Sunteți pe pagina 1din 214

Reacţia Antigen-Anticorp

Foarte multe dintre tehnicile utilizate în


imunologie se bazează pe interacţiunea dintre antigen şi
anticorp şi pe faptul că această reacţie nu va putea avea
loc decât dacă anticorpul va recunoaşte şi lega antigenul
în mod specific. Deşi specificitatea de interacţiune este
fundamentală, pentru toate aceste metode bazate pe
reacţia antigen-anticorp, există şi alţi factori care au un
efect semnificativ asupra sa, favorizând sau inhibând
interacţiunea dintre cele două molecule.
Legarea dintre antigen şi anticorp se bazează pe
complementaritatea tridimensională a celor două
componente, iar acest aspect a fost demonstrat inclusiv
prin studii de cristalografie. Această potrivire reciprocă
permite maximizarea ariei de contact dintre cele două
structuri, putându-se ajunge până la o suprafaţă de cca.
75Ǻ2. Legarea nu diferă însă ca principiu de alte reacţii
dintre o moleculă şi ligandul pe care îl leagă în mod
specific. Interacţiunea dintre o enzimă şi substratul ei se
bazează pe acelaşi principiu, diferenţa în acest caz
particular fiind că substratul este modificat de acţiunea
enzimei, în timp ce anticorpul nu induce modificări ale
antigenului.

1
1. Legături implicate în formarea complexului
antigen-anticorp

Legăturile care intervin în formarea complexului


antigen-anticorp sunt necovalente şi, prin urmare, relativ
slabe (figura 1):
1. Legăturile electrostatice (ionice) se formează între
grupări ionice, cu sarcini electrice de semn opus (de
exemplu CO2-, NH3+). Forţa de atracţie este caracterizată
prin formula F=1/kD x d2, unde kD este constanta
dielectrică, iar d este distanţa dintre molecule. Deoarece
constanta dielectrică a apei este foarte mare, devine deja
evident că excluderea moleculelor de apă este de natură
să crească foarte mult forţa de legare.
2. Legăturile de hidrogen se formează între atomii
încărcaţi negativ ai unor molecule polare (CO2-) şi ionii
de hidrogen încărcaţi pozitiv (H+) ai unor grupări
hidrofilice (.OH, NH2). Punţile de hidrogen sunt legături
slabe şi se bazează pe interacţiuni electrostatice, de
aceea, excluzia moleculelor de apă este de natură să
crească forţa de legare prin reducerea constantei
dielectrice.
3. Legăturile van der Waals sunt forţe de atracţie
care apar ca urmare a interacţiunii dintre norii electronici
externi ai moleculelor respective. Sunt cauzate de
perturbări electronice temporare care conduc la formarea
unui dipol la nivelul unei molecule, iar acesta induce o
perturbare dipolară la nivelul moleculei pereche, cu care
astfel va putea interacţiona. Forţa de atracţie este invers
proporţională cu distanţa (F α 1/d7), ceea ce arată că
această forţă va creşte rapid pe măsură ce moleculele de

2
antigen şi anticorp se apropie tot mai mult unele de
celelalte.
4. Legăturile hidrofobe se formează între molecule
nonpolare, pe măsură ce acestea se apropie, eliminând în
cursul acestui proces, moleculele de apă dintre ele.
Procesul poate fi asemănat cu picăturile de ulei care,
plutind pe suprafaţa apei, se unesc până când se formează
o picătură unică. Explicaţia e dată de faptul că moleculele
de apă nu pot forma punţi de hidrogen cu moleculele
hidrofobe şi atunci se asociază între ele.

Fig. 1 Tipuri de legături ce intervin în interacţiunea Ag-Ac.

Se remarcă faptul că toate tipurile de legături


descrise mai sus depind de distanţa dintre cele două
molecule, cu cât aceasta este mai mică, mai multe
molecule de apă sunt excluse şi forţa de legare creşte. O

3
astfel de distanţă mică între norii electronici ai epitopului
şi paratopului poate fi atinsă atunci când există o
complementaritate a celor două structuri. Cu cât
suprafaţa de contact (de „potrivire”) dintre antigen şi
anticorp este mai mare, cu atât forţa de atracţie este mai
mare.

Intervenţia exclusivă a legăturilor non-covalente


în procesul de asociere face ca reacţia dintre antigen şi
anticorp să fie una reversibilă, ceea ce înseamnă că, odată
format, complexul antigen-anticorp se poate disocia.
Demonstraţia reversibilităţii reacţiei antigen-
anticorp poate fi făcută de o manieră foarte simplă, cu
ajutorul unui experiment în care sunt folosite haptene
(molecule cu greutăţi moleculare extrem de mici) şi un
sac format dintr-o membrană de dializă, care permite
trecerea haptenelor, dar nu şi a anticorpilor. Pe scurt, în
interiorul sacului de dializa sunt introduse haptene şi
anticorpi specifici pentru haptenele respective. Sacul este
mai întâi scufundat într-un lichid până la atingerea unei
stări de echilibru în care numărul de molecule de haptene
libere dinăuntrul sacului de dializa şi din afara lui se
egalizează. Apoi, lichidul din afara sacului va fi înlocuit
continuu, ceea ce înseamnă că haptenele din acest
compartiment vor fi îndepărtate din sistem, ceea ce va
duce la perturbarea echilibrului dintre moleculele aflate
în interiorul sacului şi cele din exterior. În această
situaţie, moleculele din interiorul sacului încearcă să
atingă din nou starea de echilibru şi, o parte dintre ele vor
traversa membrana de dializă. După o perioadă de timp
de înlocuire a lichidului din afara sacului, se constată că
în interiorul acestuia nu numai că nu mai există molecule

4
libere de haptenă, dar nu mai există nici molecule legate
la anticorpi. Acest lucru atestă faptul că legătura dintre
anticorp şi antigen a putut fi desfăcută şi antigenul
eliberat (figura 2).

Fig. 2 Reprezentare schematică a experimentului efectuat cu


ajutorul unei membrane de dializă, care demonstrează
reversibilitatea reacţiei antigen-anticorp (adaptat după Delves
PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM, 2006).

Asocierea dintre un singur paratop al unui


anticorp şi epitopul corespunzător seamănă cu o reacţie
chimică şi poate fi definită printr-o ecuaţie:

Ag+AcAg-Ac

Kinetica asocierii şi disocierii din cadrul reacţiei


antigen-anticorp respectă legea acţiunii maselor şi poate
fi reprezentată prin ecuaţia:

ka[Ag][Ac]=kd[AgAc]

5
unde [Ag] şi [Ac] sunt concentraţiile antigenului şi
anticorpului liberi, [AgAc] este concentraţia complexelor
Ag-Ac, iar ka şi kd sunt constanta de asociere şi,
respectiv, de disociere. Ecuaţia de mai sus poate fi
rescrisă, putându-se defini constanta de echilibru:

K=ka/kd=[AgAc]/[Ag] [Ac]

La un moment dat, reacţia ajunge în punctul de


echilibru în care o jumătate dintre moleculele de anticorp
(o jumătate dintre paratopi) sunt legate (deci se regăsesc
în complexele antigen-anticorp) şi o jumătate sunt libere.
[AgAc]=[Ac], ceea ce arată că, dacă afinitatea
anticorpului este mare pentru haptena specifică lui, atunci
necesită o cantitate mică din acea haptenă pentru a deveni
saturat. Forţa de legare dintre un epitop şi un paratop a
fost numită afinitate. Aceasta reprezintă suma forţelor
non-covalente, de atracţie şi de respingere, care
stabilizează complexul Ag-Ac şi este caracterizată printr-
o particulară constantă de afinitate, Ka, care este egală cu
constanta de echilibru, K.
În mod similar, afinitatea poate fi definită şi dacă
este analizată desfacerea complexului antigen-anticorp.

Kd=[Ag] [Ac]/[AgAc]

unde Kd este constanta de disociere care indică


stabilitatea legăturii odată formate.
Valoarea Ka mai poate fi determinată şi de
diferenţa de energie (ΔG) dintre antigen şi anticorp aflaţi
în stare liberă, pe de o parte şi cea din starea complexată,
pe de altă parte:

6
ΔG=-RT ln Ka

unde R este constanta universală a gazelor, T este


temperatura absolută, ln Ka este logaritmul natural al
constantei de afinitate.
Termenul de afinitate descrie forţa unei legături
monovalente, paratop-epitop. În majoritatea situaţiilor,
însă, antigenele sunt multivalente, prezentând o mulţime
de epitopi diferiţi. În acest caz, legătura Ag-Ac poate fi
descrisă corect prin ecuaţia:

xAc + yAg = AcxAgy

Forţa care caracterizează o astfel de interacţiune


este denumită aviditate. Această forţă este caracterizată
de factori care ţin de heterogenicitatea anticorpilor ce
leagă fiecare epitop în parte, precum şi de
heterogenicitatea determinanţilor antigenici. La acestea
se adaugă un bonus oferit de creşterea cu ordine de
mărime a forţei de legare ce caracterizează întregul
complex.
Pentru a explica acest fenomen, apelăm la ecuaţia
care descrie diferenţa de energie dintre starea liberă şi cea
complexată, fiecare legătură individuală epitop-paratop
putând fi definită după cum urmează:
ΔG1=-RT ln K1

ΔG2=-RT ln K2 etc.

7
În situaţia în care toate aceste legături au loc,
atunci diferenţa globală de energie poate fi caracterizată
prin ecuaţia:

ΔG=ΔG1 + ΔG2 etc = -RT ln K1 –RT ln K2 = -RT (ln K1


+ ln K2) = -RT ln (K1 x K2)

Dar, ΔG= -RT ln Kavid, deci constanta de aviditate


Kavid=K1 x K2 etc.

Altfel spus, aviditatea nu este dată de suma


afinităţilor fiecărei legături paratop-epitop în parte, ci de
produsul acestor afinităţi, reprezentând o manieră mai
corectă de caracterizare a capacităţii de legare a
anticorpilor în cadrul sistemelor biologice, comparativ cu
afinitatea individuală a situsurilor de legare. O aviditate
crescută poate chiar compensa pentru o afinitate scăzută,
iar exemplul cel mai elocvent este oferit de pentamerul
de IgM, care, chiar dacă, adesea, prezintă o afinitate
inferioară celei a IgG, datorită multivalenţei poate lega
antigenul în mod eficient. În plus, aviditatea crescută ce
rezultă din multiple legături epitop-paratop explică şi de
ce un complex antigen-anticorp format din mai multe
legături este mai puţin susceptibil la disociere.

2. Factori care influenţează interacţiunea dintre


antigen şi anticorp

Formarea unui complex antigen-anticorp depinde


de o serie de factori structurali şi fizico-chimici.

8
2.1 Caracteristici structurale
Complementaritatea structurii tridimensionale
dintre un antigen şi un anticorp reprezintă condiţia
fundamentală pentru formarea complexelor imune.

2.1.1 Specificitatea situsurilor de legare a antigenului


Deoarece un răspuns imun este declanşat de
întâlnirea cu un anumit antigen, anticorpii produşi în
timpul acestui răspuns sunt specifici pentru acel
particular antigen (există complementaritate structurală
între anticorpi şi antigene). Specificitatea anticorpilor
este dată de ansamblul aminoacizilor care alcătuiesc
paratopul, secvenţa şi distribuţia lor în spaţiu fiind
determinante pentru capacitatea de legare. Situsurile de
legare ale anticorpilor sunt situate la nivelul regiunilor
hipervariabile ale lanţurilor uşoare şi grele, iar aceste
regiuni formează o serie de bucle care protruzionează şi
sunt în fapt responsabile pentru contactul intim şi legarea
epitopului. Acest concept de specificitate a fost denumit
„sistem lacăt-cheie”, unde lacătul se referă la paratop, iar
cheia la epitop.

2.1.2 Reactivitatea încrucişată


Se referă la o reacţie imunologică în care
anticorpii specifici reacţionează cu:
- două antigene diferite, dar care prezintă epitopi în
comun;
- un epitop diferit, dar cu o structură extrem de
asemănătoare cu a celui care a stimulat producţia
anticorpilor;
- un antigen heterofil (provenind de la alte specii),
care este extrem de asemănător din punct de vedere

9
structural. Anticorpii care reacţionează încrucişat cu
antigene heterofile sunt denumiţi la rândul lor anticorpi
heterofili.

2.1.3 Accesibilitatea antigenică


Deşi legarea unui antigen la un anticorp necesită
complementaritatea (specificitatea) descrisă mai sus, este
la fel de important ca acel particular epitop să fie şi
accesibil pentru paratop. Această accesibilitate este
afectată de caracteristicile structurale ale moleculei de
anticorp, inclusiv ale porţiunii constante şi ale regiunii
balama, capabile să ofere flexibilitate anticorpului şi de
capacitatea sa de a se apropia şi de a lega epitopii.

2.1.4 Structura imunoglobulinelor


Numărul situsurilor de legare antigenică ale unei
molecule de anticorp are un efect direct asupra
dimensiunii complexului antigen-anticorp. Numărul de
monomeri de imunoglobulină depinde de isotip (clasă).
Astfel, IgA poate exista ca monomer sau dimer, situaţie
în care are 4 situsuri de legare şi ar putea fi capabilă să
lege 4 epitopi identici. IgM este secretat sub formă de
pentamer, astfel că valenţa sa teoretică este 10.

2.1.5 Valenţa antigenelor


Dacă un antigen are cel puţin doi epitopi, atunci
este considerat multivalent. Pe măsură ce un antigen
multivalent interacţionează cu anticorpii, aceste molecule
se leagă încrucişat (cross-linking) la antigen şi formează
o reţea tri-dimensională care conduce, in vitro, la apariţia
unui precipitat (vezi şi Reacţia de precipitare). O astfel de
reacţie stă la baza multor metode imunologice care

10
folosesc precipitarea pentru detecţia complexelor
antigen-anticorp. Când antigenul prezintă un singur
epitop, fenomenul de legare încrucişată nu poate apare.
Dacă antigenul este bivalent, se pot forma fie lanţuri
liniare, fie complexe circulare. Dacă antigenul prezintă
epitopi multipli, atunci apar legături încrucişate multiple
şi se formează un complex cu dimensiuni mari. Astfel,
mărimea complexului antigen-anticorp depinde de
valenţa antigenului.

2.1.6 Concentraţia de antigene şi anticorpi


În plus faţă de factorii descrişi anterior, cantitatea
(concentraţia molară relativă) anticorpilor şi a
moleculelor de antigen, împreună cu valenţa celor două
componente, influenţează în mod semnificativ formarea
complexelor imune. O proporţie optimă (concentraţie
molară) între cei doi reactanţi va asigura formarea
legăturilor încrucişate între antigenul multivalent şi
anticorpii specifici. Zona de echivalenţă este definită ca
acea zonă a curbei de precipitare în care raportul
concentraţiei molare antigen/anticorp este perfect şi astfel
toate moleculele de antigen şi anticorp sunt complexate
(vezi şi Reacţia de precipitare).
Prozona este acea porţiune a curbei de precipitare
care caracterizează excesul de anticorp şi care determină
apariţia de complexe Ag-Ac solubile. Postzona este
caracterizată de un exces de antigene, absenţa raportului
ideal dintre antigene şi anticorpi împiedicând şi în
această situaţie formarea unui complex mare, care să
precipite.

11
2.2 Factori fizico-chimici care afectează legarea dintre
antigen şi anticorp

Forţele fizice care sunt responsabile pentru


formarea legăturii antigen-anticorp au fost descrise
anterior, la fel ca şi noţiunile de afinitate şi aviditate.

2.2.1 Factori de mediu


a) concentraţia ionilor de hidrogen
Modificările în pH-ul mediului de reacţie pot determina
ionizarea aminoacizilor, iar aceasta poate induce
modificări conformaţionale, precum şi modificarea
constantei de afinitate.
b) temperatura
Anticorpi precum cei din isotipul IgG necesită o
temperatură de 37oC pentru a forma complexe imune
stabile. În general, la temperaturi de peste 40oC sunt
afectate atât moleculele de antigen, cât şi cele de
anticorp, prin alterarea conformaţiei lor şi chiar prin
denaturarea proteinei, iar un anticorp denaturat s-ar putea
să nu mai posede deloc situsurile de legare. Creşterea
temperaturii scade stabilitatea complexului antigen-
anticorp şi determină disocierea lui.

2.2.2 Concentraţia în săruri (forţa ionică)


O concentraţie scăzută de săruri favorizează o
legare specifică a anticorpilor la antigene. Această
observaţie a condus la dezvoltarea unor metode de
laborator care utilizează produşi cu forţă ionică scăzută
sau concentraţii scăzute de sare (în special în băncile de
sânge), tocmai pentru a promova formarea complexelor
antigen-anticorp. În cazul unor concentraţii crescute de

12
săruri, se poate produce pierderea (neutralizarea)
situsurilor active ale moleculelor care interacţionează,
ceea ce conduce la scăderea afinităţii dintre antigen şi
anticorp sau chiar inhibarea completă a legării. De aceea,
în metodele care se bazează pe reacţia antigen-anticorp,
trebuie evitată evaporarea probelor, tocmai pentru a
preveni creşterea concentraţiei sărurilor.

2.2.3 Potenţialul zeta


Suprafaţa anumitor antigene particulate poate
prezenta o sarcină electrică. Un exemplu important se
referă la hematii. Când astfel de antigene sunt suspendate
în soluţii saline (mediu de reacţie) se formează un
potenţial electric între astfel de particule, denumit zeta,
care le împiedică să se apropie una de alta. În acest fel,
reacţia de aglutinare a eritrocitelor încărcate negativ de
către anticorpii de clasă IgG se produce cu dificultate.
Acest fenomen este explicat şi prin aceea că porţiunile
Fab ale IgG sunt prea scurte pentru a putea surmonta
potenţialul zeta a două hematii.

13
Anticorpi monoclonali

Cele mai multe antigene cu care organismul intră


în contact au o structură complexă, prezentând o
multitudine de epitopi diferiţi. Ca urmare, răspunsul imun
declanşat va fi direcţionat împotriva fiecărui determinant
antigenic accesibil şi vor fi generate, astfel, o multitudine
de clone limfocitare (răspuns policlonal). Un antiser
(serul ce provine de la un organism imunizat)
convenţional reprezintă un amestec de anticorpi cu
diferite specificităţi.
Obţinerea de anticorpi cu o unică specificitate
(anticorpi monoclonali) a fost tentată iniţial prin
adsorbţia dintr-un antiser polispecific a tuturor
anticorpilor cu specificităţi nedorite, cu ajutorul unui
amestec de antigene care nu includeau însă şi antigenul
de interes. În scurtă vreme, a devenit evident că această
abordare nu conduce la un preparat satisfăcător. Ideea că
ar trebui mai degrabă separate celulele producătoare de
anticorpi cu o unică specificitate a părut mult mai
atractivă. Au fost puse la punct metode pentru a izola
aceste puţine celule, dar s-a ivit o nouă dificultate, ce
părea de această dată insurmontabilă: aceste celule
normale nu putea fi menţinute în cultură decât pe termen
scurt. Metoda pusă la punct de Georges Kohler şi Cesar
Millstein în 1975 pentru producerea anticorpilor
monoclonali a reprezentat o adevarată breşă tehnologică

14
şi, totodată, o revoluţie ce a deschis poarta utilizării
anticorpilor în biologie şi medicină. În anul 1984, celor
doi li s-a acordat premiul Nobel pentru medicină, premiu
pe care l-au împărţit cu Niels Jerne, cel care a adus
bazele teoretice, introducând conceptul de clonalitate a
sistemului şi a răspunsului imun.
Producţia anticorpilor monoclonali are la bază
observaţia că, spre deosebire de celulele normale, care nu
pot fi menţinute în cultură, celulele maligne, în particular
celulele mielomatoase, pot fi cultivate practic nelimitat
(celule imortalizate). Era nevoie deci de o celulă care să
îmbine capacitatea de a secreta anticorpii cu
specificitatea dorită şi capacitatea de a creşte în cultură.
O astfel de celulă hibrid (hibridom) a fost obţinută prin
fuziunea unei celule producătoare de anticorpi cu o celulă
mielomatoasa. Celulele hibrid sau heterokaryoni, conţin
nuclei de la ambele celule parentale dar, prin pierderea
aleatorie a unor cromosomi şi prin proliferarea ulterioară
a acestor celule, va rezulta o clonă de celule care conţin
un singur nucleu, cu cromosomi de la fiecare dintre cele
două celule de origine. Iniţial, pentru fuziunea celulelor
era folosit virusul Sendai, dar metoda de elecţie utilizează
în prezent polietilenglicolul (PEG).
Celulele mielomatoase, la fel ca şi celulele
normale, au la dispoziţie două căi pentru sinteza ADN-
ului, calea principală şi calea secundară sau “de salvare”,
ambele funcţionând în paralel. Calea secundară utilizează
enzima HGPRT (Hipoxantin Guanin Phospho Ribosil
Transferaza).
În cazul hibridoamelor destinate secreţiei
anticorpilor monoclonali, celulele mielomatoase utilizate
îndeplinesc două condiţii importante: 1) nu secretă

15
anticorpi şi 2) au un defect al enzimei HGPRT care nu
permite utilizarea căii secundare de sinteză a ADN-ului.
Selectarea celulelor HGPRT-negative se realizează prin
incubarea celulelor cu 8-azaguanină (8AzG), substanţă
care, încorporată în ADN printr-o reacţie catalizată de
HGPRT, determină moartea celulei, aceasta neputând
funcţiona cu o bază alterată. Dacă, însă, o celulă nu are
enzima HGPRT funcţională, nu va putea încorpora 8AzG
şi va supravieţui.
Producţia anticorpilor monoclonali debutează prin
imunizarea animalelor de laborator cu antigenul ales
(figura 1). Cele mai utilizate animale în acest scop sunt
şoarecii, dar anticorpii monoclonali pot fi produşi în
diverse alte specii, cu condiţia existenţei de celule
mielomatoase aparţinând speciei respective. După
stimularea repetată cu Ag şi obţinerea unui răspuns imun
(RI) puternic, animalul este sacrificat şi i se extrage
splina. Aceasta este prelucrată şi splenocitele sunt
introduse în cultură. Dat fiind faptul că splenocitele
provin de la un animal puternic imunizat, acest amestec
celular conţine un procent ridicat de limfocite cu
specificitatea dorită.
În continuare, celulele mielomatoase HGPRT-
negative sunt fuzionate cu plasmocitele din splină,
rezultatul constând dintr-un amestec de celule
mielomatoase nefuzionate, celule hibrid şi plasmocite
nefuzionate. În urma fuzionării, singurele celule de
interes sunt doar cele hibrid. Dacă plasmocitele normale,
nefuzionate, vor muri spontan după câteva zile, în
schimb, celulele mielomatoase şi celulele hibrid, care
moştenesc caracterul malign, supravieţuiesc în cultură.
Dintre aceste ultime două tipuri celulare, doar celulele

16
hibrid prezintă ambele căi de sinteză a ADN-ului,
moştenire de la plasmocitul normal, în timp ce celulele
mielomatoase nefuzionate prezintă doar calea principală
de sinteză a ADN-ului.

Fig. 1 Principiul obţinerii de anticorpi monoclonali prin tehnica


hibridoamelor (adaptat după Roitt I, Brostoff J, Male D, 2001)

Uciderea selectivă a celulelor mielomatoase


nefuzionate se realizează cu ajutorul unui mediu de

17
cultură denumit HAT (Hipoxantina, Aminopterina,
Timidina). Aminopterina este un analog de acid folic,
care blochează calea principală de sinteză a ADN-ului,
interferând conversia tetrahidrofolatului în dihidrofolat.
Astfel, doar celulele hibrid pot supravieţui şi prolifera
utilizând calea de salvare, în timp ce celulele de mielom
nefuzionate vor fi ucise în prezenţa aminopterinei.
Odată ce celulele hibrid au fost izolate,
următoarea etapă constă în selectarea acelor hibridoame
care secretă anticorpii cu specificitatea dorită. În acest
scop, se fac diluţii care vor duce la plasarea în fiecare
dintre godeurile unei plăci de cultură a unei singure
celule, ceea ce va asigura monoclonalitatea celulelor din
godeul respectiv. Astfel, de vreme ce anticorpii vor fi
produşi de celulele unei singure clone, ei vor fi identici
din punct de vedere al isotipului, al allotipului şi al
idiotipului, deci al specificităţii şi al afinităţii pentru un
anumit epitop.
Celulele hibrid vor prolifera şi, totodată, vor
secreta anticorpi în supernatant. Acesta va fi recoltat, iar
specificitatea anticorpului va fi testată, de obicei printr-
un test ELISA, utilizându-se antigenul de interes. Este,
astfel, evident că, pentru producerea anticorpilor
monoclonali, trebuie să existe şi o sursă de determinanţi
antigenici necesari pentru screening-ul hibridoamelor.
Godeurile care conţin celulele ce produc
anticorpii cu specificitatea dorită sunt izolate şi
amplificate numeric în cultură (clonate), ceea ce va
permite producerea unei cantităţi mari de anticorpi.
Capacitatea secretorie a celulelor hibrid are tendinţa de a
scădea în timp, dar menţinerea ei se poate realiza prin
două metode. Hibridoamele sunt fie cultivate pe scară

18
largă, apoi împărţite în aliquoturi ce vor fi păstrate în azot
lichid şi la care se poate apela pentru reinstaurarea unei
culturi, fie sunt inoculate unor şoareci ascitogeni
particulari, de la care pot fi obţinute titruri impresionante
de anticorpi. De câte ori este posibil însă, se încearcă
evitarea utilizării animalelor.
Avantajul deosebit al anticorpilor monoclonali
este acela că o cantitate practic nelimitată de material
identic poate fi oferită tuturor laboratoarelor şi, astfel,
rezultatele obţinute de diferite centre din întreaga lume
pot fi comparate.
Odată pusă la punct, tehnologia hibridoamelor a
fost extinsă şi la limfocitele T, obţinându-se hibrizi din
celule T maligne şi non-maligne, capabili să prolifereze
şi să se activeze. Astfel de hibridoame s-au dovedit
extrem de utile pentru studiul relaţiei dintre limfocitele T
şi epitopul pentru care acestea exprimă receptor specific.
Utilizarea anticorpilor monoclonali are aplicaţii
dintre cele mai diverse în cercetare, diagnostic şi
tratament.
Cei mai mulţi anticorpi monoclonali sunt produşi
cu ajutorul hibridoamelor murine. Introducerea în scop
terapeutic a unor astfel de anticorpi în organismul uman
înseamnă, practic, administrarea unei doze însemnate de
antigen. În această situaţie, anticorpii murini sunt
recunoscuţi ca molecule non-self de către sistemul imun
al gazdei şi îndepărtaţi, fiind deci împiedicaţi să-şi atingă
ţinta. În anumite situaţii, se poate întâmpla ca anticorpii
monoclonali murini să fie preluaţi de către celulele
tumorale, procesaţi, prezentaţi în cupa MHC I
limfocitelor T citotoxice şi să devină astfel o ţintă a
atacului limfocitelor T citotoxice sau să ajute la

19
amplificarea unui răspuns faţă de imunogene slabe de pe
suprafaţa celulelor tumorale. În plus, dată fiind cantitatea
mare de antigen cu care sistemul imun ia contact brusc,
pot apare reacţii de hipersensibilitate de tip „boala
serului”. În mod evident, soluţia pentru această problemă
este utilizarea de anticorpi monoclonali umani, dar
producţia acestora in vitro, prin metoda descrisă mai sus,
nu a a fost nici pe departe satisfăcătoare.
Rezolvarea acestei probleme a venit odată cu
apariţia tehnologiei ce permite introducerea ADN-ului în
celule, procedeu numit transfecţie. În plus, secvenţa de
ADN pe care dorim să o introducem într-o anumită celulă
poate fi modificată prin procesul denumit generic
mutageneză, astfel că celulele hibrid mielomatoase pot fi
făcute să producă anticorpi monoclonali modificaţi, în
funcţie de design-ul secvenţei genice introduse. Acest
proces de inginerizare a moleculelor permite construirea
de gene în care o porţiune, ce provine de la o specie,
codează pentru regiunea variabilă a imunoglobulinelor şi
o altă porţiune, de la o altă specie, codează pentru
fragmentul constant, Fc. În această manieră, se pot obţine
anticorpi monoclonali recombinanţi în care regiunea
variabilă aparţine anticorpului murin, iar porţiunea
constantă aparţine imunoglobulinei umane – un anticorp
monoclonal chimeric, care este cu mult mai puţin
imunogenic decât anticorpul murin. Astfel de anticorpi
sunt denumiţi „umanizaţi”.
Pentru producerea ultimei generaţii de anticorpi
monoclonali umanizaţi se procedează la grefarea
secvenţelor genice murine, care codează pentru cele şase
regiuni hipervariabile (CDR – regiuni care determină
complementaritatea), la secvenţa responsabilă pentru

20
codarea unei imunoglobuline umane, în acest fel,
singurul element al anticorpului ce provine de la şoarece
fiind chiar paratopul.
Printr-o tehnologie similară, pot fi produşi
anticorpi recombinanţi care conţin porţiunea destinată
legării antigenului cuplată la o porţiune cu capacitatea de
a acţiona ca o enzimă. Aceste molecule sunt denumite
abzime, iar unul dintre avantajele lor este acela că pot fi
utilizate în diferite teste de detecţie a antigenelor fără a fi
nevoie de un anticorp secundar.
În aceeaşi manieră, anticorpii pot fi construiţi în
aşa fel încât să includă co-factori pentru complexe
metalice sau toxine (imunotoxine). Deoarece
imunotoxinele nu au porţiunea Fc, nu vor fi interceptate
de către celulele care prezintă receptori Fc, astfel că
aceşti anticorpi vor fi capabili să se lege doar la celulele
tumorale, ceea îi face extrem de eficienţi în acţiunea lor
terapeutică.
Amplificarea ADN-ului cu ajutorul reacţiei PCR
(polymerase chain reaction) permite, pornind de la ADN-
ul obţinut din hibridoame sau plasmocite, generarea de
biblioteci de gene, inclusiv pentru lanţurile grele şi
uşoare ale imunoglobulinelor. Asocierea aleatorie a
acestora generează Fab-uri, iar prin screening-ul acestora
împotriva unor diverse antigene este decelată
specificitatea lor. Cu ajutorul acestei tehnologii, astăzi
este posibilă producerea unui număr enorm de clone cu
diferite specificităţi, efectuarea unui screening rapid şi
generarea unui construct Fab al unui anticorp monoclonal
fără să fie nevoie de imunizarea unui animal de laborator.
Un alt avantaj este că se poate creşte afinitatea de legare
a anticorpului respectiv prin procesul denumit „gene

21
shuffling”, în care o genă VH ce codează pentru un
anticorp cu o afinitate rezonabilă este recombinată
aleatoriu cu un grup de gene VL, iar anticorpii obţinuţi
sunt apoi supuşi selecţiei cu ajutorul antigenului.
Procesul poate fi ulterior continuat prin combinarea unei
gene VL cu un grup de gene VH.
Anticorpii bispecifici sau heteroconjugaţi
reprezintă un alt tip de molecule hibrid, obţinute prin
cuplarea unor anticorpi cu specificităţi diferite. Astfel de
anticorpi pot fi obţinuţi fie prin cross-legare chimică, fie
prin sintetizarea lor în hibridoame obţinute prin fuziunea
a două astfel de linii celulare. Prin ambele metode sunt
produse amestecuri de anticorpi mono-specifici şi bi-
specifici, din care ar trebui apoi extraşi anticorpii bi-
specifici, astfel că, din nou, soluţia acestei probleme este
inginerizarea genelor şi utilizarea doar a acelora
responsabile pentru codarea celor două specificităţi.
Utilitatea anticorpilor bi-specifici s-a regăsit în terapia
anti-tumorală, anticorpul legându-se printr-un paratop la
celula malignă şi prin celălalt la o celulă efector a
sistemului imun (celulă NK, limfocit T citotoxic efector -
CTL, macrofag activat). Heteroconjugaţii sunt gândiţi în
aşa fel încât activează celula efector atunci când sunt
cuplaţi şi la celula tumorală, declanşând distrucţia
acesteia.
Un număr tot mai mare de anticorpi monoclonali,
fie puri, fie cuplaţi cu alte substanţe, încep să fie utilizaţi
în terapia unor afecţiuni dintre cele mai diverse.
Prezentăm mai jos doar câţiva dintre aceşti anticorpi
monoclonali, împreună cu denumirile lor comerciale.

22
Denumire Molecula ţintă Utilizare
Alemtuzumab CD52 Leucemia B
(Campath) limfocitică cronică
Trastuzumab Receptorul Neoplasm mamar
(Herceptin) Her2/neu Her2-pozitiv
Rituximab CD20 Recăderi ale
(Rituxan) limfoamelor non-
Hodgkin
Gemtuzumab CD33 Leucemie mieloidă
(Mylotarg) acută
Infliximab TNF Artrita reumatoidă,
(Remicade) boala Crohn
Palivizumab Proteina F a Infecţia cu virus
(Synagis) virusului sinciţial sinciţial respirator la
respirator copii
Daclizumab CD25 Rejet acut în
(Zenapax) trasplantul renal
Muromonab-CD3 CD3 Rejet acut în
(Orthoclone transplantul cardiac,
OKT3) hepatic, renal
Adaptat după Carter P, Nat Rev Cancer, 2001

23
Reacţia de precipitare

1. Precipitarea în soluţie
Reacţia de precipitare se produce atunci când
anticorpii reacţionează cu antigene solubile, iar rezultatul
este un complex antigen-anticorp care îşi pierde
solubilitatea şi precipită. Formarea unui complex Ag-Ac
solubil poate avea loc într-un interval de doar câteva
minute, pe când formarea unui precipitat necesită o
perioadă mult mai lungă de timp (1-2 zile). Explicaţia
pentru obţinerea unui astfel de precipitat este dată de
necesitatea formării de legări multivalente care conduc la
apariţia unei adevărate reţele tridimensionale. Atunci
când complexul ajunge la o anumită dimensiune îşi
pierde solubilitatea şi precipită.
Formarea acestui precipitat depinde nu doar de
cantitatea de antigen şi de anticorp, dar şi de valenţa
fiecăruia dintre reactanţi. Antigenul trebuie să fie în mod
obligatoriu cel puţin bivalent, deci trebuie să aibă cel
puţin două copii ale aceluiaşi epitop; multivalenţa
constituie un real avantaj pentru producerea precipitării.
Un experiment simplu, care demonstrează
necesitatea existenţei unui raport optim între cele două
componente ale reacţiei antigen-anticorp, poate fi realizat
într-un set de tuburi care conţin o cantitate constantă de
anticorp. În fiecare dintre aceste tuburi, va fi adăugată o

24
cantitate progresiv crescândă de antigen specific
anticorpului utilizat. După formarea complexelor
antigen-anticorp, tuburile sunt centrifugate şi precipitatul
este depus la fundul recipientului, putând fi izolat cu
uşurinţă şi cuantificat. Se observă astfel că, pe măsură ce
tot mai mult antigen este adăugat, cantitatea de precipitat
creşte, până la atingerea unui optim, după care, adăugarea
în continuare de antigen va determina, în mod paradoxal,
scăderea cantităţii de precipitat obţinut.
Cantitatea maximă de precipitat este obţinută
atunci când între antigen şi anticorp există un raport
ideal, această situaţie fiind denumită „zonă de
echivalenţă”. Atunci când există un exces de anticorpi
(prozonă) sau, din contră, un exces de antigen (postzonă),
deoarece proporţiile existente între cei doi reactivi nu
permit formarea unei reţele mari, rezultatul este că se
formează complexe mici şi solubile (figura 1).
Acest aspect este în mod particular valabil în zona
excesului de antigen, situaţie în care se formează o
cantitate minimă de precipitat, dar în supernatant sunt
prezente cantităţi importante de complexe Ag-Ac
solubile. Situaţia excesului de anticorpi are însă o
importanţă deosebită într-o multitudine de teste
imunologice. Explicaţia este dată de numărul mare de
paratopi în raport cu numărul de epitopi, ceea ce face ca
anticorpii să se lege mai degrabă monovalent şi, astfel, să
nu poată lega antigenele între ele.
Agregatele mici care se formează în urma reacţiei
dintre anticorpi şi antigene solubile determină, din punct
de vedere macroscopic, scăderea transparenţei lichidului
şi un aspect de tulbure, prin creşterea turbidităţii.

25
Fig. 1 Curba de imunoprecipitare arată efectul concentraţiei de
antigen şi anticorp asupra cantităţii de precipitat format în
cursul reacţiei (adaptat după Benjamini E, Coico R, Sunshine G,
2000).

Turbidimetria decelează turbiditatea unei soluţii


prin măsurarea absorbţiei luminii şi a scăderii intensităţii
acesteia la trecerea prin soluţia respectivă. Absorbţia
fasciculului luminos se realizează proporţional cu
mărimea, concentraţia şi forma moleculelor prezente în
soluţie.
Nefelometria (tehnica imunonefelometrică) este
o metodă de cuantificare a proteinelor dintr-o soluţie în
care se adaugă anticorpi faţă de substanţa ce urmează să
fie testată şi care determină formarea de complexe imune
solubile. Această tehnică se bazează pe măsurarea
nivelului de împrăştiere a unui fascicul de lumină
monocromatică la trecerea prin această soluţie (light
scatter). Lumina este înregistrată cu ajutorul unui senzor

26
situat la un anumit unghi faţă de fasciculul emis.
Cantitatea de lumină împrăştiată este, astfel, o măsură a
cantităţii de antigen ce se doreşte a fi cuantificată. În
contrast cu reacţiile de precipitare, nefelometria este
realizată în exces de anticorp şi nu în zona de
echivalenţă. Există două abordări ale nefelometriei, rate
şi fixed-time, ambele permiţând măsurarea cu acurateţe a
unor clase de imunglobuline (IgG şi subclasele sale, IgA,
IgM), a unor factori ai sistemului complement (C3, C4,
factor B), a proteinei C reactive (CRP) şi ale altor
proteine serice. Metoda poate fi adaptată inclusiv pentru
determinarea unor proteine ce se găsesc în cantităţi
scăzute, atât în sânge, cât şi în lichidul cefalorahidian.
Dată fiind disponibilitatea pentru automatizare a acestei
tehnici, ea a devenit o metodă aproape standard pentru
realizarea imunogramei în multe laboratoare clinice.

2. Precipitarea în gel
Precipitatele imune se pot forma nu doar în
soluţie ci şi în medii semisolide, cum ar fi gelurile de
agar, care au proprietatea de a lăsa soluţiile apoase de
antigen şi de anticorp să difuzeze liber. Efectuarea
acestor reacţii în geluri a oferit posibilitatea de a distinge
între reacţii antigen-anticorp diferite, produse de diferiţi
anticorpi prezenţi în ser. În această manieră s-a putut
realiza şi examinarea relaţiei dintre diferite antigene.

2.1 Dubla imunodifuzie (Oucthterlony)


În acest test, denumit după inventatorul ei, gelul
de agar este turnat într-o placă Petri, în care sunt
practicate godeuri distincte, necesare pentru plasarea
reactivilor, într-un godeu, antigenul şi, în celălalt godeu,

27
anticorpul. Tehnica poate fi însă miniaturizată, astfel
încât să fie efectuată pe lame de microscop.
Dat fiind faptul că sunt substanţe apoase,
antigenul şi anticorpul vor difuza din godeurile în care au
fost amplasate şi vor forma gradiente de concentraţie, cea
mai mare concentraţie fiind în imediata proximitate a
godeului. Totodată, prin acest proces de difuzie se vor
îndrepta unul către celălalt, iar pe măsură ce moleculele
celor doi reactanţi se întâlnesc vor forma complexe
antigen-anticorp. La o anumită distanţă dintre cele două
godeuri, raportul dintre anticorp şi antigen va fi unul
optim, cele două componente găsindu-se astfel în zona de
echivalenţă, iar complexele antigen-anticorp vor fi
incluse într-o reţea tridimensională ce va deveni vizibilă
sub forma unei linii fine de precipitare (figura 2).

Fig. 2 Dubla imunodifuzie conduce la obţinerea unei linii de


precipitare în cazul utilizării unui singur antigen sau a mai
multor linii dacă sunt utilizate amestecuri de antigene (adaptat
după Benjamini E, Coico R, Sunshine G, 2000).

28
Viteze diferite de difuzie, atât ale anticorpilor cât
şi ale antigenelor, reflectă diferenţe în concentraţie,
greutate moleculară sau formă.
Dacă sunt utilizate mai multe godeuri în care sunt
plasate antigenele, pattern-ul liniilor de precipitare care
se formează e de natură să ofere informaţii despre
diferenţele dintre antigenele utilizate.
În figura 3 (1) anticorpii difuzează spre antigene
şi generează o linie de precipitare continuă, coalescentă.
Acest aspect trădează faptul că substanţele cu care au
reacţionat anticorpii sunt identice din punct de vedere
antigenic, iar o linie de precipitare de acest tip este
denumită pattern de identitate.

Fig. 3 Dubla imunodifuzie. Diferitele pattern-uri ale liniilor de


precipitare reflectă relaţia dintre antigene. 1) identitate 2) non-
identitate 3) identitate parţială (adaptat după Benjamini E,
Coico R, Sunshine G, 2000).

Figura 3 (2) demonstrează situaţia în care într-un


godeu a fost plasat un amestec de anticorpi, iar aceştia, la
contactul cu antigenele din cele două godeuri, generează
linii de precipitare independente, distincte, care se
intersectează net unele cu celelalte. Un astfel de pattern
reflectă completa non-identitate a celor două antigene.
O a treia variantă este aceea în care pattern-ul este
cel al unei identităţi parţiale. Figura 3 (3) arată o linie de

29
precipitare similară pattern-ului de identitate, dar care
prezintă un „pinten” suplimentar. Acesta reflectă faptul
că cele două antigene au epitopi în comun, dar că
antigenul 1 prezintă şi epitopi suplimentari, responsabili
pentru reacţia suplimentară a unor molecule de anticorp.
Dubla imunodifuzie poate fi utilizată fie ca o
tehnică semicantitativă, fie calitativă. Pot fi evaluate
relaţia dintre anumiţi anticorpi şi antigene în soluţie.
Comparaţia dintre un material de referinţă şi un ser
necunoscut permite evaluarea comparativă a identităţii,
identităţii parţiale sau non-identităţii moleculelor
componente. Metoda este în mod curent utilizată pentru
evaluarea prezenţei autoanticorpilor anti – fibră
musculară, anti-RNP (anti-nuclear ribonuclear protein)
anti-SS-A (anti-Sjögren syndrome A), anti-SS-B (anti-
anti-Sjögren syndrome B), anti-Scl-70, anti-Jo1 etc.
Chiar dacă nu are sensibilitatea multor metode
cantitative, acest test este uşor de realizat şi poate fi pus
în lucru chiar şi când antigenele sunt doar parţial
purificate, este înalt specific şi e foarte util ca test de
screening pentru prezenţa unui anumit antigen sau
anticorp.

2.2 Imunodifuzia radială simplă (Mancini)


O variantă cantitativă a testului Ouchterlony este
reprezentată de testul Mancini. În această metodă, gelul
de agar conţine deja anticorpii, într-o diluţie potrivită,
ceea ce înseamnă că aceştia sunt omogenizaţi în mediul
semisolid şi răspândiţi uniform în întregul volum al
gelului. Diferite concentraţii de antigen dizolvate în
volume standard sunt plasate ulterior în godeurile rotunde
realizate în agar. Plăcile sunt lăsate la incubat cel puţin

30
24h, timp în care antigenul difuzează centrifug în gel. Pe
măsură ce antigenul se depărtează de godeu, concentraţia
acestuia scade progresiv până ce va ajunge într-un raport
optim cu cea a anticorpului din gel, deci va ajunge în
zona de echivalenţă. În aceste condiţii, precipitatul care
se formează are dimensiuni maxime şi va putea fi
vizualizat prin inelul de precipitare care se formează şi
care centrează godeul (figura 4). Diametrul inelului de
precipitare este un indicator al concentraţiei antigenului,
aceasta fiind determinată prin compararea diametrului cu
cele obţinute prin utilizarea unui set de standarde
(concentraţii cunoscute).

Fig. 4 Linia de precipitare apare sub forma unui inel care


centrează godeul. Diametrul inelului este proporţional cu
cantitatea de antigen (adaptat după Delves PJ, Martin SJ,
Burton DR, Roitt IM, 2006).

Imunodifuzia radială simplă este o metodă simplă


şi eficientă de cuantificare a imunoglobulinelor (inclusiv
a subclaselor IgG), a compuşilor sistemului complement
sau a altor proteine serice care se găsesc în concentraţii
relativ mari, dar există şi kituri care extind sensibilitatea
tehnici până la 0,03 mg/l.
Se descriu însă situaţii în care tehnica Mancini va
furniza rezultate eronate:

31
a) În macroglobulinemia Waldenström, gammopatie
monoclonală malignă, caracterizată prin
hipergamaglobulinemie M (IgM monomerică),
concentraţia IgM determinată prin această metodă
va avea o valoare foarte mare, dar această valoare
nu este cea reală, fiind dată de monomerul de IgM
care, având greutate moleculară scăzută, va difuza
mai rapid decât IgM pentameric.
b) În cazul unor concentraţii mari de factor
reumatoid (IgM anti-IgG), determinarea IgM prin
această tehnică duce, din nou, la rezultate false,
întrucât IgM reacţionează cu IgG, se vor forma
complexe IgM-IgG, iar acestea, ca urmare a
greutăţii moleculare mai mari decât a
pentamerilor IgM, vor migra mai încet.
La acestea se pot adăuga potenţiale erori tehnice generate
de încărcarea incorectă a godeurilor, uscarea gelului,
plasarea gelului într-un plan care nu este perfect
orizontal, sau erori de calcul, de vreme ce concentraţia
finală a unei probe diluate este obţinută prin
multiplicarea rezultatelor cu un factor de diluţie
corespunzător.

3. Imunelectroforeza
Electroforeza proteinelor serului permite
separarea acestora în 5 fracţii majore: albumine, α1-, α2-,
β- şi γ-globuline.
Diferenţele de migrare ale proteinelor în câmpul
electric sunt datorate sarcinilor electrice distincte,
mărimii şi greutăţii moleculare ale moleculelor, dar şi
unor caracteristici ale mediului de migrare (în principal

32
pH 1 ) sau unor condiţii fizice (de ex. temperatura). În
tabelul următor sunt rezumate componentele fracţiilor
proteice ale serului.

Fracţia proteică Componente


albumină
α1-globulină α1-acid glicoproteic
α1-antitripsina
α-lipoproteina
α2-globulină α2-macroglobulina
α2-antitripsina
Haptoglobina
β-globulină Fibrinogen
β-lipoproteina
Transferina
Complement
IgA
γ-globulină Proteina C reactivă
IgM, IgG, IgD, IgE
Adaptat după Thomas L, 1998.

Benzile de migrare de la nivelul gelului vor putea


fi ulterior colorate, iar scanarea densitometrică a acestora
va permite transformarea pattern-ului benzilor în grafice
caracteristice (electroforegrame), ceea ce permite
cuantificarea fiecărei fracţii proteice. Intensitatea
marcării/grosimea benzii determină dimensiunea vârfului

1
Proteinele sunt substanţe amfotere, astfel că, în funcţie de pH-ul
mediului, se pot comporta ca baze sau acizi, ceea ce se reflectă şi
asupra sarcinii lor electrice. Într-un tampon de migrare alcalin de
exemplu, proteinele vor avea caracter acid şi o sarcină electrică
negativă.

33
reprezentat în grafic, iar aceasta reflectă concentraţia
fracţiei respective (figura 5A).

A B

C D

Fig. 5 Conversia benzilor obţinute prin electroforeză în vârfuri


caracteristice. A. electroforegramă normală; B. gammopatie
monoclonală; C. gammopatie policlonală; D. inflamaţie cronică;
E. ciroză (modificat după Thomas L, 1998).

Majoritatea isotipurilor de imunoglobuline se


regăsesc în fracţia γ a serului. Gammopatiile policlonale
sunt caracterizate de benzi largi, difuze şi intens colorate
la nivelul fracţiei γ, ceea ce reflectă o creştere a cantităţii
de imunoglobuline cu diferite isotipuri şi specificităţi

34
(figura 5C). Aceste molecule sunt secretate de plasmocite
diverse şi reprezintă, cel mai adesea, rezultatul stimulării
antigenice cronice de către diverşi patogeni (figura 5D),
sau al unei afecţiuni hepatice cronice (figura 5E).
Apariţia unui vârf ascuţit în regiunea γ-
globulinelor din electroforegramă este sugestivă pentru
prezenţa unei gammopatii monoclonale. O astfel de
proteină apare ca o consecinţă a proliferării necontrolate
(în dauna altor clone de limfocite B) a unei singure clone
de limfocite, care s-au diferenţiat în celule secretante de
anticorpi. În majoritatea cazurilor, stimulul nu este unul
antigenic, cel mai adesea fiind vorba de o afecţiune
malignă B (figura 5B).
Anumite molecule, cum ar fi proteina C reactivă,
variante ale factorului C3 al complementului,
fibrinogenul, complexele hemoglobină-haptoglobină,
care apar în sângele hemolizat, pot apare pe
electroforegramă în aceleaşi regiuni ca şi componentele
monoclonale. Aceste molecule pot fi caracterizate şi
diferenţiate de componentele monoclonale prin
imunofixare sau prin imunelectroforeză.
3.1 Imunelectroforeza este efectuată de obicei în
cazul în care este necesară confirmarea prezenţei unui
component monoclonal, detectat prin electroforeză.
Metoda reprezintă o variantă a precipitării în gel,
în care unul dintre componentele reacţiei Ag-Ac, de
obicei antigenul, este mai întâi supus separării în câmp
electric. Dacă substanţa supusă electroforezei reprezintă
în fapt un amestec heterogen de molecule, vor putea fi
separate fracţii electroforetice. Apoi, curentul este stopat
şi, în gelul utilizat pentru migrare, se practică un godeu
lung, paralel cu direcţia de migrare a proteinelor, în care

35
va fi introdus anticorpul sau amestecul de anticorpi.
Oprirea curentului electric permite fracţiilor
electroforetice şi anticorpilor să difuzeze în gel,
îndreptându-se unele către celelalte. Acolo unde cele
două componente se întâlnesc, la nivelul zonei de
echivalenţă, va apare un arc de precipitare (figura 6).

Fig. 6 Pattern-uri ale benzilor de imunelectroforeză ale


proteinelor serice (adaptat după Benjamini E, Coico R, Sunshine
G, 2000).

Utilizând anticorpi obtinuţi în alte specii, prin


imunelectroforeză putem decela dacă un pacient produce
cantităţi anormale (prea mari sau prea mici) dintr-un
anumit isotip. Pot fi identificate doar lanţurile grele sau
doar lanţurile uşoare ale imunoglobulinelor, după cum
poate fi evidenţiată şi hiperproducţia altor proteine din
fracţiile electroforetice ale serului. Totodată, metoda
poate fi utilizată şi pentru identificarea unor alte antigene
decât cele serice.
Trebuie subliniat însă că imunelectroforeza nu
este o metodă cantitativă şi, în plus, este capabilă să
deceleze proteine care au concentraţii de ordinul μg/ml.
3.2 Electroforeza de imunofixare
(immunofixation electrophoresis - IFE) este utilizată ca
o alternativă la imunelectroforeză şi este destinată
caracterizării fracţiilor proteice din gammopatiile
monoclonale din punct de vedere al specificităţii

36
antigenului, mobilităţii electroforetice, cantităţii fiecărei
fracţii proteice şi raportului dintre aceste fracţii.
Electroforeza de imunofixare diferă de imunelectroforeză
prin aceea că în timpul celei de a doua etape, anticorpii
(de obicei monoclonali) sunt aplicaţi direct peste gel,
ceea ce le permite să se lege direct la antigenele pentru
care sunt specifici şi să formeze o bandă.
3.3 Electroforeza contracurent (countercurrent
electrophoresis) este similară ca principiu dublei
imundifuzii, dar migrarea se realizează în câmp electric.
Această tehnică poate fi aplicată însă doar la un pH ales
în aşa fel încât antigenul şi anticorpul să aibă sarcini
electrice diferite. Astfel, la un pH de 8.0, anticorpii vor fi
încărcaţi pozitiv, în timp ce antigenele alese vor fi
încărcate negativ şi vor migra către polul pozitiv, aparent
în contra curentului electric. Uneori, în acest scop,
antigenelor li se pot ataşa grupări încărcate negativ.
Antigenul şi anticorpul sunt plasate în godeuri
distincte şi, odată cu aplicarea curentului electric, se vor
deplasa unul către celălalt. Antigenul migrează către zona
în care se găseşte anticorpul şi aici va lega succesiv
cantităţi progresiv crescânde de anticorp. În plus, ca
urmare a vitezei accelerate de migrare impuse de curentul
electric, linia de precipitare care apare la nivelul zonei de
echivalenţă se formează într-un interval de timp mult mai
scurt, ceea ce face ca electroforeza contracurent să fie un
test mai sensibil şi mai rapid decât dubla imunodifuzie.
3.4 Electroforeza în rachetă (rocket
electrophoresis) reprezintă o variantă a difuziei simple
Mancini şi permite cuantificarea nivelului antigenelor.
Anticorpii sunt introduşi direct în gelul de agar şi astfel
distribuiţi uniform în întregul volum al acestuia. pH-ul

37
gelului este ales în aşa fel încât anticorpii să rămână
staţionari în gel, în timp ce doar antigenele să devină
încărcate negativ şi să difuzeze astfel către anod atunci
când este aplicat curentul electric. Aceasta este totodată
şi o limitare a tehnicii. Unele proteine, cum sunt
imunoglobulinele, nu sunt încărcate suficient pentru a
putea fi analizate prin această metodă şi necesită un
tratament special pentru a le putea amplifica migrarea
către polul pozitiv.
Pe măsură ce antigenele migrează în gel, vor
apare o serie de benzi de precipitare, având o formă
caracteristică, similară cozii în flăcări a unei rachete.
Înălţimea arcului de precipitare (cozii de rachetă) este
proporţională cu concentraţia antigenului (figura 7).

Fig. 7 Antigenele migrează în gelul care conţine anticorpi şi


generează arcuri de precipitare cu o formă caracteristică
(adaptat după Golub ES, 1987).

3.5 Focusarea isoelectrică (isolectric focusing)


reprezintă o metodă alternativă pentru separarea
proteinelor dintr-un amestec, care se bazează pe existenţa

38
unor diferenţe foarte mici între punctele isoelectrice ale
acestor proteine. Această tehnică este folosită în special
pentru detectarea anumitor enzime serice şi pentru
separarea hemoglobinei, dar poate fi utilizată şi pentru
detectarea benzilor de imunoglobuline oligoclonale din
lichidul cefalorahidian.

39
Reacţia de aglutinare

Reacţia de aglutinare apare atunci când anticorpii


reacţionează cu antigene particulate, insolubile, cum ar fi
celule sau molecule carrier multivalente inerte, şi
determină formarea unui complex tridimensional stabil,
cu o dimensiune mare, care devine vizibil sub forma unui
agregat. Din acest punct de vedere, reacţia de aglutinare
seamănă cu cea de precipitare. Anticorpii care pot
conduce la o reacţie de aglutinare sunt denumiţi
aglutinine.
Procesului de aglutinare i se descriu 2 etape:
- Etapa de sensibilizare vizează particulele
antigenice şi se poate produce in vivo sau in vitro. Acest
proces reversibil implică practic prima etapa a reacţiei
antigen-anticorp în timpul căreia un anumit paratop se
leagă la un epitop individual de pe suprafaţa antigenului
multivalent. Această reacţie de „sensibilizare” nu este
detectabilă decât dacă unul dintre cei doi reactivi este
marcat.
- Etapa de formare a agregatului este cea în care
apare legarea încrucişată (cross-linking) dintre epitopii
rămaşi liberi şi paratopii corespunzători ai anticorpilor,
ceea ce conduce la formarea unui complex
tridimensional. Agregatele pot fi vizibile microscopic sau
chiar macroscopic, în funcţie de mărimea acestora.

40
Reacţia de aglutinare poate fi influenţată în mod
particular de o serie de factori.
- Isotipul anticorpilor: anticorpii multivalenţi, cum
sunt cei de clasă M, sunt molecule mari, care conţin
multiple situsuri de legare şi de aceea sunt mai eficienţi
în realizarea aglutinării – a legăturii dintre particule –
decât cei monovalenţi, de clasă G. Mai mult, în situaţia în
care serul conţine cantităţi crescute de anticorpi care nu
pot induce aglutinarea, aceştia se vor lega la epitopii
antigenului, blocând accesul anticorpilor aglutinanţi. O
altă explicaţie pentru capacitatea scăzută de aglutinare a
anumitor isotipuri este dată de relativa rigiditate a
regiunii balama, care împiedică molecula de anticorp să
adopte unghiul necesar dintre fragmentele Fab şi Fc,
pentru legarea epitopilor situaţi pe antigene diferite.
- Sarcina electrică: Suprafaţa anumitor antigene
particulate poate fi încărcată cu o anumită sarcină
electrică: de ex., sarcina electrică negativă netă de pe
suprafaţa hematiilor este cauzată de prezenţa acidului
sialic. Când astfel de particule încărcate sunt suspendate
în soluţie salină, între particule apare un potenţial electric
numit zeta, care le împiedică să se apropie una de
cealaltă. Acest potenţial crează un obstacol suplimentar
în realizarea aglutinării, prin intermediul anticorpilor, a
particulelor încărcate electric, în particular a eritrocitelor
de către IgG. Distanţa dintre braţele Fab ale IgG, chiar şi
în forma cea mai extinsă, este prea scurtă pentru a realiza
legarea (unirea) a 2 hematii depăşind potenţialul zeta.
Astfel, deşi IgG reacţionează specific cu antigene de pe
suprafaţa eritrocitelor, aglutinarea nu se produce datorită
respingerii determinate de potenţialul zeta. În schimb,
unele Fab ale IgM sunt suficient de depărtate şi pot

41
determina legarea eritrocitelor. Această proprietate a
anticorpilor IgM, împreună cu faptul că sunt multivalenţi,
reprezintă principalele motive pentru eficienţa lor în
realizarea aglutinării.
- Numărul de epitopi ai antigenului: numărul,
localizarea şi distribuţia epitopilor de la nivelul unui
particular antigen sunt de natură să influenţeze reacţia de
aglutinare. Antigenele care prezintă o multitudine de
determinanţi antigenici vor facilita legarea încrucişată a
anticorpilor. Există însă şi situaţii în care anumiţi epitopi
cheie sunt situaţi în aşa numite „buzunare”, greu
accesibile anticorpilor, după cum există posibilitatea ca
tocmai densitatea crescută a epitopilor să fie cea care va
împiedica legarea paratopilor.
- Concentraţia celor doi reactivi: în general,
aglutinarea se produce mai rapid atunci când
concentraţiile de antigen şi anticorp sunt crescute.
Trebuie subliniat însă că, la fel ca şi în cazul reacţiei de
precipitare, efectul maxim va fi obţinut atunci când există
o proporţie echilibrată între componentele reacţiei
antigen-anticorp, deci în zona de echivalenţă. Excesul de
anticorp (prozona) sau de antigen (postzona) pot inhiba
reacţia de aglutinare. Efectul de prozonă prezintă în mod
particular relevanţă pentru testele imunologice şi poate fi
detectat prin amestecarea unor diluţii seriate de ser cu o
concentraţie fixă de antigen. Utilizarea de diluţii ale
anticorpilor este obligatorie, întrucât testarea serului la o
singură diluţie poate conduce la rezultate false: absenţa
aglutinării poate să însemne nu numai absenţa
anticorpilor, dar şi situarea în prozonă. Titrul anticorpilor
se referă la concentraţia cea mai mică a acestora în
mediul de reacţie, (diluţia cea mai mare) la care reacţia se

42
mai poate produce, iar măsurarea sa este o metodă semi-
cantitativă.
- Factori de mediu: amestecarea sau vortexarea,
temperatura sau perioada de incubare sunt doar
câteva dintre condiţiile care pot influenţa eficienţa
reacţiei.
Aglutinarea poate fi însă amplificată prin modificarea
unor factori variaţi:
- reducerea legăturilor ionice ale mediului de
reacţie prin adăugarea de soluţii saline cu putere
ionică scăzută (LISS – low ionic strength saline);
- scăderea sarcinii electrice de suprafaţă prin
adăugarea de albumină (5-30%);
- creşterea vâscozităţii prin adăugarea de substanţe
precum dextranul;
- reducerea sarcinii de suprafaţă a eritrocitelor şi
expunerea de epitopi adiţionali prin adăugarea de
enzime (bromelina, papaina, ficina, tripsina);
- creşterea contactului dintre antigene şi anticorpi
prin agitare şi centrifugare;
- menţinerea unei temperaturi corespunzătoare în
timpul reacţiei: de exemplu, IgG reacţionează
optim între 30oC şi 37oC, în timp ce IgM
aglutinează în mod optim între 4oC şi 27oC;
- menţinerea unui pH corespunzător (6.7 – 7.2):
majoritatea reacţiilor, cu excepţia celor la care
participă IgM, se desfăşoară în mod optim la acest
pH.
Complexele antigen-anticorp formate, în special cele
la care participă IgM, au capacitatea de a activa sistemul
complement şi, astfel, determină liza hematiilor. Această
etapă a aglutinării este adesea denumită etapa terţiară,

43
deoarece necesită adăugarea de complement pentru
producerea lizei celulare. Hemoliza este astfel un
indicator al unor diverse teste, utilizate în special în
băncile de sânge.
Reacţia de aglutinare poate fi realizată în mod direct
sau indirect.
1. Aglutinarea directă este denumită ca atare
deoarece interacţiunea dintre antigene şi anticorpi
conduce la apariţia unui agregat în mod direct (figura 1).

Fig. 1 Aglutinare directă: Anticorpii care leagă epitopii


aparţinând unor antigene particulate determină agregarea
acestora (modificat după Lefkovits I, 1997).

Aglutinarea poate fi realizată pe lame de sticlă, în


tuburi sau în godeurile unor plăci (figura 2).

44
B

Fig. 2 Aglutinarea poate fi detectată macroscopic pe lame de


sticlă (A), în tuburi (B) sau în plăci de microtitrare (C). Mărimea
agregatului reflectă intensitatea reacţiei.

Reacţia poate fi folosită fie pentru identificarea


unor antigene necunoscute, fie a unor anticorpi
necunoscuţi, dar probabil cea mai cunoscută reacţie este
cea de determinare a grupelor sanguine în sistemul ABO
(figura 3). Explicaţiile pentru apariţia unei reacţii de
aglutinare directă constau, pe de o parte, în existenţa unui
număr mare de epitopi accesibili, iar pe de altă parte, în
participarea la reacţie a unor anticorpi multivalenţi. În
cazul sistemului ABO, ambele condiţii sunt îndeplinite,
eritrocitele prezintă o cantitate mare de antigene, iar
anticorpii implicaţi în recunoaşterea acestor glucide sunt
de clasa M.
Nu doar eritrocitele pot fi subiectul procesului de
aglutinare directă. Metoda poate fi utilizată şi în cazul
bacteriilor. O suspensie celulară conţinând bacterii

45
necunoscute este incubată într-un set de tuburi, cu diluţii
seriate de anticorpi având specificităţi cunoscute, iar
reacţia va fi citită după o perioadă corespunzătoare de
incubare. Prezenţa aglutinării bacteriilor este evidenţiată
prin tulburarea suspensiei, ceea ce atestă prezenţa speciei
bacteriene vizate.

Anti-A Anti-B

Fig. 3 Aglutinarea eritrocitelor sub acţiunea aglutininelor din


sistemul ABO apare rapid şi poate fi observată macroscopic.

Aglutinarea nu este o metodă cantitativă ci doar


semicantitativă, rezultatul fiind exprimat sub forma
diluţiei maxime la care agregarea este încă decelabilă.
2. Aglutinarea indirectă este reacţia în care
legarea anticorpilor la antigene nu determină aglutinarea,
concentraţia epitopilor fiind una scăzută, iar anticorpii
specifici fiind, cel mai adesea, de clasă G. Este situaţia

46
întâlnită în cazul grupului sanguin Rh, în care epitopii
proteici se găsesc într-un număr mult mai mic pe
membranele eritrocitelor, comparativ cu antigenele
grupului ABO. În plus, dat fiind faptul că antigenele sunt
proteine, anticorpii anti-Rh, ce apar ca urmare a
imunizării, aparţin isotipului G, iar legarea acestora la
antigenele Rh nu reuşeşte să determine legări încrucişate
şi agregarea eritrocitelor. Ca urmare, este nevoie de o
etapă suplimentară în care hematiile care au fixat
anticorpii anti-Rh sunt incubate cu anticorpi IgM anti-
IgG şi, acest anticorp, fiind multivalent, reuşeşte să
determine aglutinarea eritrocitelor (figura 4).
Reacţia de aglutinare descrisă mai sus se
adresează doar antigenelor particulate, iar simplitatea şi
sensibilitatea ei au făcut să fie extinsă şi în cazul
antigenelor solubile.

Fig. 4 Model schematic al aglutinării indirecte. Anticorpii care


recunosc antigenele ţintă nu au capacitatea de a induce
agregarea acestora, aglutinarea fiind obţinută cu ajutorul
anticorpilor secundari, ideal de clasă M (modificat după
Lefkovits I, 1997).

3. Aglutinarea pasivă este o metodă în care astfel


de antigene solubile sunt ataşate ferm la suprafaţa unor

47
particule solide, insolubile, care pot fi chiar hematiile.
Acest lucru a fost posibil prin tratarea suprafeţei celulare
cu diferite substanţe (de exemplu, cu acid tanic) sau prin
utilizarea unor agenţi de legare bifuncţionali ca
bisdiazobenzidina. Cele mai utilizate eritrocite în acest
scop sunt cele de curcan, datorită vitezei lor crescute de
sedimentare. Testul este efectuat de obicei în godeurile
unor plăci de cultură, în care pattern-ul de sedimentare
este mai uşor de observat.
Hematiile au început să fie înlocuite progresiv cu
particule sintetice inerte din bentonită sau latex, iar
acestea din urmă au fost ameliorate prin utilizarea unui
co-polimer de glicidil metacrilat şi stiren, care furnizează
un set de domenii hidrofilice şi hidrofobice. Avantajele
unor astfel de particule sunt date de dimensiunea perfect
controlată, de cuantificarea cu mai mare precizie a
antigenelor care le tapetează, de absenţa forţelor de
respingere ce ar trebui surmontate, dar şi de absenţa
agregării nespecifice.
O altă variantă a aglutinării pasive utilizează
anticorpi fixaţi la particule solide, iar acestea vor fi
incubate cu antigenele.
4. Testele de inhibiţie a aglutinării sunt utilizate
atunci când se încearcă identificarea unor cantităţi mici
de antigen şi se bazează pe competiţia pentru acelaşi
anticorp dintre un antigen fixat la un suport solid şi un
antigen solubil cunoscut.
În timpul primei etape, produsul recoltat de la
pacient este incubat cu o cantitate bine determinată de
anticorpi a căror specificitate este cunoscută. Dacă în
produsul biologic ce provine de la pacient există

48
moleculele de antigen a căror prezenţă dorim să o
determinăm, se vor forma complexe antigen-anticorp.
În a doua etapă, sunt adăugate şi antigene cuplate
la particule insolubile. Dacă anticorpii au reacţionat în
prima etapă cu antigenele solubile, atunci fie că nu vor
mai exista deloc molecule disponibile şi aglutinarea nu se
va mai produce, fie numărul de molecule de anticorp
rămase este scăzut şi aglutinarea va fi slabă. Astfel, o
reacţie este considerată pozitivă atunci când aglutinarea
nu apare, deci când s-a produs inhibarea aglutinării, ceea
ce atestă prezenţa antigenului suspectat în produsul
biologic investigat.
De exemplu, antigenul solubil numit
2
tiroglobulină poate fi ataşat la particule de latex, astfel
încât adăugarea de anticorpi anti-tiroglobulină să producă
agregarea particulelor. Adăugarea de antigen solubil
peste anticorpi (serul unui pacient cu tiroidită autoimună)
înainte de adăugarea particulelor de latex tapetate cu
tiroglobulină va determina legarea celor două
componente şi aglutinarea nu se va mai produce –
inhibiţia aglutinării.
Inihibiţia aglutinării este utilizată nu doar în
diagnosticul unor afecţiuni, ci şi în testele de dopaj sau de
identificare a prezenţei anumitori droguri în sânge şi
urină dar, în acest ultim caz, există riscul reactivităţii
încrucişate a anticorpilor utilizaţi cu diferite
medicamente şi de aceea, o reacţie pozitivă va trebui
întotdeauna confirmată prin tehnici care nu se bazează pe
legarea anticorpilor.

2
Tiroidita Hashimoto este o afecţiune autoimună ce conduce la
distrugerea foliculilor tiroidieni; ca urmare, tiroglobulina este
eliberată în ser.

49
Un exemplu adesea menţionat în legătură cu
utilizarea testului de inhibiţie a aglutinării este cel al
virusurilor care pot induce aglutinarea hematiilor.
5. Testul anti-imunoglobulinic (testul Coombs)
Testul anti-imunoglobulinic este un exemplu de
aglutinare mediată de anticorpi. Metoda este intens
utilizată în centrele de transfuzie pentru decelarea de
anticorpi cum sunt cei de tipul IgG, care, chiar şi în cazul
extensiei maxime a braţelor Fab, nu reuşesc să ajungă să
lege două eritrocite şi, astfel, să formeze o reţea. Din
acest motiv, anticorpii de clasă G sunt denumiţi
„anticorpi incompleţi”. În această situaţie, este adăugat
un al doilea anticorp, anti-imunoglobulină umană, care să
lege porţiunile Fc ale anticorpilor IgG legaţi deja la
antigenele de pe suprafaţa hematiilor. De abia aceste
complexe care se formează vor fi responsabile pentru
agregarea eritrocitelor (hemaglutinare). Trebuie remarcat
faptul că intensitatea reacţiei de hemaglutinare este
proporţională cu cantitatea de anticorpi care tapetează
eritrocitele (figura 5).

Fig. 5 Testul Coombs se bazează pe principiul aglutinării


indirecte (adaptat după Benjamini E, Coico R, Sunshine G,
2000).

50
Există două variante ale testului Coombs, directă
şi indirectă.
În testul direct (DAT – direct immunoglobulin
test), anti-imunoglobulinele sunt adăugate la particule
(ex. eritrocite) care sunt suspectate că ar avea anticorpi
legaţi la suprafaţa lor. De ex., dacă un nou născut este
suspect de boală hemolitică produsă de anticorpi materni
anti-Rh, adăugarea de anti-imunoglobuline faţă de IgG
materne s-ar lega la acestea şi ar conduce la aglutinare.
În testul indirect, se urmăreşte detectarea
prezenţei în ser a anticorpilor specifici pentru anumite
antigene de pe suprafaţa unei celule sau particule.
Anticorpii adăugaţi peste celule sau particule nu conduc
la aglutinare, dar dacă se adaugă ulterior anti-
imunoglobuline, acestea vor determina aglutinarea. O
aplicaţie obişnuită a testului Coombs indirect este
detecţia anticorpilor IgG anti-Rh din sângele femeilor
Rh-negative. Testul presupune ca serul femeii să fie
adăugat peste eritrocite Rh+, apoi este adăugat anticorp
anti-imunoglobulină umană.

51
Teste de fază solidă - Solid phase assay

1. RIA (Radio Immuno Assay)


În anul 1977, medicul endocrinolog Rosalyn
Yalow a primit premiul Nobel pentru medicină, ca o
recunoaştere a importanţei tehnicii, pe care împreună cu
SA Berson, a imaginat-o şi a utilizat-o. Cu ajutorul
acestei metode sensibile, cei doi au fost primii capabili să
măsoare concentraţii de până la 0,001 μg/ml. Testul
original era destinat măsurarii insulinei, a cărei
concentraţie serică este atât de mică încât, la vremea
respectivă, nu putea fi cuantificată prin nici o altӑ
tehnică.
Principiul pe care se bazează metoda este cel al
competiţiei pentru o cantitate constantă de molecule de
anticorp specific între un ligand marcat radioactiv, ligand
a cărui concentraţie este cunoscută şi unul nemarcat, a
cărui concentraţie trebuie determinată (proba de interes).
Cantitatea de antigen marcat utilizată este calculată astfel
încât să poată satura întreaga cantitate de anticorp (figura
1).
Adaptată ca tehnică de fază solidă, în RIA
semnalul este măsurat exclusiv la nivelul suprafeţei
solide. Într-o prima etapă, antigenul este incubat la
nivelul unei suprafeţe solide şi o cantitate oarecare va fi
adsorbită la nivelul acesteia, în timp ce moleculele
nelegate vor fi îndepărtate prin spălare. Situsurile rămase

52
neocupate vor fi blocate prin incubarea cu o proteină
irelevantă, pentru a împiedica legarea directă,
nespecifică, a anticorpilor la suprafaţa respectivă. În
etapa următoare, este adăugat anticorpul test, având o
specificitate cunoscută, dedicată antigenului imobilizat.
Moleculele de anticorp în exces sunt înlăturate prin
spălare, după care cele legate sunt detectate cu ajutorul
unui ligand radiomarcat.

Fig. 1 Principiul pe care se bazează RIA. O cantitate cunoscută


de antigen radiomarcat este incubată cu o cantitate limitată de
anticorp. Antigenul nelegat este îndepărtat şi se măsoară doar
radioactivitatea complexelor (adaptat după Benjamini E, Coico
R, Sunshine G, 2000).

2. RIST – Radioimmunosorbent test


Metoda este o variantă RIA, bazată pe principiul
competiţiei dintre un ligand marcat şi unul nemarcat,
dedicată detecţiei şi cuantificării cantităţii totale de
anticorpi de clasă E. Suprafaţa solidă este tapetată cu
anticorpi anti-IgE şi, într-o primă etapă, va fi tratată cu
cantităţi cunoscute, progresiv crescânde, de IgE
radiomarcat, pentru a determina capacitatea maximă de
legare a plăcii. În etapa următoare, este utilizată o
cantitate de aproximativ 70-80% de IgE radiomarcat din
acest maxim, amestecată cu o cantitate necunoscută de
IgE nemarcat (proba biologică de interes). Cu cât

53
radioactivitatea măsurată este mai mică, cu atât cantitatea
de IgE din proba de investigat este mai mare (figura 2).

Fig. 2 Testul RIST se bazează pe competiţia dintre o cantitate


cunoscută de IgE radiomarcat şi o cantitate necunoscută de IgE
din serul pacientului (adaptat după Roitt I, Brostoff J, Male D,
2001).

3. RAST – Radioallergosorbent test


Evidenţierea unei cantităţi crescute de IgE total în
serul unui pacient reprezintă o informaţie foarte utilă, de
natură să orienteze diagnosticul către o afecţiune al cărei
mecanism poate fi explicat de hipersensibilitatea de tip I.
Metoda RIST poate fi utilizată pentru cuantificarea IgE,
dar nu poate evidenţia specificitatea anticorpilor de clasă
E, deci a antigenului (alergenului) responsabil pentru

54
manifestările bolii respective. În acest scop, este necesară
utilizarea unei metode alternative, denumită RAST.
RAST reprezintă o metodă de screening alergenic
şi de identificare a profilului alergenelor. Testul este
efectuat în general pacienţilor care prezintă reacţii severe
la testarea dermică, sau în cazul copiilor, atunci când se
încearcă stabilirea existenţei unei sensibilităţi la diverse
alimente sau polen. Protocolul de lucru utilizat implică
legarea unei cantităţi mari de antigen (alergen) la un disc
de celuloză, astfel încât un număr cât mai mare de epitopi
să fie disponibili pentru legarea la un număr foarte mic
de molecule de IgE din serul pacientului. De vreme ce
doar acest particular isotip este de interes, detecţia
acestor anticorpi se va realiza în etapa următoare cu
ajutorul unor anticorpi anti-IgE radiomarcaţi (figura 3).

Fig. 3 Testul RAST este destinat măsurării cantităţii de IgE


specific pentru un anumit alergen. Sensibilitatea metodei derivă
şi din cantitatea mare de antigen fixat covalent pe suportul de
celuloză (adaptat după Roitt I, Brostoff J, Male D, 2001).

55
4. ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ELISA reprezintă una dintre cele mai utilizate
tehnici bazate pe reacţia antigen-anticorp. Descrisă iniţial
de către Engvall şi Perlmann în 1971, apoi de către
Schuurs şi Van Veemen în 1977, reprezintă şi astăzi una
dintre cele mai simple şi sigure metode pe care le avem la
dispoziţie.
Tehnica se încadrează de asemenea în categoria
denumită „solid phase assay”, în care fracţiile de anticorp
legat şi, respectiv, liber sunt separate în mod fizic prin
etapele de spălare, iar antigenul care trebuie detectat şi
măsurat este fizic ataşat la o suprafaţă solidă. Suprafeţele
solide sunt reprezentate de materiale plastice speciale,
care oferă situsuri de legare pentru moleculele ţintă.
Trebuie remarcat că antigenele glucidice nu pot fi ataşate
la astfel de suprafeţe în mod direct şi trebuie cuplate la
proteine purtător ca poli-L-lizina sau tiramina.
Din punct de vedere al principiului metodei,
ELISA este similară RIA, fiind dezvoltată, iniţial, ca o
alternativă la aceasta, cu deosebirea că măsurarea
semnalului nu se face cu ajutorul unor substanţe
radioactive, care necesită manipulări speciale şi
precauţiuni deosebite pentru manevrarea deşeurilor
radioactive, ci se bazează pe o reacţie colorimetrică
produsă de o enzimă care degradează un substrat.
Sensibilitatea ELISA poate fi amplificată astfel încât să
devină comparativă cu RIA.
Astăzi, există un număr remarcabil de mare de
variante ale acestei tehnici, iar utilizarea ELISA pe scară
largă după atâţia ani de la introducerea ei reprezintă o
dovadă a calităţilor pe care le prezintă. În plus, există o
serie întreagă de enzime care pot fi utilizate în acest scop,

56
dintre care peroxidaza din hrean (HRP – horseradish
peroxidase), β-galactozidaza şi fosfataza alcalină sunt
preferate, în primul rând datorită stabilităţii lor. Deoarece
fiecare moleculă de enzimă poate degrada un număr
oarecare de molecule de substrat, semnalul obţinut este
proporţional cu numărul moleculelor de cromogen
degradate şi, indirect, cu stabilitatea şi activitatea enzimei
respective. La rândul lor, substraturile cromogene pot fi
alese în aşa fel încât să determine amplificarea
semnalului de culoare. De exemplu, primul substrat
folosit produce, prin degradare, un produs care, la rândul
lui, va acţiona ca o co-enzimă pentru o a doua enzimă, ce
va degrada mai departe un substrat specific. Un sistem
larg răspândit se bazează pe interacţiunea, caracterizată
de o extraordinară specificitate şi afinitate, dintre biotină
(cu care sunt cuplate de obicei moleculele de anticorp) şi
avidină (cu care sunt cuplate moleculele de enzimă).
Varianta tehnică, în care antigenul să fie detectat
cu ajutorul anticorpilor primari direct cuplaţi cu o
anumită enzimă, nu este utilizată.

4.1 ELISA indirectă


Este preferată, cel mai adesea, varianta indirectă,
ca urmare a avantajului oferit de sensibilitatea sa
crescută. Principiul metodei este descris schematic în
figura 4.
Antigenele sunt ataşate la suprafaţa de plastic a
unor godeuri, tuburi sau bile. Pentru a împiedica, în etapa
ulterioară, legarea nespecifică a anticorpilor la plastic,
prin intermediul fragmentului Fc, situsurile rămase
neocupate la nivelul suprafeţei solide sunt blocate cu
ajutorul unor proteine irelevante, al căror exces

57
(moleculele nelegate) este îndepărtat prin spălare cu
detergenţi.

Fig. 4 Antigenele imobilizate la suprafaţa solidă vor fi legate de


către anticorpi nemarcaţi. Legarea acestora va fi evidenţiată
într-o etapă ulterioară prin adăugarea de anticorpi secundari
cuplaţi cu o enzimă şi apoi a unui substrat cromogen.

În etapa următoare, sunt adăugaţi anticorpii


primari, ce provin, cel mai adesea, din serul pacientului
investigat. După o perioadă corespunzătoare de incubare,
antigenele fixate la plastic vor fi legate de către anticorpii
specifici, iar anticorpii nelegaţi vor putea fi îndepărtaţi
prin spălare.
Legarea anticorpilor primari la antigenele
specifice cu formarea complexelor antigen-anticorp este
pusă în evidenţă prin adăugarea de anticorpi secundari
specifici pentru un anumit isotip. Anticorpii secundari
sunt fie cuplaţi direct cu enzima, fie sunt biotinilaţi,

58
situaţie în care va fi necesară o etapă suplimentară, de
incubare cu un complex format din streptavidină şi
enzimă. Excesul de reactivi nelegaţi la suprafaţa solidă
este îndepărtat prin spălare.
În ultima etapă, în mediul de reacţie este adăugat
substratul cromogen care, degradat de către enzima cu
care este cuplat anticorpul secundar, va genera o reacţie
de culoare particulară sistemului enzimă-substrat utilizat.
Intensitatea culorii este proporţională cu numărul de
molecule de substrat degradate, iar acesta este
proporţional cu numărul de molecule de enzimă care au
acţionat asupra lor, deci cu numărul de molecule de
anticorp secundar. Numărul de molecule de anticorp
secundar depinde de numărul de molecule de anticorp
primar care au legat cantitatea cunoscută de antigen fixat
la suprafaţa solidă. Astfel, prin măsurarea intensităţii
reacţiei de culoare cu ajutorul unui spectrofotometru,
putem obţine informaţii cantitative.
Datorită popularităţii ei, pentru tehnica ELISA s-a
ajuns la un nivel de standardizare ce a impus utilizarea de
plăci cu câte 96 de godeuri şi o anumită dimensiune, ceea
ce a condus şi la dezvoltarea de spectrofotometre
adaptate acestora, denumite cititoare ELISA.

4.2 ELISA sandwich


Această variantă tehnică utilizează suprafeţe
solide tapetate cu anticorpi dedicaţi antigenului vizat şi
permite identificarea şi măsurarea cantităţii unor antigene
solubile din diverse fluide. Practic, lichidul în care se
găsesc antigenele de interes este incubat în godeurile
plăcii tapetate cu anticorpi. După o perioadă de incubare
care permite legarea antigenelor la anticorpi, moleculele

59
de antigen rămase nelegate sunt îndepărtate prin spălare,
iar cele capturate în complexele antigen-anticorp sunt
detectate cu ajutorul unui al doilea strat de anticorpi.
Aceşti anticorpi secundari sunt marcaţi, fie direct cu
enzimă, fie cu biotină, variantă care necesită o incubare
suplimentară cu complexe streptavidină-enzimă. Excesul
de anticorpi secundari este îndepărtat prin spălare, după
care se adaugă cromogenul. Intensitatea reacţiei de
culoare va fi proporţională cu concentraţia antigenului
(figura 5).

Fig. 5 ELISA sandwich. Antigenul vizat este legat între două


straturi de anticorpi.

4.3 ELISA competitivă


În toate tehnicile descrise în acest capitol (solid
phase assays), măsurarea semnalului se realizează cu

60
stricteţe la nivelul suprafeţei solide. Această variantă a
ELISA nu face excepţie, dar prima ei etapă implică
incubarea, în soluţie, a probei ce conţine antigenul de
interes cu anticorpi, ceea ce permite formarea de
complexe imune solubile. O cantitate mare de antigen va
determina, în mod proporţional, legarea unei cantităţi
mari de molecule de anticorp, astfel că, în etapa
următoare, vor fi disponibile, în mod proporţional, mai
puţine molecule de anticorp libere.
Soluţia care conţine amestecul de complexe
antigen-anticorp şi molecule libere de anticorp este
introdusă în godeurile unei plăci ELISA tapetate cu
antigen, situaţie ce permite anticorpilor rămaşi liberi să se
lege la antigenele imobilizate la placă, în timp ce
complexele antigen-anticorp, solubile, vor fi îndepărtate
prin spălare. Legarea anticorpilor la antigenele fixate va
fi evidenţiată prin adăugarea de anticorpi secundari
conjugaţi cu enzimă şi apoi substrat.
De această dată, intensitatea culorii este invers
proporţională cu cantitatea de antigen din proba
investigată. Cu cât cantitatea de antigen este mai mare, cu
atât cantitatea de anticorp rămasă disponibilă pentru
detecţie este mai mică.

4.4 ELISPOT
ELISPOT reprezintă o metodă alternativă pentru
identificarea şi cuantificarea celulelor secretante de
citokine sau anticorpi.
În cazul plasmocitelor, într-o primă etapă,
suprafaţa de plastic a unui vas de cultură este tapetată cu
antigene. Apoi, suspensia celulară este incubată în vasul
respectiv, ceea ce permite celulelor să se distribuie la

61
nivelul acelei suprafeţe şi să secrete anticorpi. Odată
secretaţi, dacă sunt specifici pentru antigenele imobilizate
la placă, anticorpii se vor lega rapid la antigenele din
imediata proximitate a celulelor care i-au secretat şi vor
forma un inel de complexe antigen-anticorp în jurul
celulei respective.
Celulele sunt înlăturate în etapa următoare, iar
legarea anticorpilor va putea fi evidenţiată cu ajutorul
sistemului descris mai sus, anticorp secundar cuplat cu
enzimă şi substrat.
Când se urmăreşte identificarea limfocitelor T
care secretă o anumită particulară citokină, suprafaţa
plăcii de cultură va fi tapetată cu molecule de anticorp
specifice pentru citokina respectivă. Apoi, suspensia de
limfocite T va fi introdusă în vas şi celulele vor fi
incubate suficient timp cât să se distribuie într-un
monostrat şi să secrete factori solubili. Dacă printre
aceştia se găseşte şi citokina de interes, ea va fi capturată
la suprafaţa de plastic de către anticorpii care o acoperă.
După înlăturarea celulelor, legarea citokinei va putea fi
pusă în evidenţă cu ajutorul unui al doilea strat de
anticorpi marcaţi.

5. Chemiluminiscenţa

Chemiluminiscenţa reprezintă o alternativă


avantajoasă a tehnicii ELISA. Ea se bazează pe
măsurarea luminii ce rezultă din anumite reacţii chimice,
fapt ce o face mult mai eficientă şi mai sensibilă,
comparativ cu ELISA. În această variantă, substratul
cromogenic este înlocuit cu un substrat caracterizat prin
capacitatea de a emite lumină în prezenţa unei enzime.

62
Principiul metodei se bazează pe interacţiunea
dintre antigenele de interes şi anticorpi cuplaţi cu enzimă
(de exemplu, fosfataza alcalină sau peroxidază-HRP), iar
developarea reacţiei utilizează un substrat
chemiluminiscent care, în prezenţa enzimei legată la
anticorpi, generează o luminiscenţă continuă, cu o
intensitate constantă şi proporţională cu cantitatea de
enzimă, deci, indirect, cu cantitatea de antigen, ce poate
fi măsurată şi cuantificată în acest fel.
Pe lângă sensibilitatea crescută, un avantaj
important al unei astfel de metode este cel legat de
posibilitatea de automatizare, deci de efectuare a unui
număr mare de determinări în condiţiile unor manipulări
minime. O astfel de platformă bazată pe
chemiluminiscenţă este denumită Immulite, al cărei
principiu este descris pe scurt în cele ce urmează:
- conjugatele formate din anticorpi şi fosfatază
alcalină sunt ataşate la nişte bile speciale, care vor fi
incubate cu proba ce conţine antigenul de interes.
Cantitatea de fosfatază alcalină legată prin intermediul
anticorpului de antigen este proporţională, în cazul unui
test sandwich, sau invers proporţională, în cazul unui test
bazat pe principiul competiţiei, cu concentraţia analitului
din produsul biologic de analizat.
- odată ce unitatea de testat este spălată, pentru
îndepărtarea excesului de reactanţi, se adaugă un substrat
luminogenic.
- după o perioadă de incubare de 10 minute,
unitatea de testat este poziţionată în faţa tubului
fotomultiplicator (PMT), unde lumina generată de reacţia
luminogenică este măsurată. *Spre deosebire de reacţiile
chemiluminiscente bazate pe esteri de acridină, care

63
produc o reacţie luminoasă de tip „flash”, reacţia
enzimatică amplificată în sistemul Immulite produce o
strălucire prelungită.
- în reacţia luminogenică, substratul (adamantyl
dioxetane phosphate) este defosforilat într-un anion
instabil intermediar de către conjugatul de fosfatază
alcalină fixat pe suportul bilelor. Compusul intermediar
instabil emite fotoni în procesul de descompunere.
Cantitatea de lumină emisă este direct proporţională cu
cantitatea de fosfatază alcalină legată.
În mod remarcabil, în comparaţie cu alte mijloace
de detecţie, chemiluminiscenţa furnizează cel mai înalt
grad de sensibilitate. În multe situaţii, sensibilitatea
metodei ajunge să fie mai mare cu ordine de mărime
decât cea obţinută prin teste bazate pe substanţe
radioactive (radioimmunoassay).

64
Imunohistochimia

Studiile histologice clasice nu pot furniza detalii


asupra localizării tisulare si celulare a proteinelor.
Întrucât localizarea celulară a proteinelor poate da
informaţii asupra rolurilor lor fiziologice, iar identificarea
proteinelor modificate în cursul unor afecţiuni ar putea
contribui la elucidarea mecanismelor patologice ale
acestora, au fost dezvoltate metode de vizualizare prin
microscopie optică sau electronică.
Tehnica imunohistochimică este dedicată
identificării antigenelor proteice de la nivel celular sau
tisular. Principiul tehnicii se bazează pe abilitatea
anticorpilor de a interacţiona specific cu epitopi sau
antigene. Ţesuturile destinate investigării prin această
metodă sunt fixate şi apoi incluse la parafină.
Fixatorii sunt utilizaţi pentru capacitatea lor de a
proteja ţesuturile de autoliză (inhibă activitatea enzimelor
lizozomale) şi de a împiedica dezvoltarea bacteriilor şi a
mucegaiurilor. Totodată, ei stabilizează celulele şi
ţesuturile, menţinându-le antigenicitatea şi permit accesul
anticorpilor la moleculele de interes. Cei mai populari
fixatori conţin formalină (40% formaldehidă în apă), o
sare neutră pentru menţinerea tonicităţii şi, frecvent, un
tampon pentru menţinerea unui anumit pH. Sunt bine
toleraţi de ţesuturi şi asigură o penetrabilitate bună a
reactivilor utilizaţi la ţintele moleculare. Există situaţii în

65
care localizarea antigenelor face imposibilă detectarea lor
prin aplicarea directă a anticorpilor specifici. Acest
impediment a fost depăşit prin tratarea secţiunilor, după
deparafinare şi rehidratare, fie cu enzime (digestie
proteolitică), fie cu soluţii pe bază de citrat de sodiu,
procedeu ce permite fenomenul de demascare antigenică.
Reactivul pivot, comun tuturor tehnicilor de
imunohistochimie este molecula de anticorp. În tehnicile
imunohistochimice pot fi utilizaţi anticorpi monoclonali
sau policlonali. Anticorpii monoclonali au fost descrişi
într-un capitol pecedent. Anticorpii policlonali sunt
obţinuţi prin imunizarea cu peptide antigenice a
animalelor de laborator: şoarece, iepure, capră, porc,
oaie, cal, cobai etc; sunt produşi de celule diferite şi
interacţionează cu epitopi variaţi de la nivelul antigenului
faţă de care au fost sintetizaţi. Pentru a reduce legarea
nespecifică a anticorpilor, situsurile nespecifice pot fi
blocate prin incubarea ţesutului cu ser (2-10%) sau
albumină serică bovină (1-4% în PBS, pH 7,4); la
soluţiile blocante pot fi adăugaţi detergenţi slabi (Tween
20, 0,2%).
Datorită înaltei lor omogenităţi şi specificităţi,
folosirea anticorpilor monoclonali în imunohistochimie
prezintă avantaje certe. Există, însă, şi dezavantaje ce nu
pot fi ignorate. De exemplu, în situaţia în care anticorpul
monoclonal utilizat reacţionează cu un epitop pe care
două sau mai multe antigene îl au în comun, fenomen
numit reactivitate încrucişată, se pierde specificitatea,
marele beneficiu al monoclonalilor.
Anticorpilor li se pot aplica toate metodele de
cuplare cunoscute. Unii monoclonali, însă, îşi pierd în
totalitate activitatea după cuplare cu enzime sau haptene

66
de tipul biotinei sau fluoresceinei. Acest fenomen se
produce cu siguranţă şi la nivelul anticorpilor policlonali
dar, datorită heterogenităţii lor, el este mascat.
Anticorpii mai pot fi clasificaţi în primari şi
secundari. Anticorpii primari sunt destinaţi cuplării cu
antigenele de interes şi, cel mai frecvent, sunt
neconjugaţi, în timp ce anticorpii secundari au ca
specificitate epitopi de la nivelul anticorpilor primari şi
sunt conjugaţi fie cu biotină, fie cu diferite enzime, fie cu
agenti fluorescenţi.

1. Noţiuni de enzimologie.
Metodele de colorare imunoenzimatică se bazează pe
reacţiile dintre enzime şi substraturile lor, cromogeni
incolori care se colorează în produşi finali detectabili.
Dintre enzimele utilizate cel mai frecvent amintim
peroxidaza (HRP), fosfataza alcalină (AP),
glucozoxidaza şi beta-galactozidaza. Enzimele sunt
catalizatori de natură proteică, a căror eficienţă catalitică
este foarte mare. Astfel, un mol de enzimă poate cataliza
într-un minut transformarea unui număr ce variază între
10000 şi 1000000 moli de substrat. Au fost identificate şi
obţinute în forme pure şi cristalizate mii de asemenea
structuri. Din punct de vedere al funcţiilor lor, enzimele
pot fi clasificate în enzime hidrolitice (esteraze,
proteaze), fosforilaze, enzime oxido-reducatoare
(dehidrogenaze, oxidaze, peroxidaze), enzime de transfer,
decarboxilaze şi altele. Unele dintre ele pot acţiona strict
specific asupra unui singur substrat, altele pot cataliza
substraturi înrudite. Activitatea enzimelor este
dependentă de o serie de variabile cum ar fi concentraţiile
enzimei şi a substratului, pH, concentraţiile sărurilor din

67
mediul tampon, temperatura, lumina, prezenţa unor ioni
metalici, ca agenţi electrofili (Mg2+, Mn2+, Zn2+).
Alegerea unei enzime pentru o tehnică
imunohistochimică particulară trebuie să aibă în vedere o
serie de factori:
 enzima trebuie să fie la îndemână într-o formă înalt
purificată şi relativ ieftină;
 conjugarea cu anticorpii sau cu avidina nu trebuie să
afecteze activitatea enzimatică;
 enzima legată să fie stabilă în soluţii;
 activitatea enzimelor endogene să interfere minim cu
coloraţia specifică a antigenului;
 produşii reacţiilor enzimatice să fie uşor detectabili şi
stabili.

Peroxidaza (horseradish peroxidase) este o


glicoproteină extrasă din hrean, cu o greutate moleculară
de 44 kDa. Prezintă un grup hem ce conţine fier
(hematina) ca situs activ (grupare prostetică), doi atomi
de Ca2+ şi funcţionează optim la un pH de 6.0-6.5. În
reacţie cu substratul, activat extemporaneu cu H2O2,
hematina formează un complex cu hidrogenul peroxid şi
apoi determină descompunerea acestuia în apă şi oxigen
atomic. În prezenţa unor donori de electroni, complexul
generează un produs final colorat şi apă.
Peroxidaza este una dintre cele mai utilizate
enzime în imunohistochimie, datorită unor avantaje
importante:
 are greutate moleculară redusă;
 se obţine uşor în formă pură;
 este stabilă şi nu-şi modifică proprietăţile în timpul
obţinerii, păstrării şi utilizării;

68
 în probele tisulare este prezentă în cantităţi reduse,
uşor de blocat;
 poate fi ataşată altor proteine, cum sunt anticorpii,
avidina sau biotina.
Există mai multe tipuri de cromogeni ce, în
reacţie cu peroxidaza, formează produşi finali coloraţi, ce
precipită la nivelul situsului antigenic, făcându-l vizibil.
Pentru peroxidază, cei mai folosiţi cromogeni
sunt: tetra-clorhidratul de 3,3’-diaminobenzidină (DAB),
3-amino-9-etilcarbazol (AEC), 4-cloro-1-naftol,
diclorhidrat de p-fenilendiamină (pirocatechol sau
reactivul Hanker-Yates):
1. tetraclorhidratul de 3,3’-diaminobenzidină, pe scurt
DAB, generează un produs final de reacţie de culoare
maro, insolubil în alcool sau alţi solvenţi organici. Este
considerat un posibil cancerigen, ceea ce ar reprezenta
principalul său dezavantaj.
2. 3-amino-9-etilcarbazol sau AEC formează după
oxidare un produs roşu, solubil în alcool, de aceea
probele procesate cu AEC nu trebuie tratate ulterior cu
alcool sau soluţii alcoolice cum este hematoxilina Harris.
AEC este susceptibil la oxidare şi, expus la lumină
excesivă, pierde din intensitatea coloraţiei.
3. 4-cloro-1-naftol (CN) precipită sub forma unui
produs final albastru. Pentru că şi acest cromogen este
solubil în alcool şi alţi solvenţi organici, probele nu
trebuie deshidratate, expuse la contracolorări alcoolice
sau montate cu medii ce conţin solvenţi organici.
4. diclorhidratul de p-fenilendiamină formează un
produs final de culoare albastru-negru, insolubil în alcool
sau alţi solvenţi organici.

69
Fosfataza alcalină (AP – alkaline phosphatase)
se poate obţine fie din intestin de viţel, fie din culturi de
Escherichia coli. Enzima este un dimer, cu o greutate
moleculară de 140 kDa şi conţine ioni de Zn. În
imunohistochimie, metoda APAAP - Alkaline
Phosphatase Anti-Alkaline Phosphatase se utilizează
frecvent în situaţiile în care identificarea antigenelor nu
poate fi realizată prin tehnici ce folosesc peroxidaza,
datorită conţinutului crescut în peroxidază endogenă a
ţesutului investigat. O serie de substraturi şi cromogeni
pot fi utilizaţi pentru evidenţierea fosfatazei alcaline:
1. naftol AS-MX fosfat, Fast RED, Fast BLUE B3. AP
hidrolizează substratul (naftol fosfat), iar fenolii ce
rezultă în urma acestei reacţii se cuplează cu cromogenii
(Fast RED şi Fast B3) generând produşi finali coloraţi
(roşu şi, respectiv, albastru), insolubili în alcool.
2. New Fuchsin. Folosirea acestui cromogen generează
un produs final de culoare roşie, insolubil în alcool sau
solvenţi organici.

2. Metode de colorare
Există mai multe metode de colorare
imunoenzimatică ce pot fi folosite pentru localizarea şi
identificarea antigenelor.
2.1 Metoda directă. În această variantă, anticorpul
primar este marcat cu enzimă, iar aplicarea, ulterioară
acestei reacţii, a substratului cromogen evidenţiază
formarea complexelor specifice antigen-anticorp, printr-o
reacţie de culoare (figura 1).

70
Fig.1 Metoda directă (adaptat după Râşniţă TDL, 1996).

2.2 Metoda indirectă în doi paşi. Acestă metodă


presupune folosirea unui anticorp primar neconjugat
pentru reacţia antigen-specifică (figura 2). Un al doilea
anticorp, secundar, conjugat cu enzimă, recunoaşte şi
interacţionează cu anticorpul primar, iar substratul
cromogen vizualizează reacţia.
Această tehnică este mult mai sensibilă decât cea
directă, întrucât mai mulţi anticorpi secundari se vor lega
de epitopi diferiţi de la nivelul celui primar, ataşându-se,
în această manieră, mai multe molecule de enzimă la
situsul antigenului, ceea ce creşte intensitatea semnalului
de colorare.
De obicei, într-un protocol standard de colorare,
anticorpul secundar nu este cuplat cu HRP, ci este
biotinilat şi se cuplează, într-o etapă ulterioară, cu un
complex enzimatic format din streptavidină-peroxidază.
În acest fel, un număr relativ redus de anticorpi
secundari, conjugaţi standard cu biotină, pot fi utilizaţi
pentru un număr mare de anticorpi primari, cu diferite
specificităţi, ceea ce reprezintă un avantaj important.

71
Fig. 2 Metoda indirectă în doi paşi (adaptat după Râşniţă TDL,
1996).

2.3 Metoda indirectă în trei paşi. Tehnica are acelaşi


principiu ca şi cea în doi timpi, dar presupune în plus
adăugarea unui anticorp terţiar, marcat enzimatic, ca şi
cel secundar, cu specificitate pentru anticorpul secundar
(figura 3).
Cei doi anticorpi, cel secundar şi cel terţiar, sunt
marcaţi cu aceeaşi enzimă. Prin adiţia celui de al treilea
anticorp, un surplus de enzimă este adus la locul de
expresie a antigenului, ceea ce are rolul de a amplifica şi
mai mult semnalul de colorare.

72
Fig. 3 Metoda indirectă în trei timpi (adaptat după Râşniţă TDL,
1996).

3. Controale.
Protocoalele şi reactivii de control sunt necesari
pentru validarea rezultatelor obţinute la colorarea
imunohistochimică. Absenţa utilizării lor va face ca
interpretarea colorării să fie hazardată, iar rezultatele,
îndoielnice. Reactivii de control se găsesc fie disponibili
comercial, fie pot fi preparaţi, scopul utilizării lor fiind
acela de a determina dacă anticorpii primari şi secundari
au specificitate pentru ţintele antigenice pentru care sunt
folosiţi. Ca urmare, anticorpul primar este testat pe
ţesutul de interes, la o diluţie optimă de lucru, dar, în
acelaşi timp, şi pe alte ţesuturi diferite (controale
tisulare), despre care se ştie cu certitudine că exprimă
(control pozitiv) sau nu (control negativ), antigenul
urmărit.
Controalele interne. Acest tip de control este
ideal, pentru că elimină orice variaţie legată de preparare,

73
procesare şi colorare a probelor biologice. Practic, proba
şi controlul există pe aceeaşi secţiune, nemaiexistând
necesitatea unor controale pozitive separate.

4. Colorarea de fond (nespecifică sau background)


reprezintă colorarea difuză a tuturor sau a majorităţii
elementelor tisulare de pe secţiune, ceea ce face
imposibilă interpretarea rezultatelor. Este o problemă
frecventă în imunohistochimie, determinată de o
multitudine de cauze:
1. Interacţiunea hidrofobă
Hidrofobicitatea reprezintă o proprietate comună,
în grade diferite, a majorităţii proteinelor. Datorită acestei
proprietăţi, la nivelul ţesutului testat pot exista proteine
diferite de antigenele de interes ce au abilitatea de a se
cupla cu anticorpii primari, ceea ce va determina legări
nespecifice şi, în consecinţă rezultate fals pozitive. Cea
mai practică metodă folosită pentru reducerea colorării de
fond în această situaţie este incubarea ţesutului, cu o
proteină de blocare, anterior etapei de incubare cu
anticorpul primar. Proteina de blocare are rolul de a
interacţiona cu situsurile nespecifice, făcându-le
inaccesibile anticorpului primar.
2. Interacţiunile ionice (electrostatice)
Acest tip de interacţiuni se produc între proteine
cu sarcini net opuse. Anticorpii primari de tip IgG, având
un punct izoelectric cuprins între 5,8 şi 7,3, au o
încărcare net negativă la un pH neutru, de aceea, este
posibilă formarea legăturilor ionice ale acestora, în cazul
în care ţesutul prezintă proteine cu încărcare pozitivă.

74
3. Activităţi enzimatice endogene
Se ştie că hemoproteinele, cum sunt hemoglobina
(hematii), mioglobina (celule musculare), citocromii
(granulocite, monocite), catalazele (ficat, rinichi),
prezintă activitate peroxidazică endogenă. În această
situaţie, utilizarea DAB va fi urmată de apariţia unui
zgomot de fond, ce va face imposibilă identificarea certă
a antigenului de interes. Acest inconvenient poate fi
depăşit prin blocarea peroxidazei endogene, ce se
realizează înainte de incubarea ţesutului cu anticorpul
primar. Pentru ţesuturile fixate în formalină, blocarea
peroxidazei endogene presupune incubarea secţiunilor în
hidrogen peroxid (H2O2) 3%, timp de 5-10 minute.
O altă problemă legată de activitatea endogenă
este cea legată de folosirea tehnicii avidină-biotină în
cazul ţesuturilor ce conţin biotină, cum sunt ficatul şi
rinichiul. Blocarea biotinei endogene se realizează prin
incubări ale secţiunilor cu soluţii de avidină şi biotină.
4. Anticorpi naturali şi anticorpi contaminanţi
Imunizarea animalelor cu diferite antigene pentru
obţinerea anticorpilor policlonali (antiseruri) este grevată
de riscul ca aceste antiseruri să conţină şi alţi anticorpi
decât cei cu specificităţile dorite. Folosirea acestor
antiseruri în imunohistochimie poate fi urmată de
producerea legărilor nespecifice şi, în consecinţă, de
apariţia coloraţiei de fond. Folosirea anticorpilor
monoclonali poate elimina această problemă.
5. Legarea de substanţe lectin-like
Avidina conţine 10% carbohidraţi ce se pot lega
de substanţele asemănătoare lectinei prezente în diferite
ţesuturi. Folosirea complexului streptavidină-peroxidază
pentru developarea reacţiilor specifice reprezintă o

75
rezolvare a acestui inconvenient, întrucât streptavidina nu
conţine glucide.
6. Difuzia antigenului
Există situaţii în care antigenul de interes este fie
o proteină sintetizată şi stocată în celule, dar care
difuzează în ţesuturile din vecinătatea celui de stocare, fie
o moleculă înglobată în citoplasma unor celule cum sunt
fagocitele. Localizarea acestor antigene în alte situsuri
celulare sau tisulare, decât cele fiziologice, poate
determina coloraţie de fond.
7. Reacţii încrucişate
În cazul în care epitopul, pentru a cărui
identificare se utilizează un anticorp sau un antiser, este
prezent şi la nivelul altor molecule prezente pe secţiune,
se va produce legarea acestora şi, în consecinţă, o
colorare de fond.
8. Receptorii Fc
Sunt glicoproteine exprimate pe membrana unui
grup larg de celule, cum sunt monocitele, macrofagele,
mastocitele, eozinofilele, bazofilele, celulele NK,
limfocitele T şi B şi interacţionează cu fragmentele Fc ale
moleculelor de imunoglobuline. În general, aceşti
receptori prezintă specificitate de specie, clasă şi
subclasă, dar pot exista şi reacţii între receptorii Fc umani
şi imunoglobuline murine de tipul IgG2a şi IgG3.
Colorarea nespecifică datorată acestor reacţii posibile
poate fi evitată prin utilizarea de fragmente F(ab’)2 în
locul moleculei întregi de anticorp primar.
9. Legarea mediată de complement
Colorarea de fond apare extrem de rar în această
situaţie, pentru că, de obicei, complementul este
inactivat.

76
10. Alte cauze:
- leziuni fizice ale ţesutului;
- fixarea incompletă sau improprie a probei biologice;
- deparafinare incompletă;
- folosirea unor diluţii necorespunzătoare ale anticorpilor;
- spălarea necorespunzătoare a lamelor;
- incubări incorecte cu substratul;
- prezenţa unor arii necrotice datorate autolizei tisulare.

5. Contracolorarea
Contracolorarea oferă detalii despre arhitectura
ţesuturilor şi despre morfologia elementelor celulare şi
ale matricii extracelulare. Ea completează tehnica
imunohistochimică, favorizând vizualizarea exactă a
localizării antigenelor identificate prin coloraţie
specifică.
Este necesar să se aibă în vedere folosirea unor
soluţii pentru contracolorare în funcţie de substratul
utilizat în developarea reacţiei specifice. De exemplu,
folosirea DAB determină formarea unor produşi finali
insolubili în alcool şi în solvenţi organici, ceea ce permite
contracolorarea cu coloranţi alcoolici (ex. hematoxilină
Harris) şi montarea lamelor în medii cu xilen sau toluen
(ex. Balsam de Canada).
Produşii finali de reacţie ai substraturilor AEC şi
clor-4-naftol sunt solubili în alcool şi solvenţi organici,
necesitând contracolorare cu coloranţi pe bază de alcool-
acid şi montare în medii apoase.

6. Imunocitochimia
Reprezintă o variantă a metodei de colorare
bazată pe folosirea reacţiei antigen-anticorp, care se

77
adresează frotiurilor. Protocolul de lucru presupune
obţinerea de celule din lichide (sânge periferic, lichid de
ascită sau pleural, etc), prin metode de separare în
gradient de densitate, sau din ţesuturi, prin digestie
enzimatică. Celulele sunt depuse pe lame de microscop
prin centrifugare (citospin), într-o concentraţie de 1-2 x
104 celule/100 μl mediu, concentraţie ce asigură o
densitate suficientă, dar şi o etalare eficientă a acestora.
Lamele sunt incubate 15 minute în etanol absolut, etapă
ce asigură, pe de o parte, fixarea celulelor la lama de
sticlă şi, pe de altă parte, permeabilizarea acestora. După
inhibarea peroxidazei endogene, în 3% H2O2, lamele sunt
incubate cu anticorpii primari, specifici moleculelor de
interes, şi apoi cu anticorpi secundari marcaţi cu enzimă
sau, mai frecvent, biotinilaţi. Developarea reacţiei se
realizează prin adăugarea substratului specific enzimei cu
care este cuplat secundarul sau, în cazul celor biotinilaţi,
prin incubări succesive cu complexe enzimatice
streptavidină-enzimă şi substrat.

7. Dubla/tripla coloraţie
Reprezintă variante ale imunohistochimiei/
imunocitochimiei, prin care pot fi identificate simultan
două sau trei antigene diferite exprimate la nivelul
aceluiaşi ţesut sau frotiu, cu condiţia ca aceste antigene
să aibă localizări diferite, fie la nivelul aceleiaşi celule
(ex. nucleu versus citoplasmă sau membrană), fie să fie
exprimate de tipuri diferite de celule (ex. marker de
celulă epitelială versus marker pentru leucocite sau
marker pentru celulă epitelială versus marker pentru
limfocit T versus marker pentru limfocit B).

78
Antigenele sunt evidenţiate în etape succesive de
colorare, cu ajutorul unor sisteme de vizualizare ce
presupun reacţii între enzime diferite şi
substraturile/cromogenii lor (figura 4, figura 5).

A B

Fig. 4 Imunohistochimie. A. Dublă coloraţie pentru evidenţierea


a două antigene diferite la nivelul aceleiaşi celule (nucleu/negru
versus citoplasmă/maro); B. Triplă coloraţie. Două antigene sunt
localizate la nivelul aceleiaşi celule (nucleu/negru versus
citoplasmă/maro), al treilea este exprimat de un tip diferit de
celulă (roşu).

A B
Fig. 5 Imunocitochimie. A. Dublă coloraţie pentru evidenţierea a
două antigene (nuclear/negru şi citoplasmatic/maro) în aceeaşi
celulă; B. Triplă coloraţie. Antigen nuclear/negru şi
citoplasmatic/maro identificate simultan în aceeaşi celulă.
Antigen exprimat de un tip diferit de celulă (roşu).

79
Imunofluorescenţa

Substanţele fluorescente sau fluorocromii au


capacitatea ca, odată stimulate (excitate) cu o lumină
caracterizată de o anumită lungime de undă, să emită
lumina cu o altă lungime de undă, caracteristică
fluorocromului respectiv. Deoarece anticorpii pot fi
cuplaţi cu astfel de substanţe fluorescente la nivelul
fragmentului Fc, fără ca specificitatea lor să fie alterată,
pot fi utilizaţi pentru detecţia unor variate antigene,
inclusiv a celor localizate la nivelul unor celule sau
ţesuturi. Această tehnică este denumită
imunofluorescenţă.
Substanţele fluorescente pe care le avem astăzi la
dispoziţie în acest scop acoperă un spectru larg de emisie.
Alegerea unui anumit particular fluorocrom ţine de o
multitudine de considerente, începând cu cele tehnice,
legate de chimia cuplării, de disponibilitatea unei surse
de lumină de excitaţie cu lungime de undă potrivită, de
posibilitatea înregistrării semnalului, de posibilitatea de a
face distincţie între spectrele de emisie etc. şi terminând
cu cele legate de costurile acestor substanţe.
Printre cei mai utilizaţi fluorocromi în
imunofluorescenţă sunt fluoresceina (FITC –
isothiocianat de fluoresceină) şi phycoerthrina (PE).
Excitarea FITC cu o lumină cu lungimea de undă de 490
nm (albastră) conduce la emisia de lumină cu lungimea

80
de 517 nm (verde). PE absoarbe lumina de circa 30 de ori
mai eficient decât FITC şi emite la o lungime de undă de
578 nm.

Fluorocromi disponibili comercial:


Fluorocrom Culoarea de Excitaţie Emisie
emisie (nm) (nm)
Alexa Fluor albastru 360, 405, 407 421
405
Pacific Blue albastru 360, 405, 407 455
AmCyan verde 405, 407 491
Alexa Fluor verde 405, 407 541
430
Cascade verde 405, 407 548
Yellow
Alexa Fluor verde 488 519
488
FITC verde 488 519
PE galben 488, 532 578
Cy3 galben 488, 532 570
PE-Texas Red portocaliu 488, 532 615
Texas Red portocaliu 595 615
APC roşu 595, 633, 660
635, 647
Alexa Fluor roşu 595, 633, 668
647 635, 647
PE-Cy5 roşu 488, 532 667
Cy5 roşu 633, 635 667
PerCP roşu 488, 532 678
PerCP-Cy5.5 roşu inchis 488, 532 695
Alexa Fluor roşu inchis 633, 635 719
700
Pe-Cy7 infraroşu 488, 532 785
APC-Cy7 infraroşu 595, 633, 785
635, 647

81
Imunofluorescenţa poate fi utilizată pentru
identificarea de populaţii celulare pe baza unor molecule
cheie de suprafaţă, pentru identificarea unor autoanticorpi
fixaţi în diverse ţesuturi, a componentelor sistemului
complement care s-au legat la celule, a unor produşi
celulari precum hormonii sau citokinele, dar şi a unor
specii bacteriene. Metoda poate fi directă sau indirectă.

1. Imunofluorescenţa directă
În imunofluorescenţa directă, anticorpii primari
sunt cuplaţi cu fluorocromi, iar aceşti anticorpi sunt
aplicaţi direct peste produsul ce urmează a fi analizat,
secţiune tisulară sau suspensie celulară. Legarea specifică
a anticorpilor numai la antigenele ţintă este ulterior
vizualizată prin examinarea probei cu ajutorul unui
microscop denumit adesea „cu fluorescenţă”, altfel spus,
un microscop dotat cu o sursă capabilă să emită o lumină
cu lungimea de undă adecvată excitării substanţelor
fluorescente utilizate (figura 1).
Anticorpii folosiţi pot proveni de la alte specii,
dar pot fi şi anticorpi umani. Un exemplu important din
punct de vedere al aplicaţiilor imunofluorescenţei se
referă la folosirea chiar a autoanticorpilor recoltaţi de la
pacienţii cu diverse autoimunităţi, anticorpi care sunt
apoi fluorocromaţi şi utilizaţi pentru marcare şi astfel
pentru identificarea prezenţei şi distribuţiei
autoantigenelor. În alte situaţii, moleculele ţintă sunt
chiar autoanticorpii. Evidenţierea lor prin
imunofluorescenţă se realizează cu ajutorul unor
anticorpi provenind de la alte specii, direcţionaţi (de
obicei), împotriva fragmentului Fc al anticorpilor umani.

82
A B

Fig. 1 A. Celule SKBR-3 de adenocarcinom mamar marcate cu


ajutorul anticorpului anti-EMA (epithelial membrane
antigen)/FITC – coloraţie membranară; B. Celule MCF-7 de
adenocarcinom mamar marcate cu Iodură de Propidiu (PI) –
coloraţie nucleară.

Un avantaj important al imunofluorescenţei este


oferit de posibilitatea utilizării simultane a mai multor
fluorocromi (al căror spectru de emisie nu trebuie însă să
se suprapună) şi deci de posibilitatea identificării
simultane a mai multor molecule diferite. În cazul când
moleculele vizate au o distribuţie celulară distinctă, de
exemplu nucleu versus membrană, atunci şi culorile
generate de excitaţia substanţelor fluorescente pot fi
percepute în mod distinct. În cazul când însă moleculele
au o aceeaşi localizare, culorile fluorocromilor se
amestecă, iar rezultatul este o nouă culoare ce rezultă din
combinaţie.
O variantă tehnică des utilizată în
imunofluorescenţă se bazează pe anticorpi care sunt
cuplaţi cu biotină. Odată legaţi la moleculele ţintă,
anticorpii sunt apoi incubaţi cu un complex
avidină/fluorocrom.

83
2. Imunofluorescenţa indirectă
Această tehnică în două straturi prezintă câteva
avantaje importante. De vreme ce nu anticorpul primar
este cel marcat, pentru legarea antigenelor ţintă nu mai
suntem constrânşi la utilizarea de anticorpi, de obicei
monoclonali, fluorocromaţi. Utilizarea de anticorpi
secundari care, de obicei, nu sunt monoclonali, ci
policlonali (deci mai uşor de produs), cuplaţi cu substanţe
fluorescente face ca un singur astfel de reactiv marcat să
poată fi folosit pentru o multitudine de anticorpi primari,
respectând, în mod evident, specificitatea de specie şi de
isotip. În plus, metodele indirecte, care se bazează pe un
al doilea strat de anticorpi, beneficiază astfel de o
creştere a sensibilităţii, deoarece o moleculă de anticorp
primar va fi legată de mai multe molecule de anticorpi
secundari marcaţi, ceea ce conduce în mod simplu şi
eficient la amplificarea semnalului. Un al treilea strat de
anticorpi ar putea fi, de asemenea, adăugat, ceea ce ar
conduce la o creştere impresionantă a semnalului, dar
există riscul diminuării specificităţii, ceea ce face ca
această abordare să fie evitată.
Imunofluorescenţa indirectă permite, prin
utilizarea de anticorpi secundari cu specificitate adecvată,
să se poată face distincţie între diferitele isotipuri ale
anticorpilor primari. Această metodă poate fi, de
asemenea, aplicată pentru testarea capacităţii de fixare a
complementului la nivelul unui anumit ţesut, în prima
etapă fiind utilizaţi anticorpul primar cu specificitate
pentru un antigen tisular şi produşi ai complementului,
iar în a doua etapă anticorpi fluorocromaţi anti-
complement pentru vizualizarea fixării acestuia.

84
În cazul autoimunităţilor, proba de ţesut recoltată
de la pacient va fi incubată, în prima etapă, chiar cu serul
pacientului respectiv. În ipoteza că serul conţine
autoanticorpi, aceştia se vor lega la autoantigenele
prezente în ţesut, iar a doua etapă va presupune incubarea
cu un anticorp fluorocromat anti-anticorp uman pentru
vizualizarea reacţiei.

Microscopia confocală

Când în imunofluorescenţă este necesară o


creştere importantă a magnificaţiei, apar probleme din
punctul de vedere al rezoluţiei imaginii. Irizarea produsă
de semnalul fluorescent generează un semnal într-un set
de planuri suprapuse, care nu pot fi focalizate simultan.
Microscopul confocal reuşeşte să surmonteze acest
obstacol, prin scanarea cu ajutorul unui laser a câte unui
plan extrem de fin (subţire) de la nivelul celulei
respective şi prin înregistrarea semnalului fluorescent de
către un fotomultiplicator (PMT – phot multiplier tube),
cu ajutorul unei aperturi confocale. Fluorescenţa din
oricare alt plan decât cel focalizat nu va putea astfel
ajunge la fotomultiplicator şi de aceea imaginea obţinută
va fi cea aferentă exclusiv planului analizat, deci extrem
de clară.
Microscopia confocală permite nu doar analiza
calitativă, dar şi pe cea cantitativă, datorită unui sistem de
scanare a întregii suprafeţe. Dacă sunt utilizaţi doi
fluorocromi, atunci este posibilă comparaţia dintre cele
două molecule analizate simultan, atât din punct de
vedere al distribuţiei la nivelul probei analizate, cât şi din
punct de vedere al nivelului lor de expresie.

85
Datorită faptului că imaginea obţinută este
recompusă digital, software-ul instrumentului poate
recrea imagini, astfel încât acestea să apară ca
tridimensionale. În plus, imaginile vor putea fi rotite de
către investigator şi analizate din diferite unghiuri.

Tissue FAXS

Această tehnologie reprezintă o combinaţie


performantă de microscopie optică de înaltă rezoluţie şi
imunofluorescenţă sau imunohistochimie. Avantajul
imens pe care metoda îl aduce constă în posibilitatea
colorării aceluiaşi produs biologic cu un număr mare de
anticorpi, cu specificităţi variate, marcaţi fiecare cu un alt
fluorocrom sau marcarea de secţiuni seriate din acelaşi
produs biologic, cu anticorpi diferiţi marcaţi cu enzime,
care vor fi procesate ca în metoda imunohistochimică.
Programul (software) destinat metodei
înregistrează fiecare semnal fluorescent sau de culoare, îl
recompune digital şi procesează imaginea astfel încât este
posibilă identificarea celulelor pe baza unor markeri
specifici. Acest lucru este, însă, posibil şi cu ajutorul
imunofluorescenţei sau imunohistochimiei. Ceea ce
aduce, în plus, această tehnologie, este posibilitatea de a
analiza ulterior datele, de a le combina şi prelucra în aşa
fel încât informaţiile oferite să fie complexe, bi- şi multi-
parametrice. O aceeaşi celulă va fi caracterizată, nu de
expresia unei molecule, ci de un fenotip generat de
prezenţa simultană a mai multor antigene. Din acest
punct de vedere, tehnica este asemănătoare citometriei în
flux.

86
Citometrie în flux (Flow cytometry)

1. Principiu
Citometria în flux reprezintă astăzi una dintre cele
mai versatile metode utilizate în clinică şi în cercetare.
Printre numeroasele aplicaţii menţionăm identificarea
şi/sau sortarea celulelor pe baza markerilor de suprafaţă,
analiza conţinutului ADN şi a ciclului celular, evaluarea
funcţionalităţii unor celule, studiul bacteriilor şi chiar al
unor plante, cross-match-ul efectuat pre-transplant, dar şi
monitorizarea post-transplant.
Principiul esenţial al citometriei în flux este acela
că particulele (celulele) antrenate de un flux de lichid vor
trece în mod individual prin dreptul unui fascicul laser
concentrat pe o suprafaţă extrem de mică. În această
manieră, fiecare particulă în parte va fi analizată ca un
„eveniment” distinct. Prin citometrie în flux pot fi
analizate particule de aproape orice natură, iar
dimensiunea lor poate să fie chiar sub dimensiunea
rezoluţiei luminii vizibile. Numărul de evenimente care
pot fi evaluate este uriaş, putându-se ajunge la 100000 de
particule/secundă, în timp ce până la 20 de parametri
distincţi pot fi analizaţi pentru fiecare dintre aceste
particule.
Componentele principale ale unui flow citometru
sunt sursa de lumină monocromatică şi componentele
necesare pentru focalizarea luminii, un sistem pneumatic

87
care este responsabil pentru mobilizarea cu o viteză
constantă, precis controlată, a particulelor, o celulă de
flux (flow cell), un ansamblu de detectoare şi de
convertoare de semnal şi un sistem de colectare,
procesare şi stocare a datelor.
Majoritatea flow citometrelor din generaţiile
recente folosesc ca sursă de lumină laserele.
Sensibilitatea unui flow citometru depinde în mod
esenţial de o astfel de sursă coerentă de lumină, iar
criteriul de selecţie pentru aceasta este legat de lungimea
de undă a laserului care trebuie să fie potrivită cu spectrul
de absorbţie necesar pentru excitarea fluorocromilor. În
plus, sursa de lumină trebuie să fie focalizată la nivelul
unei suprafeţe foarte înguste, precis delimitate. De
asemenea, fasciculul trebuie să aibă şi o anumită formă,
ceea ce se poate realiza cu un sistem optic special. Cea
mai utilă formă este cea eliptică, cu dimensiuni de
aproximativ 15/60 microni.
Din punct de vedere hidrodinamic, într-un flux de
lichid, celulele sunt plasate în centrul acestuia,
înconjurate într-o teacă de lichid. Plecând de la această
premiză, au fost construite celulele de flux, al căror
design este crucial pentru funcţionarea oricărui flow
citometru. În cadrul acestor celule, un ac introduce
particulele în interiorul unui flux de lichid (în majoritatea
cazurilor, o soluţie salină) generând astfel un flux
coaxial. Lichidul este obligat să se deplaseze de la o zonă
cu un diametru mai mare, către o zonă cu un diametru
semnificativ mai mic şi, în acest fel, viteza de curgere
este amplificată semnificativ la nivelul canalului mai
îngust. Mai mult decât atât, în interiorul acestui canal,
viteza de deplasare este maximă în centrul curentului.

88
Acest aspect este deosebit de important atunci când sunt
analizate celule, care, datorită proteinelor de suprafaţă,
pot interacţiona generând turbiditate care riscă să altereze
natura hidrodinamică a fluxului de lichid.
Cele mai multe instrumente utilizează
fotomultiplicatoare (PMT – photomultipliers), atât pentru
detecţia împrăştierii luminii (scatter), cât şi pentru
detecţia semnalelor fluorescente, în cazul acestora din
urmă fiind alocate câte un PMT distinct pentru fiecare
lungime de undă dorită. Pulsul pe care îl generează o
particulă care este excitată de fasciculul laser va depinde
de forma fasciculului, intensitatea luminii, dar şi de
dimensiunea, viteza şi încărcarea cu fluorocromi a
particulei. La o viteză de 10 m/s, o particulă va traversa
un fascicul de 10 microni într-o microsecundă (figura 1).
Pe măsura creşterii cerinţelor impuse de cercetare
şi pe măsură ce sistemele de diagnostic au devenit tot mai
sofisticate, presiunea pusă asupra acestei tehnici a impus
practic introducerea a două sau chiar a unui număr mai
mare de fascicule laser, decalate între ele prin câteva
microsecunde. Fiecare particulă trebuie astfel analizată
de către fiecare laser, ceea ce face ca datele înregistrate
ca urmare a excitării de către primul fascicul laser să fie
stocate până la trecerea particulei prin dreptul celui de-al
doilea fascicul laser şi aşa mai departe. Dacă separarea
între fascicule este suficient de mare, există posibilitatea
ca mai multe particule să fie analizate de către primul
fascicul, până ce prima celulă va ajunge la al doilea
fascicul.

89
Fig. 1 Principiul de funcţionare al unui citometru de flux Coulter
(adaptat după Beckmann-Coulter).

Ansamblul de informaţii obţinut prin împrăştierea


luminii şi a semnalelor înregistrate ca urmare a
fluorescenţei emise de fluorocromii cuplaţi, de obicei, cu
anticorpi monoclonali, determină identificarea
proprietăţile fiecărei celule care trece prin dreptul
fasciculului laser. Această investigaţie este denumită
imunofenotipare. Lumina înregistrată de către un senzor
situat de partea opusă sursei de lumină, senzor denumit
Forward Scatter (FS) oferă informaţii legate de mărimea
particulei. Lumina înregistrată de un alt senzor, situat de
obicei la un unghi de 900 faţă de fasciculul laser, oferă
informaţii legate de granularitatea sau structura nucleară
a celulei respective.

90
Prin combinarea acestor doi parametri, mărime şi
granularitate, fiecare particulă va putea fi proiectată sub
forma unui punct în cadrul unui grafic denumit uzual
„dot plot”. Particule cu dimensiuni şi grad de
neregularitate al suprafeţei diferite vor ocupa zone
distincte ale graficului. În acest fel, pe baza acestor două
caracteristici, un amestec de celule va putea fi separat în
populaţii distincte, vizibile sub forma unor grupuri
compacte de puncte. Acestea vor putea fi ulterior
încadrate în aşa numite „porţi” electronice, ceea ce va
permite numărarea lor, dar şi selectarea lor pentru analiza
ulterioară (figura 2).

Fig. 2 Identificarea şi separarea celulelor din sângele periferic pe


baza mărimii şi granularităţii lor.

Identificarea fenotipului celular, deci a


ansamblului de molecule care caracterizează o anumită
celulă, implică incubarea acesteia cu anticorpi
monoclonali specifici antigenelor celulei respective,
cuplaţi cu substanţe fluorescente, apoi analizarea sa prin
flow-citometrie. Când o astfel de celulă trece prin dreptul
fasciculului laser, excitarea fluorocromilor va conduce la

91
emiterea de lumină cu o lungime de undă superioară celei
absorbite, dar la un nivel de energie inferior. Cantitatea
de energie este proporţională cu cantitatea de substanţă
fluorescentă prezentă la nivelul celulei respective.
Această informaţie este înregistrată de către PMT-uri
construite astfel încât să înregistreze o anumită lungime
de undă (figura 1). În plus, lumina emisă de un anumit
fluorocrom va putea trece de oglinzile dicroice sau va fi
reflectată de către acestea, în funcţie de pragul impus de
filtre.
Când o particulă conţine însă substanţe
fluorescente multiple, cu spectre de emisie diferite, apare
o problemă tehnică legată de posibila suprapunere a
acestor spectre. Astfel, un PMT destinat unei lungimi de
undă de 550 nm (corespunzătoare fluorocromului
phycoeritrina – PE) va înregistra şi lumina cu lungimea
de undă de 525 nm emisă de fluoresceină (FITC), ceea ce
ar face imposibil să distingem care detector înregistrează
fotonii emişi de către FITC. Această situaţie impune
efectuarea unei operaţiuni destul de complexe, denumită
„compensaţie spectrală”, prin care procentul de semnal
înregistrat de către un detector pentru o anumită
fluorescenţă este scăzut din procentul de semnal
înregistrat de celălalt detector. În această manieră se
poate ajunge la utilizarea unui număr mare de detectori
dedicaţi unor spectre de emisie foarte apropiate.
Analiza fluorescenţelor emise se poate realiza
monoparametric (fiecare fluorescenţă în parte) sau
biparametric, comparând fluorescenţele două câte două.
Analiza monoparametrică generează aşa numitele
„histograme”, în care semnalul fluorescent este
reprezentat sub forma unor vârfuri, care sunt proiectate

92
pe axa x (de obicei logaritmică), cu atât mai departe de
origine, cu cât intensitatea semnalului este mai mare.
Primul vârf, care trebuie să apară în aceste histograme,
este cel generat de autofluorescenţa celulelor, astfel că
orice semnal real, înregistrat ca urmare a excitării
fluorocromilor, este reprezentat de un vârf situat la
dreapta vârfului autofluorescenţei (figura 3).

Fig. 3 Analiza monoparametrică a fluorescenţei Primul vârf este


generat de autofluorescenţa normală a celulelor. Al doilea vârf
reflectă semnalul generat de anticorpul fluorocromat. Cu cât
intensitatea semnalului fluorescent este mai puternică, acest vârf
va fi proiectat mai departe de origine.

Analiza bi-parametrică a fluorescenţelor compară


intensitatea semnalului generat de doi fluorocromi. Prin
reprezentarea evenimentelor înregistrate sub forma unui
dot-plot, graficul poate fi împărţit în 4 cadrane, care vor
fi alocate particulelor dublu-negative, dublu-pozitive şi,
respectiv, simplu pozitive pentru fluorocromii respectivi
(figura 4).

93
Fig 4 Analiza biparametrică a fluorescenţelor. Semnalul
autofluorescent (celule dublu negative) este reprezentat în
cadranul din stânga-jos. Celulele dublu pozitive sunt
reprezentate în cadranul din dreapta sus. Celulele simplu
pozitive pentru cei doi fluorocromi utilizaţi sunt proiectate în
cadranele din dreapta jos şi, respectiv, stânga sus.

2. Sortarea particulelor
Termenul de FACS – fluorescence activated cell
sorter - a devenit practic sinonim cu cel de citometrie în
flux, deşi, în realitate, nu toate citometrele au şi
capacitatea de sortare a celulelor. Aceasta se referă la
separarea fizică a unor particulare celule de interes, pe
baza unor parametri stabiliţi de către investigator, de
exemplu mărimea celulei sau expresia unei anumite
molecule. Una dintre variantele tehnice utilizate în acest
scop constă în sortarea electrostatică. Principiul metodei
se bazează pe identificarea celulei de interes pe baza
semnalului măsurat, identificarea cu mare acurateţe a
poziţiei fizice a celulei şi plasarea la nivelul său a unei
sarcini electrice exact la momentul potrivit. La ieşirea din
analizor, celulele încărcate în această manieră vor trebui
să treacă printr-un câmp electric care le va obliga să se

94
direcţioneze către un anumit pol şi astfel vor putea fi
separate fizic într-un recipient (figura 5).

Fig. 5 Principiul FACS de separare fizică (sortare) a celulelor


(adaptată după Benjamini E, Coico R, Sunshine G, 2000).

Aplicaţii ale citometriei în flux

1. Imunofenotiparea
Cea mai frecvent utilizată aplicaţie a citometriei
în flux vizează identificarea, cu ajutorul anticorpilor
monoclonali fluorocromaţi, a expresiei unor diferite
molecule, la nivelul membranei celulei şi/sau în interiorul
acesteia (prin permeabilizarea membranei). Moleculele
constante pe care se bazează această caracterizare

95
alcătuiesc un ansamblu foarte complex şi, pentru
simplitate, ele au fost introduse într-un sistem denumit
CD (cluster of differentiation) şi numerotate. Până în
prezent, sunt cunoscute cel puţin 339 astfel de CD-uri.
Pe baza evidenţierii expresiei acestor molecule,
pot fi identificate nu doar celule aparţinând unei anumite
populaţii sau subpopulaţii, dar poate fi precizat şi stadiul
de dezvoltare al celulelor respective sau statusul lor de
activare. După identificarea populaţiilor de limfocite T
CD4+ (helper), respectiv LyT CD8+ (citotoxice) şi după
evidenţierea tropismului virusului HIV pentru limfocitele
T helper, una dintre aplicaţiile clinice importante a fost
cea de monitorizare a statusului pacienţilor cu SIDA. O
astfel de aplicaţie punctuală a condus chiar la dezvoltarea
de instrumente cu două fluorescenţe, dedicate acestui
scop. În schimb, investigaţiile impuse de diagnosticul în
varii afecţiuni hematologice, în special maligne, sunt
extrem de complexe, iar cerinţele actuale din acest
domeniu au fost cele care au împins performanţele
citometrelor până la posbilitatea analizării simultane a 8
culori distincte.
Alte aplicaţii ale imunofenotipării sunt cele
realizate cu scopul evaluării pacienţilor pre- şi post-
transplant şi monitorizării medicaţiei imunosupresive,
stabilirii diagnosticului în imunodeficienţele congenitale
şi monitorizării imunoterapiei şi a reconstituirii imune,
detectării bolii minime reziduale ca măsură a eficienţei
unei terapii în afecţiunile maligne hematologice.
Cu ajutorul citometriei în flux, poate fi realizată
inclusiv tiparea HLA, dar această aplicaţie este relativ
rară, metodele de biologie moleculară fiind cele care
astăzi predomină.

96
2. Analiza conţinutului ADN (Ploidia ADN)
Celulele normale conţin doi cromosomi fiind
considerate „diploide” sau „euploide”, cu alte cuvinte
având un conţinut normal de ADN (figura 6). Cu
excepţia ovulelor şi a spermatozoizilor, toate celulele
care nu sunt diploide, sunt considerate aneuploide şi
reprezintă un indicator al prezenţei unei malignităţi.
Analiza ploidiei poate fi utilizată pentru aprecierea
cantităţii de ADN ce caracterizează o anumită tumoră şi
pentru monitorizarea eficienţei chimioterapiei în
eliminarea celulelor aneuploide.

Fig. 6 Distribuţia ADN-ului între diferitele faze ale ciclului


celular.

Fluorocromul de elecţie utilizat pentru acest tip de


investigaţie este iodura de propidiu (PI – propidium
iodide), care are capacitatea de a pătrunde în nucleii
celulelor şi de a se lega la ADN, astfel încât, cantitatea de
acid nucleic este cuantificată prin măsurarea intensităţii
fluorescenţei înregistrată de către senzorul FL2

97
(lungimea de undă emisă de PI este de 562-588 nm
atunci când fluorocromul este excitat la 488 nm),
intensitatea fluorescenţei fiind direct proporţională cu
cantitatea de ADN din celule.

Fig. 7 ADN-ul este distribuit în 3 vârfuri distincte, separate prin


regiuni de fluorescenţă intermediară acestor regiuni bine
delimitate. Marcarea cu PI reflectă prezenţa simultană în
preparatul celular atât a unor celule diploide cât şi aneuploide
(ca urmare maligne). Regiunea M1 corespunde celulelor aflate în
stadiul G0/G1. În condiţii de normalitate, aceste celule ar trebui
să se dovedească preponderente. Regiunea M2 se găseşte la un
nivel de fluorescenţă de 2 ori mai mare decât al regiunii M1 şi
este corespunzătoare stadiului G2. Este posibil astfel ca celulele a
căror fluorescenţă corespunde regiunii M4 să fie tetraploide,
după cum o parte din celulele regiunii M2 ar putea fi celule
tetraploide aflate în stadiul G0/G1. Regiunea M3 este o regiune
de tranziţie, cu fluorescenţă intermediară.

Indexul ADN (DI – DNA index) este utilizat


pentru determinarea ploidiei unei malignităţi şi reprezintă
un raport între fluorescenţa ADN a celulelor tumorale şi
fluorescenţa ADN a celulelor normale. Indexul ADN al
unei celule diploide, normale, este 1, astfel că un DI mai

98
mic sau mai mare decât 1 reprezintă un indicator pentru
prezenţa celulelor aneuploide.
Măsurarea conţinutului ADN face posibilă,
totodată, identificarea distribuţiei acestuia între diferitele
faze ale ciclului celular, în scopul estimării ritmului de
creştere şi al agresivităţii unei tumori maligne. Cu cât
celulele proliferează mai intens, cu atât cantitatea de
ADN va fi mai mare şi vârful aferent fazei S (de sinteză)
va fi mai înalt în histograma care prezintă fluorescenţa
emisă de PI. O cantitate mare de ADN este direct
proporţională cu agresivitatea tumorii (figura 7).

3. Investigarea unor molecule solubile


Citometria în flux s-a dezvoltat ca o tehnică
dedicată analizării unor structuri particulate, în principal
a celulelor. Odată cu progresul tehnologic, care a permis
producerea de particule (bile) cu o dimensiune perfect
controlată şi posibilitatea de a le tapeta cu proteine, a
apărut şi o nouă direcţie de dezvoltare a citometriei. CBA
– Cytometric Bead Array - utilizează un set de bile cu
dimensiuni distincte (care astfel pot fi separate în cadrul
unui dot plot), cu fluorescenţe discrete, care sunt
acoperite cu anticorpi destinaţi unor substanţe solubile,
cum sunt, de exemplu, citokinele. În această manieră,
bilele oferă practic o suprafaţă de captură pentru proteina
vizată şi, din acest punct de vedere, reprezintă
echivalentul unui godeu din tehnica ELISA. Odată ce
proteina ţintă este fixată la suprafaţa bilelor, ea va putea
fi detectată cu ajutorul unui al doilea strat de anticorpi,
într-o variantă similară tehnicii sandwich (figura 8).

99
Fig. 8 Grupurile de puncte reprezintă, de jos în sus, bilele de
captură pentru IFN-γ TNF, IL-10, IL-6, IL-4, IL-2. Cele două
grupuri deplasate la dreapta demonstrează pozitivitatea probei
investigate pentru TNF şi IL-10.

4. Medicina reproducerii
Identificarea şi analiza celulelor spermatice este
mai delicată şi trebuie să utilizeze fluorocromi care se pot
lega de ADN fără să îi inducă alterări, aşa cum este
Hoechst 33342. O altă abordare utilizează anticorpi cu
specificitate faţă de antigenele H-Y. Totuşi, posibilitatea
sortării spermatozoizilor ridică o serie de probleme etice
legate de selectarea acestora.

5. Cross-match
Acest test are ca scop identificarea în serul
primitorului a eventualilor anticorpi capabili să
recunoască antigene ale donatorului. Metoda flow
citometrică este considerată a fi de 100 de ori mai
sensibilă decât metoda clasică, bazată pe citotoxicitatea
determinată de sistemul complement. Limfocitele izolate
de la donator sunt incubate mai întâi cu serul primitorului
şi apoi cu anticorpi fluorocromaţi anti-anticorpi umani.

100
Dacă în serul primitorului există anticorpi faţă de
molecule prezente pe suprafaţa limfocitelor donatorului,
atunci aceştia se vor lega şi prezenţa lor va putea fi
identificată prin analiza flow-citometrică a celulelor, pe
baza fluorescenţei emise de anticorpul secundar
fluorocromat. În plus, pe baza unor markeri caracteristici,
această procedură oferă avantajul de a putea identifica
simultan dacă limfocitele care fixează anticorpii
primitorului sunt limfocite T sau B.

6. Biologia celulară
Prin citometrie în flux, poate fi evaluată producţia
de radicali liberi ai oxigenului de către o singură celulă,
ceea ce reprezintă o manieră foarte eficientă de
investigare a funcţiei de fagocitoză a neutrofilului. Mai
mult decât atât, pot fi studiate nu doar celulele ci şi
organitele celulare. Odată cu dezvoltarea de probe
fluorescente corespunzătoare, citometria în flux oferă
posibilitatea investigării pH-ului intracelular, a
concentraţiei thiolului, a unor proteine.

7. Analiza proliferării celulare


Proliferarea reprezintă evenimentul major ce se
produce după stimularea şi activarea celulelor, iar
investigarea fenomenului poate aduce informaţii extrem
de importante despre funcţionalitatea acestora. În
principiu, identificarea celulelor proliferante se bazează
pe capacitatea lor de a sintetiza ADN şi de a încorpora la
nivelul acestuia analogi de nucleozide marcate, ce vor
putea fi vizualizate.
Principiul folosirii CFSE este diferit, molecula nu
este inclusă în ADN-ul nou sintetizat de celula

101
proliferantă, ci dimpotrivă, fiecare diviziune celulară
împarte cantitatea de CFSE conţinută de o celulă între
cele două celule fiice.
Carboxy-fluorescein-diacetate-succinimidyl-ester
(CFSE - C29H19NO11) constă dintr-o moleculă de
fluoresceină care conţine un grup funcţional de
succinimidyl ester şi două grupări acetat. CFSE difuzează
liber în celulă, iar esterazele intracelulare clivează
grupările acetat, convertindu-le într-un colorant
fluorescent, care nu mai poate traversa membrana, este
reţinut în celulă, nu poate fi pierdut şi nici transferat
celulelor vecine şi nu afectează în vreun fel funcţiile
celulare. În timpul fiecărei runde de diviziune,
intensitatea relativă a colorantului se reduce cu jumătate,
dat fiind faptul că se distribuie într-un număr de două ori
mai mare de celule, permiţând identificarea de generaţii
celulare succesive. CFSE este detectat cu ajutorul unor
filtre standard pentru fluoresceină (excitaţie = 492 nm,
emisie = 517 nm).
Aplicaţiile utilizării CFSE includ analiza
proliferării specifice şi nespecifice a limfocitelor T.
Limfocitele sunt mai întâi incubate cu CFSE, eveniment
ce permite moleculei să difuzeze liber în interiorul
celulei, străbătând membrana celulară. Excesul de
colorant este îndepărtat prin spălare şi celulele în repaus
sunt stimulate să prolifereze in vitro cu ajutorul unor
mitogeni sau prin stimulare antigenică. La sfârşitul
perioadei de incubare, celulele sunt analizate prin flow
citometrie în flux. Kitul CFSE furnizează o metodă
simplă şi sensibilă de analizare multiparametrică, ce
permite studierea de populaţii celulare aflate în proces de

102
proliferare şi identificarea a 7-10 generaţii celulare
succesive (figura 9).

Fig. 9 Celule SKBR-3 permeabilizate cu saponină. Analiza


monoparametrică comparativă a fluorescenţelor emise de CFSE
în zilele 1, 2, 3, 4, 7 şi 8 ale culturii demonstrează scăderea
progresivă a intensităţii FL2, ceea ce atestă proliferarea celulară.

Utilizarea concomitentă a iodurii de propidiu şi a


unor anticorpi fluorescenţi cu specificitate pentru
anumite molecule (markeri celulari), facilitează estimarea
viabilităţii celulare şi determinarea fenotipului acestora.
Analiza proliferării celulare cu ajutorul CFSE
furnizează câteva avantaje importante faţă de metodele
tradiţionale. Utilizarea timidinei tritiate (3H thymidine)
pentru studiile de proliferare celulară este grevată, pe de
o parte, de riscul manevrării de substanţe radioactive iar,
pe de altă parte, de faptul că metoda nu permite
identificarea populaţiilor proliferative. Analiza capacităţii
proliferative care se bazează pe încorporarea de
bromodeoxyuridină (BrdU) nu permite diferenţierea între

103
o singură diviziune celulară şi mai multe diviziuni ale
aceleiaşi celule. Mai mult, detecţia BrdU este realizată cu
ajutorul unui anticorp, pe când utilizarea CFSE elimină
această etapă suplimentară. Metoda bazată pe BrdU
necesită permeabilizarea membranei celulare, ceea ce
face imposibilă utilizarea iodurii de propidiu, în scopul
identificării celulelor vii. Spre deosebire de aceste
metode, marcarea cu CFSE permite recuperarea celulelor
vii în scopul unei eventuale noi utilizări.

8. Analiza morţii celulare prin apoptoză


O aplicaţie oarecum particulară se adresează
evidenţierii procesului apoptotic. Unul dintre
evenimentele precoce ale apoptozei este reprezentat de
translocarea fosfatidil-serinei (PS), un fosfolipid
membranar, din interiorul celulei la exteriorul
membranei. Acest eveniment poate fi exploatat în
citometria de flux, datorită faptului că PS va putea fi
evidenţiată prin legare de către Annexina V cuplată, la
rândul ei, cu o substanţă fluorescentă. Annexina V este o
proteină de aproximativ 35 kDa, Ca2+-dependentă, care
se leagă la fosfolipide şi în special la PS, cu o afinitate
crescută. Incubarea celulelor cu complexul Annexină V-
fluorocrom şi analiza lor flow-citometrică permit, pe
baza analizei fluorescenţei, detecţia acelor celule intrate
în apoptoză, în special a celor aflate în stadiile precoce
ale procesului.

9. Analiza citotoxicităţii celulare


Evidenţierea capacităţii citotoxice a celulelor NK
sau a limfocitelor T citotoxice se poate realiza prin teste
funcţionale, bazate pe evaluarea şi măsurarea eliberării

104
de 51Cr din ţintele ucise de efectori (vezi Teste de
evaluare a funcţionalităţii componentelor sistemului
imun). Există şi metode care utilizează citometria în flux
pentru analiza uciderii ţintelor celulare de către efectori.
Una dintre ele presupune o incubare prealabilă a ţintelor
celulare cu CFSE, apoi co-cultivarea celor două tipuri
celulare, efectori/ţinte, în diferite rapoarte. După o
anumită perioadă de incubare la 37oC, în atmosferă
5%CO2, mediului de cultură i se adaugă un colorant vital
fluorescent, care va pătrunde numai în celulele moarte.
Analiza flow-citometrică a amestecului de celule face
distincţia, pe de o parte, între celulele efector şi ţinte,
pentru că acestea din urmă sunt marcate cu CFSE, şi, pe
de altă parte, între ţintele vii şi cele moarte, pentru că
acestea din urmă au înglobat colorantul vital fluorescent.

10. Microbiologie
Chiar dacă investigarea bacteriilor (identificarea
patogenului sau sensibilitatea la antibiotice) este perfect
posibilă prin citometrie în flux, metoda este considerată
prea scumpă pentru a fi utilizată de rutină în acest
domeniu. Studiile efectuate până în prezent aparţin
domeniului cercetării şi au permis caracterizarea kineticii
bacteriene, incluzând curbe de creştere, studii de
reproducere sau studiul necesităţilor metabolice ale unor
microorganisme.
O direcţie particulară se referă la utilizarea flow
citometriei în controlul eficienţei metodelor de transfecţie
genică. De exemplu, flow-citometria permite măsurarea
expresiei intracelulare a genei ce codează β-galactozidaza
bacteriei E. coli (LacZ), inserată în celule de mamifere,
prin hidroliza unui substrat numit fluorescein

105
digalactozid. În funcţie şi de constructul folosit, gena
poate fi utilizată ca un marker în studii de dezvoltare şi
migrare, sau ca o genă reporter aflată sub controlul unor
elemente reglatoare definite.

11. Botanică
Chiar dacă imensa majoritate a aplicaţiilor
citometriei în flux se adresează omului şi animalelor,
există câteva aplicaţii ale acestei tehnici şi în lumea
plantelor, care vizează investigarea ciclului celular sau a
cromosomilor celulelor vegetale, chiar dacă aceştia sunt
mai greu de obţinut.

12. Farmacologie
Acest domeniu a devenit interesat de citometria în
flux dată fiind posibilitatea screening-ului unui număr
foarte mare de evenimente dintr-o singură probă, într-un
timp scurt. Astfel, în anumite condiţii, pot fi investigate
şi 100000 de probe pe zi. În plus, citometria în flux oferă
avantajul unic al analizării unui număr record de
parametri pentru fiecare probă.

106
Histocompatibilitatea în transplant

Transplantul de organe, ţesuturi şi celule


reprezintă o manieră spectaculară de tratament, la care se
apelează tot mai des atunci când pacienţii sunt afectaţi de
boli acute sau cronice care le pun viaţa în pericol.
Diversitatea transplanturilor realizate în prezent este
impresionantă: rinichi, ficat (întreg sau parţial), plămân,
cord, pancreas (sau insule de celule pancreatice), intestin,
piele, membre superioare sau inferioare, celule stem şi
chiar ţesuturi inginerizate genetic.
O compatibilitate perfectă între donator şi
primitor poate exista doar în cazul gemenilor monozigoţi.
Majoritatea transplanturilor se efectuează între membrii
diferiţi ai aceleiaşi specii (allotransplant). Organele sunt
obţinute fie de la cadavru, fie de la donatori în viaţă, de
obicei înrudiţi. În această situaţie, ca urmare a
polimorfismului sistemului MHC (Complex Major de
Histocompatibilitate), se va produce respingerea (rejetul)
grefei generată de existenţa unui nivel oarecare de
incompatibilitate (mismatch) între organismul primitor şi
cel donator. Rejetul apare ca o consecinţă a unui răspuns
imun celular foarte puternic, astfel încât primitorul va
trebui supus în mod obligatoriu unui tratament
imunosupresor.
Un transplant de succes se bazează pe o
compatibilitate (potrivire) cât mai bună între primitor şi

107
donator, deoarece astfel şi supravieţuirea organului
transplantat este mai lungă. De aceea, testarea pre-
transplant a compatibilităţii donor-acceptor este
obligatorie. Aceste teste de compatibilitate încep cu
determinarea grupei sanguine în sistemul ABO, continuă
cu tiparea HLA (MHC uman) a primitorului şi a
donatorului şi se încheie cu investigarea prezenţei
anticorpilor pre-existenţi în serul primitorului faţă de
molecule caracteristice donorului. Din raţiuni practice,
potrivirea în cazul transplantului de organe solide se
bazează pe definiţia serologică a antigenelor HLA. În
cazul în care donatorul este un frate/soră, şansa unei
potriviri perfecte este de ¼, ca urmare a transmiterii
Mendeliene, în bloc, a genelor HLA. În cazul donatorilor
neînrudiţi, luând în considerare un număr de 100 de gene
HLA clasă I şi HLA clasă II (ceea ce reprezintă o
subevaluare importantă) şi numărul de combinaţii ce
poate fi obţinut cu acest număr de gene, probabilitatea ca
un donator şi un primitor să se potrivească perfect poate
varia de la 1/1000 la 1/100000, în funcţie de frecvenţa cu
care o anumită alelă este prezentă în populaţie. Este deci
extrem de dificilă identificarea unui donator care să
prezinte aceleaşi antigene HLA-A, B şi DR ca şi
pacientul. Subliniem însă că o potrivire perfectă între doi
indivizi diferiţi nu poate fi atinsă, chiar dacă la nivelul
acestor 6 antigene ar exista un match perfect (0
mismatch). O adevărată identitate a tuturor alelelor HLA
între un donator şi un primitor neînrudiţi nu există, ca
urmare a polimorfismului extraordinar al sistemului
HLA, la care se adaugă diferenţe şi la nivelul unor alte
sisteme de gene şi molecule (de ex. mHC – complex
minor de histocompatibilitate) astfel încât, chiar şi în

108
cazul unei potriviri considerate acceptabile din punct de
vedere al sistemului HLA, tratamentul imunosupresor nu
poate fi abandonat. Progresul înregistrat din punct de
vedere al dezvoltării de noi astfel de droguri şi regimuri
imunsupresoare fac posibilă supravieţuirea pe termen
scurt a grefonului şi în caz de mismatch, dar
supravieţuirea pe termen lung este în mod semnificativ
ameliorată de potrivirea în sistemul HLA, după cum
există o relaţie inversă între numărul de nepotriviri şi
perioada de supravieţuire a grefei.
În cazul donatorilor cadavru, după tiparea HLA,
rezultatul este înregistrat într-o bază de date naţională sau
internaţională 3 , iar organele vor fi alocate primitorilor cei
mai potriviţi, înregistraţi la rândul lor pe o listă de
aşteptare.
Spre deosebire de transplantul de organe solide, în
cazul transplantului de măduvă osoasă (celule stem),
stringenţele imunologice de potrivire donor/acceptor sunt
mult mai mari, astfel încât, dificultatea de a identifica un
donator pentru un anumit primitor este mult mai mare.
De aceea, registrele potenţialilor donatori de măduvă,
care cuprind milioane de voluntari, sunt interconectate pe
plan internaţional, pentru a facilita găsirea donatorilor
potriviţi. În plus, celulele recoltate de la aceşti donatori,
pot fi păstrate în azot lichid şi transportate cu uşurinţă.

3 În Statele Unite există o reţea denumită UNOS – The United


Nation Network for Organ Sharing. În Europa, un grup de ţări
(Belgia, Olanda, Luxemburg, Germania, Austria, Slovenia) au
format Eurotransplant.

109
Tiparea tisulară (tiparea HLA I şi II)
Identificarea setului de molecule HLA de pe suprafaţa
leucocitelor poate fi realizată prin mai multe metode:
1. Citometria în flux (folosind Ac monoclonali)
– metodă rar utilizată. O variantă a acestei tehnici
(denumită Luminex) utilizează bile cu diametre şi culori
diferite, tapetate cu anticorpi anti-HLA.
2. Microlimfocitotoxicitatea sau citotoxicitatea
dependentӑ de complement (CDC) – această metodă
serologică foloseşte seruri policlonale, recoltate, în
special de la femeile însărcinate, imunizate prin
intermediul fătului cu antigene HLA paterne. Tehnica
tinde să fie tot mai puţin utilizată, fiind una laborioasă şi
tarată de cross-reactivităţile (reactivităţi încrucişate)
anticorpilor utilizaţi, dar are avantajul de a reproduce in
vitro o serie dintre fenomenele imunologice care se
produc in vivo.
Pentru tiparea HLA I, sunt utilizate fie celule
mononucleare izolate din sângele periferic, fie limfocite
T. Pentru tiparea HLA II, este nevoie de separarea
limfocitelor B din amestecul de mononucleare, de obicei
printr-o metodă magnetică ce utilizează bile tapetate cu
anticorpi ce leagă markeri pan-B (CD19, CD21). Între
2000 şi 5000 de celule sunt introduse în godeurile unor
plăci speciale, denumite Terasaki. Celulele sunt incubate
o perioadă suficientă de timp cu 1 µl de ser care provine
dintr-un panel de antiseruri, fiecare având o specificitate
sau un set de specificităţi definite. În cazul când
anticorpii se vor lega la moleculele HLA, se formează
complexe antigen-anticorp pe suprafaţa celulelor. În
etapa următoare, este adăugat complement, de obicei de

110
iepure. În acest fel, complexele antigen-anticorp vor
putea activa sistemul complement pe cale clasică şi vor
induce liza celulelor respective. Prin adăugarea unui
colorant vital (eozină, acridin orange/bromura de etidiu)
celulele vii pot fi distinse de cele moarte (figura 1).

A B

C D

Fig. 1 Microscopie în contrast de fază. A. Limfocite vii, colorate


cu eozină (se observă limfocitele mici, refringente, dispuse la
marginea godeului plăcii Terasaki (x100); B. Limfocitele moarte
au înglobat eozina, au talia mai mare şi şi-au pierdut refringenţa
(x400).
Microscopie de fluorescenţă. C. Limfocitele moarte, marcate cu
acridin-oranj, apar colorate în roşu-portocaliu (x200); D.
Amestec de limfocite vii (culoare verde) şi moarte (culoare roşu-
portocaliu) x200.

Prezenţa celulelor moarte este cuantificată în


incremente de câte 20%, astfel încât, de exemplu, o

111
pozitivitate caracterizată prin scorul 5 reflectă faptul că
între 80-100% din celulele godeului respectiv au fost
ucise.
Această tehnică are însă limite importante. Pentru
izolarea unui număr suficient de leucocite este necesar un
volum de minimum 10 ml de sânge proaspăt în cazul
tipării de clasă I şi o cantitate dublă pentru tiparea HLA
II. Celulele izolate prin separare în gradient de densitate
trebuie să aibă o viabilitate minimă de 80%, pentru ca
interpretarea testului să fie posibilă. Variate afecţiuni sau
tratamente medicamentoase pot influenţa dramatic
numărul şi viabilitatea leucocitelor. Reactivii utilizaţi,
anticorpii şi complementul, sunt produşi cu o valabilitate
limitată şi uşor degradabili atunci când sunt depozitaţi
incorect. Serurile de tipare HLA sunt produse rare,
deoarece sunt recoltate de la femei multipare şi trebuie
testate împotriva unui panel impresionant de leucocite
tipate. Anticorpii anti-HLA II sunt în mod particular
problematici, iar pentru HLA-DP nici nu există astfel de
anticorpi disponibili.
3. Metodele de biologie moleculară se bazează
pe amplificarea ADN-ului într-o reacţie PCR
(polymerase chain reaction) şi toate variantele tehnice
speculează diferenţele dintre secvenţele de nucleotide ale
alelelor.
Moleculele MHC prezintă fragmente importante
de structură în comun, dar şi diferenţe care sunt generate
tocmai de multiplele variante alelice. La nivelul fiecărei
molecule HLA, se poate descrie o secvenţă de bază
comună (consens) şi un fragment diferit care explică
polimorfismul. Prin tipare, se urmăreşte identificarea şi
caracterizarea acelor secvenţe nucleotidice responsabile

112
pentru diferenţele între moleculele HLA. Există trei
metode de biologie moleculară aflate în uzul curent: SSP
– sequence-specific priming; SSOP – sequence-specific
oligonucleotide probing; SBT – sequence-based typing.
Odată ce ADN-ul a fost extras din celulele
pacientului, va trebui amplificat într-o reacţie PCR.
Aceasta este o tehnică prin care se creşte numărul de
copii ale unei secvenţe ADN cunoscute (în cazul de faţă,
a unei porţiuni dintr-o genă HLA) cu ajutorul unei
perechi sau a mai multor perechi de primeri. Primerii
sunt secvenţe de oligonucleotide complementare
capetelor secvenţei genice ce urmează a fi amplificată.
Odată introduşi în reacţie, aceştia hibridizează secvenţele
respective şi, cu ajutorul unei enzime numită polimerază,
iniţiază replicarea secvenţei genice ţintă, ceea ce va
conduce la finalul primului ciclu de amplificare la
obţinerea unui număr dublu de copii ale ADN-ului de
interes. Procesul de denaturare a ADN-ului dublu
catenar, legarea primerilor şi replicarea secvenţei se
repetă astfel încât, datorită creşterii exponenţiale, după 25
de astfel de cicluri, numărul copiilor secvenţei genice
(ampliconi) vizate depăşeşte un milion.
Atunci când se urmăreşte tiparea HLA, primerii
sunt concepuţi de aşa natură încât să determine
amplificarea fie a unui întreg locus (de exemplu A, sau
DQβ), fie a unei particulare alele (de exemplu A23 sau
DRB1 16).
3.1 În metoda SSP, primerii sunt construiţi de aşa
natură încât să poată amplifica o secvenţă cunoscută,
caracteristică unei anumite variante alelice, ceea ce
înseamnă că această metodă implică în fapt un set de
reacţii PCR efectuate simultan. După amplificare, ADN-

113
ul este migrat în câmp electric într-un gel de agaroză.
Ansamblul benzilor de amplificare înregistrate se
constituie într-un pattern care este caracteristic unei
particulare alele. În majoritatea cazurilor, acest pattern
este într-atât de amplu încât este necesară utilizarea unui
software dedicat pentru interpretare (figura 2).

Fig. 2 Tehnica SSP: pattern-ul ampliconilor ce rezultă într-o


reacţie de tipare de rezoluţie joasă este capabil să ofere definirea
alelelor HLA la nivelul a 2 cifre (de exemplu HLA-A 02).

3.2 Metoda SSOP se desfăşoară în mai multe


etape. În prima parte, o secvenţă din ADN-ul
corespunzător genelor HLA vizate este amplificată într-o
reacţie PCR. Pot fi utilizate una sau mai multe perechi de
primeri (multiplex). Apoi, ADN-ul dublu catenar rezultat
din amplificare este denaturat, transformat în ADN
monocatenar şi fixat la suprafeţe solide (membrane).

114
Acest ADN fixat este ulterior pus în contact cu secvenţe
de oligonucleotide marcate, denumite probe. Design-ul
acestor oligonucleotide, cu lungimi cuprinse, în general,
între 19 şi 24 de baze azotate, este realizat în aşa fel încât
să fie complementare unor secvenţe cunoscute ale
diverselor alele HLA. Incubarea se realizează într-un
tampon de hibridizare, la o temperatură de hibridizare
foarte atent controlată, ceea ce permite ca secvenţele de
ADN monocatenar să se lege prin complementaritatea
bazelor azotate. Legarea nespecifică este contracarată
prin spălări ulterioare în condiţii de maximă stringenţă, la
temperaturi similare celei de hibridizare. Evidenţierea
legării se poate realiza prin marcarea probelor cu
substanţe radioactive (metodă rar utilizată astăzi, în ciuda
sensibilităţii ei), chemiluminiscente (ceea ce impune un
dispozitiv dedicat pentru detectarea semnalului) sau cu
enzime care vor degrada un substrat adecvat şi vor genera
o reacţie de culoare. Această ultimă variantă este şi cea
mai utilizată, deoarece poziţionarea benzilor colorate pe
suportul solid poate fi citită cu ochiul liber. Interpretarea
pattern-ului benzilor necesită, ca şi în cazul metodei SSP,
un program computerizat adaptat kiturilor utilizate.
O alternativă a metodei SSOP descrisă mai sus,
denumită Revers Dot Blot, este utilizată din ce în mai
frecvent. De această dată, probele sunt cele fixate la un
suport solid, iar ADN-ul amplificat este lăsat să
hibridizeze, în condiţii similare (Figura 3)

Fig. 3 Tehnica SSOP- revers dot blot: Pattern-ul benzilor


rezultat în urma procesului de hibridizare a ADN-ului amplificat
la oligonucleotide fixate pe un suport solid.

115
3.3 Atât SSP cât şi SSOP se adresează unor
secvenţe alelice cunoscute, bine caracterizate. De aceea,
nici una dintre aceste metode nu va putea identifica alele
noi, cu secvenţe necunoscute. Într-o astfel de situaţie, se
impune utilizarea unei tehnici denumită SBT – sequence
based typing, cu ajutorul căreia se realizează în fapt
caracterizarea secvenţei alelei respective. ADN-ul care
conţine gena de interes este mai întâi amplificat într-o
reacţie PCR obişnuită, după care urmează o a doua
reacţie de amplificare în care replicarea ADN-ului este
stopată prin încorporarea de dideoxinucleotide, analogi ai
bazelor azotate. Produsul de PCR va conţine astfel
secvenţe cu lungimi diferite, ca urmare a terminării
reacţiei la nivelul fiecărei baze azotate din secvenţă. Prin
migrarea produsului de amplificare în gel, vor putea fi
separate benzi care vor arăta ordinea bazelor azotate în
cadrul secvenţei respective. Această metodă ce foloseşte
substanţe radioactive este însă tot mai rar utilizată, în
defavoarea sistemelor automate de secvenţiere care se
bazează pe marcarea cu fluorocromi.
Secvenţa finală obţinută va putea fi apoi
comparată cu secvenţe HLA existente în baza de date.
Este nevoie de secvenţierea unei porţiuni suficient de
mari pentru a putea detecta toate diferenţele responsabile
pentru generarea unor epitopi definitorii. De exemplu, în
cazul HLA clasă I este nevoie de caracterizarea
secvenţelor aferente exonilor 2 şi 3, ba chiar şi a unor
secvenţe intronice la nivelul cărora poate apare un nivel
de polimorfism.
4. Cultura limfocitară mixtă (MLC – mixt
lymphocytes culture) sau reacţia limfocitară mixtă

116
(MLR – mixt lymphocytes reaction) reprezintă o
metodă de punere în evidenţă a diferenţelor dintre
celulele provenite de la două organisme diferite. Constă
în co-cultivarea a două populaţii celulare allogenice, deci
diferite din punct de vedere al sistemului HLA. Cele
două populaţii de limfocite îşi recunosc reciproc
moleculele HLA ca structuri non-self şi fiecare dintre
populaţiile celulare se activează faţă de antigenele
celeilalte.

Cross-match (X-match)
Acest test trebuie efectuat în mod obligatoriu
înainte de realizarea oricărui transplant şi are menirea de
a identifica prezenţa eventualilor anticorpi deja existenţi
în serul primitorului, specifici pentru antigene exprimate
de către celulele donatorului. Un cross-match pozitiv
(cross-match incompatibil) indică existenţa unor astfel de
anticorpi şi, într-o astfel de situaţie, transplantul nu se
poate efectua, deoarece rezultatul ar fi un rejet hiperacut,
mediat de aceşti anticorpi. Reacţia apare într-un interval
ce poate varia de la câteva minute până la 48h de la
momentul inserţiei organului. Astfel de anticorpi pot
apare ca urmare a imunizării anterioare a primitorului, în
urma unor transfuzii sanguine sau a unor transplanturi
anterioare. Trebuie menţionat însă că reacţia se produce
în special la nivelul organelor care sunt direct conectate
la vascularizaţie, aşa cum este, de exemplu, rinichiul 4 .

4
În interval de aproximativ 1h, apare un infiltrat masiv cu neutrofile,
se produce alterarea importantă a capilarelor glomerulare şi
hemoragie. Se formează trombi la nivelul arteriolelor, organul devine
necrotic şi este definitiv pierdut. Efectorii principali sunt neutrofilele
şi trombocitele care sunt activate prin intermediul receptorilor Fc şi a

117
Rejetul hiperacut, odată declanşat, nu poate fi stopat şi
este ireversibil.
Cea mai simplă procedură pentru efectuarea
cross-match-ului este reprezentată de metoda
microlimfocitotoxicităţii (citotoxicitate dependentă de
complement - CDC), menţionată anterior ca o tehnică
utilizată pentru identificarea diverselor molecule HLA.
De această dată, celulele donatorului sunt incubate chiar
cu serul primitorului, după care este adăugat
complement. Există şi se utilizează metode variate,
necesare pentru a diferenţia liza limfocitelor B de cea a
limfocitelor T, precum şi pentru a face distincţie între
prezenţa în serul primitorului a anticorpilor de clasă M
versus IgG.
Cross-match-ul se poate efectua şi prin citometrie
în flux, care se dovedeşte a fi o metodă mai sensibilă
decât tehnica CDC şi care, în plus, oferă posibilitatea de
detecţie a anticorpilor anti-HLA legaţi deja pe suprafaţa
celulelor donatorului. Dezavantajul acestei tehnici este
generat, în mod paradoxal, tocmai de sensibilitatea ei
crescută, ce amplifică riscul obţinerii de rezultate fals
pozitive.
În ciuda faptului că este o metodă laborioasă,
multe laboratoare utilizează tehnica ELISA pentru
avantajele legate de sensibilitatea şi acurateţea
rezultatelor. Principiul se bazează pe izolarea în gradient
de densitate a mononuclearelor din sângele periferic al
donatorului sau din splină (în cazul donatorului cadavru)
şi lizarea lor. Extractul proteic obţinut este utilizat pentru

receptorilor pentru complement. Odată activate, celulele eliberează


compuşi activi ai oxigenului, enzime, amine vasoactive, care vor
conduce la creşterea permeabilităţii vasculare şi leziuni tisulare.

118
tapetarea godeurilor unei plăci standard. Aceste proteine,
printre care se găsesc şi molecule HLA sunt ulterior
incubate cu ser de la primitor, apoi cu un anticorp
secundar anti-IgG uman cuplat cu o enzimă. Dacă se
produce legarea anticorpilor din serul primitorului la
proteinele de pe suprafaţa solidă a plăcii, atunci
anticorpul secundar interacţionează cu aceşti anticorpi,
iar enzima cu care secundarul este cuplat, va degrada un
substrat, adăugat în ultima etapă a metodei, şi va genera o
reacţie de culoare.

Rejetul acut se poate datora fie necrozei vaselor


grefonului, fie unui răspuns imun celular dezvoltat la
nivelul parenchimului acestuia. Acest tip de rejet, spre
deosebire de cel hiperacut, are şanse de a fi stopat prin
tratament imunsupresor agresiv.
Rejetul cronic reprezintă un proces ce evoluează
foarte lent (necesită luni sau ani), dar ireversibil.
Mecanismul incriminat cel mai adesea este reprezentat de
depunerea de complexe imune la nivelul grefonului, ceea
ce va determina dezvoltarea unei reacţii inflamatorii
cronice, ce se însoţeşte de distrucţii tisulare.

119
Evaluarea funcţionalităţii componentelor sistemului
imun

Acest capitol îşi propune să treacă succint în


revistă o serie de determinări şi teste in vivo şi in vitro,
care sunt capabile să ofere informaţii despre
funcţionalitatea celulelor sistemului imun specific şi
nespecific, precum şi a sistemului complement.

1. Limfocitele B
1.1 Teste in vivo
1.1.1 Cuantificarea nivelului imunoglobulinelor
serice reprezintă una dintre primele investigaţii ce trebuie
efectuate pentru evaluarea funcţiei limfocitelor B.
Metodele utilizate se pot baza pe reacţia de precipitare în
gel (imunodifuzia radială) sau în soluţie (nefelometria),
după cum pot fi utilizate metode mai sensibile precum
ELISA. În ceea ce priveşte imunoglobulinele din clasa
IgE, măsurarea nivelului seric al acestui isotip particular
(extrem de mic) necesită metode foarte sensibile bazate
pe chemiluminiscenţă sau radioactivitate. Este important
de subliniat că, datorită modificărilor semnificative ce se
produc odată cu îmbătrânirea, valorile normale trebuie
raportate corect la grupa de vârstă, după cum nu trebuie
neglijate nici diferenţele, fie ele şi minore, dintre rase şi
dintre sexe. Majoritatea valorilor de referinţă din
literatură prezintă un interval de confidenţă de 95%.

120
1.1.2 Cuantificarea subclaselor IgG se impune
atunci când sunt suspicionate anomalii mai subtile ale
limfocitelor B şi imunodeficenţa umorală avută în vedere
este asociată cu valori serice normale ale IgG totale.
Raţionamentul unei astfel de investigaţii se bazează pe
concentraţiile serice extrem de reduse ale IgG3 şi IgG4,
pe creşterile compensatorii ale celorlalte subclase, dar şi
pe proprietăţile diferite ale anticorpilor aparţinând celor 4
subclase. De exemplu, IgG4 nu activează calea clasică a
sistemului complement, iar IgG2 o face foarte slab.
Perioada de înjumătăţire a IgG3 este de numai 7 zile faţă
de 21 de zile în cazul IgG1. Anticorpii IgG2 sunt induşi
de o serie de antigene glucidice, în timp ce antigenele
proteice induc mai degrabă producţia de IgG1 şi/sau IgG3.
Nivelul IgG2 creşte lent în timpul copilăriei, ajungând la
nivelul maxim la vârsta de 6-7 ani. Imunodeficienţa în
IgG2 poate fi asociată cu o deficienţă în IgA. Deşi metoda
utilizată cel mai frecvent pentru măsurarea subclaselor
IgG este ELISA, costurile relativ crescute ale acestei
investigaţii impun ca, cel puţin din acest motiv,
determinarea subclaselor IgG să nu reprezinte un test de
rutină. O astfel de investigaţie este justificată în situaţia
în care, de exemplu, o imunodeficienţă, manifestă clinic
prin infecţii bacteriene recurente, este însoţită de un nivel
normal al anticorpilor serici, sau la limita inferioară a
valorilor normale.
1.1.3 Determinarea concentraţiei pre- şi post-
imunizare a anticorpilor apăruţi în urma unui răspuns
imun reprezintă o manieră de evaluare in vivo a
capacităţii limfocitelor B de a răspunde faţă de un anumit
particular antigen prin secreţia de anticorpi specifici. În
absenţa unei hipo- sau agammaglobulinemii, acest tip de

121
testare este capabil să ofere informaţii critice despre o
potenţială anormalitate a limfocitelor B, înainte de
iniţierea unui tratament intravenos cu imunoglobuline. În
cazul copiilor cu vârsta mai mică de 2 ani, diferenţierea
între un răspuns normal şi unul anormal faţă de antigene
polizaharidice este dificilă şi trebuie întotdeauna luat în
considerare contextul clinic.
1.1.4 Numărul absolut de limfocite poate fi
cuantificat cu ajutorul citometriei în flux, prin marcarea
celulelor cu anticorpi monoclonali fluorocromaţi,
specifici unor markeri caracteristici limfocitelor B.
1.2 Teste in vitro
1.2.1 Capacitatea limfocitelor B de a răspunde prin
proliferare, diferenţiere şi secreţie de anticorpi este
testată prin incubarea acestora în cultură cu activatori
policlonali (mitogeni) adecvaţi sau cu antigene. Astfel de
investigaţii nu se constituie în teste de rutină şi au
aplicaţii foarte restrânse în diagnosticarea unor
imunodeficienţe şi în cercetare.
2. Limfocitele T
2.1 Teste in vivo
2.1.1 Determinarea numărului absolut şi procentual
de limfocite T furnizează informaţii importante, inclusiv
din punct de vedere al funcţionalităţii acestor celule,
deoarece ele reprezintă majoritatea limfocitelor din
sângele periferic (cca. 75%), ca urmare a participării lor
la traficul limfocitar. Orice scădere sau creştere a
numărului de limfocite T influenţează, de o manieră mai
evidentă decât în cazul celulelor B şi NK, numărul total
de limfocite. Metoda de elecţie pentru numărarea
limfocitelor T este, aşa cum menţionam şi în cazul
limfocitelor B, citometria în flux, prin marcarea celulelor

122
cu anticorpi fluorocromaţi capabili să lege molecule
caracteristice limfocitelor T (markeri pan-T ca, de
exemplu, CD3). Dacă marcarea vizează identificarea
moleculelor co-receptor CD4 şi CD8, atunci este posibilă
evidenţierea celor 2 subpopulaţii majore de limfocite T:
helper şi citotoxice. Raportarea la valorile de referinţă va
trebui să ţină cont de grupele de vârstă.
2.1.2 Testarea dermică pentru hipersensibilitatea
întârziată. Una dintre cele mai cunoscute astfel de reacţii
este intradermoreacţia (IDR) la tuberculină, prin care se
urmăreşte evidenţierea capacităţii limfocitelor T de
memorie de a iniţia un răspuns imun de tip inflamator la
al doilea contact cu antigenul introdus intradermic. La 48
şi, respectiv, 72 de ore de la momentul injectării
antigenelor, sunt măsurate edemul şi eritemul de la locul
administrării. Absenţa acestor manifestări tipice reacţiei
inflamatorii acute denotă fie o anormalitate funcţională a
sistemului imun, fie absenţa unui contact anterior cu
antigenul respectiv, care să fi iniţiat formarea limfocitelor
T cu memorie. Pentru a contracara această ultimă
eventualitate, sunt administrate, în general, amestecuri de
antigene, din aceste paneluri făcând parte de obicei
antigene de Candida, varicela, dermatophyton, toxoid
difteric, toxoid tetanic şi PPD (purified peptide
derivative). Absenţa unui răspuns faţă de întregul panel
de antigene, coroborat cu infecţii produse de oportunişti,
evidenţiază o deficienţă severă a limfocitelor T care, deşi
prezente în organism, se dovedesc a fi anergice din punct
de vedere funcţional. La extrema cealaltă, manifestările
dermice ce apar la contactul cu anumite antigene
evidenţiază funcţionalitatea limfocitelor T, ce dau naştere
unui răspuns exagerat/neadecvat (dermatita de contact).

123
2.2 Teste in vitro
2.2.1 Testele de proliferare reprezintă echivalentul
in vitro al testelor dermice pentru evidenţierea
hipersensibilităţii întârziate. Proliferarea limfocitară este
estimată prin măsurarea sintezei de ADN de către
celulele aflate în cultură şi stimulate prin incubare cu
unul sau mai mulţi stimuli: mitogeni, ca
phytohemagglutinina (PHA) sau concanavalina A
(conA), sau antigene. Proliferarea este evaluată, după un
interval adecvat, prin cuantificarea încorporării unui
nucleosid marcat radioactiv (timidină tritiată) în ADN-ul
nou sintetizat. Rezultatele sunt exprimate fie sub forma
scintilaţiilor/minut (cpm – counts per minute), fie a
dezintegrărilor/minut (dpm – disintegrations/minute), fie
a unui indice de stimulare care reprezintă un raport între
cpm emise de celulele stimulate şi cpm emise de celulele
nestimulate. Activatorii policlonali stimulează practic
toate celulele T normale, astfel încât determinarea
proliferării se poate realiza după doar 3 zile de la
stimulare. Atunci când limfocitele T sunt stimulate cu un
anumit antigen, doar un număr restrâns de limfocite T,
specifice pentru antigenul în cauză, vor fi stimulate; în
acest caz, estimarea proliferării se realizează după cca. 6
zile. Ca şi în cazul testării dermice pentru
hipersensibilitatea de tip întârziat, este recomandată
utilizarea unui panel de antigene. Dacă pentru testarea
proliferării limfocitare este utilizat sânge integral, în
locul mononuclearelor separate în gradient de densitate,
este important să fie luat în considerare numărul absolut
de limfocite. O altă metodă ce poate fi utilizată pentru
determinarea proliferării limfocitelor este citometria în
flux, care permite nu doar numărarea celulelor dar şi

124
evaluarea fazelor ciclului celular, prin marcarea cu iodură
de propidiu (un fluorocrom care se leagă la ADN).
2.2.2 Testele de citotoxicitate sunt realizate pentru a
evalua capacitatea funcţională a limfocitelor T de a ucide
ţinte celulare, într-o manieră MHC-restrictată sau ne-
restrictată. Testul cel mai frecvent efectuat este destinat
limfocitelor T citotoxice, care recunosc antigene
prezentate de către moleculele MHC I. Acest tip de
răspuns are o mare importanţă in vivo din punct de
vedere al apărării împotriva unor patogeni intracelulari,
aşa cum sunt virusurile sau bacteriile intracelulare. În
situaţii speciale, este evaluată şi capacitatea de ucidere a
ţintelor de către limfocitele T helper, care recunosc
antigene prezentate de către moleculele MHC II. O parte
dintre limfocitele T care au un receptor pentru antigen de
tip γδ (TCR γδ) prezintă remarcabila capacitate de a
ucide ţinte într-o manieră directă, MHC ne-restrictată şi,
din acest punct de vedere, sunt practic similare cu
celulele NK. În testele de citotoxicitate, celulele ţintă
sunt marcate cu crom radioactiv (51Cr) şi sunt cultivate
împreună cu limfocitele, într-un set cunoscut de proporţii
ţintă/efector, iar prin uciderea celulelor ţintă, cromul este
eliberat în supernatantul de cultură. Liza ţintelor de către
limfocitele citotoxice impune însă ca acestea să fi fost în
prealabil activate de către antigenul respectiv şi să ajungă
în stadiul de celulă efector. În cazul limfocitelor care ucid
într-o manieră MHC ne-restrictată, sensibilizarea
anterioară cu antigenul respectiv nu este necesară.
Sistemul de testare al citotoxicităţii menţionat aici este
utilizat pentru ambele tipuri de liză a ţintei, MHC-
restrictată sau ne-restrictată.

125
2.2.3 Determinarea producţiei de citokine din
supernatantul de cultură al limfocitelor activate se
efectuează după o anumită perioadă de cultivare sau după
stimularea celulelor. Evaluarea secreţiei de citokine in
vivo este dificilă datorită cantităţilor foarte mici în care
acestea sunt secretate, datorită perioadei de înjumătăţire
extrem de scurte a acestor molecule şi datorită legării
rapide a acestor factori solubili la receptori de mare
afinitate. Metodele cele mai utilizate pentru măsurarea
citokinelor sunt ELISA, citometria în flux (cu ajutorul
unor bile cu diametre cunoscute, tapetate cu anticorpi –
CBA, cytometric bead array) sau metoda similară
denumită Luminex. Alternativ, prezenţa citokinelor în
citoplasma celulară poate fi identificată prin imunoblot
(după liza celulelor) sau prin citometrie în flux (după
permeabilizarea membranelor celulare).
3. Celulele NK (natural killer)
3.1 Citotoxicitatea celulelor NK este MHC ne-
restrictată şi nu necesită contactul anterior cu antigenul.
În organism, celulele NK sunt responsabile pentru
apărarea antivirală (anumite virusuri) şi antitumorală
(anumite celulele tumorale), dar şi pentru respingerea
grefelor. Dată fiind această acţiune selectivă a celulelor
NK, tehnica de evaluare a citotoxicităţii lor impune
alegerea acelor ţinte care să poată fi ucise în mod
spontan, cum ar fi celulele leucemice K562. Acţiunea
citotoxică a celulelor NK poate fi diversificată şi extinsă
şi la alte tipuri celulare, prin tapetarea acestora cu
anticorpi de isotipul G. Celulele opsonizate cu IgG sunt
recunoscute de către receptorii Fcγ activatori de pe
suprafaţa NK, ceea ce va determina activarea efectorilor
şi uciderea ţintelor. Acest tip de citotoxicitate este

126
denumit ADCC – citotoxicitate celulara dependentă de
anticorpi. Testul este similar celui descris mai sus,
marcarea celulelor ţintă făcându-se cu 51Cr, iar măsurarea
radioactivităţii supernatantului de cultură va reflecta
numărul de celule lizate.
3.2 Citotoxicitatea celulelor NK poate fi amplificată
prin acţiunea citokinelor, astfel că în testul descris
anterior intervine o etapă suplimentară, în care celulele
sunt mai întâi incubate cu citokine, în special IFNγ şi IL-
2. Prin acţiunea interferonului, activitatea celulelor NK
este amplificată în decursul a doar câteva ore, în timp ce
prin acţiunea IL-2 este amplificată nu doar activitatea
citotoxică, dar şi diversitatea ţintelor care devin
susceptibile la liza indusă de NK. Este cazul anumitor
celule tumorale, care nu sunt ucise în testele standard de
citotoxicitate. Astfel de celule efector activate prin
acţiunea citokinelor sunt denumite generic LAK –
lymphokine-activated killer cells, celule citotoxice
activate de limfokine.
4. Fagocite
4.1 Acţiunile monocitelor/macrofagelor sunt mai
numeroase şi mai diverse decât lasă să se înţeleagă
denumirea de fagocite. În afara capacităţii de
internalizare şi ucidere intracelulară a particulelor, aceste
celule pot prezenta antigenele limfocitelor T, pot ucide
extracelular (în special prin intermediul anticorpilor –
ADCC), pot ucide celule tumorale şi joacă un rol
important în procesul inflamator, în special prin secreţia
de factori cu acţiune chemotactică. Din punct de vedere
clinic, alterarea funcţionalităţii acestor celule conduce la
imunodeficienţe manifestate prin infecţii recurente cu
oportunişti şi patogeni intracelulari. Evaluarea funcţiei

127
monocitelor/macrofagelor implică testarea capacităţii lor
de fagocitoză, de activare a mecanismelor oxigen-
dependente şi de ucidere intracelulară a patogenilor, a
capacităţii de procesare, prezentare şi activare a
limfocitelor T, a citotoxicităţii, a expresiei de receptori
pentru citokine, precum şi a secreţiei de citokine.
4.2 Funcţionalitatea neutrofilelor (PMN –
polimorfonucleare neutrofile) este testată din punct de
vedere al capacităţii acestora de a fagocita, de a produce
compuşi activi ai oxigenului şi de a ucide bacteriile
fagocitate, de a răspunde la factori chemotactici şi de a
traversa barierele endoteliale prin exprimarea unor
molecule cheie de adeziune.
4.2.1 Chemotaxia neutrofilelor poate fi studiată cu
ajutorul unui dispozitiv numit cameră Boyden care constă
într-o recipient format din 2 spaţii, separate printr-un
filtru. Într-unul dintre spaţii sunt plasate celulele şi în
celălalt sunt introduşi factori chemotactici. După o
perioadă de incubare, filtrul este examinat la microscop,
iar dacă neutrofilele sunt funcţionale, ele se deplasează ca
urmare a acţiunii chemoatractanţilor şi se ataşează la
filtru. O metodă alternativă utilizează geluri de agar.
Alternativa in vivo a metodei descrise pentru studiul
chemotaxiei este metoda Rebuck, de realizare a unei
„ferestre” dermice. Pielea este răzuită cu un bisturiu pe o
porţiune de cca. 2 cm2 şi este acoperită cu o lamelă timp
de 24 de ore. Apoi, lamela este colorată şi analizată la
microscop pentru evidenţierea celulelor ataşate.
4.2.2 Puseul oxidativ se realizează prin activarea
şuntului hexoz-monofosfaţilor şi conduce la obţinerea de
compuşi activi ai oxigenului (anion superoxid, oxigen
singlet, radicali hidroxil şi hidrogen peroxid (H2O2)), cei

128
mai eficienţi mediatori ai uciderii bacteriilor fagocitate.
Acest proces este declanşat consecutiv activării
neutrofilelor, iar absenţa puseului oxidativ reflectă o
importantă deficienţă funcţională a celulelor.
Manifestarea clinică cea mai cunsocută este Boala
Cronică Granulomatoasă. Metoda utilizată pentru
evaluare se bazează pe testul NBT (nitroblue
tertrazolium), în care neutrofilele activate fagocitează
acest colorant galben, iar compuşii activi ai oxigenului
formaţi reduc NBT-ul în interiorul celulei, conducând la
formarea de cristale insolubile de formazan de culoare
albastră. În locul NBT, poate fi utilizată o substanţă
fluorescentă, 123-dihidrorodamina (DHR), care sub
acţiunea apei oxigenate este oxidată şi emite un semnal
fluorescent ce poate fi măsurat prin citometrie în flux.
Pentru a obţine un semnal mai puternic, în general,
neutrofilele sunt activate cu Phorbol Myristate Acetate
(PMA) – un mitogen. O metodă alternativă se bazează pe
chemiluminiscenţă. Ingestia de particule de zimozan
activează neutrofilele, induce generarea de metaboliţi ai
oxigenului şi aceştia au capacitatea de a reacţiona cu
substraturi luminogene conducând la emisia de lumină
care poate fi detectată şi cuantificată.
4.2.3 Testele de ucidere microbiană urmăresc
evaluarea funcţiei neutrofilelor de a ucide bacteriile pe
care le-au fagocitat (bacteriile intracelulare). Principiul
tehnicii presupune incubarea neutrofilelor cu bacteriile
vizate, dar şi cu opsonine, care au rolul să amplifice
fagocitoza. După o perioadă de timp, necesară producerii
fagocitozei, la mediul de cultură se adaugă antibiotic, ce
va ucide bacteriile extracelulare, rămase nefagocitate.
Singurele bacterii vii sunt cele din interiorul

129
neutrofilelor, care, însă, vor fi, la rândul lor ucise, prin
activarea neutrofilelor şi generarea de metaboliţi ai
oxigenului într-o perioadă de incubare suplimentară.
După această incubare suplimentară, neutrofilele sunt
lizate, conţinutul celular este plasat în agar şi cultivat
peste noapte, la 37oC. Bacteriile rămase vii, vor produce
în agar colonii. Coloniile sunt numărate şi raportate la
numărul de colonii formate de celule la momentul zero
(înainte de adăugarea antibioticului, o fracţiune din
cultură este lizată şi cultivată în agar). Această tehnică
este avantajoasă, dar impune existenţa unor controale
foarte bine definite.
4.2.4 Evaluarea expresiei moleculelor de adeziune
este necesară pentru a putea identifica eventualele
deficienţe ale procesului de diapedeză a neutrofilelor.
Metoda de elecţie este citometria în flux, anticorpii
utilizaţi fiind directionaţi în special împotriva moleculei
LFA-1 (leukocyte function-associated antigen).
Deficienţele la nivelul moleculelor de adeziune conduc la
sindromul leucocitelor leneşe (LAD – defect de adeziune
leucocitară), manifestat prin neutrofilie, scăderea
capacităţii celulelor de a adera, de a răspunde la factori
chemotactici şi de a fagocita şi care, din punct de vedere
clinic, sunt reflectate prin infecţii recurente, vindecarea
foarte lentă a leziunilor şi absenţa formării puroiului la
nivelul infecţiei.
5. Bazofile
Testul de eliberare a histaminei reprezintă o metodă de
evaluare a anticorpilor de clasă E specifici pentru un
anumit alergen. Principiul tehnicii se bazează pe
caracterul homocitotropic al IgE, care, după sinteză, se
ataşează de receptorii Fcε de mare afinitate, exprimaţi pe

130
membranele mastocitelor şi ale bazofilelor. Peste un
preparat care conţine fie sânge periferic provenind de la
un individ sensibilizat (prezintă IgE cu anumită
specificitate), fie leucocite care conţin bazofile,
(mastocitele sunt celule tisulare, nu se găsesc în sânge) se
adaugă ser test, în care se găsesc antigenele specifice
anticorpilor pe care dorim să-i identificăm. Interacţiunea
dintre alergene şi anticorpii fixaţi pe membranele
bazofilelor determină activarea celulelor şi degranularea
lor, cu eliberarea de histamină, care este măsurată în
supernatant şi este raportată la cantitatea totală de
histamină conţinută în toate bazofilele din proba
investigată.
6. Sistemul complement (SC)
Sistemul complement este testat într-o varietate de
afecţiuni imunologice în care este suspectată fie
funcţionarea sa deficitară, fie utilizarea lui excesivă, care
va conduce la scăderea concentraţiei unora dintre
componentele sale.
6.1 Determinarea concentraţiei diverşilor compuşi ai
SC se realizează cu ajutorul unor metode care nu necesită
o sensibilitate deosebită, dat fiind faptul că valorile
normale ale acestor proteine sunt de ordinul mg/ml.
Astfel, pot fi utilizate difuzia radială simplă,
nefelometria, ELISA. Din păcate însă, anticorpii specifici
pentru compuşii complementului care sunt utilizaţi în
aceste metode, nu pot face distincţia între formele
normale ale acestor factori şi cele anormale, astfel încât
identificarea unei concentraţii normale a unui particular
compus al SC nu reflectă neapărat şi funcţionalitatea
acestuia. Un exemplu din acest punct de vedere este dat
de angioedemul ereditar, afecţiune manifestată prin

131
apariţia de edeme localizate la nivelul feţei, al cavităţii
bucale sau la niveul mâinilor şi cauzată de o deficienţă de
C1 inhibitor (C1-INH).
6.2 Testele funcţionale sunt cele care pot evalua
activitatea propriu-zisă a diverşilor factori ai SC. Testul
conceput în scopul evaluării deficitului de sistemului
complement, numit CH50 (total haemolitic complement
assay), reprezintă un sistem de măsurare a funcţionalităţii
căii clasice de activare a sistemului complement, precum
şi a compuşilor terminali ai acesteia (complexele de atac
membranar – MAC) şi presupune incubarea complexelor
formate din eritrocite şi anticorpi anti-eritrocite cu serul
de interes. Prezenţa complexelor antigen-anticorp
activează calea clasică de activare a complementului,
ceea ce va conduce la liza hematiilor. Procentul de
eritrocite lizate depinde de conţinutul serului în
complement, iar hemoliza serului de testat este
comparată cu hemoliza eritrocitelor de către un ser
standard, ce conţine toate componentele căii clasice. În
ciuda simplităţii principiului expus, astfel de teste sunt
dificil de realizat din punct de vedere tehnic, fiind
sensibile la o serie de factori cum sunt concentraţia de
eritrocite şi fragilitatea lor, cantitatea de anticorp utilizată
pentru sensibilizarea celulelor, concentraţia de cationi şi
pH-ul mediului de reacţie, temperatura şi timpul de
reacţie.
6.3 Complexe Imune Circulante (CIC) şi compuşi ai
SC. Determinarea concentraţiei serice a complexelor
antigen-anticorp se poate realiza prin diverse metode.
Datorită activării sistemului complement pe cale clasică
de către anticorpii de clasă M şi G, unele dintre aceste
metode se adreseaza compusului C3 şi produşilor care

132
rezultă prin scindarea sa. Testul celular Raji se bazează
pe imobilizarea complexelor imune la nivelul unei linii
celulare care exprimă receptori pentru compuşii iC3b şi
C3d. Testul anti-C3 se bazează pe legarea anticorpilor
specifici la acest compus. Prin fixarea la o suprafaţă
solidă de anticorpi specifici pentru produşi de scindare ai
C3, complexele imune care conţin astfel de compuşi sunt
capturate şi pot fi detectate cu anticorpi anti-
imunoglobuline marcaţi.

133
Modele experimentale animale

Modelele experimentale in vitro prezintă un set de


avantaje legate de posibilitatea de a controla şi manipula
cu precizie condiţiile în care se desfăşoară interacţiunile
celulare. Din acest motiv, experimentele pot fi concepute
în maniera dorită şi, totodata, pot fi repetate în condiţii
identice. Pe de altă parte, dezavantajul acestui tip de
abordare este legat tocmai de inevitabila simplificare a
condiţiilor experimentale, care poate conduce la un
sistem artificial.
Experimentele in vivo, care implică întregul
organism animal, au dezavantajul de a introduce în
sistemul experimental un număr uriaş de necunoscute şi
variabile, în schimb, aduc cu sine avantajul foarte
important al obţinerii de rezultate într-un context extrem
de complex dar, totodată, real. Pentru a descrie în mod
plastic veridicitatea datelor obţinute în animalul viu, a
fost parafrazat celebrul dicton roman: „in vivo veritas”.
Pentru a obţine rezultate semnificative, este
extrem de importantă alegerea corectă a speciei sau a
tipului de animal de laborator. De exemplu, este posibil
ca dezvoltarea unor particulare vaccinuri să impună
utilizarea exclusivă a primatelor sau este necesară
utilizarea animalelor cu talie mare (iepure, oaie, capră,
cal, etc), atunci când se doreşte obţinerea unor cantităţi
mari de anticorpi, pentru că aceste animale sunt capabile

134
să furnizeze cantităţi mari de ser. Totuşi, pentru cea mai
mare parte a experimentelor in vivo, şoarecele rămâne
animalul de elecţie. Motivele acestei alegeri sunt legate
de faptul că este un mamifer, uşor de manevrat, iar din
punct de vedere al sistemului imun, mai bine caracterizat
decât la alte specii, prezintă similitudini remarcabile cu
cel uman. În plus, chiar dacă este un animal de talie mică,
organele interne, inclusiv organele limfoide, pot fi
vizualizate cu uşurinţă. Creşterea şoarecilor necesită un
spaţiu relativ redus, o cuşcă cu dimensiunile
aproximative ale unei cutii de pantofi putând acomoda 5
adulţi. Un alt avantaj important este cel legat de
capacitatea lor de a se înmulţi cu uşurinţă, sarcina având
o durată de cca. 4 săptămâni; după 3 săptămâni, puii pot
fi înţărcaţi, iar după alte 4 săptămâni ajung la maturitate
sexuală.

1. Animale inbred (singenice)


Ideea producerii unor astfel de linii de animale a
apărut din necesitatea de a putea utiliza în experimente
loturi perfect omogene de animale, care să nu prezinte
diferenţe din punct de vedere al bagajului genetic. În
afară de şoareci, au mai fost folosiţi şobolani sau cobai;
totuşi, şoarecii sunt preferaţi din cauza ciclului scurt de
înmulţire. Maniera de obţinere a unei linii inbred este
aceea de înmulţire a animalelor într-un sistem frate-soră,
timp de cel puţin 20 de generaţii, ceea ce conduce în final
la generarea unor pui care sunt identici la nivelul a peste
98% dintre loci, astfel că, la fel ca şi în cazul gemenilor
monozigoţi, animalele sunt denumite singenice.
Transplantul de celule sau organe de la un animal
la altul în cadrul unei linii inbred nu conduce la reacţia de

135
respingere (rejet), de vreme ce şi din punct de vedere al
genelor şi al produşilor MHC, aceste animale sunt
identice. În fapt, utilizarea liniilor inbred a oferit
posibilitatea identificării funcţiei moleculelor MHC I şi
MHC II, de prezentare a peptidelor antigenice
limfocitelor T.
MHC-ul murin, codat de un ansamblu de gene
situate pe cromosomul 17, este denumit H-2 (grupul 2 de
histocompatibilitate). Setul de alele prezente pe un
acelaşi cromosom este denumit haplotip. Două
haplotipuri, câte unul de la fiecare părinte, alcătuiesc
genotipul individului respectiv. Dat fiind faptul că în
cazul liniilor inbred haplotipul matern şi cel patern sunt
identice, şoarecii inbred sunt definiţi şi denumiţi pe baza
haplotipului MHC, cu ajutorul unei litere latine mici. De
exemplu, setul de alele MHC care apare în cazul
şoarecilor din specia C57BL este denumit cu litera b, iar
haplotipul este atunci H-2b. Haplotipul şoarecilor CBA
este H-2k, al şoarecilor DBA/2 este H-2d, etc.
Prezentăm în tabelul alăturat câteva dintre cele
mai utilizate linii inbred şi caracteristicile lor.

2. Animale congenice
Pentru anumite scopuri experimentale, sunt uneori
necesare animale care să difere între ele doar printr-o
anumită particulară genă, în timp ce toate celelalte gene
ale genotipului sunt identice. Aceste animale sunt
denumite congenice. Adesea, gena vizată face parte din
complexul MHC şi, în acest caz, diferenţele între
răspunsurile imune dezvoltate de cele două animale
congenice pot fi asociate direct cu funcţia genei şi a
produsului proteic codat de aceasta.

136
Linii inbred
Linia Sublinia Caracteristici
AKR AKR/J Incidenţă crescută a leucemiilor
BALB/c BALB/cj Sensibilitate la radiaţii
CBA CBA/J Degenerescenţă retiniană
C57BL/6 C57BL/6J Incidenţă crescută a
hepatoamelor
DBA/1 DBA/1J Incidenţă crescută a tumorilor
mamare
DBA/2 DBA/2N Răspuns imun scăzut faţă de
polizaharidul pneumococic tip III
NZB NZB/N Afecţiune autoimună LED-like la
puii obţinuţi prin încrucişarea cu
şoareci NZW
SWR SWR/J Susceptibilitate crescută la EAE
(encefalita experimentală
alergică)
Adaptat după Thomas J Kindt, Barbara A Osborne, Richard A
Goldsby, 2006

Metoda de obţinere a şoarecilor congenici a fost


pusă la punct de George Snell, laureat al premiului Nobel
în anul 1980 pentru lucrările sale din domeniul MHC.
Procedura implică încrucişarea a două animale din linii
imbred diferite, cu scopul de a introduce un anumit
caracter (o anumită genă) în background-ul genetic al
celui de-al doilea animal. De exemplu, se poate încrucişa
un şoarece care are capacitatea biologică de a respinge o
anumită tumoră (linia A) cu un şoarece, aparţinând liniei
B, care nu are această capacitate, cu scopul de a
introduce în animalele B, caracterul liniei A, de
respingere a tumorii. Puii care vor rezulta în urma acestei

137
prime încrucişări, generaţia F1, vor avea gene moştenite
de la ambii părinţi, astfel încât e necesară identificarea
acelor pui care posedă capacitatea de respingere a tumorii
(caracterul A). Numai aceste animale vor fi încrucişate,
în continuare, cu un şoarece sensibil la celulele tumorale,
din linia B şi, astfel, va rezulta generaţia F2 de pui, care
la rândul ei va trebui supusă screening-ului pentru a putea
identifica animalele rezistente (pozitive pentru gena ce
codează caracterul A). Procedeul continuă timp mai
multe generaţii (14-18) şi, după fiecare încrucişare, vor
rezulta pui al căror bagaj genetic este tot mai bogat în
gene moştenite de la animalele liniei B, dar care
păstrează gena responsabilă pentru rezistenţa faţă de
tumoră (caracterul A). După aproximativ a 15-a
încrucişare, diluţia genică este completă, animalele
obţinute în final au acelaşi genom ca cele din linia B, cu
excepţia genei responsabile de caracterul A.

3. Animale chimerice (chimeras)


În mitologia greacă, chimerele erau fiinţe
fantastice, reprezentate, cel mai adesea, ca un amestec de
leu, capră şi şarpe. Acest termen este utilizat pentru
şoarecii în organismul cărora coexistă ţesuturi separate,
cu origine maternă şi paternă (părinţii fiind animale
distincte din punct de vedere genetic), spre deosebire de
animalele rezultate din încrucişări obişnuite, la care
trăsăturile materne şi paterne coexistă în fiecare celulă.
Astfel, chimerele oferă celule şi ţesuturi cu genotipuri
diferite, ce sunt exprimate în cadrul aceluiaşi animal.
Un exemplu remarcabil de chimeră este oferit de
şoarecele tetraparental (allophenic), obţinut pentru prima
oară de Beatrice Mintz şi colaboratorii săi în anul 1967.

138
Producerea acestor animale este realizată prin
combinarea a 2 embrioni diferiţi, aflaţi în stadiul în care
conţin câte 8 celule. Embrionii sunt introduşi în uterul
unor şoareci pseudogravizi. Deoarece fiecare dintre cei
doi embrioni are câte 2 părinţi, combinaţia care rezultă
are astfel 4 părinţi, de unde şi termenul de
„tetraparental”. Atunci când sunt utilizaţi şoareci care au
haplotipuri H-2 diferite, chimerele rezultate vor conţine
ambele haplotipuri, dar întrucât aceste celule diferite s-au
dezvoltat în cadrul aceluiaşi organism şi în contact unele
cu celelalte, ele vor deveni tolerante unele faţă de
celelalte.
Dificultăţile tehnice pe care le incumbă
producerea şorecilor tetraparentali au făcut ca şi
experimentele care pot fi realizate cu ajutorul acestora să
fie limitate ca număr. Soluţia a venit însă prin realizarea
unui alt tip de şoareci chimerici şi anume chimerele de
măduvă osoasă. Acestea sunt animale adulte care suferă o
iradiere totală, ceea ce are ca efect distrugerea în
totalitate a celulelor derivate din măduva hematogenă,
după care sunt repopulate cu măduvă osoasă ce provine
de la un al doilea şoarece, aparţinând unei linii diferite.
Limfocitele care se vor genera din măduva donorului
sunt obligate să se dezvolte în micromediul oferit de
şoarecele recipient. Primele experimente, efectuate cu
astfel de chimere de către von Boehmer în 1975, au
urmărit să determine dacă limfocitele B de la un animal
pot coopera cu limfocitele T de la un animal diferit.
Experimentul a presupus injectarea de măduvă osoasă,
provenind de la două animale cu haplotipuri diferite, într-
un animal iradiat, de fapt, într-un pui rezultat din
încrucişarea a două animale din liniile respective.

139
Analizarea celulelor din organele limfoide ale acestei
chimere a evidenţiat o populaţie mixtă de limfocite având
haplotipuri diferite, caracteristice celor două animale
parentale. Confruntarea acestui animal cu un antigen a
fost urmată de generarea de plasmocite, ceea ce a
demonstrat existenţa cooperării allogenice T-B.
Rezultatele au fost surprinzătoare şi uneori controversate,
în special în ceea ce priveşte funcţionarea fenomenului
de restricţie MHC, iar concluzia acestor tipuri de
experimente a fost constatarea că există o remarcabilă
plasticitate a sistemului imun, astfel încât restricţia MHC
poate fi modificată sau reînvăţată.

4. Şoareci SCID (severe combined immunodeficiency


– imunodeficienţa severă combinată)
Şoarecii liniei inbred CB-17 dezvoltă în mod
spontan o imunodeficienţă caracterizată prin
imposibilitatea maturării limfocitelor T şi B, ca urmare a
incapacităţii lor de a executa rearanjările genelor V/D/J
necesare sintezei şi expresiei receptorilor pentru antigen
(TCR şi BCR). Absenţa limfocitelor mature, funcţionale,
în aceste animale permite, în schimb, grefarea de celule
sau ţesuturi de la alte linii de şoareci sau alte specii, fără
apariţia fenomenului de rejet. Ca urmare, şoarecii SCID
reprezintă modele experimentale animale foarte
importante pentru studiul sistemului imun, inclusiv
uman, dat fiind faptul că, prin injectarea de măduvă
osoasă se generează limfocite B şi T normale, după cum
transplantul unor ţesuturi/organe umane ca ficatul,
timusul, sau organe limfoide secundare nu va fi urmat de
respingerea acestora. Prin introducerea de ţesut hepatic
fetal uman sunt introduse în organismul şoarecilor SCID

140
şi precursori limfocitari (celule stem). Aceste celule
nediferenţiate vor lua contact cu ţesuturile murine iar
consecinţa va fi un proces de inducere a toleranţei,
similar celui de inducere a toleranţei faţă de self dintr-un
organism normal. În plus, celulele stem vor avea
posibilitatea să migreze către diversele ţesuturi umane
grefate şi se vor putea diferenţia în limfocite B şi T, ceea
ce permite manipularea şi studierea limfocitelor umane
într-un model experimental animal sau testarea
vaccinurilor, în special a celor destinate protecţiei
împotriva virusurilor cu tropism limfocitar. Un astfel de
animal chimeric este denumit şoarece SCID umanizat.

5. Şoareci nuzi
Importanţa timusului în dezvoltarea limfocitelor T
mature este evidentă în cadrul sindromului DiGeorge,
manifestat prin hipoplazie timică sau atimie congenitală.
Din punct de vedere experimental, rolul timusului poate
fi demonstrat cu ajutorul animalelor de laborator care
sunt timectomizate neonatal sau iradiate şi care, apoi,
sunt reconstituite cu măduvă osoasă de la animale
singenice. În absenţa timusului, animalele respective nu
mai pot produce limfocite T, fiind generată o
imunodeficienţă severă. Formarea limfocitelor T poate fi
reluată prin grefarea de ţesut timic epitelial.
Există o specie de şoareci care sunt homozigoţi
pentru o particulară mutaţie la nivelul unei gene recesive
de pe cromosomul 11, responsabilă pentru absenţa
timusului, dar şi pentru absenţa blănii, de unde şi numele
de şoareci nuzi (nu/nu). Şoarecii heterozigoţi au atât păr,
cât şi timus, fără să fie foarte clar dacă aceeaşi genă
trebuie incriminată pentru cele două caracteristici.

141
Deoarece aceste animale prezintă o imunodeficienţă
severă, ele nu pot supravieţui în condiţii normale şi
trebuie manipulate în condiţii de sterilitate, inclusiv în
ceea ce priveşte apa şi hrana. În schimb, reprezintă
modele experimentale foarte utile (figura 1).

Fig. 1 Şoarece nud. Se remarcă absenţa completă a blănii.


Absenţa timusului face ca aceşti şoareci să poată supravieţui
doar în condiţii de sterilitate.

Dată fiind absenţa cvasitotală a limfocitelor T şi a


imposibilităţii producerii de răspunsuri imune celulare,
deci a unei reacţii de rejet, astfel de şoareci s-au dovedit
extrem de utili pentru propagarea in vivo a unor linii
celulare tumorale (cum ar fi hibridoamele) sau a unor
explanturi tumorale provenind de la alte specii. Absenţa
ajutorului limfocitelor T face ca şi producţia de anticorpi
să fie blocată.
Transplantul timic la şoarecii nuzi oferă
posibilitatea reversării acestei imunodeficienţe, ceea ce
subliniază odată mai mult importanţa micromediului
acestui organ limfoid primar pentru formarea limfocitelor
T. Trebuie însă remarcat faptul că şoarecii nuzi prezintă
totuşi un număr foarte redus de limfocite T, frecvent

142
limfocite cu TCR de tip γδ, iar numărul acestora creşte cu
vârsta, fapt ce sugerează existenţa în organism a unui
situs extratimic de diferenţiere a limfocitelor T.

6. Şoareci transgenici
Animalele transgenice reprezintă instrumentul cel
mai important pentru studierea efectelor genelor ce
codează pentru diferite molecule implicate în
funcţionarea sistemului imun. Sunt obţinute prin
introducerea cu ajutorul unui ac extrem de fin în unul
dintre pronucleii oului fertilizat a unei gene străine
clonate (transgenă), urmată de microinjectarea ouălelor în
oviductul unor femele pseudogestante. Rata de succes a
acestei tehnici nu depăşeşte 30%, dar, în caz de succes,
transgena este integrată stabil atât în celulele somatice cât
şi în celulele germinale ale animalului transgenic, şi va fi
transmisă celulelor fiică şi, mai departe, într-o manieră
Mendeliană, puilor.
Într-un astfel de animal transgenic, toate celulele
conţin transgena respectivă, dar, cu toate acestea, apar, în
funcţie de ţesut, diferenţe de expresie a produsului codat.
În plus, expresia genei poate fi controlată prin construcţia
unei transgene căreia i se ataşează un promotor
particular, care poate funcţiona doar în anumite ţesuturi.
Un exemplu des utilizat este cel al promotorului
insulinei, care funcţionează doar la nivelul pancreasului.
Alţi promotori reacţionează ca răspuns la anumiţi stimuli
biochimici, cum ar fi de exemplu promotorul
metalotioninei care funcţionează în prezenţa zincului, ce
poate fi adăugat ca un supliment în apa de băut a
animalelor transgenizate.

143
Astăzi sunt disponibile o varietate de linii de
şoarecii transgenici, utilizate atât pentru studierea unor
gene care nu sunt în mod uzual exprimate in vivo, cum ar
fi oncogenele, dar şi a unor gene care codează pentru
anumite particulare imunoglobuline, receptori pentru
antigen ai limfocitelor T, molecule MHC I sau II,
citokine, precum şi structuri antigenice.
În ciuda spectaculozităţii unui astfel de model
experimental, interpretarea rezultatelor obţinute cu
ajutorul acestor şoareci trebuie realizată cu mult
discernământ ca urmare a unor limitări importante.
Astfel, expresia crescută a transgenei în ţesuturi
nerelevante poate face acest model nefiziologic. Pe de
altă parte, transgena se integrează în genomul celulelor
de o manieră aleatorie, inclusiv în regiuni ale ADN-ului
care nu sunt active din punct de vedere transcripţional,
situaţie în care transgena nu se va putea exprima. O astfel
de situaţie a putut fi depaşită prin direcţionarea genei
respective către un locus particular din linia germinală a
şoarecelui respectiv.
Etapele necesare pentru obţinerea unui şoarece
transgenic pot fi rezumate astfel:
- Femela, a cărei ovulaţie este indusă hormonal,
este încrucişată cu un mascul aparţinând unei linii
diferite → sunt obţinute ouă fertilizate (embrioni)
→ ouăle sunt disociate şi selectate; cele selectate
sunt plasate pe lame de microscopie speciale.
- Este pregătit ADN-ul de inserat şi este introdus în
pipeta destinată injecţiei, apoi acesta este injectat
în interiorul embrionului → se incubează peste
noapte.

144
- Embrionul transgenic este implantat în
infundibulum-ul unei femele pseudogestante →
se aşteaptă cca. 20 de zile → sunt născuţi puii →
se aşteaptă 25 de zile pentru a putea face
screening-ul puilor.
- Se taie vârful cozii (aproximativ 2 cm) → se
extrage ADN-ul genomic → se testează într-o
reacţie Southern blot → sunt identificaţi puii care
conţin insertul ADN injectat.
- Aceştia sunt utilizaţi în continuare pentru
împerechere şi/sau pentru experimente ulterioare.

7. Şoareci knock out (KO)


Înlocuirea unei anumite gene cu o variantă ce a
suferit o mutaţie sau cu o formă alterată a genei
respective conduce la anularea funcţiei acesteia (knock
out). Această abordare a condus la obţinerea de animale
transgenice knock-out (KO), care au putut oferi, astfel,
informaţii despre efectul genei respective asupra, de
exemplu, sistemului imun.
Procedura de obţinere a acestor animale implică
introducerea genei modificate în celulele embrionare,
apoi selectarea acelor celule la nivelul cărora genele
normale au fost înlocuite cu genele mutate. Ulterior,
aceste celule sunt introduse într-un blastocist care va fi
implantat unei femele pseudogravide. Puii chimerici
heterozigoţi vor fi apoi împerecheaţi pentru a putea
obţine animale homozigote, care nu vor prezenta pe nici
unul dintre cromosomi o variantă funcţională a genei
respective.

145
8. Şoareci knock-in
Sunt animale obţinute printr-o tehnologie ce
permite înlocuirea unei întregi gene normale cu o formă
mutată a acesteia, cu o altă genă sau cu o secvenţă genică
de interes. Un exemplu adesea citat este cel în care unor
şoareci li s-a înlocuit gena care codează molecula co-
receptor CD4 cu gena care codează o enzimă, β-
galactozidaza. Deoarece gena înlocuitoare, care codează
pentru β-galactozidază, se află sub controlul
promotorului genei CD4, enzima va fi produsă în acele
celule care ar fi exprimat în mod normal co-receptorul
CD4. Identificarea acestor celule se bazează pe abilitatea
enzimei de a acţiona asupra unui substrat, căruia îi
schimbă culoarea în albastru. În această manieră, în
prezenţa substratului, poate fi realizată diferenţierea
timocitelor în celule CD4-pozitive versus celule CD8-
pozitive.

O diferenţă importantă între imunitatea celulară şi


cea umorală, mediată de anticorpi, este aceea că prima
este destinată, în general, apărării împotriva unor
patogeni intracelulari, în timp ce cea de-a doua este
direcţionată, mai degrabă, împotriva patogenilor
extracelulari. Distincţia între aceste două braţe
complementare ale imunităţii a putut fi demonstrată prin
experimente de transfer adoptiv de celule limfoide între
animale inbred, fenomen care conduce la imunizare
adaptativă de lungă durată, consecutiv contactului cu
antigenul, sau prin administrarea pasivă a serului,
imunizare pasivă, care este eficientă atâta vreme cât
persistă anticorpii. În astfel de experimente, răspunsul
imun al gazdei singenice faţă de diverse antigene este

146
unul nedorit, întrucât poate interfera cu cel dezvoltat de
celulele transferate. De aceea, este esenţial ca, într-o
primă etapă, gazda să fie iradiată total (650-750
razi/şoarece) şi astfel să fie ucise 99,99% din limfocitele
animalului respectiv, după care pot fi introduse celulele
limfoide ale donatorului. Dacă şi celulele hematopoietice
ale gazdei sunt de natură să influenţeze acest tip de
experiment, atunci este necesar ca animalul să fie iradiat
cu doze crescute (900-1000 razi). Nu trebuie neglijat
faptul că, animalul iradiat va muri în scurtă vreme, dacă
nu va fi reconstituit cu ajutorul celulelor din măduva
osoasă a unui alt animal din aceeaşi linie inbred.
Experimentele de transfer adoptiv au fost utilizate
de către Mitchison şi colaboratorii pentru a analiza
evenimentele celulare ce ar fi putut explica fenomenul
numit „efectul carrier”. Obţinerea de anticorpi în cadrul
unui răspuns imun secundar faţă de un complex haptenă-
carrier impune ca haptena, pentru care limfocitele B sunt
specifice, să fie asociată cu aceeaşi moleculă carrier,
utilizată pentru inducerea răspunsului imun primar.
Fenomenul a fost denumit „efect carrier” şi a demonstrat
faptul că molecula carrier nu joacă doar un rol pasiv în
procesul de imunizare şi de inducere a răspunsurilor
imune. Pentru înţelegerea mecanismului celular
responsabil pentru acest efect, unor şoareci iradiaţi le-au
fost administrate splenocite de la şoareci singenici
neimunizaţi (control) sau imunizaţi, în prealabil, fie cu
complexul haptenă/carrier-1, fie cu complexul
haptenă/carrier-2. Consecutiv repopulării cu celule
limfoide, tuturor şoarecilor primitori li s-a administrat
complexul haptenă/carrier-1 şi s-a constatat că răspunsul
imun secundar apare numai în cazul animalelor populate

147
cu splenocitele ce proveneau de la şoareci imunizaţi cu
acest particular complex. Ulterior, s-a dovedit că această
situaţie poate fi depăşită dacă şoarecele iradiat primeşte
atât splenocite de la un şoarece imunizat în prealabil cu
complexul haptenă carrier-1 cât şi splenocite de la un
şoarece imunizat exclusiv cu carrier-2, ceea ce a arătat că
limfocitele acestui din urmă şoarece sunt necesare pentru
răspunsul celulelor ce secretă anticorpii anti-haptenă.
Această constatare a stat la baza experimentelor ce au
condus la înţelegerea faptului că există o adevărată
diviziune a muncii între limfocitele B şi T, dar şi o
cooperare evidentă între ele. Uciderea selectivă a
limfocitelor T a demonstrat că limfocitele B sunt cele
care produc anticorpii responsabili pentru legarea
haptenelor, în timp ce limfocitele T răspund faţă de
moleculele carrier. Experimentele de transfer adoptiv au
putut demonstra că nici limfocitele B pure şi nici
limfocitele T pure nu sunt capabile să determine secreţia
de anticorpi anti-haptenă în gazdele iradiate şi este
nevoie de ajutorul limfocitelor T helper pentru ca
limfocitele B să se poată activa. Doar în cazul în care
ambele populaţii celulare sunt transferate în gazda
iradiată se va putea produce un răspuns imun umoral.

148
Tehnici de biologie moleculară (manipulare acizi
nucleici şi producţie de proteine)

Metode de manipulare a genelor

1. Extragerea ADN din ţesuturi şi culturi de celule


Punctul de plecare al tuturor tehnicilor de biologie
moleculară (Southern blot, PCR, etc.) este extragerea
ADN din ţesuturi sau culturi de celule. Întrucât unele
dintre aplicaţiile ulterioare, ca de exemplu construcţia
bibliotecilor genomice (“genomic libraries”), necesită o
calitate foarte bună a ADN-ului, metodele de izolare
utilizate în prezent sunt foarte stringente, în scopul
înlăturării ARN-ului, a proteinelor, a lipidelor sau ale
altor constituienţi celulari care ar putea interfera cu
activitatea enzimelor de restricţie, a ligazelor sau a
polimerazei. De asemenea, sunt esenţiale, pe de o parte,
eliminarea oricăror nucleaze care pot degrada ADN-ul cu
greutate moleculară mare şi, pe de altă parte, evitarea
stressului mecanic ce poate duce la fragmentarea ADN-
ului genomic în cursul purificării.
Cele mai utilizate metode folosesc pentru liza
celulelor şi îndepărtarea parţială a proteinelor o soluţie
(“buffer”) ce conţine unul sau mai mulţi detergenţi
(dodecil sulfat de sodiu - SDS, NP-40 sau TritonX-100).
DN-azele sunt dependente de Mg2+ şi Ca2+ şi, de aceea,
adăugarea de EDTA (cel puţin 2mM) în soluţia de

149
extracţie, pentru chelarea acestor cationi, previne
degradarea ADN-ului cu greutate moleculară mare de
către aceste nucleaze. Pentru o deproteinizare practic
completă, se adaugă în această soluţie de liză proteinază
K, care este activă în prezenţa detergenţilor şi la
temperaturi crescute (55-65°C). În aceste condiţii,
majoritatea proteinelor, denaturate sau nu, inclusiv
nucleazele, sunt fragmentate de către proteinaza K, ceea
ce duce la distrugerea integrităţii celulare şi la eliberarea
ADN-ului nuclear. Proteinele reziduale şi lipidele sunt
înlăturate ulterior prin extracţie cu fenol-cloroform
(fenolul este pre-echilibrat cu o soluţie având pH >8.0),
ele ramânând în “faza organică”, în timp ce ADN-ul va fi
solubil în “faza apoasă”. Odată ce proteinele şi lipidele
au fost înlăturate, ARN-ul contaminant poate fi degradat
prin tratarea soluţiei cu RN-ază, etapă urmată de o
extracţie cu cloroform pentru înlăturarea RN-azei. În
final, ADN-ul celular total poate fi precipitat din “faza
apoasă” prin adăugarea de etanol sau isopropanol.
Această metodă generează cantităţi rezonabile de
ADN genomic de calitate, care are, în general, o lungime
de 150 kb, puritate şi integritate bune, caracteristici
acceptabile pentru majoritatea aplicaţiilor ulterioare. Un
dezavantaj al metodei este durata relativ lungă, necesară
izolării ADN. Există şi alte metode, “rapide”, de
purificare a ADN-ului genomic (care utilizează, de
exemplu, clorura de guanidină); acestea, deşi simple, au
şi ele dezavantaje, cum ar fi resuspensia dificilă a ADN-
ului sau inhibiţia polimerazei Taq de către heparină.
O metodă simplă, rapidă şi care furnizează ADN
cu o puritate crescută, se bazează pe adsorbţia ADN-ului
la nivelul unor matrici (membrane) de silica gel în timpul

150
unei scurte centrifugări. Condiţiile de pH şi concentraţia
în săruri fac ca proteinele şi alţi contaminanţi care ar
putea inhiba reacţia de amplificare (PCR) să nu fie
reţinuţi la nivelul membranei.

2. Extragerea ARN-ului din ţesuturi sau culturi de


celule
Izolarea ARN-ului total celular reprezintă, de
multe ori, punctul de plecare pentru identificarea unei noi
gene sau proteine. În general, ideea de bază a unei
proceduri de izolare este solubilizarea componentelor
celulare şi inactivarea concomitentă a RN-azelor, cu
menţinerea ARN-ului biologic activ. Scopul final este
obţinerea ARN-ului celular pur, intact, care să poată fi
utilizat ca substrat pentru aplicaţiile ulterioare: translaţie
in vitro, transcripţie inversă sau Northern blot.
Izolarea ARN-ului din ţesuturi are ca element
esenţial necesitatea ca celulele să fie lizate complet şi
rapid, astfel ca activitatea RN-azelor celulare să poată fi
neutralizată instantaneu. În acest scop, dar şi pentru
obţinerea unei cantităţi mai mari de ARN, în mod ideal,
ţesuturile sunt îngheţate în azot lichid şi apoi pulverizate
(prin măcinare în mojar cu azot lichid) înainte de liza
celulară, astfel ca solubilizarea completă să fie foarte
rapidă. Soluţia de liză trebuie să conţină, pe lângă
detergenţii responsabili de solubilizare (SDS, N-lauril
sarcosil, NP-40, deoxicolat de sodiu), şi agentul
chaotropic necesar neutralizării RN-azei (isotiocianat de
guanidină, trifluoroacetat sau uree). Majoritatea
metodelor curente utilizează extracţia rapidă cu un
solvent organic (fenol sau amestec fenol-cloroform) sau o
centrifugare în gradient de CsCl, urmată de extracţie cu

151
solvenţi. Prima variantă exploatează tendinţa majorităţii
proteinelor şi a fragmentelor mici de ARN de a rămâne în
faza organică la pH-uri mici. Fragmentele ARN mai mari
şi unele proteine rămân la interfaţa dintre fazele organică
şi apoasă. O a doua extracţie cu cloroform îndepărtează
urmele de fenol şi îmbunătăţeşte puritatea ARN-ului. În
final, ARN-ul din faza apoasă poate fi precipitat cu LiCl
sau etanol 95%.
Metoda descrisă mai sus este o procedură simplă,
rapidă, care permite îndepărtarea ADN-ului, a proteinelor
şi a lipidelor într-o singură extracţie, menţinând
integritatea ARN-ului pe toată durata izolării.
Isotiocianatul de guanidină este unul dintre cei mai
potenţi inhibitori ai RN-azei, iar utilizarea apei tratate cu
dietilpirocarbonat (DEPC) în toate soluţiile garantează
obţinerea unui ARN nedegradat, astfel încât,
electroforeza în gel şi vizualizarea cu bromură de etidiu
evidenţiază două benzi clare şi distincte corespunzătoare
ARN-ului ribozomal 28S şi 18S. ARN-ul izolat astfel
este de bună calitate şi poate fi utilizat în majoritatea
aplicaţiilor din biologia moleculară. Avantajul major al
metodei este aplicabilitatea ei pentru izolarea ARN din
practic orice tip de ţesut sau cultură de celule.

3. Electroforeza ADN în gel


Un element fundamental în tehnicile actuale de
biologie moleculară îl constituie capacitatea de a separa
şi de a vizualiza lanţuri de ADN cu lungimi cuprinse
între 5 şi 5000000 de nucleotide. Posibilitatea de a separa
acest spectru larg de molecule derivă din utilizarea a trei
tehnici similare de electroforeză în gel: electroforeza în
gel de poliacrilamidă (PAGE), electroforeza în gel de

152
agaroză şi electroforeza în câmp electric pulsatil - cu
schimbarea orientării câmpului electric (“pulse-field gel
electrophoresis”). În fiecare caz, moleculele de ADN sunt
mobilizate într-un gel, prin aplicarea unui câmp electric.
Gelul se comportă ca o reţea (sită) cu pori prin care
trebuie să treacă moleculele de ADN. În cazul gelurilor
de agaroză şi de poliacrilamidă, aplicarea unui curent
electric la capetele gelului produce un câmp electric a
cărui intensitate este determinată atât de lungimea
gelului, cât şi de diferenţa de potenţial. Datorită prezenţei
în moleculele de ADN a grupurilor fosfat, încărcate
negativ, acestea vor migra către anod la aplicarea
câmpului electric. Deoarece raportul între încărcarea
electrică şi masă este constant în cazul moleculelor de
ADN, rata migrării acestora, în absenţa gelului, ar fi
constantă. În gel însă, frecarea determină rata migrării,
astfel că moleculele mai mari se vor deplasa mai încet,
deoarece trec mai greu prin pori decât moleculele mici.
3.1 Electroforeza în gel de agaroză
Agaroza este un polimer liniar extras din alge
marine. Pulberea de agaroză este solubilizată, prin
fierbere, iar soluţia, lăsată să se răcească, formează un gel
prin legături de hidrogen. Mărimea porilor din gelul
solidificat depinde de concentraţia agarozei şi, ca urmare,
şi rezoluţia gelului este dependentă de această
concentraţie: cu cât concentraţia este mai mare, mărimea
moleculelor care pot fi separate este mai mică (de
exemplu, un gel de 3% agaroză poate separa molecule de
100-1000 nucleotide, în timp ce un gel de 0,3% agaroză
poate separa molecule de 5000-40000 nucleotide).
Gelurile standard au concentraţii de 0,8-1% agaroză,
putând separa molecule de 0,5-7 kb.

153
Aparatul de electroforeză poate avea aspecte
variate, cel mai folosit tip fiind electroforeza
“submarină”. Gelul de agaroză este realizat pe o placă-
suport, iar pentru formarea locaşurilor în care se va
“încărca” ADN-ul se utilizează un “pieptene”. După
solidificarea gelului, “pieptenele” se îndepărtează, iar
placa cu gelul se aşează într-o cuvă ce conţine o soluţie
ionică (buffer-ul de electroforeză), astfel ca gelul să fie
acoperit de soluţie. Cuva de electroforeză este conectată
la o sursă de curent electric (de cel puţin 100 V şi
intensităţi până la 100 mA). Tensiunea aplicată gelului
este aleasă ţinând cont de mai mulţi factori: cu cât
tensiunea aplicată gelului este mai mare, cu atât migrarea
moleculelor va fi mai rapidă dar, la tensiuni mari,
încălzirea gelului poate duce la distorsiunea benzilor. În
plus, trebuie ţinut cont de lungimea gelului: cu cât gelul
este mai lung, cu atât separarea benzilor este mai bună,
dar benzile îşi pierd din claritate.
Eşantioanele de ADN care trebuie analizate prin
electroforeză în gel de agaroză sunt amestecate cu o
soluţie specială (“loading buffer” – tampon de încărcare)
şi sunt introduse cu ajutorul unei micropipete în
locaşurile preformate. Soluţia cu care este amestecat
ADN-ul conţine coloranţi (xilen-cianol şi bromofenol
albastru) care permit vizualizarea directă a migrării
ADN-ului în gel (într-un gel standard de 0,8% agaroză,
xilen-cianolul migrează împreună cu moleculele de ADN
cu dimensiuni de aproximativ 500 de nucleotide, în timp
ce bromofenolul albastru migrează împreună cu
moleculele de ADN cu dimensiuni de aproximativ 4000-
5000 de nucleotide). Alături de eşantioanele de ADN se
utilizează “standarde ADN” alcătuite dintr-un număr de

154
benzi de mărimi cunoscute. Migrarea acestora
concomitent cu eşantioanele oferă posibilitatea de a
calcula destul de precis greutatea moleculară a
moleculelor din eşantion (figura 1).

Fig. 1 Migrarea amestecului de fragmente de ADN cu lungimi


cunoscute oferă imaginea unei scări (DNA ladder) (Promega).

Pentru vizualizarea moleculelor de ADN se


utilizează bromura de etidiu, ideal inclusă atât în gel, cât
şi în soluţia de electroforeză. Acest colorant se
intercalează între bazele ADN-ului dublu catenar şi are o
fluorescenţă roşu-oranj când este iluminat cu lumină
ultravioletă (260-360 nm). Colorantul neintercalat nu este
fluorescent şi, ca urmare, numai benzile de ADN din
gelul de agaroză vor fi vizualizate în lumina ultravioletă
(figura 2).

155
Fig. 2 Evidenţierea ADN-ului în gel de agaroză. Benzile
strălucitoare corespund unor produse de amplificare obţinute
într-o reacţie PCR.

Electroforeza în gel de agaroză este folosită în


scop analitic, pentru a determina cantitatea de ADN,
pentru a aprecia rezultatul unei digestii enzimatice sau al
unei reacţii PCR sau, în scop preparativ, pentru a purifica
un fragment de ADN dintr-un complex de produse ale
digestiei enzimatice sau ale PCR.
3.2 Electroforeza în gel de poliacrilamidă
Acrilamida este un monomer sintetic care poate fi
polimerizat în lanţuri lungi cu ajutorul radicalilor liberi
generaţi de persulfatul de amoniu şi stabilizat de
tetrametiletilen-diamină (TEMED). Prin legări
încrucişate, lanţurile polimerice formează un gel poros în
prezenţa metilen-bisacrilamidei. Separarea electroforetică
a ADN-ului în gel de poliacrilamidă este similară celei în
gel de agaroză, migrarea făcându-se spre anod, iar
discriminarea, pe baza mărimii porilor. Gelurile de
poliacrilamidă pot separa molecule cu dimensiuni
cuprinse între 1000-2000 de nucleotide (3,5% acrilamidă)
şi 6-100 nucleotide (20% acrilamidă). Spre deosebire de
electroforeza în gel de agaroză, această metodă poate fi
utilizată atât pentru ADN-ul bicatenar, cât şi pentru cel
monocatenar, în condiţii denaturante sau nedenaturante.
Moleculele de ADN monocatenar care migrează într-un

156
gel nedenaturant de poliacrilamidă prezintă o mobilitate
specifică, determinată de secvenţa lor nucleotidică
(împerecherea bazelor în interiorul moleculelor duce la
formarea unei structuri secundare), fenomen utilizat
extensiv în analiza mutaţiilor punctiforme.
3.3 Electroforeza în câmp electric pulsatil
Electroforeza în gel de agaroză nu poate separa
molecule de ADN mai mari de 750 kb, gelurile standard
separând molecule cu dimensiuni de până la aproximativ
25 kb. Această limită este dictată de mărimea porilor
gelului. Moleculele de ADN ce depăşesc o anumită
mărime nu mai pot fi filtrate prin gel şi trec prin acesta cu
o viteză constantă, nemaiputând fi separate pe baza
mărimii. În 1984, Schwartz şi Cantor au demonstrat că
este posibilă separarea unor molecule de până la 2 Mb
prin schimbarea (alternarea) direcţiei câmpului electric.
Acest fenomen determină moleculele de ADN să îşi
schimbe orientarea înainte de a putea migra în noua
direcţie impusă de noul câmp electric. Cu cât molecula
este mai mare, cu atât timpul necesar reorientării este mai
mare. Această metodă este frecvent utilizată drept punct
de plecare pentru cartografierea genică şi clonarea în
YACs (“yeast artificial chromosomes”).

4. Southern blot
Denumită astfel după numele inventatorului ei,
Edwin Southern, reprezintă o metodă eficientă, bazată pe
hibridizare, destinată identificării şi caracterizării unor
secvenţe specifice de ADN, dintr-un amestec de
fragmente de acid nucleic. Prezentăm, pe scurt,
principalele etape ale tehnicii.

157
Fig. 3 Variante de aparate de transfer capilar a ADN-ului:
configuraţia Southern originală şi configuraţie modificată.

ADN-ul ce conţine secvenţa de interes este


digerat cu una sau mai multe enzime de restricţie,

158
fragmentele obţinute după digestie sunt separate în
funcţie de mărime prin electroforeză în gel, de obicei, de
agaroză, după care sunt transferate, prin capilaritate, pe o
membrană (de nitroceluloză sau de nylon) depusă pe gel
(figura 3).
În această manieră, membrana conservă
configuraţia spaţială a fragmentelor de ADN, precum şi
poziţia lor exactă după migrarea în gel sub influenţa
câmpului electric aplicat. Prin încălzirea membranei la
80oC, o perioadă de timp cuprinsă între 30 de minute şi 2
ore, sau prin iradiere cu UV, fragmentele de ADN sunt
legate ferm de membrană.
În general, nitroceluloza nu leagă în mod
semnificativ ADN-ul nativ, în timp ce membranele de
nylon au capacitatea de a reţine la fel de bine atât acizii
nucleici denaturaţi, cât şi pe cei nativi. Din aceste motive,
atunci când se utilizează membrane de nitroceluloză,
moleculele migrate în gel sunt denaturate în molecule
monocatenare. Fragmentele denaturate de ARN sau ADN
destinate transferului trebuie reduse la dimensiuni mai
mici de 10 kb (ADN-ul nativ la dimensiuni mai mici de
4-5 kb) şi acest lucru se realizează prin depurinare cu
acizi. Tratamentul gelurilor de agaroză cu 0,25 N HCl la
temperatura camerei timp de 10-20 de minute
depurinează ADN-ul în medie o dată la fiecare 500 de
baze şi facilitează următoarea etapă de hidroliză în alcali.
O depurinare prelungită conduce însă la formarea de
oligonucleotide. Hidroliza nu trebuie, nici ea, prelungită
pentru a nu se ajunge la fragmente prea scurte (<300 bp)
care nu se mai pot lega eficient de membrană.
Necesitatea fragmentării ADN-ului este redusă
semnificativ în procedurile de transfer electroforetic.

159
Tratamentul gelurilor înaintea transferului este
adesea necesar pentru reducerea dimensiunii sau alterarea
conformaţiei macromoleculelor din gel (de ex. pentru
facilitarea eluţiei, îmbunătăţirea legării), sau pentru a
preveni modificările dimensionale ale gelului în timpul
transferului.
În urma transferului, molecula ţintă
monocatenară, fixată pe membrană, devine disponibilă
pentru hibridizarea cu o probă de ADN monocatenar
marcată radioactiv sau fluorescent. În cazul folosirii
metodei radioactive, perioada de reacţie este influenţată
de alegerea şi cantitatea de oligonucleotid radiomarcat.
De exemplu, cu cât este mai mare radioactivitatea
specifică a oligonucleotidelor marcate şi cu cât este mai
redusă cantitatea de ADN ce urmează a fi marcată, cu
atât va fi mai scurtă perioada de incubare necesară pentru
ca încorporarea să atingă un maximum.
Interacţiunile specifice dintre secvenţa ţintă şi
proba de oligonucleotid marcată radioactiv determină
formarea de molecule hibride, care, după înlăturarea
hibridizării nespecifice prin spălare cu detergenţi, sunt
detectate prin autoradiografie. În cazul utilizării
oligonucleotidelor marcate cu substanţe fluorescente,
detecţia moleculelor hibrid se realizează prin detectarea
fluorescenţei probei. De la introducerea sa în 1975,
analiza ADN-ului prin Southern blot a devenit o tehnică
de rutină pentru analizarea organizării genelor,
identificarea şi clonarea unor secvenţe specifice, studiul
mutaţiilor, caracterizarea genotipurilor, diagnosticarea
bolilor genetice şi a cancerului, detecţia unor
microorganisme sau identificarea genetică (“genetic
fingerprinting”) în medicina legală.

160
5. Northern blot reprezintă o variantă a tehnicii
Southern blot, care, însă se adresează moleculelor de
mARN. Detecţia unei molecule specifice de mARN prin
această metodă presupune mai întâi denaturarea ARN,
pentru a asigura liniaritatea moleculelor. Amestecul
molecular este apoi supus unei separări prin electroforeză
şi transferat pe o membrană de nitroceluloză. Detecţia
unei anumite molecule de mARN se realizează prin
incubarea membranei cu o probă de ADN sau ARN
complementară secvenţei de interes şi marcată, de obicei,
radioactiv. Formarea moleculei hibrid este identificată
prin autoradiografie.

Metode de evidenţiere a secvenţelor nucleotidice în


celule şi ţesuturi

1. Hibridizarea in situ
Hibridizarea in situ reprezintă, împreună cu
imunohistochimia, un instrument puternic de detectare şi
evaluare a nivelelor de expresie şi distribuţie a
secvenţelor de acizi nucleici la nivelul cromosomilor
conservaţi din punct de vedere morfologic, al celulelor şi
al ţesuturilor. Această tehnică poate fi utilizată pentru a
stabili, la nivel microscopic, care regiuni din secţiunile
tisulare exprimă o anumită particulară genă şi care este
natura celulelor din cadrul organului investigat care
exprimă o genă specifică. Principiul tehnicii se bazează
pe complementaritatea dintre o probă de ADN sau ARN
complementar (cARN), marcată radioactiv sau non-
radioactiv şi secvenţa de interes de la nivel celular sau
tisular. Hibridizarea uzuală necesită izolarea ADN-ului

161
sau ARN-ului, separarea pe un gel, apoi transferul (blot)
pe o membrană şi identificarea cu o probă adecvată. În
cazul hibridizării in situ, principiul este similar, dar
probele sunt utilizate pentru detecţia secvenţelor
nucleotidice la nivelul ţesuturilor, iar sensibilitatea
metodei este de aşa natură încât poate evidenţia până la
10 copii de mARN/celulă.
Utilizarea probelor non-radioactive prezintă o
serie de avantaje faţă de cele radioactive: rezoluţie
suficient de înaltă, manipularea mai uşoară, reziduuri mai
puţin nocive, timpul mai scurt de lucru pentru întregul
experiment. În anumite cazuri, când concentraţia
antigenului vizat este mare, astfel de probe se pot dovedi
chiar mai sensibile.
Hibridizarea in situ implică o serie de etape,
fiecare dintre acestea fiind la fel de critice pentru
rezultatul final al detecţiei mARN-ului:
1. Pregătirea probei de cARN presupune obţinerea sa prin
transcripţie in vitro folosind o matriţă de cADN, urmată
de marcarea cu o substanţă radioactivă sau fluorescentă;
2. Pregătirea ţesutului sau a celulelor implică etape de
fixare, permeabilizare, etc;
3. Hibridizarea presupune incubarea secţiunilor sau a
citospinurilor cu proba de cARN marcată; după
hibridizare, secţiunile sunt supuse unei digestii cu RNaze
pentru înlăturarea probelor de cARN nehibridizate care
apoi sunt spălate în condiţii de stringenţă crescută.
4. Detecţia probei reprezintă etapa în care secţiunile sunt
analizate prin expunere faţă de un film radiologic pentru
detectarea pattern-ului de hibridizare. Pentru o analiză
deosebită, care să permită şi evidenţierea detaliilor
structurale, secţiunile sunt acoperite cu emulsie

162
autoradiografică şi analizate la un microscop cu optica
adaptată câmpului întunecat.
Pentru hibridizarea in situ pot fi folosite diferite
tipuri de probe (sonde de detecţie):
- ADN dublu catenar (double-stranded ADN,
dsADN) - poate fi reprezentat de clone de ADN genomic
sau ADN complementar (cADN);
- ARN monocatenar (single-stranded ARN,
ssARN), obţinut prin sinteză enzimatică;
- Oligonucleotide (ARN sau ADN) obţinute prin
sinteză chimică.
Aceste probe pot fi folosite pentru detecţie şi
localizare, dar şi pentru determinarea cantităţii de pre-
ARN mesager nuclear sau ARN mesager citoplasmatic în
celule singulare sau pe secţiuni tisulare. Fiecare dintre
aceste tipuri de probe prezintă avantaje şi dezavantaje.
Probele de ADN dublu catenar generate prin
translaţie “nick” (scindare) din ADN genomic sau clone
de ADN complementar sunt în mod uzual utilizate pentru
localizarea ARN, în principal pentru că sunt uşor de
obţinut. Prezintă avantajul de a fi complementare pentru
regiuni întinse ale ţintei ARN şi ca urmare, probabilitatea
ca o parte a secvenţei ţintă să fie accesibilă probei este
foarte mare. Pe de altă parte, prezintă dezavantajul unei
potenţiale activităţi specifice mai scăzute comparativ cu
cea a unui oligonucleotid marcat. De asemenea, pot
prezenta capacitate scăzută de penetrare în unele ţesuturi
şi celule fixate cu anumiţi reactivi, ca urmare a
dimensiunilor mari.
Probele de ARN monocatenar antisens sunt
utilizate în mod extensiv pe secţiuni tisulare. Avantajul
acestor sonde este acela că formează hibrizi foarte

163
puternici cu ţinta ARN, comparativ cu probele ADN. În
plus, în paralel, sunt generate probe sens care servesc
drept controale. În unele cazuri, probele ssARN anti-sens
sunt caracterizate printr-un grad înalt de marcare a
nucleolilor, ca urmare a conţinutului înalt de ARN la
nivelul acestei regiuni nucleare (figura 4).

Fig. 4 Granulaţii strălucitoare la nivelul celulelor epiteliale


intestinale (ce conturează vilii), obţinute prin hibridizarea cu o
riboprobă radiomarcatӑ (ARN monocatenar antisens) pentru
receptorul Fc neonatal.

Oligonucleotidele prezintă în comparaţie cu


ADN-ul complementar avantajul că pot fi concepute
astfel încât să poată distinge între secvenţe specifice, cum
ar fi de exemplu 2 secvenţe de ARN mesager cu înaltă
homologie (isoforme ARN). Dimensiunile lor scăzute le
oferă în plus avantajul unei capacităţi crescute de
penetrare în nucleu şi la nivelul secţiunilor tisulare. Pot fi
produse cu uşurinţă prin sinteză automată, iar faptul că
sunt secvenţe monocatenare exclude posibilitatea
renaturării. Din punct de vedere al dezavantajelor, trebuie
menţionată dimensiunea limitată a ţintei pe care o
detectează. Ca urmare, astfel de probe conduc la

164
identificarea unui număr mai scăzut de molecule per ţintă
şi deci e generat un semnal mai slab comparativ cu
probele de ADN complementar sau genomic.
În multe cazuri însă, abundenţa ţintei se dovedeşte
suficientă, chiar luând în considerare stoichiometria
scăzută a grupărilor de detectat folosind oligonucleotide
marcate (snARN sau histone). Dacă dimensiunea ţintei
multiplicată cu abundenţa ei echivalează cu circa 200 kb,
atunci detecţia devine posibilă. Semnalul obţinut poate fi
amplificat prin utilizarea simultană a mai multor
oligonucleotide obţinute din secvenţe diferite dar cis-
related. Oligonucleotidele pot fi de asemenea utilizate
pentru detectarea a două sau mai multe secvenţe simultan
în cadrul aceleiaşi celule, prin marcarea lor cu diferiţi
fluorocromi.
Dimensiunea probei reprezintă un factor critic
pentru eficienţa hibridizării, sau cu alte cuvinte a
raportului dintre semnal şi zgomot (background). Proba
trebuie să fie suficient de redusă pentru a putea penetra
ţesutul sau celula vizată. De asemenea, dimensiunile
probei trebuie alese de aşa natură încât legarea ei să nu se
producă la întâmplare şi să genereze semnal nespecific.
Această din urmă consideraţie prezintă o importanţă în
plus pentru cazurile în care se urmăreşte detectarea unor
secvenţe al căror număr de copii este foarte redus. Pentru
probele “nick” translate, media de dimensiune a probei
trebuie să fie de circa 200 de nucleotide, dar să nu
depăşească 600 de nucleotide. Intensitatea background-
ului creşte semnificativ dacă această dimensiune este
depăşită. Pentru detecţia oligonucleotidelor sunt folosiţi
de rutină 15-20-meri.

165
Marcarea probelor.

Probele pot fi marcate cu o varietate de grupări de


detecţie:
 Biotină (vitamina H)
 Digoxigenină
 Fluorocromi
 Enzime
Biotina şi digoxigenina sunt folosite de rutină pentru
marcarea probelor destinate detectării ARN-ului. Biotina
este detectată cu mare afinitate de avidină, o
glicoproteină extrasă din albuşul de ou, care prezintă o
constantă de legare de 10-15/M la temperatura de 25°C.
Digoxigenina este un steroid izolat din plantele de
digitală. Florile şi frunzele acestei plante sunt singurele
surse de digoxigenină cunoscute până la ora actuală. Ca
urmare a acestui fapt, anticorpii anti-digoxigenină nu
reacţionează încrucişat în majoritatea sistemelor celulare
şi tisulare. Atât biotina, cât şi digoxigenina pot fi
detectate cu ajutorul fluorocromilor sau a enzimelor, cum
ar fi fosfataza alcalină sau HRP (horseradish peroxidase)
conjugate cu avidină, respectiv cu anticorpi anti-
digoxigenină. Fosfataza alcalină are avantajul de a
continua reacţia de precipitare cu substratul respectiv în
timp, iar reacţia poate fi stopată atunci când raportul
semnal/zgomot este optim. Detecţia cu fluorocromi este
mai puţin sensibilă decât cea enzimatică, dar are
avantajul unei detecţii într-o singură etapă şi prezintă o
rezoluţie superioară. De asemenea, utilizarea
fluorocromilor permite detecţia simultană a mai multor
probe marcate cu substanţe a căror fluorescenţă este
distinctă din punct de vedere al spectrului de emisie. În

166
plus, ca urmare a faptului că nu este utilizat un al doilea
reactiv, astfel de probe vor conduce la un background
mult mai scăzut decât probele a căror detecţie este
indirectă.
În situaţiile în care secvenţa ţintă este abundentă,
sensibilitatea hibridizării non-radioactive este net
superioară în termeni microscopici, având în vedere că
suprafaţa pe care se produce scăderea radioactivităţii este
întinsă. De exemplu, particulele  de tritiu nu sunt
detectate până nu ajung în contact cu emulsia, oarecum la
distanţă de situsul de hibridizare. Acest fenomen măreşte
aria de detecţie şi, ca urmare, diminuează concentraţia
semnalului. În plus, sensibilitatea detecţiei fluorocromilor
poate fi crescută prin utilizarea unor dispozitive sensibile
la emisia de fotoni (camere CCD cu răcire), în care
fotonii capturaţi pe un cip generează un semnal electric,
iar acesta este cuplat cu un dispozitiv de detecţie vizual.
Semnalul poate fi integrat pe parcursul unei perioade de
timp şi prelucrat digital astfel încât prin scăderea
zgomotului să se ajungă la o amplificare a semnalului
propriu-zis.

Controale
Pentru validarea oricărui experiment sunt necesare
controale corespunzătoare. În cazul hibridizării in situ,
următoarele controale pot fi luate în considerare;
 “Mock” hibridizare – proba nu este marcată;
 Hibridizare în care se foloseşte o probă nespecifică
sau irelevantă, de ex. vector ADN, oligonucleotid sens;
 Pretratarea unuia dintre preparate cu RN-aza A
înaintea hibridizării;

167
 Hibridizare cu un exces de probă nemarcată, urmată
de tratare cu proba marcată şi reactiv de detecţie;
 Hibridizare cu o probă cunoscută şi testată (control
pozitiv pentru protocolul experimental);
 Pretratarea celulelor cu  amanitină timp de 5 ore (50
g/ml) înaintea fixării preparatului în scopul blocării
ARN-polimerazei şi deci a transcripţiei. În acest caz, nici
un semnal nu ar trebui detectat, cu excepţia cazului în
care ţinta ARN este stabilă.

2. FISH – Fluorescence in situ hybridization


Numele tehnicii defineşte cu destulă claritate
principiul pe care se bazează. Ea este destinată
identificării şi localizării prezenţei sau absenţei unor
cromosomi sau a unor anumite secvenţe ADN. Tehnica
se bazează pe capacitatea sondelor de detecţie (secvenţe
ADN cunoscute), marcate cu substanţe fluorescente, de a
se lega specific numai de secvenţele ADN
complementare, prezente la nivelul probelor biologice
investigate. Legarea specifică este apoi vizualizată cu
ajutorul unui microscop cu fluorescenţă. Metoda se
adresează probelor biologice reprezentate de secţiuni la
gheaţă sau celulelor depuse pe lame de microscop prin
centrifugare (citospin), de unde şi numele metodei, in situ
(detecţia nu presupune extracţia ADN şi analiza sa
ulterioară).
Probele utilizate pentru hibridizare (sondele de
detecţie) sunt derivate din fragmente de ADN care au fost
izolate şi utilizate în Proiectul Genomului Uman,
amplificate în sisteme bacteriene.
Metoda se poate adapta şi pentru detecţia şi
localizarea mARN la nivelul probelor biologice.

168
FISH este utilizată frecvent în diagnosticul unor
afecţiuni congenitale precum sindromul Down,
sindromul velocardiofacial, sindromul Prader-Willi,
sindromul Angelman, dar şi al unor afecţiuni
hematologice precum leucemiile limfoblastice acute sau
mieloide cronice (figura 5). Un domeniu distinct în care
FISH îşi regăseşte utilitatea este cel al microbiologiei, în
special în situaţiile în care bacteriile vizate nu pot fi
cultivate corespunzător în condiţii de laborator.

Fig. 5 FISH. Sonda de interes (roşu) şi sonda control (verde)


arată un aspect normal pentru CRS 21.

3. CISH – Chromogenic in situ hybridization


CISH a apărut ca o variantă a FISH, principiul
metodei fiind similar, cu excepţia faptului că sondele de
ADN sunt cuplate cu o enzimă, iar semnalul este detectat
sub forma unui precipitat colorat apărut ca urmare a
degradării unui substrat, adăugat într-o etapă ulterioară,
de către enzima respectivă. Studiile iniţiale au relevat o

169
concordanţă mai mult decât satisfăcătoare între semnalul
obţinut prin FISH şi, respectiv, prin CISH, astfel că
această variantă tehnică îşi găseşte astăzi aplicabilitatea,
în special în cazul probelor biologice reprezentate de
secţiuni la parafină, pentru care FISH nu este eficientă.
Un alt avantaj al acestei variante este dat de posibilitatea
ca după marcarea specifică, secţiunea să poată fi
contracolorată, astfel încât, vizualizarea la microscopul
optic să aducă informaţii nu numai asupra semnalelor
specifice, dar şi asupra arhitecturii ţesutului respectiv şi
asupra morfologiei celulelor pozitive.
Metoda detectează amplificări genice, translocaţii
ale cromosomilor, numărul de CRS. O aplicaţie des
utilizată este cea pentru detectarea amplificării genei Erb-
B2 (HER-2/neu) în cancerul mamar, necesară pentru
diagnosticul cancerului mamar şi, mai ales, pentru
aprecierea prognosticului.

Manipularea enzimatică a ADN-ului

1. Digestia cu enzime de restricţie


Dificultăţile legate de izolarea şi purificarea unei
gene unice din cromosomi de dimensiuni mari au fost
depăşite odată cu descoperirea enzimelor de restricţie.
Acestea sunt enzime bacteriene care taie ADN-ul dublu
catenar în puncte specifice, definite de secvenţa
nucleotidică locală. Funcţia biologică a acestor enzime
este de a împiedica intrarea ADN-ului străin (de
exemplu, fagi) în genomul bacterian, prin tăierea acestuia
la nivelul unor secvenţe (situsuri de recunoaştere) care nu
există în bacteria gazdă. Diferite specii de bacterii produc
enzime de restricţie cu situsuri de recunoaştere specifice.

170
Aceste molecule acţionează asupra ADN-ul în două
moduri: prin tăiere asimetrică a situsului de recunoaştere,
cu generarea unor capete monocatenare 5’ şi 3’, numite
capete lipicioase (“sticky ends”) sau prin tăiere simetrică,
cu generarea de capete drepte. Enzimele de restricţie sunt
numite după bacteria din care au fost izolate (de
exemplu, EcoRI a fost izolată din Escherichia coli, Kpn
din Klebsiella pneumoniae).
În practică, enzima de restricţie este incubată
împreună cu ADN-ul într-o soluţie specifică (fiecare
enzimă necesită o anumită concentraţie ionică) şi taie
ADN-ul în fragmente cu mărimi definite. Deoarece
tăierea se face în funcţie de secvenţă, diferite eşantioane
de ADN vor produce o serie de fragmente (“digestion
pattern”) caracteristice. Aceste “tipare” ADN pot fi
recunoscute după separarea fragmentelor de diferite
mărimi prin electroforeză în gel. Astfel, se pot alcătui
“hărţi de restricţie” ale moleculelor de ADN. Aceasta
permite compararea aceleiaşi regiuni de ADN ale unor
indivizi diferiţi, fără a fi necesară determinarea în detaliu
a secvenţei nucleotidice. Hărţile de restricţie fac posibilă
localizarea unei anumite gene într-un anumit fragment de
restricţie, facilitând astfel izolarea sa.
O a doua aplicaţie majoră a enzimelor de restricţie
este ingineria genetică, în cadrul căreia acestea sunt
folosite pentru tăierea unor fragmente de ADN şi
transferarea lor în alte molecule, în scopul de a genera
noi secvenţe de ADN (ADN recombinant).

2. Utilizarea ligazelor în ingineria genetică


Ligazele sunt enzime care ataşează covalent două
fragmente de ADN. Cea mai utilizată ligază este ligaza

171
T4. Reacţia se desfăşoară între grupul 3’ OH al unei
catene de ADN şi grupul 5’ fosfat al celeilalte molecule.
Energia necesară desfăşurării reacţiei este furnizată de
ATP. Legarea ADN se desfăşoară eficient numai în cazul
în care capetele fragmentelor de ADN sunt compatibile.
Cea mai frecventă utilizare a ligazelor este încorporarea
unui fragment de ADN într-un vector de clonare.

3. Amplificarea prin PCR


Reacţia în lanţ a polimerazei (PCR, “polymerase
chain reaction”) este o tehnică dezvoltată de CETUS
Corporation în 1985, la care s-a mai făcut referire pe
parcursul acestei lucrări. Ea permite amplificarea
enzimatică, aproape exponenţială, a ADN-ului, pornind
de la cantităţi foarte mici de material, mimând
mecanismul de bază al replicării ADN.
Amplificarea in vitro a ADN prin PCR este un
proces ciclic, fiecare ciclu constând în trei faze bine
definite: denaturare, legarea primerilor şi extensia
acestora. Denaturarea constă în încălzirea ADN-ului
original la peste 90°C, timp de cel puţin 60s, pentru a
separa molecula bicatenară în două molecule
monocatenare. În cea de-a doua fază, temperatura este
redusă la 40-68°C pentru 60-120 secunde, pentru a
permite primerilor oligonucleotidici să se lege la
secvenţele ADN complementare de pe catenele generate
în faza de denaturare. Ultima fază a unui ciclu constă
într-o reacţie de extensie enzimatică a primerilor, în
direcţia 5’–3’, cu producerea unor copii complementare
ale ADN-ului bicatenar la care aceştia s-au legat. Această
reacţie are loc la 72°C şi durează 60-180 secunde, fiind
realizată cu ajutorul unei ADN-polimeraze, capabilă să

172
reziste la temperaturile de denaturare. Această enzimă a
fost izolată iniţial din bacteria Thermophilus Aquaticus şi
denumită Taq. Repetarea de 25-40 ori a acestor cicluri
duce la amplificarea unei secvenţe originale de ADN de
până la 1000000 de ori în 3-4 ore.
Reactivii necesari tehnicii de amplificare PCR
sunt ADN-polimeraza, primerii, cantităţi echimolare din
cele 4 tipuri de nucleotide (dNTP) şi tiparul original de
ADN (ADN genomic sau ADNc ce conţine secvenţa de
interes). Primerii sunt oligonucleotide (formate din 15-30
baze) complementare secvenţelor care flanchează
regiunea ţintă. Soluţia ionică în care se desfăşoară reacţia
trebuie să menţină un pH relativ constant, de 8.3 şi, de
asemenea, un element esenţial pentru reacţie este
prezenţa şi concentraţia ionilor de Mg2+. Aceştia sunt
necesari activităţii eficiente a polimerazei, formând un
complex solubil cu nucleotidele, eveniment necesar
pentru încorporarea acestora în cursul extensiei.
Confirmarea mărimii produsului amplificat se
realizează, de obicei, prin electroforeză în gel de agaroză,
dar este, de asemenea, posibilă confirmarea corectitudinii
produsului şi prin analiza (digestia) cu enzime de
restricţie. Este util de menţionat că orice polimerază
poate introduce erori în noua secvenţă de ADN. În cazul
Taq, frecvenţa acestora a fost estimată ca fiind 1
substituţie la aproximativ 500 de nucleotide, deci sunt
destul de frecvente. În vederea evitării efectelor nedorite
ale erorilor de copiere, au fost caracterizate noi
polimeraze, unele dintre acestea dovedind o remarcabilă
corectitudine (de exemplu, Pfu). Deoarece aceste
polimeraze nu au aceeaşi eficienţă ca Taq, de multe ori se
utilizează o combinaţie de 2 polimeraze în aceeaşi

173
reacţie. O abordare mai ingenioasă a acestei probleme
constă în crearea unor polimeraze recombinante care să
combine calităţile celor două tipuri.
Aplicaţiile tehnicii PCR sunt extrem de diverse.
PCR este frecvent utilizat pentru manipularea genică,
înlocuind clonarea ca metodă de generare a unor mari
cantităţi dintr-un anumit fragment de ADN şi dând
posibilitatea de a modifica ADN-ul prin crearea unor noi
situsuri de restricţie (pentru o mai uşoară inserţie a
fragmentului într-un anumit vector) sau prin introducerea
unor mutaţii în vederea studierii efectelor acestora asupra
funcţiei proteinei modificate.
PCR crează posibilitatea introducerii
“direcţionate” a mutaţiilor (mutageneză dirijată - “site-
directed mutagenesis”), atât în secvenţele codante, cât şi
în elementele reglatoare ale genelor. În această ultimă
situaţie, este posibilă alterarea unor situsuri specifice
pentru anumiţi factori de transcripţie, în vederea evaluării
efectului acestora asupra activităţii promotorului.
Mutageneza implică, de obicei, o singură substituţie
nucleotidică, deşi este posibilă schimbarea mai multor
baze (inclusiv deleţii sau inserţii mici) într-o singură
reacţie. Cel mai utilizat protocol (“overlap extension
mutagenesis”) constă în utilizarea unui primer care este
complementar secvenţei normale de ADN, cu excepţia
unei singure baze mutante, care se găseşte de obicei în
apropierea capătului 5’ al oligonucleotidului, pentru a nu
afecta funcţia acestuia. Prin PCR se realizează extensia
primerului mutant, ceea ce duce la încorporarea mutaţiei
în ADN-ul nou-sintetizat. Ulterior, produsul primei
reacţii de amplificare (conţinând mutaţia) este utilizat ca
primer într-o nouă reacţie de amplificare, împreună cu un

174
alt primer. După câteva cicluri, este creată o secvenţă
ADN mai lungă, care conţine mutaţia şi care poate fi
amplificată mai departe prin PCR convenţional.
PCR-ul este frecvent utilizat ca metodă de
diagnostic în medicină, deoarece permite detecţia directă
sau indirectă a mutaţiilor genice.
Mutaţiile punctiforme ale unei gene pot fi
detectate cu ajutorul PCR, dacă secvenţa genică din
vecinătatea mutaţiei este cunoscută. În acest caz, primerii
utilizaţi sunt specifici (complementari) fie alelei normale,
fie celei mutante, fiind denumiţi oligonucleotide cu
specificitate de alelă. Cele două oligonucleotide diferă
doar printr-o singură bază, dar acest fapt este suficient
pentru ca hibridizarea oligonucleotidelor să fie specifică
pentru o anumită alelă. Când se realizează detecţia unei
mutaţii, specimenul de ADN este amplificat alături de 3
specimene cunoscute: homozigot normal (NN),
heterozigot (Na) şi homozigot mutant (aa). Produsele
PCR sunt transferate pe filtre de nitroceluloză ("dot blot")
şi apoi sunt hibridizate (separat, în două reacţii) cu cele
două oligonucleotide specifice, marcate radioactiv (cu
32
P). Hibridizarea se face în condiţii foarte stringente,
pentru ca diferenţa de o singură bază ("mismatch") să
împiedice asocierea nespecifică. Dacă un specimen de
ADN este recunoscut de oligonucleotidul specific alelei
mutante, înseamnă că persoana este purtătoarea a cel
puţin unei gene mutante. Diferenţierea între heterozigoţi
şi homozigoţii mutanţi se realizează prin analiza filtrului
cu oligonucleotidul normal, hibridizarea acestuia cu
acelaşi specimen de ADN semnificând faptul că persoana
este heterozigotă.

175
PCR-ul poate fi utilizat şi pentru detecţia indirectă
a mutaţiilor, prin analiza polimorfismului conformaţiei
catenelor unice de ADN ("single-strand conformational
polymorphism", SSCP) sau prin analiza înlănţuirii cu
scurte secvenţe bi-, tri- sau tetranucleotidice, repetate în
tandem în număr variabil ("variable number of tandem
repeats", VNTR).
Analiza SSCP a fragmentelor de ADN amplificate
prin PCR se bazează pe tendinţa ADN-ului monocatenar
de a forma structuri secundare prin legături de hidrogen
intramoleculare. Prezenţa unei mutaţii punctiforme
determină modificarea legăturilor de hidrogen din
interiorul moleculei şi, deci, şi a conformaţiei acesteia.
Întrucât mobilitatea electroforetică în gel a moleculelor
de ADN este dependentă nu numai de mărime, ci şi de
conformaţia lor, două molecule de ADN monocatenar,
care diferă numai printr-o singură bază, pot migra
electroforetic diferit.
Avantajul principal al metodei SSCP constă în
faptul că nu este necesară cunoaşterea precisă a mutaţiei
sau a secvenţei complete a genei. Singura cerinţă este
cunoaşterea parţială a secvenţei nucleotidice, pentru
realizarea primerilor. ADN-ul amplificat prin PCR este
denaturat şi apoi aplicat imediat pe un gel nedenaturant,
pentru a nu permite renaturarea. În gel, catenele rămân
separate, dar formează structuri secundare prin legături
de hidrogen, deoarece ADN-ul bicatenar este mai stabil
decât cel linear, monocatenar. Catenele cu structuri
diferite au mobilitate electroforetică diferită, metoda
SSCP putând detecta o diferenţă de o bază dintr-o catenă
de 500 nucleotide. Izolarea din gel a fragmentului de
ADN cu migrare anormală permite secvenţializarea şi

176
determinarea precisă a modificării nucleotidice. Această
modificare poate fi sau nu cauza unei afecţiuni, ştiut fiind
că orice polimorfism poate genera o modificare
conformaţională a ADN-ului.
În ceea ce priveşte secvenţele scurte repetate în
tandem, acestea sunt secvenţe de ADN repetitiv,
răspândite în întreg genomul, cel mai frecvent constituite
din două nucleotide. Numărul de repetiţii dinucleotidice
este variabil, polimorfismul unei astfel de secvenţe
asociat unui anumit locus putând servi la urmărirea
transmiterii unei alele specifice într-o familie. Pentru
"tiparea" unei alele sunt necesari primeri complementari
secvenţelor care flanchează secvenţa repetitivă, urmată
de amplificarea PCR a specimenelor de ADN de la
membrii familiei. Produsele PCR pot fi marcate fie
radioactiv, fie fluorescent. Diferenţierea între alele se
face pe baza mărimii secvenţelor amplificate, prin
electroforeză în gel, urmată de autoradiografie sau
detecţie într-un aparat de secvenţializare automată.
4. Tehnica PCR poate fi utilizată şi pentru a amplifica
fragmente de ARN. Această reacţie, denumită RT-PCR
(reverse transcription-PCR) duce la producţia de ADN
complementar (ADNc) secvenţei de ARN, cu ajutorul
unui primer specific, a amestecului de nucleotide (dNTP)
şi a unei enzime numită transcriptază inversă.
Transcriptaza inversă este un tip de polimerază care
utilizează drept “tipar” (“template”) o moleculă de ARN.
Ea necesită, de asemenea, un primer şi efectuează sinteza
de ADN în direcţia 5’–3’. Transcriptazele inverse au fost
izolate din retrovirusuri, care au capacitatea de a-şi crea o
copie ADN a genomului lor (ARN), necesară în perioada
în care se găsesc în celulele eucariote. Amplificarea ARN

177
este deosebit de utilă pentru identificarea isoformelor
unei gene şi pentru analiza activităţii transcripţionale a
acestora.
5. Real time PCR – PCR în timp real
Chiar dacă abrevierea RT-PCR este identică celei
de mai sus (revers-transcripţie-PCR), real time PCR este
o variantă distinctă a PCR, ce urmăreşte nu doar
amplificarea ADN-ului ci şi cuantificarea simultană a
acestuia pe măsură ce este amplificat, deci în timp real,
după fiecare ciclu de amplificare. De aceea, tehnica mai
este denumită şi PCR cantitativ în timp real (quantitative
real time PCR – qPCR) sau PCR kinetic.
Reacţia real time PCR este adesea realizată în
combinaţie cu reacţia RT-PCR (revers transcriptie PCR),
în scopul cuantificării mARN-ului care se găseşte într-o
cantitate extrem de redusă. În mod remarcabil, în această
manieră poate fi cuantificată expresia genelor la nivelul
anumitor celule sau ţesuturi, la un anumit particular
moment.
Cuantificarea ADN-ului se realizează fie cu
fluorocromi care se intercalează cu ADN-ul dublu
catenar 5 , fie cu oligonucleotide modificate, care devin
fluorescente atunci când hibridizează la ADN-ul
complementar. Astfel, creşterea cantităţii de ADN în
timpul amplificării, va conduce la creşterea intensităţii
fluorescenţei. Aceasta este măsurată la încheierea fiecărui
ciclu, ceea ce permite măsurarea cantităţii de ADN.
Valorile obţinute nu sunt însă absolute, deci nu vor fi

5
Alegerea unor astfel de fluorocromi trebuie să ţină cont de
capacitatea acestor substanţe de a se lega inclusiv la produşi de PCR
non-specifici, cum sunt dimerii de primeri.

178
determinate numărul de copii de mARN/celulă, ci un
raport dintre proba analizată şi un standard.
Ideală este utilizarea de probe „reporter”, care
furnizează rezultate de maximă acurateţe. Probele
reporter sunt secvenţe de ARN sau ADN care se vor
hibridiza doar la secvenţa amplificată, ceea ce va permite
cuantificarea precisă a acesteia, chiar şi în prezenţa unor
amplificări nespecifice. Atunci când în reacţia de
amplificare sunt utilizate mai multe perechi de primeri
(multiplex), cu ajutorul unor probe reporter adecvate,
cuplate cu fluorocromi diferiţi, este posibilă cuantificarea
mai multor gene în cadrul aceleiaşi reacţii.
Real time PCR este astăzi utilizată nu doar în
cercetare, ci şi în diagnostic, pentru identificarea şi
cuantificarea de gene implicate în malignităţi, în afecţiuni
caracterizate de anormalităţi genetice sau în boli
infecţioase.

6. Secvenţierea ADN
Cunoaşterea secvenţei nucleotidice a ADN este
esenţială pentru înţelegerea mai bună a modului în care
este controlată expresia genelor şi a mecanismelor
moleculare implicate în patologia umană. În viitor, ca
urmare a descifrării genomului uman şi prin
perfecţionarea sistemelor automate, va apare posibilitatea
diagnosticului bolilor genetice direct prin secvenţiere.
Secvenţierea ADN este o versiune modificată a
replicării ADN în condiţii controlate in vitro. Ea diferă de
replicarea normală prin includerea în reacţie a
dideoxinucleotidelor (ddNTP) cărora le lipseşte grupul
3’-OH, necesar pentru extensia lanţului de către ADN-
polimerază. În momentul încorporării unui ddNTP în

179
structura ADN, sinteza se încheie, de aceea metoda este
denumită secvenţiere prin încheierea lanţului (“chain
termination sequencing”). Într-un set de patru reacţii,
fiecare conţinând cele patru nucleotide, dar un singur tip
de dideoxinucleotid, fragmentele rezultate din reacţie vor
începe în acelaşi punct (la nivelul primerului), dar se vor
termina în funcţie de dideoxinucleotidul inclus în reacţie.
De exemplu, în reacţia cu ddATP, fiecare fragment va fi
încheiat acolo unde există T (timină) în lanţul original.
Dacă se păstrează un echilibru corespunzător între
nucleotide şi dideoxinucleotide (raport molar de aprox.
200:1), atunci reacţia va produce toate lanţurile posibile,
cu lungimi cuprinse între 1 şi 1000 baze, numărate de la
poziţia primerului.
Produsele reacţiei pot fi detectate prin
încorporarea în reacţie (în primer sau în nucleotide) a
unor markeri, urmată de electroforeza în gel de
poliacrilamidă. Există trei tipuri de marcare utilizate în
secvenţiere: radioactivă, cu patru culori fluorescente sau
cu o singură culoare fluorescentă. Metoda iniţială utiliza
marcarea radioactivă. Fragmentele de ADN nou
sintetizate sunt marcate prin încorporarea nucleotidului
radioactiv (de obicei dATP) folosit în reacţie şi, după
electroforeză şi uscarea gelului, ele sunt vizualizate prin
expunerea unui film sensibil (autoradiografie). Cele mai
frecvent utilizate tipuri de izotopi sunt 35S şi 33P.
Ciclurile de sinteză necesare pentru secvenţiere
reprezintă cicluri repetate de denaturare termică, legare a
primerilor (annealing) şi polimerizare pentru producerea
unei cantităţi mai mari a produsului de ADN de
secvenţializat. Acest proces de secvenţiere implică un
singur primer, astfel încât cantitatea de ADN creşte liniar

180
cu numărul de cicluri, spre deosebire de o reacţie PCR
clasică, în care se foloseşte o pereche de primeri şi în
care cantitatea de ADN produsă creşte exponenţial cu
numărul de cicluri.
Primele reacţii de secvenţiere utilizau primeri
marcaţi cu 32P şi o polimerază instabilă termic, ce trebuia
adăugată după fiecare ciclu de denaturare. Ulterior a fost
utilizată polimeraza termostabilă Taq şi un amestec de
nucleotide marcate, în locul primer-ului marcat.
Astăzi, secvenţierea este realizată automat şi
utilizează dideoxinucleotide marcate cu substanţe
fluorescente (fluorocromi distincţi pentru fiecare dintre
ddNTP-uri). Cum enzima nu poate face distincţie între
dNTP-uri şi ddNTP-uri, încorporarea acestora din urmă
se realizează aleatoriu şi determină stoparea sintezei. Este
generată, aşa cum descriam anterior, o colecţie
impresionantă de catene de ADN cu diferite dimensiuni,
care ulterior este încărcată într-un gel de poliacrilamidă
adaptat unui aparat dedicat atât electroforezei cât şi
analizei informaţiei. Fragmentele încărcate vor migra în
funcţie de dimensiunea lor şi fiecare astfel de fragment
va fi detectat pe măsură ce trece prin dreptul unui
fascicul laser ce va excita fluorocromii cuplaţi la ddNTP-
uri, fiecare substanţă fluorescentă emiţând o culoare
specifică. Programul computerului va avea sarcina să
ordoneze fragmentele de ADN în funcţie de mărime şi să
deceleze emisia fluorescentă, ceea ce conduce în final la
identificarea succesiunii ddNTP-urilor, deci a secvenţei
fragmentului ADN (figura 6).
Unul din avantajele acestei metode este că
informaţia referitoare la secvenţă poate fi colectată chiar
în timpul electroforezei, prelungirea timpului acesteia

181
permiţând extragerea unei cantităţi mai mari de date.
Marele dezavantaj al secvenţierii cu marcaj fluorescent
este sensibilitatea relativ redusă a metodei.

Fig. 6 Succesiunea nucleotidelor identificată prin intermediul


succesiunii semnalelor fluorescente ale fragmentelor ADN
amplificate şi ordonate în funcţie de dimensiune.

Metode de introducere a ADN-ului recombinant în


bacterii şi celule eucariote

1. Vectori
Vectorii de clonare sunt secvenţe de ADN care
există în interiorul unei celule, dar care nu fac parte din
genomul acesteia. Vectorii de clonare se replică în
interiorul celulei-gazdă, producând cantităţi mari dintr-o
secvenţă specifică de ADN care poate fi izolată pentru
studii ulterioare. Există multiple tipuri de vectori:
plasmide, virusuri, cosmide, cromosomi bacterieni
artificiali (“bacterial artificial chromosomes”, BACs) sau
cromosomi artificiali de drojdii (“yeast artificial
chromosomes”, YACs).
1.1 Plasmide
Plasmidele sunt molecule circulare de ADN care
se pot replica autonom într-o gazdă bacteriană. Ele

182
variază în mărime de la câteva kb la câteva sute de kb.
Deşi nu sunt esenţiale pentru supravieţuirea bacteriei,
plasmidele pot conferi gazdei lor un avantaj selectiv ca
rezistenţa la antibiotice sau la metale grele, producţia
toxinelor sau a altor factori de virulenţă, producţia de
bacteriocine sau capacitatea de a cataboliza compuşi
aromatici.
O caracteristică comună a tuturor plasmidelor este
prezenţa unei secvenţe specifice denumită origine a
replicării (ori). Aceasta permite plasmidului să se replice
în celula gazdă independent de replicarea acesteia.
Plasmidele existente în mod natural au
caracteristici care le fac ideale pentru dezvoltarea ca
vectori de clonare. De exemplu, enzimele responsabile
pentru rezistenţa la antibiotice, codificate de plasmide,
sunt frecvent utilizate pentru selecţia unui plasmid
recombinant.
Plasmidele naturale au fost alterate genetic pentru
a facilita inserţia fragmentelor de ADN în cadrul
procedurilor de clonare. Celor mai mulţi vectori li s-a
creat o porţiune, cu variate situsuri de restricţie, denumită
situs multiplu de clonare (“multiple cloning site”). Alte
caracteristici urmărite sunt existenţa unei modalităţi de
selecţie, rată înaltă a replicării şi greutatea moleculară
mică (3-5 kb), ultima proprietate putând permite inserţia
unor fragmente mari de ADN şi uşurând purificarea
(figura 7).
Materialul genetic de interes (genă sau fragment
genic), poate fi introdus în cadrul plasmidului prin
tăierea, atât a plasmidului cât şi a fragmentului de ADN
exogen, cu aceleaşi enzime de restricţie, etapă urmată de
încorporarea acestuia din urmă în plasmidul recombinant

183
cu ajutorul unei ligaze. Introducerea plasmidului
recombinant într-o gazdă bacteriană (prin transformare
bacteriană) permite obţinerea unor cantităţi mari de ADN
reprezentând gena luată în studiu. Transformarea
bacteriană se realizează prin crearea unor pori în peretele
bacterian, de obicei prin metode fizice, ca electroporaţia
sau şocul termic.

Fig. 7 Vector pQe, bazat pe promotorul T5 (familia de plasmide


pDS) (adaptat după Qiagen).

O serie de plasmide au fost modificate pentru a


putea exprima gena vizată în bacteria gazdă, în vederea
studierii proprietăţilor proteinei codate. Vectorii de
expresie conţin un situs de clonare poziţionat după un
promotor foarte activ (figura 8), ceea ce determină
iniţierea sintezei produşilor proteici codaţi de aceştia.
Deşi o serie de proteine de origine eucariotă au
fost exprimate eficient în gazde procariote, multe din
acestea nu au structura spaţială care să le permită
funcţionarea corectă.

184
Fig. 8 Vector pGEM, conţinând promotorul lacZ al Escherichia
coli (adaptat după Qiagen).

Pentru a evita acest dezavantaj, au fost dezvoltaţi


vectori care permit expresia proteinelor de origine
eucariotă în gazde eucariote (celule de mamifer). Aceşti
vectori conţin atât secvenţe procariote, care facilitează
construcţia şi replicarea în E. coli, cât şi secvenţe
eucariote, care crează condiţiile pentru expresia genelor
eucariote. Acestea din urmă includ un element de tip
promotor, care să iniţieze transcripţia şi semnalul de
poliadenilare a transcriptului, la care se pot adăuga
secvenţe “enhancer”, care amplifică transcripţia de până
la 1000 de ori. Prezenţa unui marker de selecţie în
plasmidul de expresie eucariotă (gene ce codifică
timidin-kinaza sau dihidrofolat-reductaza) permite
identificarea celulelor eucariote în care vectorul a fost
introdus şi, eventual, selecţia unor clone stabile.

185
1.2 Virusuri
Pentru introducerea moleculelor de ADN
recombinant în celule eucariote au fost dezvoltate şi
metode biologice. Vectorii folosiţi sunt derivaţi din
diferite tipuri de virusuri: retrovirusuri, adenovirusuri sau
virusuri adenoasociate. Virusurile recombinante pot fi
utilizate pentru a introduce copii unice ale genelor de
interes în culturi de celule, permiţând studiul funcţiilor
genei respective atât din punct de vedere calitativ, cât şi
cantitativ.
Vectorii retrovirali sunt derivaţi din virusul
Moloney al leucemiei murine, genomul lor fiind
constituit dintr-o singură moleculă monocatenară de
ARN. Principalele avantaje ale folosirii vectorilor
retrovirali sunt integrarea stabilă a genelor transferate în
genomul celulei gazdă şi imunogenicitatea redusă,
calitate care oferă posibilitatea utilizării lor pentru
transferul genelor in vivo. Principalele dezavantaje
constau în capacitatea redusă (până la 10 kb), infectarea
doar a celulelor care se divid, integrarea la întâmplare în
genomul gazdei, ceea ce poate duce la inactivarea unor
gene proprii acesteia şi posibilitatea generării virusurilor
doar în cantităţi moderate.
Vectorii adenovirali sunt vectori ce conţin o
moleculă dublu catenară de ADN mare (până la 35 kb).
Principalele avantaje ale utilizării acestor vectori sunt
asociate cu capacitatea lor de a infecta eficient celule care
nu se divid şi de a acomoda ADN străin până la 10 kb,
precum şi de posibilitatea de generare a lor în cantităţi
mari. Principalele dezavantaje constau în incapacitatea

186
lor de a se integra stabil în celulele gazdă şi în
imunogenicitatea lor crescută.
Virusurile adenoasociate sunt virusuri cu ADN
monocatenar. Capacitatea lor de a infecta celule care nu
se divid, integrarea stabilă în anumite condiţii şi
imunogenicitatea moderată reprezintă cele mai
importante avantaje ale utilizării lor, în timp ce
capacitatea lor mai redusă, de până la 4 kb, este
principalul dezavantaj.
1.3 Bacteriofagi
Bacteriofagii sunt virusuri care pot infecta
bacteriile E. coli, fiind folosiţi frecvent în procedurile de
clonare. Particulele fagice sunt constituite dintr-un înveliş
proteic şi un “miez” cu un genom liniar de ADN dublu
catenar. În scopul clonării, o mare parte din genomul
original este înlăturat pentru a fi înlocuit cu ADN-ul
exogen.
Pentru clonarea unei secvenţe de ADN într-un
fag, o mare parte din interiorul genomului viral este
înlăturat cu ajutorul digestiei cu enzime de restricţie, cu
păstrarea unui “braţ” lung (stâng) şi a unui “braţ” scurt
(drept). Nici unul dintre braţe nu conţine suficient ADN
pentru formarea unor fagi infecţioşi şi nici nu este
suficient de mare pentru a putea fi “împachetat”.
Secvenţa de ADN de interes este ligată între cele două
braţe, reconstituind un genom singular, mare. Pentru
“împachetarea” acestui fag se utilizează un extract de
proteine structurale virale provenite de la fagi wild-type.
După infectarea unei bacterii, fagii se replică în
număr extrem de mare în interiorul acesteia şi apoi
lizează celula bacteriană. Particulele fagice, nou
sintetizate şi eliberate în urma uciderii gazdei, vor liza

187
bacteriile învecinate, formând o “placă” (o “gaură”) în
cultura de bacterii. Fiecare “placă” reprezintă o clonă,
deoarece toţi fagii dintr-o placă sunt identici din punct de
vedere genetic. Fagii pot fi amplificaţi în culturi
bacteriene în mediu lichid, ca apoi să fie purificaţi, iar
ADN-ul fagic, izolat în cantităţi mari.
Un bacteriofag mult utilizat la crearea
bibliotecilor de gene este bacteriofagul  care, însă,
prezintă dezavantajul că nu poate integra fragmente mari
de ADN. Un alt fag utilizat frecvent în prezent este fagul
P1, în care se pot insera secvenţe de ADN de până la 100
kb.
1.4 Cosmide
Cosmidele sunt vectori similari plasmidelor, care
pot fi amplificaţi în E. coli şi nu determină liza celulei-
gazdă. Secvenţe de până la 40 kb pot fi introduse în
cosmide prin digestie cu enzime de restricţie, urmată de
ligare. Bacteriile în care se introduc cosmidele pot fi
selectate cu ajutorul antibioticelor pentru care cosmidul
recombinant conţine o genă de rezistenţă.
1.5 Cromosomi bacterieni artificiali
Cromosomii bacterieni artificiali sunt plasmide
speciale din E. coli, care pot asigura replicarea stabilă a
unor secvenţe foarte lungi de ADN genomic (până la 180
kb). Spre deosebire de YACs, cromosomii bacterieni
artificiali au o tendinţă redusă de a forma chimere, iar
ADN-ul din aceşti vectori este foarte uşor de extras.
1.6 Cromosomii artificiali din drojdii (YACs)
Cromosomii artificiali din drojdii sunt vectori
foarte importanţi pentru clonarea genelor umane,
deoarece pot acomoda secvenţe lungi, de până la 2000
kb. Spre deosebire de alţi vectori de clonare, YACs nu

188
sunt amplificaţi în bacterii, ci în drojdii (Sacharomyces
cerevisiae).
Un YAC este constituit dintr-un centromer
artificial, un insert şi un telomer artificial, ceea ce
înseamnă că, într-adevăr, reprezintă un cromosom
artificial. Atât centromerul artificial, cât şi telomerul
conţin gene de selecţie. Pentru a genera un YAC,
fragmente mari de ADN sunt ligate la centromer, la un
capăt, şi la telomer, la celălalt capăt. YAC-ul este apoi
introdus în drojdii, care sunt crescute pe plăci cu mediu
de selecţie, astfel că numai drojdiile care conţin un YAC
complet (cu centromer şi telomer, având gene de selecţie
diferite) vor supravieţui şi vor forma colonii. Coloniile
individuale pot fi recoltate, crescute în mediu lichid, iar
apoi ADN-ul din YAC poate fi izolat din drojdii.
Deşi au marele avantaj de a putea acomoda
secvenţe mari de ADN, YACs au şi un mare neajuns,
fiind frecvent chimerici, cu alte cuvinte, acelaşi YAC
putând conţine secvenţe din mai multe regiuni ale
genomului. Acest aspect face necesară interpretarea cu
precauţie a rezultatelor clonării în acest tip de vector.

2. Transformarea bacteriană şi purificarea ADN-ului


din plasmide
Transformarea bacteriană constă în introducerea
unui plasmid într-o gazdă procariotă prin crearea unor
pori în peretele bacterian. Cele mai folosite metode sunt
electroporaţia şi şocul termic. Creşterea susceptibilităţii
gazdei bacteriene la introducerea ADN-ului străin, prin
alterarea peretelui bacterian, se obţine prin tratamente
chimice variate, iar bacteriile tratate astfel sunt denumite
bacterii competente.

189
O metodă intens folosită pentru realizarea unor
bacterii propice transformării prin şoc termic este
tratamentul cu clorură de rubidiu. Şocul termic constă în
incubarea soluţiei bacteriene, la care s-a adăugat
plasmidul dorit, la 42oC, timp de 30-90 secunde. O parte
din bacterii preiau ADN-ul plasmidic şi pot fi selectate
prin adăugarea la mediul de cultură (placa de agar) a unui
antibiotic, pentru care plasmidul dorit conţine o genă de
rezistenţă (figura 9).
Purificarea ADN-ului unui plasmid dintr-o cultură
bacteriană are loc în mai multe etape. Bacteriile ce conţin
plasmidul sunt crescute 16-18 ore într-un mediu lichid la
care s-a adăugat antibioticul de selecţie. Bacteriile sunt
apoi colectate prin centrifugare, iar ADN-ul plasmidic
este eliberat prin distrugerea peretelui bacterian în
condiţii care să minimizeze contaminarea cu ADN
bacterian. În general, se folosesc detergenţi ionici, ca
SDS sau Triton X-100, în asociere cu lizozimul - pentru
degradarea peptidoglicanilor - şi un agent chelator de
tipul EDTA. Pentru plasmidele mai mici, se utilizează
frecvent liza alcalină cu SDS şi NaOH. În condiţii
alcaline, cromosomul bacterian va fi denaturat, în timp ce
ADN-ul plasmidic, nu. Acesta poate fi izolat din
supernatant, fie prin centrifugare în gradient de CsCl în
prezenţa bromurii de etidiu, fie prin utilizarea unor răşini
schimbătoare de ioni.

190
Fig. 9 Construcţia şi selecţia unui vector (adaptat după Qiagen).

191
Pentru a putea aprecia eficienţa transfecţiei se pot
utiliza “gene reporter” care de obicei codifică enzime a
căror activitate este uşor de monitorizat cum sunt
cloramfenicol acetil transferaza (CAT), -galactozidaza
(produsă de gena lacZ a E.coli) sau luciferaza. -
galactozidaza este cel mai frecvent folosită în combinaţie
cu X-gal, situaţie în care rezultă un produs albastru
insolubil, vizibil la microscop. Luciferaza, enzima care
produce bioluminescenţa la licurici, catalizează oxidarea
D-luciferinei, în prezenţa ATP, a Mg2+ şi a O2, rezultând
oxiluciferină, CO2 şi un foton. Reacţia in vitro este
extrem de rapidă (apare în maximum 3-5 s), dar se şi
epuizează rapid, făcând necesară prezenţa unui
luminometru. O genă reporter din ce în ce mai mult
utilizată este cea care codifică proteina cu fluorescenţă
verde de la molusca Aequorea victoria. GFP (green
fluorescent protein) este fluorescentă la iluminare cu
lumină albastră sau UV şi, ca urmare, permite
vizualizarea celulelor transfectate prin microscopie optică
convenţională cu fluorescenţă.

Producerea proteinelor în gazde bacteriene

1. Inducerea sintezei proteice în gazde bacteriene


Expresia optimă a proteinelor recombinante în
diferite sisteme de expresie, inclusiv Escherichia coli,
poate fi obţinută cu relativă uşurinţă atunci când vectorii
şi celulele gazdă sunt alese în mod adecvat, iar condiţiile
de cultură sunt controlate corespunzător. Condiţiile de
cultură şi de inducţie a expresiei proteinelor au implicaţii
critice asupra modului în care proteina recombinantă este
produsă şi, în acest context, influenţează, în mod direct,

192
strategiile alese pentru purificarea proteinei. Este
preferabilă stabilirea empirică a condiţiilor optime
folosind culturi pe scară redusă, înainte să fie tentată
purificarea unor cantităţi mari de cultură.
Proteinele recombinante exprimate în E. coli pot
fi produse în formă solubilă, dar în foarte multe situaţii,
în special în cazul unor nivele înalte de expresie,
proteinele pot agrega şi forma corpi de incluzie
insolubili. Formarea corpilor de incluzie este influenţată
de natura proteinei, de celula gazdă şi de nivelul de
expresie ce rezultă din alegerea vectorului şi a condiţiilor
de creştere şi inducţie. Corpii de incluzie limitează în
mod invariabil utilitatea metodelor de purificare ce se
bazează pe forma solubilă, nativă, a proteinei.
Expresia şi purificarea proteinelor recombinante
facilitează producţia şi caracterizarea detaliată a practic
oricărei proteine. Deşi o largă varietate de sisteme
heterologe de expresie au fost dezvoltate şi sunt utilizate
în mod curent, purificarea acestor proteine poate fi
problematică. Pot fi utilizate proceduri clasice de
purificare, dar, în majoritatea cazurilor, tehnicile de
recombinare a ADN-ului permit construcţia unor proteine
de fuziune în care secvenţe specifice (affinity tags) sunt
adăugate secvenţei proteice de interes. Utilizarea acestor
“affinity tags” simplifică purificarea proteinelor
recombinante de fuziune prin metode de cromatografie
de afinitate.

2. Purificarea proteinelor
Purificarea proteinelor se realizează prin
separarea lor, fie pe baza greutăţii moleculare, fie pe baza
încărcării lor electrice.

193
2.1 Filtrarea în gel (cromatografie de excludere)
Filtrarea în gel (“size-exclusion
chromatography”) este o metodă uzuală pentru separarea
proteinelor, în condiţii fiziologice, pe baza mărimii
moleculelor. Matricea prin care sunt filtrate proteinele
(“solid phase matrix”) constă în sfere poroase de 100-250
m, care umplu o coloană prin care circulă o fază lichidă.
Faza lichidă are acces atât la volumul din afara sferelor,
cât şi la volumul din interiorul porilor. Porozitatea
ridicată face ca volumul lichid total să reprezinte mai
mult de 95% din volumul coloanei. Separarea poate fi
percepută ca o împărţire reversibilă în două volume
lichide. Moleculele de mărimi mari rămân în spaţiul
exterior sferelor, deoarece nu pot pătrunde în pori. De
aceea, ele trec prin coloană rapid, fiind colectate în
primele fracţii (“void volume”). Moleculele mai mici,
care pot pătrunde în pori, sunt menţinute mai mult timp la
nivelul sferelor şi trec mai încet prin coloană. Volumul
de eluţie pentru proteinele care trec prin pori reprezintă
volumul lichid total din coloană. Există variate tipuri de
matrici, diametrul porilor fiind selectat în funcţie de
mărimea proteinelor care trebuie separate.
Filtrarea în gel este cel mai frecvent utilizată la
sfârşitul procedurilor de purificare, când impurităţile sunt
în număr mic, iar proteina luată în studiu a fost parţial
purificată şi concentrată prin alte tipuri de cromatografie.
O excepţie de la această regulă o constituie proteinele
membranare, caz în care filtrarea în gel este prima
metodă de separare utilizată. Motivul acestei abordări
constă în faptul că, în acest caz, nu se folosesc tehnici de
concentrare, iar materialul va fi diluat progresiv în cursul
procedurii de purificare.

194
2.2 Purificarea proteinelor cu ajutorul răşinilor
schimbătoare de ioni
O altă metodă de purificare a proteinelor
utilizează răşinile schimbătoare de ioni, pentru a separa
proteinele pe baza tipului de încărcare electrică (cationică
sau anionică) şi a puterii ionice relative. Baza acestui tip
de cromatografie cu răşini schimbătoare de ioni este
faptul că grupările încărcate electric pot fi schimbate
liber cu ioni de acelaşi tip. În acest context, masa ionilor
este irelevantă, fiind posibil ca un anion voluminos,
reprezentând o proteină cu încărcare electrică negativă,
să fie schimbat cu ioni de Cl (sau alţi anioni). Acest
proces poate fi ulterior inversat prin spălare cu ioni de Cl
(soluţii de NaCl sau KCl), procedeu care îndepărtează
mai întâi proteinele legate slab de răşina din coloana de
cromatografie şi apoi proteinele legate puternic, cu
încărcare electrică mai mare. Ca majoritatea celorlalte
tipuri de cromatografie, cromatografia cu răşini
schimbătoare de ioni necesită o fază staţionară formată
din polimeri insolubili, hidrataţi, de tipul celuloză,
dextran sau Sephadex, pe care este imobilizat grupul
schimbător de ioni, anioni, cum sunt amoniu cuaternar
(Q), dietil aminoetil (DEAE), etilamoniu cuaternar
(QAE), sau cationi, ca de exemplu metilsulfonat (S),
sulfopropil (SP) şi carboximetil (CM).
2.3 Tehnologia Ni-NTA (nichel-acid nitriloacetic)
Cromatografia de afinitate cu metal imobilizat
(IMAC - immobilized-metal affinity chromatography) a
reprezentat prima metodă de purificare a proteinelor, care
a utilizat ca ligand de chelare acidul iminodiacetic (IDA).
IDA a fost încărcat cu ioni de metal cum sunt Zn2+, Cu2+
sau Ni2+ şi a fost utilizat pentru purificarea unei varietăţi

195
largi de proteine şi peptide. IDA are doar 3 situsuri
chelatoare de metal şi, ca urmare, nu poate lega cu putere
ioni metalici. Legarea slabă determină scurgeri ionice în
cazul încărcării cu proteine şi peptide puternic chelatoare
sau în timpul etapelor de spălare, ceea ce va conduce la
obţinerea unor cantităţi scăzute de produşi, de multe ori
impuri şi la contaminarea cu ioni metalici a proteinelor
izolate (figura 10).

Fig. 10 Comparaţie între interacţiunea a diferite matrici


chelatoare de metal cu ionii de nichel (adaptat după Qiagen).

196
Ni-NTA-agaroză, complex format prin cuplarea
Ni-NTA la Sepharose, oferă o înaltă capacitate de legare
şi o legare nespecifică minimă. Acest material este foarte
potrivit şi pentru cromatografia de tip HPLC (High-
Performance Liquid Chromatography) de presiune joasă.
Concentraţia crescută de ligand NTA de suprafaţă este
suficientă pentru legarea a aproximativ 5-10 mg de
proteină 6xHis tag pe ml de răşină Ni-NTA. Reamintim
că proteinele recombinante obţinute prin sinteză
bacteriană pot fi cuplate cu secvenţe specifice, affinity
tag, procedeu ce facilitează purificarea acestora (figura
11).

Fig. 11 Interacţiunea dintre reziduurile învecinate din “coada”


formată din 6 histidine şi matricea NI-NTA (adaptat după
Qiagen).

Metoda prezintă multiple avantaje:

197
 Purificarea se poate face într-o singură etapă,
aplicându-se atât proteinelor native, cât şi produşilor
lor de denaturare.
 Legarea, spălarea şi eluţia sunt înalt reproductibile şi
nu afectează structura proteinei.
 Produsele proteice pure sunt gata pentru a fi utilizate
în orice tip de aplicaţie.
 Sistemul 6xHis tag poate fi utilizat în orice sistem de
expresie, întrucât nu interferă cu structura şi funcţia
proteinei recombinante.
Înlăturarea secvenţei 6xHis tag se realizează prin
clivaj proteolitic, dar proteina recombinantă poate fi
utilizată şi fără înlăturarea prealabilă a histidinelor. La un
pH de 8.0, această secvenţă nu este încărcată electric şi
ca urmare nu va afecta secreţia, compartimentalizarea şi
plierea proteinei de fuziune în cadrul celulei. În
majoritatea cazurilor, 6xHis tag nu interferă cu structura
şi funcţia acestor proteine purificate, aşa cum s-a
demonstrat pentru o largă varietate de proteine, incluzând
enzime, factori de transcripţie sau vaccinuri. Un alt
avantaj al folosirii 6xHis tag este acela că permite
imobilizarea proteinei pe suprafeţe cum ar fi Ni-NTA His
Sorb Strips, ceea ce conduce la simplificarea studiului
multor tipuri de interacţiune proteică.
Pentru optimizarea expresiei unui anumit
construct proteic, este recomandată o analiză a
concentraţiei în funcţie de timp. Conţinutul proteic
intracelular reprezintă adesea o balanţă între cantitatea de
proteină solubilă din celulă, formarea de corpi de incluzie
şi degradarea proteică. Analiza proteinelor marcate cu
6xHis prezente în diferite momente ale sintezei, după

198
inducţie în fracţiile solubilă şi insolubilă, conduce la
determinarea perioadei optime de inducţie.

3. Inhibitori de proteaze
Unul din aspectele critice ale procesului de
producere şi izolare a proteinelor în celule, fie eukariote,
fie prokariote, îl reprezintă protejarea acestor produşi
împotriva enzimelor proteolitice ale celulei utilizate.
Proteazele pot fi împărţite în diverse clase, pe baza
centrului activ caracteristic fiecăreia.

 Serin-proteaze, având serina şi histidina în centrul


activ;
 Cystein-proteaze care conţin cysteina (thiol, SH-) în
centrul activ;
 Metaloproteaze care au ioni de metal în centrul activ
(de exemplu Zn2+, Ca2+, Mn2+);
 Aspartat-proteaze cu un acid aspartic în centrul activ.

Următorul tabel încearcă să clasifice clasele de


proteaze şi inhibitorii specifici:

Serin Cystein Metaloproteaze Aspartat


proteaze proteaze proteaze
APMSF* Bestatin* Pepstatin*
(aminopeptidaza)
Antitrombina
III
1antitripsina E-64* EDTA-Na2*
(1-protease-
inhibitor)
Aprotinin* Phosphoramidon*

199
3,4-Dicloro-
isocumarina*
Pefabloc®SC*
Leupeptin* (inhibitor de
serin şi cystein proteaze
cu activitate tripsin-like)
PMSF*
Complet: Cocktail de inhibitori de proteaze
(tablete)*
2-Macrogloblina* (endoproteinaze)

Aplicaţiile inhibitorilor de proteaze sunt multiple:


 Protecţia proteinelor şi a enzimelor în timpul
extracţiei şi purificării lor;
 Purificarea unor substanţe cum ar fi, printre altele,
urokinaza, tripsina şi chemotripsina, cu ajutorul
aprotininei imobilizate;
 Cuantificarea activităţii kalikreinei în amestecuri de
esteraze şi proteaze;
 Garantarea degradării controlate a substraturilor şi
evitarea proteolizei nespecifice în teste chimice
clinice;
 Inhibarea activităţii proteazelor şi prelungirea în acest
fel a duratei de viaţă a celulelor în cadrul diferitelor
studii in vitro sau in vivo;
 Aprotinina poate reprezenta un model proteic în
cadrul studiilor de structură;
 Marker de greutate moleculară pentru geluri de
electroforeză SDS.

200
4. Metode de caracterizare a produsului genelor
manipulate

4.1 Electroforeza proteinelor


În fiecare tip de celulă sunt exprimate la un
moment dat cel puţin 10% din cele aproximativ 100000
de gene din genomul uman. Ca urmare, purificarea şi
analiza produşilor genelor (proteinelor) necesită tehnici
de analiză de înaltă rezoluţie. Dintre acestea, cea mai
curent utilizată este separarea prin electroforeză.
Mobilitatea electroforetică a proteinelor, bazată pe
caracterul lor amfoter, este dependentă de mai mulţi
factori, unii intrinseci (greutate moleculară şi încărcare
electrică), alţii dependenţi de tehnica de electroforeză
utilizată (intensitatea câmpului electric, pH-ul şi
concentraţia ionică a soluţiei). Majoritatea tehnicilor de
electroforeză utilizează un gel cu pori mici prin care
proteinele migrează. Proteinele imobilizate în gel pot fi
ulterior analizate printr-o colorare selectivă care permite
detecţia unor cantităţi extrem de mici (<1 ng) de proteină.
Cea mai des folosită metodă de electroforeză a
proteinelor este electroforeza în gel de poliacrilamidă -
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) sau SDS-PAGE (Sodium
Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gels), care permite
estimarea greutăţii moleculare a polipeptidelor şi analiza
unor amestecuri complexe de proteine. Proteinele sunt
denaturate în cursul electroforezei şi formează cu SDS
complexe ce maschează încărcarea electrică a
proteinelor, separarea lor făcându-se exclusiv pe baza
greutăţii moleculare. Pentru a separa amestecurile de
proteine se utilizează frecvent gradienţi de
poliacrilamidă.

201
După electroforeză, gelul poate fi colorat pentru
detectarea benzilor corespunzătoare proteinelor. Cea mai
simplă metodă implică colorarea în soluţie Coomassie
blue, ce conţine metanol şi acid acetic. O parte din
colorantul cationic se leagă de proteină în soluţia acidă,
iar cel rămas nelegat poate fi spălat cu soluţie de metanol
şi acid acetic. Limita sensibilităţii acestei metode este de
200 ng de proteină. Cea mai sensibilă metodă de colorare
(poate detecta 0,21 ng de proteină) utilizează cationii de
Ag care se pot lega de grupurile NH2- şi S- ale
proteinelor. Complexele Ag-proteine pot fi reduse pentru
a produce Ag metalic în gel, uşor de vizualizat.
O altă tehnică electroforetică (IEF – isoelectric
focusing) permite separarea proteinelor în funcţie de
încărcătura lor electrică. Metoda se bazează pe
capacitatea proteinelor de a migra în câmp electric, atâta
timp cât au o încărcare electrică netă, pozitivă sau
negativă. Moleculele neutre nu pot migra. În general,
proteinele conţin aminoacizi încărcaţi electric diferit, unii
pozitivi, alţii, negativi, ceea ce explică şi caracterul lor
amfoter. Valori diferite ale pH-ului soluţiilor de migrare
determină care dintre încărcări, pozitivă sau negativă, va
domina la nivelul unei molecule proteice. Pentru fiecare
proteină se descrie o anumită valoare a pH-ului, la care
proteina este neutră (încărcarea electrică pozitivă devine
egală cu cea negativă), valoare particulară numită punct
isoelectric. Tehnica IEF utilizează geluri ce conţin nişte
substanţe numite carrieri amfoliţi care, sub influenţa unui
câmp electric aplicat gelului, se ordonează într-un
gradient dependent de pH. Când un amestec proteic este
analizat, prin electroforeză, într-un astfel de gel, fiecare
proteină din amestec va migra, până în zona caracterizată

202
de acel pH particular numit punct izoelectric, unde se va
opri.
O metodă ce combină tehnica SDS-PAGE cu
avantajele IEF este electroforeza bi-dimensională în gel
(2D gel electrophoresis). Mai întâi, amestecul proteic
este supus unei electroforeze IEF, ce permite separarea
componentelor în funcţie de punctul lor izoelectric
(prima dimensiune), apoi, proteinele sunt tratate cu SDS,
iar gelul IEF este pus în contact cu un gel SDS-PAGE.
Reacţia prealabilă a proteinelor din amestec cu SDS
permite acestora să iasă afară din gelul IEF şi să migreze
în gelul SDS în funcţie de greutatea lor moleculară (a
doua dimensiune). Vizualizarea poziţiei unei anumite
proteine după separare se poate realiza prin colorare cu
Coomassie blue, sau prin marcare prealabilă cu o
substanţă radioactivă şi autoradiografie sau prin marcare
cu argint, metodă ce se bazează pe capacitatea proteinelor
de a reduce ionii de argint la argint metalic, ce poate fi
detectat în gel cu uşurinţă.

4.2 Western blot


Transferul proteinelor (Western blotting) a fost
iniţial introdus în anii 1970 pentru a identifica antigenele
proteice care leagă anticorpi specifici. În această
procedură, un amestec complex de proteine este separat
prin electroforeză, apoi proteinele sunt transferate şi
fixate la o membrană care poate fi analizată cu ajutorul
unui anticorp marcat radioactiv (Figura 12).
Cu alte cuvinte, Western blot reprezintă o
metodă de identificare a proteinelor nemarcate, separate
mai întâi prin electroforeză în gel (SDS-PAGE), pe baza
abilităţii lor de a reacţiona cu anticorpi specifici. Cele

203
mai utilizate membrane sunt cele de nitroceluloză cu pori
de 0,45 m sau de 0,2 m, în cazul în care proteinele au
o greutate moleculară mai mică de 20 kDa. Principalele
dezavantaje ale membranelor de nitroceluloză sunt
capacitatea lor redusă de fixare şi fragilitatea.
Membranele de nylon sunt mai fiabile, dar prezintă un
nivel înalt de legare nespecifică. Cele mai bune
membrane sunt cele de difluorură de poliviniliden
(PVDF).

Fig. 12 Reprezentare schematică a principiului tehnicii Western


blot (adaptat după Roitt I, Brostoff J, Male D, 2001).

204
Pentru transferul proteinelor din gel pe
membrane, se pot folosi multiple metode ca difuzia
simplă, capilaritatea, transferul cu vacuum, sau transferul
electric, care în prezent reprezintă metoda de elecţie.
Viteza şi eficienţa transferului depind de mai mulţi
factori ca greutatea moleculară a proteinelor, punctul
izoelectric, concentraţia de acrilamidă în gel şi soluţia de
transfer. Odată ce proteinele au fost transferate pe
membrană, ele pot fi identificate cu ajutorul unor
anticorpi specifici. Anticorpii primari pot fi ei înşişi
marcaţi sau pot fi identificaţi, la rândul lor, cu anticorpi
secundari marcaţi radioactiv, cu substanţe fluorescente
sau cu enzime ce acţionând asupra substraturilor
specifice determină reacţii de culoare.

4.3 Caracterizarea funcţională prin analiza asocierii


cu alte proteine
Caracterizarea biochimică a funcţiei unei proteine
se poate realiza prin diferite metode. Unele dintre acestea
analizează capacitatea proteinei purificate de a se asocia
cu alte proteine din ţesuturile în care se găseşte în mod
normal. Pentru aceasta, se utilizează aşa numitele
“coloane de afinitate” care conţin proteina purificată,
imobilizată pe o fază staţionară. Extractul total de
proteine este filtrat, în condiţii similare celor fiziologice,
prin acestă coloană, ceea ce face ca partenerii normali ai
proteinei luate în studiu să rămână iniţial ataşaţi acesteia
în coloană. Ulterior, interacţiunile dintre aceste proteine
pot fi distruse, iar proteinele solubilizate din coloană pot
fi identificate prin electroforeză în gel şi Western blot
(imunoblot cu anticorpi specifici).

205
4.4 Alte metode de analiză funcţională

4.4.1 Analiza Farwestern - o proteină este marcată şi


utilizată pentru detectarea proteinelor cu care ea
interacţionează, într-o manieră similară cu utilizarea
anticorpilor într-un Western blot. Pentru aceasta, proteina
este extrasă din ţesuturi şi purificată sau este exprimată în
bacterii, după care este marcată radioactiv prin fosforilare
in vitro cu 32P-ATP. Tehnica presupune separarea prin
electroforeză în gel denaturant a unor extracte proteice
totale, celulare sau nucleare, sau a unor proteine
cunoscute, urmată de transferul proteinelor pe o
membrană şi renaturarea lor. Proteina marcată este
utilizată pentru detecţia unor proteine specifice pe
membrană, ceea ce furnizează date asupra numărului de
interacţiuni şi a greutăţii moleculare relative a proteinelor
asociate. Acelaşi principiu stă la baza screening-ului
bibliotecilor ADNc.

4.4.2 Imunoprecipitarea implică utilizarea unui anticorp


specific unei anumite proteine pentru precipitarea
acesteia din extractele celulare şi, odată cu ea, şi a altor
proteine cu care ea este asociată (vezi şi Reacţia de
precipitare). Se pot folosi anticorpi mono- sau policlonali
specifici, sau proteina poate fi exprimată ca proteină
recombinantă, chimerică, cu un epitop cunoscut, caz în
care se foloseşte un anticorp direcţionat împotriva
epitopului adăugat.
În multe situaţii, imunoprecipitarea se realizează
prin cultivarea celulelor, în care se urmăreşte
identificarea unei proteine, în medii de cultură ce conţin
aminoacizi marcaţi radioactiv. Cei mai utilizaţi

206
aminoacizi sunt leucina, metionina şi cisteina, întrucât
sunt cei mai rezistenţi la modificări metabolice. După o
perioadă de cultivare, celulele sunt lizate şi amestecul
proteic este tratat cu un anticorp specific proteinei de
interes. Complexul antigen-anticorp este scos din
amestec prin imunoprecipitare, de exemplu, prin
folosirea unui anticorp secundar fixat pe un suport solid
sau fixat pe bile magnetice. Această metodă permite
detecţia unor cantităţi foarte mici de proteine.
Pentru a analiza funcţionalitatea unei proteine
recombinante exprimate în bacterii se testează de obicei
capacitatea acesteia de a înlocui proteina normală
corespunzătoare în complexele proteice. Pentru aceasta,
fie proteina recombinantă, fie cea normală, sunt marcate,
radioactiv sau non-radioactiv. Incubarea proteinei
recombinante, purificată şi marcată, cu complexe
proteice normale ce conţin proteina originală (cea de la
care s-a plecat în realizarea proteinei recombinante) duce
de obicei la dezlocuirea proteinei normale şi la formarea
unor complexe proteice ce vor conţine varianta
recombinantă marcată. În această situaţie, proteina
recombinantă păstrează capacitatea celei originale de a
interacţiona cu alte proteine, formând complexe proteice.
O variantă a metodei de mai sus este utilizată
pentru confirmarea efectului biochimic al unor mutaţii
dominante negative. În această situaţie, proteinele
recombinante rezultate prin astfel de mutaţii şi, de obicei
marcate pentru o mai uşoară identificare, trebuie să
păstreze capacitatea proteinei originale (“wild-type”) de a
interacţiona cu alte proteine şi de a forma complexe
proteice, deşi pierde total sau parţial celelalte funcţii.

207
4.5 Surface plasmon resonance (SPR)
Analizele structurale şi funcţionale reprezintă
două abordări principale pentru înţelegerea proceselor
biologice la nivel molecular. În mod ideal, aceste tehnici
se completează reciproc pentru a furniza o imagine
completă asupra aspectelor moleculare ale interacţiunii
biospecifice.
Tehnicile de analiză structurală, cum ar fi
difracţia electronilor sau a razelor X, microscopia
electronică, rezonanţa magnetică nucleară (RMN) şi
analizele de secvenţă pot da informaţii detaliate asupra
organizării atomilor din structura biomoleculelor în
repaus, dar şi asupra posibilelor modificări ale acestora în
cazul în care biomoleculele interacţioneză cu alte
molecule. Aceste metode sunt însă statice şi oferă
informaţii doar asupra unei fracţiuni a procesului de
interacţiune.
Metodele generale pentru analiza kinetică sunt
relativ puţine şi prezintă o serie de limitări importante.
Cromatografia de afinitate şi tehnicile imunologice pot
furniza informaţii valoroase asupra condiţiilor şi
specificităţii interacţiunii, dar sunt incapabile să
urmărească un întreg proces, cu excepţia unuia ce are loc
la o scară temporală extrem de lentă. Metodele
spectrofotometrice sunt rapide, dar limitate la molecule
care prezintă grupări fluorescente sau absorbante
corespunzătoare. În plus, principiul de detecţie necesită
adeseori un tip de marcare sau altul, care poate interfera
cu interacţiunea studiată. Marcarea necesită ca
substanţele ce se vor afla în interacţiune să fie purificate,
adesea în cantităţi foarte mari.

208
Utilizarea biosenzorilor vine să completeze
oarecum acest gol, dând posibilitatea studierii
interacţiunii în timp real. Un biosenzor poate fi definit ca
un instrument ce combină un mecanism de recunoaştere
biologică cu un dispozitiv senzorial (transducer).
Real-time BIA (Biomolecular Interaction
Analysis) produs de Pharmacia Biosensor AB utilizează
fenomenul optic de “surface plasmon resonance” (SPR)
pentru monitorizarea interacţiunilor biomoleculare.
Detecţia depinde de modificările în masa concentraţiei de
macromolecule la interfaţa biospecifică şi nu necesită
nici un fel de marcare a substanţelor în interacţiune. Un
corolar al acestui aspect îl reprezintă faptul că, în toate
stadiile, interacţiunea poate fi monitorizată, în contrast cu
metodele convenţionale, la care detectarea este restrânsă
la un singur component marcat. Interacţiunile sunt
urmărite pe măsură ce se desfăşoară, astfel încât
informaţiile kinetice pot fi extrase cu uşurinţă.
SPR, fenomenul pe care se bazează măsurătorile
efectuate de BIA, reprezintă un fenomen optic ce se
produce în metale extrem de subţiri în condiţiile unei
reflecţii interne totale. Fenomenul produce un unghi
ascuţit în intensitatea luminii reflectate la un unghi
specific, unghiul de rezonanţă. Poziţia acestui unghi de
rezonanţă depinde de o serie de factori, inclusiv indexul
de refracţie al mediului aflat în contact cu latura
neiluminată a filmului de metal. Indexul de refracţie se
corelează direct cu concentraţia de material dizolvat în
mediu. Prin menţinerea altor factori constanţi, SPR este
utilizat în BIA pentru măsurarea schimbărilor în
concentraţia moleculelor conţinute într-un strat de soluţie
aflat în contact cu suprafaţa senzorului (figura 13).

209
Fig. 13. În condiţiile unei reflexii interne totale la nivelul unei
interfeţe acoperite cu metal, are loc propagarea unui val efemer
într-un mediu cu indice de refracţie scăzut, pe latura
neiluminată (adaptat după BIAapplications, Pharmacia
Biotech).

Componentele esenţiale ale sistemului BIA sunt:


 sensor chip-ul cu o suprafaţă biospecifică unde are
loc interacţiunea
 un sistem optic responsabil pentru generarea şi
detecţia semnalului SPR
 un sistem de manevrare a fluidelor, dotat cu pompe
de precizie şi un dispozitiv “micro fluidic cartridge”
pentru transportul controlat al probelor la suprafaţa
senzorului.

Senzor chip-ul este compus dintr-o lamelă de sticlă,


acoperită pe una dintre laturi cu o peliculă fină de aur, la
această suprafaţă fiind ataşată în mod covalent o matrice
(figura 14).

210
Fig. 14 Sistemul optic şi celula de flux în sistemul BIA de analiză
în timp real (adaptat după BIAapplications, Pharmacia Biotech).

BIA utilizează o tehnologie în care fluxul este


continuu, tocmai pentru a putea urmări interacţiunile în
timp real. Una dintre moleculele aflate în interacţiune
este imobilizată la suprafaţa senzorului, care formează
unul dintre pereţii celulei în care este produs fluxul.
Soluţia, conţinând cealaltă substanţă aflată în
interacţiune, se deplasează continuu pe suprafaţa
senzorului. Pe măsură ce moleculele din soluţie se leagă
la substanţa imobilizată, unghiul de rezonanţă se
modifică şi este înregistrat un răspuns (figura 15).

211
Fig. 15 Sensorgrama schematică arătând asocierea, faza de
echilibru şi faza de disociere (adaptat după BIAapplications,
Pharmacia Biotech).

Sistemul este astfel capabil să furnizeze date


despre kinetica asocierii şi disocierii a două substanţe.
Substanţa imobilizată pe suprafaţa senzorului este
denumita ligand, iar cea liberă, în soluţie, este denumită
analit. În unele aplicaţii, ligandul este ataşat indirect la
suprafaţă, prin intermediul legării la o altă moleculă
imobilizată. Această tehnică este numită capturare, iar
molecula imobilizată este denumită moleculă de
capturare.

212
Bibliografie

1. Edward S Golub – Immunology: a synthesis.


Sinauer Associates Inc., 1987
2. HC Gooi, H Chapel – Clinical Immunology, A
Practical Approach. IRL Press, Oxford University Press.
D Rickwood, BD Hames (eds), 1990
3. Myron R Melamed, Tore Lindmo, Mortimer L
Mendelsohn – Flow cytometry and sorting, 2nd edition,
Wiley-Liss, 1991
4. Leonard Davis, Michael Kuehl, James Battey –
Basic Methods in Molecular Biology. 2nd edition.
Appleton&Lange. 1994
5. Traian DL Râşniţă – Tehnici imuno-enzimo-
histo-chimice, Editura Didactică şi Pedagogică RA, 1996
6. Ivan Lefkovits – Immunology Methods Manual.
The Comprehensive Sourcebook of Techniques.
Academic Press. Harcourt Brace&Company (Publishers),
1997
7. Lothar Thomas – Clinical Laboratory
Diagnostics, Use and Assessment of Clinical Laboratory
Results, TH Books, 1998
8. Eli Benjamini, Richad Coico, Geoffrey Sunshine
– Immunology, a short Course, 4th edition, Wiley Liss,
2000
9. Carter P. Improving the efficacy of antibody-
based cancer therapies. Nat Rev Cancer. 2001;1(2):118-
129
10. Ivan Roitt, Jonathan Brostoff, David Male –
Immunology. Mosby. 6th edition. 2001
11. Charles A Janeway, Paul Travers, Mark Walport
– Immunobiology. Garlands Science. 5th edition. 2001

213
12. Kenneth D. McClatcheey – Clinical Laboratory
Medicine, 2nd edition, Lippincott Williams & Wilkins,
2002
13. Howard M Shapiro - Practical Flow Cytometry,
th
4 edition, Wiley-Liss, 2003
14. Peter J Delves, Seamus J Martin, Denis R Burton,
Ivan M Roitt – Roitt’s Essential Immunology. Blackwell
Publishing, 11th edition, 2006
15. Thomas J Kindt, Barbara A Osborne, Richard A
Goldsby - Kuby Immunology. WH Freeman, 6th edition,
2006
16. Meinir G Jones, Penny Lympany – Allergy
Methods and Protocols, Humana Press, 2008
17. John M Walker, Ralph Rapley – Molecular
Biomethods Handbook, 2nd edition, Humana Press, 2008

214