange;

- Mediul este utilizat pentru izolarea, identificarea si intretinerea bacteriilor saprofite si patogene cu
urmatoarea formula:

Peptona peptica...10.0 g

Extract de carne...10.0 g

Clorura de sodiu...5.0 g

Agar bacteriologic...15.0 g

Sange berbec defibrinat 5%...15 ml

PH = 7,4 +/-0.2

mediul Mac Conkey;

- Mediu selectiv pentru enterobacterii, care evidentiaza si speciile lactozo-fermentative, cu urmatoarea


formula:

Peptona...20.0 g

Lactoza...10.0 g

Sarurile biliare...5.0 g

Na Cl...5.0 g

Rosu neutru...30.0 mg

Cristal violet...1.0 mg

Agar...12 g

A.D...1000.0 g

PH final=7,4+/-0.2

Sterilizare prin autoclavare la 0.5 atm. 30 min

25
mediul Drigalsky Lactose Agar

- Mediu de diagnostic diferential, care permite diferentierea lactozo-fermentativilor (formeaza colonii


de culoare galbena) de lactozo-nefermentativi (formeaza colonii de culoare verde-albastra). Are
urmatoare formula:

Peptona...15.0 g

Extract de carne...3.0 g

Extract de drojdii...3.0 g

Tiosulfat de sodiu...1.0 g

Lactoza...15.0 g

Albastru de bromtimol...0.08 g

Agar...11.0 g

A.D...1000.0 g

mediul Levine

- Este recomandat pentru izolarea si diferentierea speciilor de bacili Gram-negativi vienterici, care are
compozitia g/l:

Peptona...10.0 g

Lactoza...10.0 g

Fosfat dipotasic...2.0 g

Eozina Y...0.4 g

Albastru de metilen...65.0 mg

Agar...15.0 g

A.D...1000.0 ML

PH final= 7.1 +/- 0.

26
Mijloace paraclinice folosite la punerea in evidenta a prezentei unor tulpini
patogene:

Aici notam: testele screening:

- frotiu realizat din urina proaspata, necentrifugata, colorata cu Gram sau albastru de metilen;

- numarul bacteriilor din urina proaspata necentrifugata, calculate in celula de numarat elemente
figurate;

- stiks-uri, folosind metodele enzimatice;

Testele de diagnostic:

- examinarea microscopica a urinii centrifugate in preparat proaspat intre lama si lamela;

- urocultura, singura metoda care are valoare in practica fiind urocultura cantitativa.

Teste biochimice:

Identificarea de gen si/sau de specie a acestor germeni s-a bazat pe utilizarea unor teste biochimice
clasice:

TSI, MIU, SIM, testul cu citrat, testul fenilalanindezaminazei, a galeriilor API si a sistemului
automatizat VITEK 2 COMPACT. Dintre acestea exemplificam:

T.S.I - compozitie:

- Peptona din caseina...15.0 g

- Peptona pancreatica din carne...5.0 g

- Extract din carne...3 g

- Extract din drojdie...3.0 g

- Lactoza...10.0 g

- Glucoza...10.0 g

- Sulfat feros...0.50 g

- Tiosulfat de sodiu...0.30 g

27
- Rosu fenol...0.0024 g

- Clorura de sodiu...5.0 g

- Agar bacteriologic...12.0 g

- PH=7.2 +/- 0.2

M.I.L.F. - Compozitie:

- Extract de drojdie...3.0 g

- L-lizina...5.0 g

- L-fenilalanina...2.0 g

- L-triptofan...0.05 g

- Glucoza...0.75 g

- Clorura de sodiu...5.0 g

- Bromcresol purpur...0.016 g

- Agar...3.0 g

- PH= 6.8 +/- 0.2

3.3 Descrierea mijloacelor paraclinice de punere in evidenta a


microorganismelor

Examenul de urina ( sumar, 24 ore) aduce date valoroase cu privire la prezenta infectiilor urinare:
hipo, izo sau subizostenurie, proteinurie, leucociturie, piurie, cilindri leucocitari si chiar hematurie.

Examenul macroscopic al urinii - consta in determinarea culorii si a mirosului. Urina rosiatica


poate sugera o hematurie iar examenul microscopic poate confirma acest lucru. Un microb mai rar
intalnit in infectiile urinare, Sersatia Marcescens, poate determina uneori sindromul "red diaper" si
culoarea urinii atrage atentia asupra acestui germen care produce inconstant un pigment
rosiaticprodigiozina. Urina tulbure este de regula expresia piuriei, de stiut este insa si faptul ca
eliminari masive de urat amorf pot modifica culoarea urinii. Mirosul este rareori relevant pentru o

28
infectie, dar de exemplu mirosul amoniacal poate trada o infectie cu germeni ureazici in timp ce
mirosul greu - fetid este expresia unei infectii cu coliformi.

Examenul chimic - reprezentat de stabilirea pH - ului urinar este important deoarece pentru
dezvoltarea microorganismelor pH - ul optim este acid ( colibacili, unii streptococi) iar pentru altii:
Proteus, Piocianic, mediul trebuie sa fie alcalin. Asa cum si actiunea unor antibiotice este favorizata
de mediul alcalin, iar a altora, mediul acid.

Examenul microscopic al sedimentului urinar - se obtine punand 5-8 ml de urina intr-un


tub de centrifuga perfect curat si steril. Perfecta curatenie este indispensabila deoarece in fundul
tuburilor de centrifuga, folosite de mai multe ori, se pot gasi germeni care desi omorati la sterilizare
raman vizibili la examenul microscopic, putand constitui o grava sursa de eroare atat in privinta
germenilor Gram-pozitivi si Gram-negativi cat si a celor acid-alcoolo-rezistenti, proveniti eventual de
la robinetele de apa calda. Dupa 10 minute de centrifugare la 1000-2000 turatii/minut se scurge brusc
supranatantul si dupa o omogenizare prin agitatie usoara se examineaza la microscop intre lama si
lamela. Pentru cercetarea bacililor acido-alcoolo-rezistenti se va centrifuga un volum mai mare de
urina proaspata, timp mai indelungat la turatie mare. Pe langa preparatul proaspat se fac totdeauna 4
frotiuri care vor fi colorate astfel: unul cu albastru de metilen, altul Gram, altul cu Zich, iar ultimul este
proaspat ca rezerva. Preparatele sunt examinate cu marire mica, medie si apoi cu obiectivul de imersie,
pentru studiul caracterelor morfofunctionale ale celulelor, cilindrilor sau microorganismelor aflate in
urina. Acest examen permite decelarea rapida calitativa si semnificativa a unor germeni al caror aspect
poate orienta un tratament rational evidentiind eventualii gonococi si bacili Koch a caror cultivare este
dificila si dureaza mult.

29
Figura 3.1 Strip fara infectie urinara Figura 3.2 Strip cu infectie urinara

Detectarea bacteriuriei

Orientativ se poate spune ca urina este infectata cand apare aspectul tulbure-opalescent la
emisie aspect care nu dispare la incalzire sau dupa adaos de acid acetic, insa examenele care spun cu
certitudine ce tulpina s-a dezvoltat in urina sunt examenul microscopic direct si urocultura. Examenul
microscopic direct e o metoda ieftina si destul de eficienta in detectarea bacteriuriei semnificative si a
piuriei din urina necentrifugata. O picatura din urina e plasat pe o lama si lasata sa se usuce, fara sa se
imprastie. Lama e apoi fixata si colorata Gram. S-a mai recomandat de catre unii autori amestecarea
urinii, fara a produce spuma, apoi recoltarea cu ajutorul unei anse calibrate cu diametrul = 5mm, care
se introduce vertical in urina, a unei picaturi de urina ce se depunde pe o lama portobiect fara a o
intinde. Picatura se acopera cu o lamela si se examineaza la microscopul cu imersie. Se mai pot intinde
picaturi de urina corespunzator ariei unui cerc cu diametrul = 5mm, se lasa sa se usuce si se coloreaza
Gram, se examineaza minim 10 campuri. Prezenta uneia sau mai multor celule bacteriene si a uneia
sau mai multor leucocite pe camp e corelata cu mai mult de 100.000 germeni/ml urina si respectiv
piurie. O coloratie Gram pozitiva de asemenea dovedeste morfologia specifica coloratiei Gram care
poate fi folosita pentru selectia initiala a terapiei antimicrobiene. De notat ca un numar > de 3 - 5

30
leucocite/camp indica o leucociturie care in aproximativ 50 % coincide cu o infectie de tract urinar. O
coloratie Gram pozitiva si o urocultura negativa atentioneaza asupra prezentei unui microorgansim cu
o crestere dificila, a unui anaerob sau a unei flore amestecate, acest fapt cere repetarea probei.

UROCULTURA

Urocultura - metoda prin care este efectuata analiza urinii in scopul identificarii
bacteriilor si ciupercilor existente in aceasta.

Metoda cea mai des intalnita pentru obtinerea esantionului de urina, este recoltarea sterila din
mijlocul jetului urinar. In 1956, Kass introduce in practica urocultura cantitativa si termenul de
bacteriurie semnificativa, dat de numaratoarea de 105 colonii de germeni pe mJ. Numaratori intre
10000 si 100000 se considera ca reprezinta cazuri dubioase si necesita repetarea probelor, iar valori
sub 10000 sunt date de suprainfectii. Ulterior prin anii '70 s-a gasit ca infectiile persistente si cronice
pot avea un numar redus de germeni si deci, numaratori de 103 sau numai estimari calitative, pot
induce deciderea unui tratament antiinfectios. Rezulta ca o bacteriurie semnificativa in conditii de
recoltare corecta, reprezinta cu certitudine infectie, ca valori inferioare acesteia nu pot s-o excluda intr-
un context de date clinice si paraclinice sugestive si absenta unei bacteriurii semnificative, in sensul
clasic al cuvantului, nu exclude diagnosticul si inceperea tratamentului. Orice microorganism prezent
in urina se dezvolta sub forma de colonii circulare mici, in decurs de 24-48 ore. Marimea, forma si
culoarea coloniilor ajuta la identificarea bacteriei, iar numarul coloniilor sugereaza numarul de bacterii
prezente in proba de urina recoltata. Un medic sau un asistent de laborator observa si numara coloniile
aparute. Daca proba de urina a fost recoltata corect, singurele colonii care vor creste vor fi cele din
bacteria ce a determinat infectia urinara. Uneori, pot aparea culturi din bacterii diferite, in cazul
infectiilor urinare plurimicrobiene, dar cel mai frecvent datorita contaminarii probei cu flora
microbiana cutanata la recoltare.

Laborantul va preleva cate o colonie bacteriana si o va prelucra si colora cu coloratie Gram,


in scopul examinarii microscopice. Bacteriile prezinta culori si forme diferite. Escherichia coli care
cauzeaza majoritatea ITU apare la microscop sub forma de bacili riz Gram-negativi. Lactobacillus,
care contamineaza frecvent probele de urina, apare la microscop sub forma de bacili Gram-pozitivi de
culoare violet. Unele bacterii, cum este Lactobacillus sunt usor de evidentiat pentru un asistent de
laborator experimentat si nu necesita investigatii suplimentare. Alte bacterii cum sunt bacilii Gram-

31
negativi, reprezinta clase diferite si necesita testari suplimentare pentru identificarea lor. Daca in
decurs de 1-2 zile de incubatie nu creste nici o colonie pe mediul agar, urocultura este considerata
negativa. In cazul prezentei unuia sau mai multor agenti patogeni, sunt necesare testari suplimentare.
Testele biochimice sunt necesare pentru identificarea bacteriilor prezente, iar testarea sensibilitatii si
rezistentei la anumite antibiotice permite administrarea celui mai eficient antibiotic.

Realizarea uroculturii: Reguli de procedura. Actiuni si masuri preventive

Proba de urina pentru urocultura se recolteaza din jetul mijlociu al urinei de dimineata. Prima
mictiune a zilei este preferata deoarece numarul bacteriilor este mai mare.

- Se folosesc numai probe proaspat recoltate, in general toate probele destinate examinarii
microbiologice/bacteriene trebuie recoltate cu maxim 3-4 ore inainte de insamantare;

- Se folosec numai probe recoltate in recipiente sterile;

- Nu se folosesc medii de cultura dupa data expirarii;

- Nu se folosesc placi cu medii pe care se observa colonii bacteriene crescute;

- Placile cu medii se pastreaza la o temperatura de 4-8C si inainte de utilizare se pastreaza 1-2 h la


temperatura camerei.

- Trebuie respectate masurile de protectie a personalului in manipularea probelor existand riscul


infectarii cu germeni patogeni.

Reguli de procedura privind modul de lucru

A) Principiul metodei. O cantitate standard de urina este insamantata cu ansa calibrata pe o placa cu
mediul Agar-sange si pe mediu lactozat

B) Numarul de colonii dezvoltate si numarate pe tipuri de colonii este proportional cu concentratia de


UFC din suspensia bacteriana si se raporteaza la 1 ml urina.

C) Prezenta a mai mult de 15 celule malpighiene/dl sediment urinar, mai ales in asociatie cu levuri
semnifica contaminare vaginala si se repeta recoltarea.

D) Administrarea de antibiotice inainte de recoltarea urinii poate conduce la rezultate fals negative.

32
Reactivi

Medii de cultura agarizate:

- Mediu Agar-sange

- Mediu Mac-Conkey

- Mediu Levine

- Mediu Drigalski

Echipamente de masurare si incercare:

- Hota cu flux laminar cu IU;

- Termostat eletermostat electric cu IU;

- Autoclav tip S4 cu IU;

- Placi Petri cu diametrul de 90 mm cu medii de cultura AS si MC;

- Anse calibrate de unica folosinta de 0.01 ml sau de 0.001 ml sterile;

- Manusi de protectie;

Mod de lucru:

- Se scrie numarul de identificare al probei pe spatele placii de mediu;

- Se omogenizeaza suspensia microbiana/urina cu grija, prin agitatie usoara;

- Se imerseaza ansa calibrata imediat sub nivelul fluidului si se imprima cateva miscari pe vertical, in
sus si in jos;

- Se retrage ansa din fluid in pozitie verticala, cu viteza moderata a miscarii;

- Se descarca absa in striu pe unul din diametrele placii cu mediu agarizat si se epuizeaza imediat pe
toata suprafata placii in striuri stranse, perpendicular pe striul de descarcare;

- Se roteste placa la 90° si se reia epizare intr-o a doua serie de striuri, perpendiculare pe prima;

- Se introduc placite insamantate in termostat la 37° C si se incubeaza 24 h.

33
Exprimarea rezultatelor:

Prezenta bacteriilor este evidentiata, dupa incubare, de coloniile dezvoltate pe suprafata mediului de
cultura agarizat. Numarul coloniilor dezvoltate indica concentratia de UFC in proba de urina, deoarece
este rezultatul multiplicarii unei singure celule bacteriene. Placa cu mediul Agar-Sange favorizeaza
dezvoltarea unei game mai largi de bacterii, in special cele Gram pozitive.

Placa ce mediul Mac-Conkey evita impasul creat eventual prin invazia cu Proteus a placii cu AS si
permite diferentiei intre coloniile bacteriilor Gram-negativi, importante pentru aprecierea contaminarii.
Se numara coloniile dezvoltate, diferentiate, pe tipuri si se calculeaza bacteriuria cu formula:

X=NxD

X = numarul de UFC/ml urina

N = numarul coloniilor pe placa;

D = factor de multiplicare pentru raportare la 1 ml urina, respectiv in cazul utilizarii ansei de 0.01 ml si
1000 in cazul utilizarii ansei de 0.001 ml. Pentru diagnosticul de infectie de tract urinar, in unele
cazuri, poate fi semnificativ si un rezultat mai mic sau egal cu 100 UFC/ml. Cand sunt banuiti germeni
cu crestere lenta , placile insamantate se incubeaza 48 h sau chiar 72 h, citindu-se la fieacare 24 h.

Indicatiile uroculturii:

Urocultura este recomandata in scopul diagnosticarii unei infectii de tract urinar si stabilirii
unui tratament cu antibiotic eficient. Infectiile urinare sunt mult mai frecvente in cazul femeilor,
datorita lungimii mici a uretrei si vecinitatii acesteia cu regiunea anala. In cazul femeilor tinere
simptomatice cu infectii de tract urinar inferior necomplicate, terapia antibiotica poate fi prescrisa fara
efectuarea uroculturii. Escherichia coli este principala cauza a infectiilor de tract urinar inferior.
Bacteria este sensibila la o varietate de antibiotice, cum sunt biseptolul, ciprofloxacinul si
nitrofurantoinul. La femei, cistita necomplicata este cauzata de un numar mic de agenti patogeni. Peste
90% din cazuri sunt produse de Staphylococcus saprophyticus coagulao-negativ, iar 5% de
enterobacteriacee si enterococi. In plus susceptibilitatea la antibiotice a acestora este predictibila.
Aproape o treime dintre uropatogeniau rezistenta la ampicilina si sulfonamide, dar majoritatea este
sensibila la biseptol si fluorochinolone. In cazul suspiciunii de infectie urinara complicata sau lipsa
raspunsului la terapie, se recomanda efectuarea uroculturii. Femeile insarcinate asimptomatice trebuie
testate pentru pentru prezenta bacteriilor in urina, deoarece o infectie urinara poate afecta dezvoltarea
normala a fatului. Urocultura poate fi indicata si in cazul unor rezultate anormale la sumarul de urina.

34
Urocultura trebuie repetata dupa efectuarea unui tratament cu antibiotic pentru o infectie urinara, in
scopul evaluarii vindecarii infectiei. In cazul infectiilor urinare recurente, urocultura si antibiograma
trebuie efectuate la fiecare episod infectios. Pentru pacienti cu infectii frecvente de tract urinar,
selectarea antibioticelor pentru tratament trebuie facuta cu grija deoarece germenii pot capata
rezistenta antibiotica pe parcursul timpului.

In cazul unei uroculturi pozitive, pentru stabilirea unui tratament antibiotic adecvat este
necesara efectuarea antibiogramei.

Metode rapide

Se considera metode rapide ori ce tehnici ne fac sa dispunem de o infectie asupra


microorganismului ce opuleaza urina in primele 4 h dupa recoltare. In contextul clinic si al altor
analize pe care le efectuam o asemenea informatie devine extrem de pretioasa pentru stabilirea
diagnosticului.

Aceste metode se impart in 3 categorii:

Fizice: cele mai cunoscute sunt:

numaratoarea particulelor, care detecteaza prezenta bacteriilor in urina indiferent de viabilitatea lor si
de numarul acestora in urina. Se efectueaza de catre un contor care este combinat cu un analizator al
distributiei particulelor in functie de marimea lor.

fotometria se bazeaza pe diluarea urinii intr-un lichid adecvat, care permite dezvoltarea oricarui
microorganism prezent. Timpul necesar pentru a obtine un oarecare grad de turbiditate depinde de
concentratia initiala a germenilor. Aceasta turbiditate este apreciata de un sistem automat care o
traduce instantaneu in numar de microorgansime.

bioimpedometria, se bazeaza pe constatarea ca prezenta de microorganisme care se multiplica intr-un


mediu lichid produc modificari ale compozitiei in asa fel incat produc modificari in conductibilitatea si
rezistenta electrica a acestuia.

Metode chimice: Sunt destul de numeroase si se bazeaza pe reactiile chimice pe care


microorgansimele le produc asupra substratului specific.

35
Metode microscopice: examenul pe lama al sedimentului urinar simplu ori colorat Gram sau cu
albastru de metil poate evidentia prezenta de microorganisme in 1-2 minute. Centrifugarea probei
creste densitatea bacteriuriei pe unitatea de suprafata examinata.

Antibiograma

Scopul analizelor bacteriologice nu este numai de a descoperi microorganismele


cauzatoare de boli ci si de a stabili daca acesti microbi pot fi distrusi de catre unele substante chimice
sau de catre antibiotice.

Analiza care testeaza in laborator antibioticul la care este sau nu sensibil un microorgansim
cauzator de boala se numeste antibiograma. In raport de rezultatul antibiogramei, medicul stabileste
cel mai indicat sau cele mai indicate antibiotice in vederea tratamentului bolii. Evaluarea in vitro a
eficientei unui antibiotic se realizeaza prin masurarea a trei parametri:

Concentratia minim activa ( C.M.A ) = concentratia la care antibioticul poate induce anumite
perturbari in activitatea metabolica a microorganismelor, fara a afecta capacitatea de multiplicare si
viabilitatea;

Concentratia minima inhibitoare ( C.M.I ) = concentratia la care un antibiotic inhiba multiplicarea


microorganismelor;

Concentratia minima bactericida ( C.M.B ) = concentratia la care un antibiotic are actiune letala asupra
microorganismului. Antibiograma trebuie practicata in mod obligatoriu in cazul microorganismelor
patogene, supuse fenomenului de dobandire a rezistentei, inaintea inceperii oricarui tratament cu
antibiotice.

36
Figura 3.3 Determinarea spectrului de susceptibilitate la antibiotice.

Metoda Kirby-Bauer: permite determinarea concomitenta a spectrului de sensibilitate a


germenului si a valorii C.M.I in vederea calcularii dozelor terapeutice de antibiotice. Metoda are mai
multe variante, cea mai folosita fiind cea a discurilor impregnate cu antibiotic.

Materiale necesare:

- placi Petri in care s-a repartizat mediul Muller-Hinton agarizat 1,5% cu grosimea de 4 mm. Suprafata
mediului trebuie sa fie uscata.

- inoculul este reprezentat de o suspensie in bulin realizata dintr-o cultura tanara dezvoltata pe un
mediu solod, in varsta de 15-18 h cu o densitate de 1-3x100000000 UFC/ml ajustata nefelorimetric sau
spectrophotometric, prin masurarea absorbantei la 660 nm;

- tulpina de referinta E. coli;

- tampoane de vata sterile;

- truse cu discuri pentru antibiograme;

- tabele interpretative standardizate, actualizate, cu punctele critice;

Mod de lucru:

A) prin insamantarea "in panza" cu ajutorul tamponului de vata steril se imbiba in inocul, se
indeparteaza surplusul rotind si presand usor tamponul pe peretii tubului, dupa care se descarca

37
tamponul pe suprafata placii prin miscari orizontale si apoi verticale, finalizate cu descrierea unui cerc
marginal;

B) prin inundare cu ajutorul unei pipete - se repartizeaza in placa un volum suficient (1-2 ml) pentru a
realiza acoperirea uniforma a intregii suprafete a mediului prin rotirea placii, dupa care se aspira
surplusul cu ajutorul pipetei;

In vederea usacarii suprafetei mediului placile se lasa cu capacul intredeschis 30 min. la temperatura
camerei sau 17 min. la 37°C.

2. Dispunerea individuala a discurilor impregnate cu antibiotice se realizeaza cu


ajutorul unei pense sterile flambata in prealabil sau a dispozitivului Oxoid. Plasarea discurilor se face
la o distanta de 3 cm intre ele si la cel putin 1.5 cm de marginea placii. Dupa depunere, discul se apasa
usor cu pensa pentru a asigura contactul intim cu suprafata mediului. Pentru dispunerea discurilor de
antibiotice se pot utiliza si dispozitive speciale care permit depunerea simultana si echidistanta a
discurilor de antibiotice pe placa. Dupa dispunerea discurilor, placile se lasa in repaus la temperatura
camerei 20-30 min. pentru a asigura predifuziunea uniforma a antibioticelor inaintea inceperii
multiplicarii microorganismelor.

3. Incubarea placilor se realizeaza timp de 16-18 h la 37°C, cu capacul in jos.

4. Controlul de calitate se realizeaza prin testarea pe o alta placa, in aceleasi conditii, a tulpinii de
referinta adecvate.

5. Citirea rezultatelor se realizeaza prin masurarea diametrelor zonelor de inhibitie a cresterii


determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. In cazuri de urgenta clinica se poate
realiza prima citire la 6 - 8 h de la incubare.

6. Interpretarea rezultatelor se face in functie de dimensiunea zonelor de inhibitie a cresterii,


exprimand rezultatul cu termenii de tulpina sensibila, rezistenta sau intermediar sensibila. Acesti
termeni definesc de fapt si categoriile de antibiotice, in functie de efectul lor clinic.

* categoria sensibil, inseamna ca exista o mare probabilitate ca antibioticul respectiv, administrat in


doze obisnuite, sa elimine infectia determinata de tulpina testata;

* categoria intermediar sensibila inseamna ca exista posibilitatea ca antibioticul respectiv sa fie


eficient in vitro prin administrarea locala sau prin realizarea in mod fiziologic de concentratii mari la
nivelul unor organe si tesuturi afectate;

38
* categoria rezistent inseamna ca, cel mai probabil, administrarea antibioticului respectiv nu va
determina eliminarea din organism a agentului infectios a carui sensibilitate a fost testata. La citirea si
interpretarea rezultatelor se iau in considerare diametrele zonelor de inhibitie lipsite complet de colonii
vizibile cu ochiul liber. Aparitia de colonii la marginea sau in interiorul zonei de inhibitie se poate
datora urmatorilor factori:

- Cultura este mixta sau suprainfectata;

- Cultura este pura, dar prezinta celule heterorezistente;

- Aparitia de mutante rezistente;

- Dezvoltarea tardiva a unor celule, de fapt sensibile, si aparitia de colonii dupa ce antibioticul s-a
diluat prin difuzie in mediu.

Figura 3.4 Aspecte de cultura si a rezistentei/sensibilitatii la antibiotice a unor bacterii Gram


negative.

3.4 REZULTATE SI DISCUTII

Dupa cercetarea registrelor de laborator si a consultarii foilor de observatie, atunci cand a fost
necesara obtinerea de date suplimentare, a reiesit faptul ca in anul 2016 au fost efectuate in cadrul

39
sectorului "Bacteriologie - Uroculturi" din cadrul Centrului Medical Mediurg Ploiesti un numar de
2246 uroculturi. Din totalul de uroculturi realizate au fost considerate pozitive, conform parametrilor
discutati in capitolele anterioare, un numar de 449 uroculturi ceea ce reprezinta un procent de 20 %.

Evidentierea genurilor bacteriene implicate in producerea infectiilor


urinare.

In cadrul studiului efectuat, probele de urina prelevate de la pacienti, cu simptome de infectie urinara,
analizele efectuate au vizat, pe de o parte evidentierea ponderii diverselor specii de bacterii patogene
implicate in determinarea infectiilor urinare in cazurile testate ( enterobacterii, bacterii Gram pozitive
din genurile Streptococcus, Staphylococcus sau Gram negative, diferite de enterobacterii ) si pe de alta
parte, evolutia rezistentei la antibiotice a patogenilor identificati, in perioada anului 2016.

Astfel, din totalul de 449 uroculturi pozitive, au fost identificate 12 genuri. Ponderea cea mai mare o
detine E. Coli ( peste 70 % ) acest microorganism fiind cel mai frecvent patogen in ITU si in randul
populatiei generale.

Cu frecvente mai reduse au fost izolate si alte genuri din familia Enterobacteriaceae. De remarcat este
ponderea relativ ridicata a tulpinilor de Enterobacter sp 16%, Proteus 5.4 %, Klebsiella 4.9 %,
Pseudomonas 2 %, Stafilococul alb pe sonda 0.3 %, Stafilococul auriu 0.45 %, Citrobacter 0.2 %.

80
70
60
50
40
30
20
10
0
li r us lla as a iu r
co te nd ur cte
E. b ac ote
bsie on so l a ba
ro Pr Kl
e om pe u o
te ud lb coc Citr
n e o
E Ps la fil
ocu Sta
c
lo
tafi
S

Figura 3.5 Incidenta speciilor/genurilor bacteriene în cazul uroculturilor pozitive

40
Din punct de vedere etiologic ITU determinat de Escherichia coli au fost mai frecvente la sex feminin
decat la cel masculin, intr-un raport de 2.2:1. In ceea ce priveste raportul este aproximativ egala la
ambele sexe. Din punct de vedere al coloratiei Gram ponderea microorganismelor investigate este
urmatoarea:

Tabelul 3.1

Ponderea microorganismelor investigate d.p.d.v al coloratiei Gram

Coloratie Nr. cazuri 2016 % 2016

Gram (+) 20 4%

Gram (-) 429 96 %

Escherichia coli

Este pus in evidenta prin insamantarea mediului M.I.L.F cu proba de cercetat, aceasta se
incubeaza timp de 18-24 h la 35-37°C, dupa incubarea se adauga pe suprafata insamantata 5-7 picaturi
de solutie apoasa de clorura ferica 10%.

Caractere morfologice

- de cultura: tubura uniform bulionul. Coloniile de E. coli izolate pe geloza simpla apar rotunde,
opace, bombate, cu margini regulate, lucioase atunci cand sunt sub forma de "S". Pe mediile
diferentiale datorita fermentarii lactozei determina virajul culorii; pe mediul Drigalsky coloniile sunt
galbene, pe mediul Mac Conky sunt rosii, iar pe mediul Levine coloniile apar negricioase cu luciu
metalic, asemanatoare picaturilor de fuxina.

41
- caractere bio-chimice: bacilul fermenteaza zaharoza, lactoza si fructoza cu producere de gaz, nu
produce hidrogen sulfurat, nu descompune ureea, produce indol, nu dezvolta pe medii cu citrat ca
unica sursa de carbon. Punerea in evidenta a acestor caractere enzimatice este necesara pentru
identificarea bacteriei. In acest scop cultura izolata se insamanteaza pe mediile TSI, MIU si Simmons.

Figura 3.6 E. coli pe mediu MacConkey agar

http://emedicine.medscape.com/article/217485-workup

Klebsiella

Au fost identificate si prin efectuare de frotiu subtire direct intr-o picatura de rosu de Congo
1%. Frotiul se usuca la temperatura camerei, nu se fixeaza la flacara. Pe campul microscopic se vor
observa bacteriile colorate in rosu inconjurate de un halou incolor, stralucitor care corespunde
capsulei.

- caractere morfologice: Bacilii apartinand acestui gen sunt mai scurti si mai grosi decat celelalte
enterobacterii. Poseda o capsula uneori vizibila si pe coloratia Gram. Klebsiella este imobila.

42
- caractere de cultura: creste pe medii uzuale, pe medii bogate in carbohidrati, formeaza colonii
mucoide. Coloniile dezvoltate pe geloza sange de berbec nu sunt hemolitice. Klebsiella se cultiva
aerob, facultativ anaerob, la temperatura optima de 37°C.

- caractere biochimice: produce gaz din glucoza, formeaza indol, utilizeaza citratul, fermenteaza
malonatul.

Figura 3.7 Klebsiella pe mediu MacConkey agar

https://www.pinterest.com/pin/518758450802181085/

Proteus

Dupa insamantarea mediului M.I.L.F cu proba de cercetat, aceasta se incubeaza la 18-24 h la


35-37°C, dupa incubare se adauga pe suprafata insamantata 5-7 picaturi de solutie apoasa ferica 10%
apare o culoare verde fosforescent care se accentueaza in 2-3 min, dupa care intensitatea culorii scade.

- caractere morfologice: bacilii polimorfi de la forme scurte la forme lungi filamentoase, nu poseda
capsula si sunt bacili mobili.

43
- caractere de cultura: tulpinile apartinand genului Proteus nu sunt pretentioase, cresc pe medii de
cultura uzuale. Au caracteristic "fenomenul de invazie" pe medii solode, invazie in valuri care poate
cuprinde toata suprafata mediului. Invazia poate fi oprita prin adaugarea la mediu de saruri biliare
tiosulfat de sodiu sau acid boric, ceea ce permite obtinerea de colonii izolate. Pe medii de cultura cu
lactoza coloniile sunt lactozo-negative. Tulpinile ale acestui gen au in culturi miros specific de
putrefactie.

- caractere biochimice: caracterele biochimice sunt: desfacerea fenilalaninei, lipsa fermentarii


lactozei, producerea de ureaza si H2S.

Figura 3.8 Proteus pe mediu geloza sange

http://www.creeaza.com/familie/medicina/BACILI-GRAM-NEGATIVI-AEROBI-FA496.php

Pseudomonas

Urina se centrifugheaza iar din sedimentul rezultat se fac insamantari directe si insamantari pe
geloza si in bulion. Pe geloza simpla unele tulpini formeaza colonii gri, lucioase cu hemoliza beta. In
bulion cultura tulbura mediul, formand la suprafata o pelicula.

- caractere morfologice: sunt bacili scurti, drepti, subtiri Gram negativi, izolati, uneori asezati in
perechi sau in lanturi scurte. In culturi pot prezenta forme filamentoase. Nu formeaza spori, este
necapsulat, in mod obisnuit este mobil.

- caractere de cultura: Pseudomonas are cerinte nutritive minime, necesita numai acetat si amoniac
ca sursa de carbon si azot, ceea ce ii confera proprietatea de a creste pe medii simple. Se poate dezvolta

44
pe multe medii de cultura, este o bacterie strict aeroba. Cultura are uneori un miros caracteristic,
aromatic. Poate produce mai multe tipuri de pigment: piocianina, pioverdina, piorubina, piomelenina.

- caractere biochimice: este oxidazo-pozitiv, nu fermenteaza carbohidratii. Pseudomonas produce


substante cu actiune bactericida, piocinele si piocianaza.

Figura 3.9 Pseudomonas aeruginosa pe mediu agar-agar

http://tonycriss-criss.blogspot.ro/p/pseudomonas-aeruginosa.html

Enterococcus

- caractere morfologice: sunt coci Gram pozitivi, izolati, in perechi sau in lanturi. Cocii sunt ovoidali,
uneori au aspect alungit, cand frotiurile sunt dintr-o cultura dezvoltata pe medii solide. Coloniile
enterococilor pe agar sange sunt rotunde si au aspectul literei "S", cu margini regulate.

- caractere de cultura: nu sunt pretentiosi, cresc pe medii uzuale intre 10°C si 45°C cu un optim de
35°C. Pe geloza sange de berbec coloniile de enterococi dau hemoliza alfa sau sunt nehemolitici; pot fi
beta-hemolitice pe geloza sange de iepure sau de cal.

45
- caractere biochimice: nu produc catalaza; desfac glucoza pe cale fermentativa. Enterococii cresc in
prezenta a 6,5% sare si hirolizeaza esculina in prezenta sarurilor biliare. Toate tulpinile de Enterococi
produc leucin aminopeptidaza, pusa in evidenta prin testul LAP.

Figura 3.10 Enterococcus pe geloza sange

- http://atlas.microumftgm.ro/bacteriologie/bactsp/enterococ.php

Staphylococcus

- caractere morfologice: stafilococii sunt coci sferici Gram pozitivi, asezati in mod obisnuit neregulat,
in forma de ciorchine. Pe frotiurile efectuate din medii lichide sau din prelevate clinice pot aparea sub
forma de coci izolati, in perechi, tetrade sau lanturi. Cocii din culturile tinere sunt Gram pozitivi. Prin
imbatranirea culturilor, multi coci devin Gram negativi.

- caractere de cultura: stafilococii cresc pe medii uzuale in conditii aerobe si microaerofile. Cresc
rapid la 37°C dar formeaza mai bine pigmentul la temperatura camerei, la 20-25°C, se dezvolta pe

46
medii cu 7-10% sare. Coloniile pe medii de cultura solide sunt rotunde, lucioase, opace. Formeaza
colonii pigmentate de la alb la galben.

In medii lichide tulbura uniform bulionul, unele specii formand si un depozit. Pe geloza sange
stafilococii pot fi hemolitici, cu o zona de hemoliza ingusta, completa.

- caractere biochimice: stafilococii formeaza multi carbonati, intre care si glucoza, fara producere de
gaz. Activitatea proteolitica difera de la o tulpina la alta. Stafilococii lichefiaza gelatina, nu produc
indol, reduc nitritii la nitriti, coaguleaza laptele.

Figura 3.11 Staphylococcus aureus pe geloza sange

http://atlas.microumftgm.ro/bacteriologie/bactsp/staph.php

Evidentierea evolutiei rezistentei la antibiotice a bacteriilor patogene


producatoare de infectii urinare in anul 2016.

In contextul utilizarii frecvente, in mod controlat sau necontrolat, a antibioticelor in tratarea


unor infectii bacteriene variate s-a evidentiat, la nivel global o crestere alarmanta a numarului de
izolate bacteriene patogene rezistente la un numar din ce in ce mai mare de antibiotice uzuale.

47
Escherichia Coli in 2016:

- cea mai mare sensibilitate la Ceftazidim (90%) urmata de Cefuroxim (84%), Cefalexin (76%),
Gentamicina (68,64%);

- cea mai scazuta sensibilitate a fost observata la Ciprofloxacin (2%), Ceftriaxon (0,70%).

Comparand cu date din literatura de specialitate, mentionam ca, avand in vedere studiul facut de "The
Surveillance Network" (TSN) pentru E. coli s-a inregistrat o rezistenta de 40% la Ampicilina, 1% la
Nitrofurantoin si intre 2% si 3% la fluorkinolone. Un alt studiu din 2000 a demonstrat la 58% din
tulpinile de E. coli izolate o rezistenta la toate drogurile testate, incluzand Ampicilina Keflin,
Nitrofurantoinul, Biseptolul si Ciprofloxacina.

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ceftazidim cefuroxim Cefalexin GentamicinăCiprofloxacin Ceftriaxon

Figura 3.12 Sensibilitatea bacteriei E. coli la anumite antibiotice in 2016

Klebsiella in 2016:

- au sensibilitate mare la Imipenem 57% urmata de Levofloxacin 50%,Ceftazidim 49%, Cefuroxim 46


%.

- cea mai scazuta sensibilitate o are Ciprofloxacinul, Amoxicilina si Cefotaxinul.

- cea mai mare rezistenta o are la Biseptol 67 %.

48
70

60

50

40

30

20

10

0
Imipenem Levofloxacin Ceftazidim Cefuroxim Biseptol

Figura 3.13 Sensibiliatea si Rezistenta bacteriei Klebsiella in 2016

Proteus in 2016:

- rezistenta la Biseptol este de 42%, la Nitrofurantion este > 35%;

- sensibilitati bune au fost gasite la Gentamicina si Levofloxacin dar numarul de cazuri fiind doar 20,
nu se poate trage o concluzie clara.

49
42

41.5

41

40.5

40

39.5

39
Biseptol Nitrofurantion

Figura 3.14 Rezistenta bacteriei Proteus in 2016

Pseudomonas aeruginosa in 2016:

- se remarca rezistenta la 89 % la Levofloxacin, 74 % la Cefuroxim si 65 % la Biseptol;

- sensibilitatea cea mai mare este la Colistin de aproximativ 50 %.

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Levofloxacin Cefuroxim Biseptol Colistin

Figura 3.15 Rezistenta si Sensibilitatea bacteriei Pseudomonas in 2016

Exemple practice:

Pacientul nr. 1

Varsta: 77 ani

Urocultura (metoda ansei calibrate). Produs patologic: Urina

50
Ex. microscopic nativ: celule epiteliale,plate - RARE

Ex. microscopic nativ: leucocite - FRECVENTE

Flora bacteriana: PREZENTA

Gen, specie,apreciere cantitativa: - KLEBSIELLA -> 100.000 UFC/ML URINA

Examen microscopic colorat Gram: BACILI GRAM NEGATIVI

Interpretare Urocultura: SEMNIFICATIE CLINICA PENTRU INFECTIE URINARA

Urocultura - ANTIBIOGRAMA ( metoda difuzimetrica )

SENSIBIL: AC. NALIXIDIC; AMOXICILIN+AC. CLAVULANIC; CEFTIBUTEN;CEFTRIAXON;


CEFUROXIM; COLISTIN; GENTAMICINA; KANAMICINA; NORFLOXACIN.

INTERMEDIAR: -

REZISTENT: AMPICILINA; COTRIMOXAZOL; NITROFURANTOIN.

Figura 3.16 Biochimie Klebsiella pe cele 4 medii de cultura

Pacientul nr. 2

Varsta: 64 ani

Urocultura (metoda ansei calibrate). Produs patologic: Urina

Ex. microscopic nativ: celule epiteliale,plate - RARE

51
Ex. microscopic nativ: leucocite - RELATIV FRECVENTE

Flora bacteriana: PREZENTA

Gen, specie,apreciere cantitativa: - ESCHERICHIA COLI - > 100.000 UFC/ML URINa

Examen microscopic colorat Gram: BACILI GRAM NEGATIVI

Interpretare Urocultura: SEMNIFICATIE CLINICA PENTRU INFECTIE URINARA

Urocultura - ANTIBIOGRAMA ( metoda difuzimetrica )

SENSIBIL: AC. NALIXIDIC; AMOXICILIN+AC. CLAVULANIC; CEFTIBUTEN;CEFTRIAXON;


CEFUROXIM PARENTERAL; COLISTIN; GENTAMICINA; KANAMICINA; NORFLOXACIN,
COTRIMOXAZOL, NITROFURANTOIN.

INTERMEDIAR: CEFUROXIM ORAL.

REZISTENT: -

Figura 3.17 Biochimie E. coli pe cele 4 medii de cultura

CONCLUZII

1. In cadrul analizelor efectuate la Centrul Medical Mediurg au fost examinate un numar de 2246
probe de urina, dintre acestea s-au identificat germeni doar in 449 cazuri. Astfel din totalul de 449

52
uroculturi pozitive, au fost identificate 12 genuri. Ponderea cea mai mare o detine E. Coli, acest
microorganism fiind cel mai frecvent patogen in ITU si in randul populatiei generale.

2. In cadrul acestor analize s-a evidentiat faptul ca, speciile bacteriene identificate au prezentat o
crestere a rezistentei la antibiotice, fapt demonstrat si de datele furnizate in cadrul studiilor efectuate la
noi in tara cat si prin retele de supraveghere internationale de tipul EARSS.

3. Pentru stabilirea rezistentei la antibiotic au fost analizate 35 produse medicamentoase. In


tratamentul ITU in care microorganismul nu a fost identificat, cel mai utilizat antibiotic a fost
Ciprofloxacina (86%) ca si in ITU in care microorgansimul a fost identificat, iar Amikacina ar putea fi
eficienta in tratamentul empiric al infectiilor urinare deoarece E. Coli, Enterobacter si Proteus au o
buna sensibilitate, mai putin Enterococul.

4. Se constata izolarea de tulpini bacteriene multirezistente, cu rezistenta la antibiotice din clase


diferite, cu precadere din genurile Enterobacter si Klebsiella. Rezistenta acestor germeni la
betalactamine, chiar si la cefalosporine sau cele asociate cu inhibitori de enzime lactamice, sugereaza
ca terapia empirica poate fi adesea insotita de esec. De asemenea, instalarea rezistentei la
fluorokinolone, considerate adeseori ca agenti de electie in terapia infectiilor urinare, reprezinta un
fenomen ingrijorator.

5. In privinta rezistentei la antibiotice s-a observat ca in intervalul analizat 2016, nivelurile inregistrate
pemtru principalele probleme de rezistenta bacteriana au fost, Escherichia coli a avut cea mai mare
sensibilitate la Ceftazidim (90%) urmata de Cefuroxim (84%), Cefalexin (76%), Gentamicina
(68,64%) si cea mai scazuta sensibilitate a fost observata la Ciprofloxacin (2%), Ceftriaxon (0,70%).

6. Tulpinile de Klebsiella - sensibilitate mare la Imipenem (57%) urmata de Levofloxacin (50%),


Ceftazidim (49%), Cefuroxim (46 %). Sensibilitatea cea mai scazuta o are Ciprofloxacinul,
Amoxicilina si Cefotaxinul. Cea mai mare rezistenta o are la Biseptol (67 %).

7. Tulpinile de Proteus - rezistenta la Biseptol este de 42%, la Nitrofurantion este mai mare de 35%; O
sensibilitate buna o are la Gentamicina si Levofloxacin.

BIBLIOGRAFIE

1. Ardelean I.I., 2008 sau 2013, Microbiologie generală volumul 1, Editurea Ars Docendi.

2. Ardelean I.I, 2012, Microbiologie generală volumul 2, Editurea Ars Docendi.

53
3. Buiuc D., Negut D., 1999, "Tratat de Microbiologie Clinica", Editura Medicala Bucuresti.

4. Dragan - Bularda M., 1998, Microbiologie generala: note de curs, Cluj-Napoca.

5. Herlea V., 1998, Microbiologie generală, Editura Universitatii din Bucuresti.

6. Karp G., John Wiley & sons, 2002, Cell and Molecular Biology, third edition, inc., New York,
Chichester, Weinheim, Brisbane, Singapore, Toronto.

7. Mihaescu Gr., 2008, Microbiologie Generala si Virologie, Editura Universitatii din Bucuresti.

8. Lazar V., Herlea V., Cernat R., Balotescu C., Bulai D., Moraru A., 2004, Microbiologie
generală :Manual de lucrări practice, Editura Universitatii din Bucuresti.

9. Vassu T., Stoica I., Csutak O., Musat FL., 2001, Genetica microorgansimelor si inginerie genetica
microbiana. Editura Petrion.

10. Zarnea G., 1984, Tratat de microbiologie generală, vol. II, Edit. Academiei, Bucureşti.

11. Zarnea G., 1986, Tratat de microbiologie generală, vol. III, Edit. Academiei, Bucureşti.

12. Zarnea G., O.V.Popescu, 2011, Dicționar de microbiologie generală și biologie moleculară, Editura
Academiei Române, București.

13. Zarnea G., 1983, Anatomie bacteriană. In: Tratat de microbiologie generală, vol. I, Editura
Academiei Române, Bucureşti, 426p.

14. Zarnea G., 1994, Tratat de microbiologie generală, vol. V, Editura Academiei Române, Bucureşti,
1078p.

15. W.H. Freeman and Company,2000, Molecular cell biology, Lodish, H. Et al., fourth edition, New
York, USA.

54
55
56