Proceso aguas abajo: aislamiento y purificación de productos

biofarmacéuticos
El procesamiento posterior incluye todos los pasos necesarios para purificar
un producto biológico desde el caldo de cultivo celular hasta el producto final
purificado. Implica múltiples pasos para capturar el objetivo biomolecular y
para eliminar impurezas relacionadas con la célula huésped (por ejemplo,
proteínas de la célula huésped, ADN, etc.), impurezas relacionadas con el
proceso (por ejemplo, tampones, ligandos lixiviados, antiespumante, etc.) y
productos relacionados con las impurezas (por ejemplo, agregados,
fragmentos, especies recortadas, etc.). Cada paso de purificación es capaz de
eliminar uno o más clases de impurezas. El Proceso de aguas abajo
usualmente abarca tres etapas principales.
(i) recuperación inicial (extracción o aislamiento).
(ii) (ii) purificación (eliminación de la mayoría contaminantes)
(iii) (iii) pulido (eliminación de contaminantes específicos y formas no
deseadas de la biomolécula que pudieron haberse formado durante el
aislamiento y la purificación).
La recuperación inicial implica la separación entre la célula y sobrenadante
(clarificación del caldo). Para este propósito, las operaciones empleadas son
centrifugación, filtración, sedimentación y flotación. Si se produce la
biomolécula objetivo extracelularmente, el caldo clarificado se somete a
concentración (por ejemplo, ultrafiltración) seguido de purificación. Por
ejemplo, Las proteínas secretadas y solubles en los medios de cultivo de P.
pastoris se pueden recuperar directamente por centrifugación. Las muestras
pueden luego ser concentradas y la proteína objetivo se purificará del
sobrenadante por procesos tales como ultrafiltración, precipitación, y / o
cromatografía. Para biomoléculas intracelulares, las células cosechadas deben
someterse a lisis (p. ej., alta presión homogeneizador, sonicación, paso por
molinos, etc.) seguido por aclaración para eliminar los restos celulares. La
biomolécula objetivo se purifica del homogeneizado celular clarificado
(generalmente por precipitación y / o cromatografía). En casos donde las
proteínas se expresan como cuerpos de inclusión (como algunos
recombinantes producidos por E. coli), un paso adicional de replegamiento de
proteínas (tampón intercambio) es obligatorio. Estos pasos adicionales
significativamente contribuyen al aumento del tiempo de producción y los
costos de las biomoléculas intracelulares. La recuperación y purificación
eficiente de productos biofarmacéuticos han sido referidos como una parte
crítica del proceso de producción. El proceso de purificación debe ser robusto,
confiable, fácil de ampliar, y capaz de eliminar procesos y productos
relacionados impurezas para garantizar la seguridad del producto. La pureza
lograda, la velocidad del desarrollo del proceso, el rendimiento general de
recuperación, y el rendimiento son algunos de los principales parámetros clave
que debe tenerse en cuenta durante el proceso posterior al desarrollo. Para
alcanzar la rigurosidad de pureza requerida en la industria biofarmacéutica, a
veces superior al 99%, Por lo general, se requieren pasos de cromatografía. La
cromatografía permite alta resolución y ha sido tradicionalmente el caballo de
batalla para la purificación y pulido de proteínas. Sin embargo, la
cromatografía también ha sido el principal centro de costos en procesos de
purificación, principalmente debido al costo de los medios y relativamente
largos tiempos de ciclo. Además, la industria biofarmacéutica aún enfrenta
limitaciones prácticas en términos de rendimiento y escalabilidad.
Cromatografía

Se han descrito diferentes estrategias basadas en secuencias de cromatografía

clásica para ácidos nucleicos, péptidos, y purificación de proteínas. De hecho,
la cromatografía es una técnica de purificación efectiva con una amplia gama
de aplicaciones industriales y actualmente representa la opción favorita debido
a su capacidad de alta resolución. El principio de separación en cromatografía
se basa en las diferencias en la afinidad de la especie transportada por una fase
móvil fluida hacia una fase estacionaria sólida. Cuando se introduce y
transporta una muestra por el eluyente a lo largo de la columna, algunos de sus
componentes tendrán interacciones más potentes con el estacionario fase que
otros, generando perfiles de concentración que filtrar la columna
cromatográfica a diferentes velocidades. Las especies menos retenidas eluirán
antes de la columna que los más retenidos, permitiendo eventualmente la
recolección de los productos de interés con un alto grado de pureza. Basado en
la interacción entre la fase estacionaria sólida y biomoléculas, las técnicas
cromatográficas se pueden resumir en cinco clases: (i) afinidad, (ii)
intercambio iónico, (iii) interacciones hidrofóbicas, (iv) exclusión de tamaño y
(v) cromatografía de modo mixto. La cromatografía de afinidad simula y
explota natural procesos biológicos como el reconocimiento molecular para el
purificación selectiva de proteínas diana.61 Esta clase de cromatografía es
probablemente la única técnica actualmente disponible que es capaz de
abordar problemas clave en alto rendimiento proteómica y escalamiento.62 El
ejemplo más común de un proceso de afinidad es la cromatografía de proteína
A, que tiene Se aplica desde hace más de una década en el ámbito industrial y
académico. ajustes para la captura y purificación de anticuerpos.60 De manera
similar, la proteína L posiblemente podría desempeñar un papel en el
anticuerpo purificación de fragmentos.59 Otra estrategia bien basada en
afinidad establecido para la purificación de proteínas recombinantes es el uso
de etiquetas de fusión, que son secuencias de aminoácidos unidas a proteínas
recombinantes con afinidades selectivas y altas para un ligando químico o
biológico inmovilizado en una columna cromatográfica. En particular, la
etiqueta polihistidina (xHis) tiene se ha utilizado con frecuencia para purificar
proteínas recombinantes debido a su capacidad de unión hacia cationes
metálicos divalentes.60 A pesar del hecho de que los métodos de afinidad
usualmente eliminan la purificación pasos, aumentar los rendimientos y
reducir el equipo de capital, presenta algunos inconvenientes, particularmente
los reguladores desde la retirada completa de ligandos lixiviados es un
requisito.
Las opciones tradicionales en configuraciones cromatográficas incluyen
resinas a base de partículas, operación en modo discontinuo y empaquetadas
columnas Para abordar los inconvenientes de estos parámetros estándar,
algunas alternativas de proceso están atrayendo la industria farmacéutica,
especialmente la cromatográfica separación basadas en lecho móvil simulado
(SMB), expandido adsorción de lecho (EBA) y columnas monolíticas de
bloque único.
La cromatografía SMB es la opción preferida para la separación de
enantiómeros de drogas sintéticas en productos farmacéuticos. industria. Sin
embargo, recientemente, su uso tuvo un aumento significativo en empresas de
biotecnología, especialmente para el replegamiento de proteínas y proceso
continuo descendente.63 El sistema presenta múltiples columnas
cromatográficas pequeñas conectadas y operadas secuencialmente con flujo de
contracorriente de fluidos. El movimiento simulado proviene del cambio
periódico de entradas / salidas multipuerto de columna a columna, en la
dirección de flujo de fluido, lo que da la impresión de que el lecho de la
columna Se está moviendo. Estas válvulas de entrada / salida (alimentación,
desorbente, refinado, y extraer) se colocan de manera que minimicen las zonas
muertas, permitir el reciclaje desorbente, optimizar la recuperación del
producto y funcionan como modo semicontinuo.64 Especialmente para el
replegamiento, SMB junto con el reciclaje de agregados conducen a un
rendimiento teórico del 100%, excluyendo el equilibrio de plegado como un
factor limitante para la productividad.65 Sin embargo, SMB es más complejo
de implementar y requiere un mayor costo de inversión. La cromatografía
EBA es un proceso 3 en 1 destinado a capturar el producto directamente de la
suspensión celular, combinando clarificación, concentración y purificación
inicial. La alimentación inferior del sistema EBA crea un flujo que
gradualmente expande la resina y forma un gradiente de partículas estable.66
Esto gradiente consiste en partículas de diferentes rangos de tamaño y
diferentes densidades, lo que requiere un rango estrecho de cálculo caudales.
Todos los adsorbentes en contacto directo con la materia prima pueden unirse
a las células / desechos celulares, interrumpiendo el gradiente y reduciendo la
recuperación. Este problema se aborda con estudios en pH de adsorción para
identificar condiciones con adsorción máxima del producto y mínima
adhesión celular.67 Varios estudios han mostrado el valor de EBA. Elimina
eficazmente los precipitados y captura las proteínas objetivo de los grupos de
E. producción basada en coli68 y promueve una recuperación mejorada de
Factor de crecimiento epidérmico humano a partir de homogeneizado de E.
coli y Medio de cultivo de Pichia pastoris.67 Las resinas a base de partículas
dependen de la transferencia de masa principalmente a través de difusión, que
requiere largos tiempos para grandes biomoléculas. En Por otro lado, la
columna monolito de bloque único tiene canales interconectados que
transfieren masa principalmente a través de convección, que permite una alta
velocidad de flujo. Además, el monolito no tiene el paso de empaque y tolera
el paso del aire, reduciendo costos y tiempo con el embalaje validación y
reempaque / reemplazo de fase sólida debido a la interrupción del aire. Otras
ventajas significativas son la fácil ampliación debido a flujo independiente de
enlace dinámico y compatibilidad con varios medios orgánicos, a base de
polímeros e inorgánicos. La desventaja de un mayor consumo de tampón se
puede disminuir con la configuración SMB, que también se puede combinar
con un solo usar tecnología. Los monolitos se aplican ampliamente a la
recuperación. de proteínas como el factor de coagulación IX (intercambio
iónico) 70 y IgG (cromatografía de afinidad) 29 de una variedad de cultivos
celulares incluyendo P. pastoris71 y E. coli.
Técnicas alternativas de separación.
Con un floreciente mercado de biotecnología, hay un continuo buscar
alternativas nuevas y mejoradas a la cromatografía en un esfuerzo por reducir
costos y mejorar los rendimientos, mientras se mantiene una alta pureza del
producto.56 Varias alternativas prometedoras tienen ha sido descrito en la
literatura, incluida la precipitación por afinidad, filtración de flujo tangencial
de alto rendimiento, estrategias de filtración basadas en interacciones tiofílicas
y de afinidad, de dos fases sistemas acuosos, pesca magnética de alto
gradiente, preparativa electroforesis y enfoque isoeléctrico. Separación
magnética con soportes de inmunocaptura. entre las técnicas utilizadas en kits
de purificación, pero solo Recientemente su aplicación a escala industrial
mostró caminos viables. Se superaron los altos costos iniciales de las cuentas
de los kits con nuevos materiales y una capacidad de unión y dispersión de
mayor tamaño, sin disminuir la consistencia de lote a lote. Partículas
superparamagnéticas submicrométricas de magnetita recubierta Los cristales
se pueden funcionalizar de acuerdo con la selectividad deseada. Estas
partículas han sido utilizadas para la purificación de enzimas y cuerpos de
inclusión.29 La filtración con membranas de intercambio iónico sustituye la
cromatografía de flujo continuo por etapas de pulido. Quitan proteínas de la
célula huésped, ácidos nucleicos y virus con aumento caudales, reducen el
consumo de tampón y el tiempo, cuando en comparación con el pulido
tradicional. Las membranas de interacción hidrofóbica pueden eliminar
dímeros y agregados de Producción de anticuerpos monoclonales y sustitución
de más pasos de cromatografía.
Tendencias generales

El objetivo del proceso posterior debe ser entregar el mayor rendimiento del
producto más puro en el menor tiempo / costo. Sin embargo, los procesos
tradicionales y el control de calidad sí no trae la eficiencia necesaria para
mantener el ritmo de la corriente producción aguas arriba. Para abordar los
problemas actuales, algunos generales Las tendencias emergen como las más
relevantes, incluyendo módulos de un solo uso, producción continua,
tecnología analítica de procesos, y calidad por diseño.73 Las unidades
desechables son compatibles con el modo continuo. y trae una operación de
rutina más rápida porque no hay limpieza o la limpieza / validación debe
realizarse.73 Los procesos continuos generalmente resultan en una mayor
productividad, menos amortiguación consumo y menor huella. Un general de
principio a fin proceso continuo puede lograrse por célula de perfusión
reactores junto con un paso de captura continuo, integrado con algunas de las
tecnologías posteriores descritas en la Tabla 2. Una revisión reciente y extensa
sobre continua el procesamiento posterior de productos biofarmacéuticos
describe y analiza cada opción de configuración en detalle. La consistencia del
proceso a lo largo del tiempo se puede asegurar con la ayuda de tecnología
analítica de procesos (PAT) y calidad por diseño (QbD) conceptos descritos
en el Consejo Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos
para Productos Farmacéuticos para uso humano (ICH). QbD preconiza que el
El producto es el proceso. Por lo tanto, es esencial conocer los parámetros
críticos del proceso y vincularlos con atributos de material críticos para
predecir y ajustar su impacto en la crítica atributos de calidad del producto
final. Procesos desarrollados bajo QbD, el conocimiento contiene espacios de
diseño en lugar de valores únicos o parámetros extremadamente estrechos;
valores dentro del el espacio de diseño da como resultado un buen rendimiento
del producto y aporta la flexibilidad necesaria para el procesamiento
continuo.74 Sin embargo, el conocimiento del proceso requiere un proceso
analítico herramientas de tecnología (PAT) que incluyen química analítica y
modelado / análisis matemático y estadístico. Entre la opciones,
espectroscopía de infrarrojo cercano y componente principal el análisis son
opciones de tendencia para análisis y matemática herramientas, que se pueden
aplicar a varios pasos.
Mercado global de consumo de microbios productos biofarmacéuticos

En 1982, la insulina humana fue la primera proteína recombinante. que fue

aprobado por la FDA para su uso en humanos como producto
biofarmacéutico10,39. En la década de 1980, el biofarmacéutico industria
experimentó un crecimiento significativo en la producción y aprobación de
proteínas recombinantes, incluidos interferones (IFN, y) y hormonas de
crecimiento. En la década de 1990, el primer Los anticuerpos monoclonales
(MAb) y productos relacionados experimentaron un crecimiento
extraordinario, y en 2015, estos productos representaban dos tercios de los
productos aprobados para uso comercial en el mundo según la base de datos
Biotrack (Fig. 4). Actualmente, las ventas totales de mercado de productos
recombinantes microbianos alcanzaron aproximadamente $ 50 mil millones,
lo que representa un tercio de las ventas totales de productos
biofarmacéuticos. La elección de microorganismos en la producción de
productos biofarmacéuticos se basa en muchos factores, incluida la
producción de bajo costo, fáciles métodos de manipulación y propagación y
biología molecular. Algunos de los productos biofarmacéuticos más
importantes obtenidos por fuentes naturales o por expresión heteróloga se
muestran en Tablas 3–5.
Los biofarmacéuticos son revolucionarios en la industria farmacéutica. Según
los ingresos mundiales, 10 biotecnológicos productos relacionados incluidos
entre los 25 medicamentos más vendidos en 2015; 4 de ellos producidos por
microorganismos77,78 (Tabla 6). Estos productos biofarmacéuticos son
comercializados por compañías farmacéuticas líderes ubicadas principalmente
en los EE. UU., Japón y Europa y comprenden un alcance estrecho de perfil
de tratamiento, con La mayoría de los medicamentos para el tratamiento y
manejo de enfermedades inflamatorias (por ejemplo, artritis reumatoide) y
cáncer. Las patentes para la clonación y producción de varios productos
biofarmacéuticos de generación original (marca) han expirado o lo harán
expirará en los próximos años (Tabla 6). Similar a las drogas químicas, una
vez que la patente de un producto biológico expira La comercialización de
biosimilares y genéricos es posible. Estos vencimientos de patentes,
combinados con el aumento de la asistencia sanitaria los costos y el
envejecimiento de la población en todo el mundo están allanando el camino
para el desarrollo de biosimilares y biobetters, apertura nuevas oportunidades
comerciales.80,81 Muchos biosimilares están actualmente en desarrollo y
estos productos de continuación inevitablemente juega una competencia
sustancial y un papel cada vez mayor en salud en los próximos años79,82. En
Brasil el escenario es modesto, pero considerando el panel global y el reciente
incentivo gubernamental para la industria biofarmacéutica nacional desarrollo,
esperamos ver más patentes en el futuro cercano y también nuevas
oportunidades para biosimilares y biobetters.

Conclusión y tendencias futuras.

Nuevos avances tecnológicos se hacen continuamente para mejorar el

descubrimiento, la modificación racional, la producción y purificación de
productos biofarmacéuticos. Estrategias innovadoras para identificar
diferentes especies de microorganismos de la biodiversidad brasileña deben
ser investigados dirigidos al descubrimiento de hosts alternativos para la
expresión heteróloga.