Sunteți pe pagina 1din 10

LP.

14 Diagnosticul de laborator in infectiile fungice determinate de levuri


si de fungi filamentosi

OBIECTIVE:
I. Prezentarea caracterelor generale ale fungilor.
II. Prezentarea levurilor de interes medical: Candida, Cryptococcus.
III. Prezentarea caracterelor generale ale fungilor hialini neseptati (Zygomicete de interes
medical).
IV. Prezentarea fungilor hialini septati (Aspergillus).

I. Caracterele generale ale fungilor


Definitie: Fungii sunt bioentitati microscopice, eucariote uni- sau pluricelulare heterotrofe,
care contin chitina in peretele celular.
Morfologie
Se bazeaza pe aspectul si structura partii asimilatoare a fungului- talul, si permite descrierea a
3 tipuri principale de fungi:
1. levuriformi- microorganisme unicelulare, de forma rotunda sau alungita, ce se
multiplica in principal prin burjeonare; burjeonul- denumit blastospor sau
blastoconidie, fie se poate desprinde de celula-mama printr-un proces de fisiune, fie
ramane atasat la aceasta si genereaza succesiv noi indivizi, sub forma unor agregate
liniare – pseudohife.
2. filamentosi- microorganisme pluricelulare, cu talul alcatuit din filamente tubulare,
septate sau nu, denumite hife; hifele sunt de obicei ramificate si aglomerate formand
miceliul.
3. dimorfici- microorganisme care apar sub forma de levuri in tesuturile organismelor
parazitate sau la 370C in vitro si sub forma filamentoasa cand sunt cultivate la
temperatura camerei sau la 300C, pe medii uzuale.
Levuri de interes medical
Generalităţi
Levurile sunt fungi unicelulari care se multiplica vegetativ (asexuat) fie prin
burjeonare, fie prin fisiune. Habitatul lor natural este extrem de diversificat. Levurile sunt
intalnite la plante, insecte, animale si om (pe piele, mucoase si in tractul digestiv), in sol, apa

1
(dulce si sarata) si aer. Au caracter ubicuitar. Levurile de interes clinic sunt microorganisme
aerobe sau facultativ anaerobe, mezofile si acidofile.
Temperatura optima de cultivare variaza pentru marea majoritate a levurilor intre 25 0C
si 300C, insa cele patogene tolereaza si temperatura de 370C.
Identificarea levurilor
1. Examenul microscopic direct al produselor patologice
- preparat extemporaneu intre lama si lamela cu solutie 20% KOH (scuame, fragmente
unghiale, secretii linguale, vaginale);
- preparat extemporaneu cu sol 20% KOH + substanta fluorescenta sau frotiu colorat cu
aceeasi substanta fluorescenta (Calcofluor); necesita microscopie in lumina ultraviolet;
- preparat extemporaneu cu tus de India (pune in evidenta levurile capsulate din genul
Cryptococcus, in sedimentul LCR, urinar);
- frotiu colorat Gram (pune cu usurinta in evidenta filamentele, pseudohifele;
- frotiu colorat May Grunwald-Giemsa (este coloratia de rutina pentru depistarea
levurilor intracelulare de tip Histoplasma);
In cursul examenului microscopic se urmaresc prezenta, forma si dimensiunile
formatiunilor caracteristice levurilor: blastospori, pseudohife, filamente (hife).
2. Cultivarea pe medii de izolare
In general, insamantarea prelevatelor se face pe Agar Sabouraud aditivat cu
cloramfenicol; acest mediu permite o buna dezvoltare a levurilor si suprimă multiplicarea
eventualelor bacterii contaminante.
Levurile de interes medical se dezvolta in 24-72 h de incubare.
- pentru prelevatele provenind din situsuri in care in mod normal temperatura este
identica cu cea a organismului se va alege temperatura de 370C pentru incubare;
- in cazul celor provenind de la nivelul tegumentelor sau unghiilor incubarea se va face
atat la 370C cat si la 300C, deoarece unele levuri cultivabile la 300C dar necultivabile la
370C, pot avea semnificatie clinica fiind cauza unor micoze superficiale.
Coloniile pot imbraca diverse aspecte in functie de genul si specia in cauza. In general, au
forma rotunda, sunt bombate si nu prezinta pigment. Suprafata poate fi neteda, uneori
neregulata, cu margini fin franjurate si au aspect umed sau uscat. Consistenta este pastoasa,
mucoida sau cerata.
3. Teste de identificare
Algoritmul de identificare a unei tulpini levurice se bazeaza pe o combinatie de:
A- caractere microscopice

2
B- caractere de cultură
C - caractere biochimice
D - caractere genetice
a)obtinerea si examinarea preparatelor extemporanee cu tus de India
- pe o lama de sticla curata si degresata se etaleaza o picatura de tus in care se
suspensioneaza apoi cu ajutorul unei anse microbiologice un mic fragment din colonia
levurii de identificat;
- se acopera cu o lamela si se examineaza la microscop cu obiectiv X20 (X40);
- observarea unor levuri rotunde sau ovoidale, inconjurate de un halou necolorat, clar,
pe fond brun –negru, indica prezenta capsulei.
b)testul de filamentare (testul de blasteza sau germ-tube test)
- ca medii pentru blasteza se utilizeaza serul sanguin de cal, serul sanguin uman;
Tehnica:
- se prepara suspensia levurica in solutie salina fiziologica, densitatea acesteia
ajustandu-se la 0,5 Mc Farland (cca.105-106 celule /ml) ;
- in fiole cu capacitatea de 2 ml se pun in contact 0,5 ml suspensie levurica si 0,5 ml ser
sanguin de cal;
- fiolele se mentin apoi in baia de termostatare la 360C timp de 2h.
Dupa expirarea celor 2h, fiolele se agita si din fiecare amestec se preleveaza un volum de
25µL care se etaleaza apoi intre lama si lamela.
- preparatul extemporaneu astfel obtinut se examineaza la microscop in vederea
decelarii tubilor germinativi caracteristici tulpinilor de Candida albicans si Candida
dubliniensis-filamente scurte care emerg din blastospori fara strangulare;
- ca martor al filamentarii, se utilizeaza de fiecare data o tulpina tip de Candida
albicans;
- si alte levuri pot produce formatiuni similar de tipul pseudofilamentelor, insa ele se
diferentiaza de adevaratii tubi germinativi prin existenta unei strangulari la locul de
emergenta din blastospor.
B. Teste biochimice
a)fermentarea zaharurilor
- utilizarea metabolica a zaharurilor este utila in diferentierea diverselor specii
apartinand genului Candida
b)capacitatea de asimilare a surselor de carbon

3
- abilitatea levurilor de a creste pe diverse medii in prezenta anumitor substante chimice
adaugate ca unica sursa de carbon, poarta numele de auxanograma
c)capacitatea de asimilare a surselor de azot
- important pentru diferentierea levurilor apartinand genurilor Criptococcus si
Rhodotorula
d)producerea de ureaza
- pune in evidenta capacitatea levurilor de a produce enzima numita ureaza; de ex.,
Cryptococcus
e)rezistenta la cicloheximida
- testul se refera la abilitatea levurilor de a se dezvolta pe medii de cultura continand
doua concentratii de cicloheximida- 0,01 %, repectiv 0,1%
f)producerea de fenol-oxidaza
- permite identificarea speciei de Criptococcus neoformans pe baza unei reactii de
culoare ce determina o brunificare a mediului in aproximativ 24h de incubare la 30 0C
g)producerea altor enzime
- este evidentiabila prin cultivarea levurilor pe medii cromogene
h)teste rapide de identificare a unor specii de levuri:
- latex-aglutinare (exemplu: pentru C.dubliniensis- BICHRO-DUBLI, Fumouze)
- asimilarea trehalozei
C. Tehnici moleculare
- se bazeaza in principal pe amplificarea si secventializarea unor regiuni unanim
prezente in genomul levurilor;
- regiunile tinta sunt amplificate prin PCR cu ajutorul a doua secvente nucleotidice
cunoscute, denumite amorse.
II. Descrierea principalelor genuri de levuri de interes medical: Candida,
Cryptococcus
Genul Candida
Cuprinde peste 160 de specii, de ex.: C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata, C. kefir,
C.krusei, C.tropicalis s.a.
C. albicans este comensală a cavităţilor naturale (în special gură, intestin, vagin). Alte
specii se întâlnesc atât pe mucoase, cât şi la nivelul pielii sănătoase. Sunt levuri oportuniste;
produc infecţii când apar deficineţe ale mecanismelor de apărare (nespecifică şi specifică) ale
gazdei. Determină candidoze cu localizare superficială sau profundă.

4
Diagnosticul de laborator
Produsul patologic recoltat: variază în funcţie de localizarea leziunilor.
- Recoltarea scuamelor din leziunile cutanate se face cu pensa; din leziunile mucoasei,
cu ajutorul tamponului steril; prelevarea prin raclarea unghiilor la limita dintre zona
sănătoasă şi cea infectată.
- Recoltarea sputei, l.c.r., urină se face în recipiente sterile.
Transportul produsului patologic trebuie efectuat rapid (max 1h), datorită multiplicării rapide
a levurii.
Examen direct, microscopic, se practică:
- în stare proaspătă, lamă-lamelă (materii fecale, urină)
- după clarificare cu solutie de hidroxid de potasiu 30% sau cu solutie cloral-lactofenol
(scuame, unghii)
- după colorare (frotiu, preparate histologice).
Se pot observa:
- Levuri circulare sau rotunde, cu diametrul de 2-6 μm, înmugurite.
- Pseudofilamente (excepţie C. torulopsis, care nu filamentează).
Cultivare
- Cultivă sub formă de levuri pe mediul Sabouraud (cu antibiotice), formând colonii
albicioase, după 24-48 ore.
- Temperatura de cultivare este de 26ºC sau 37ºC după localizarea superficială sau
profundă a infecţiei.
Identificare
-se face pe baza caracterelor morfologice macro- si microscopice, biochimice si genetice.
Testul de filamentare este pozitiv pentru Candida albicans si Candida dubliniensis.
Antifungigrama permite stabilirea sensibilităţii la antifungice (Fluconazol, Itraconazol,
Amfotericina B, Nistatina, Flucitozina, Ketoconazol, Miconazol, Econazol).
Genul Cryptococcus
Cuprinde levuri capsulate al caror habitat natural este reprezentat de mediul ambiant.
A fost izolat din excrementele păsărilor domestice (în special porumbei) şi sălbatice, precum
şi din solul îngrăşat cu acestea. Contaminarea este predominant aerogena. Specia cea mai
importanta din punct de vedere a implicarii in aparitia infectiilor criptococice este C.
neoformans; celelalte specii sunt mai rar semnalate. C. neoformans interesează, în special,
persoanele imunodeficiente (HIV pozitive sau cu hemopatii maligne), la care produce cel mai
frecvent meningite.

5
Diagnosticul de laborator
Produse patologice: l.c.r., urină, spălătură bronho-alveolară, puroi, biopsie.
Examen microscopic: levuri; se evidentiaza capsula. Levuri sferice, înmugurite, cu diametrul
de 3-8μm, înconjurată de o capsulă groasă. Nu formează filamente sau pseudofilamente.
Cultivare: Cultivă pe mediul Sabouraud, incubat la 37ºC, în timp de 3-5 zile. Coloniile de C.
neoformans sunt foarte mucoase, de culoare bej.
Identificarea se face pe baza caracterelor morfologice macro- si microscopice, biochimice si
genetice. Cryptococcus spp. produc urează.
Antifungigrama permite stabilirea sensibilităţii la antifungice.
I.Caracterele generale ale fungilor hialini neseptati (Zygomicete de interes medical).
Fungii hialini neseptati (zygomicetele) se caracterizeaza:
 Macroscopic: prin aspectul lanos al coloniei, culoare alb-cenusie, crestere rapida,
invaziva;
 Microscopic: prin prezenta miceliului neseptat, format din hife hialine, cu diametru
neregulat.
Inmultirea:
 Asexuata:
- este asigurata de endospori produsi in interiorul unor structuri numite sporocisti (sporangi)
- sporocistii contin sporangiospori, care sunt eliberati in mediul ambiant prin dehiscenta
peretelui sporocistului
- filamentul micelian care sustine sporangele se numeste sporocistofor (sporangiofor),
- jonctiunea dintre cele doua elemente este cunoscuta sub denumirea de apofiza.
 Sexuata:
- se realizeaza prin:
 homotalism (intre structuri apartinand aceluiasi individ)
 heterotalism (intre structuri ale unor indivizi diferiti)
- se materializeaza prin formarea zigosporilor (spori sexuati).
Habitat: sol, materie organica in descompunere, fructe, boabe de cereale, resturi de alimente
Patogenie:
 Fungii familiei Mucorales:
- Absidia, Rhizopus, Mucor, Rhizomucor
- determina infectii pentru pacientii imunodeprimati
- infectii cutanate si viscerale profunde (forme rino-cerebrale, pulmonare, gastro-intestinale,
diseminate)
- prognostic nefavorabil pentru marea majoritate a pacientilor.

6
 Fungii familiei Entomophthorales
- Conidiobolus, Basidiobolus
- determina infectii la pacienti imunocompetenti
- infectii localizate in tesutul subcutanat
- prezinta un prognostic favorabil
Produse patologice:
- aspirat bronsic in infectii respiratorii
- raclaj sau biopsie in micoze cutanate (frecvent la nivelul fetei)
- LCR in zigomicoza rino-cerebrala
- frecvent de la persoane diabetice
Examenul microscopic direct:
- preparate microscopice de tipul frotiurilor colorate Gomori sau cu calcofluor
- se vizualizeaza filamente miceliene largi, pana la 25 μm grosime, cu diametru neregulat,
ramificate in unghi drept.
Cultivarea prelevatelor:
- pe medii uzuale, fara adaos de cicloheximida
- temperatura de incubare recomandata este de 37 0C.
Identificarea genurilor si a speciilor:
Caractere de cultura:
- colonii lanoase, cu crestere rapida, de culoare alb-cenusie
- la suprafata se observa sporocistii sub forma de granule gri-negre
Caractere morfologice:
- pot fi urmarite prin:
o preparat extemporaneu cu scotch in albastru-lactoferol
o dilacelarea miceliului cu ace in albastru-lactoferol
- se urmaresc detaliile morfologice pentru stabilirea genului

Genul Rizoizi Sporangiofor Sporocist Apofiza Sporangiospori


ramificat
Rhizopus ++ nu sferic + Angulari,
striati
Absidia + da piriform ++ Rotunzi-
ovoizi, netezi
Rhizomucor + da sferic _ Rotunzi-
ovoizi, netezi
Mucor _ da sferic - Rotunzi-
ovoizi, netezi

7
II.Fungi hialini septati (Aspergillus)
Generalitati:
Termenul de „hialin” se refera la lipsa pigmentului brun-negricios de la nivelul hifelor, in
vivo.

Habitat: sol, aer, plante.


Genuri:
 Aspergillus
 Penicillium
 Fusarium
 Acremonium
Examenul microscopic direct:
- se efectueaza pe prelevate in stare proaspata, cu sau fara colorare prealabila (calcofluor,
Giemsa):
o biopsii (frotiuri prin amprenta),
o sputa (dupa tratare cu N-acetil-cisteina),
o hemoculturi,
o prelevate superficiale- cutanate, sinusale, conjunctivale, unghiale, auriculare.
- elementele morfologice frecvent identificabile sunt fragmentele hifale, fine (3-12μm
diametru), regulate, septate, ramificate dicotomic in unghi ascutit (45 0).
Cultivarea prelevatelor:
- Mediu PDA (potato-dextrose-agar) sau agar cu malţ- medii elective pentru fungi filamentosi
- Mediu Agar Sabouraud cu cloramfenicol
- Mediu Agar Czapek- mediu selectiv pentru Aspergillus
Incubare:
- 370C pentru prelevate profunde
- 300C pentru prelevate superficiale
- Aspergillus fumigatus poate creste la 450C.
Caractere de cultura:
 Aspergillus fumigatus: colonie albastra-verzui inchis, uneori pigment rosu
 Aspergillus niger: suprafata coloniei neagra (datorita capetelor aspergilare), aspect granular
 Aspergillus flavus: colonie galben-verzuie, aspect granular
 Penicillium spp: colonii cu crestere rapida, pufoase, galbene, albe, verzi sau rosiatice in
functie de specie
 Fusarium spp: colonii lanoase, de culoare roz

8
 Acremonium spp: colonii catifelate, de culoare alb-galbui sau roz

Genul Aspergillus
- din punct de vedere morfo-structural, fungii acestui gen se caracterizeaza prin prezenta unor
formatiuni de fructificare cu aspect particular, cunoscute sub denumirea de capete aspergilare.
- la nivelul acestor structuri se formeaza sporii asexuati sau conidiile.
In functie de randul de celule conidiogene, capetele aspergilare pot fi:
- uniseriate (un singur rand de celule conidiogene –fialidele) sau
- biseriate (doua randuri de celule conidiogene-metule + fialide).
Speciile genului Aspergillus pot fi:
- uniseriate (prezinta doar capete aspergilare uniseriate),
- uni-biseriate (prezinta in aceeasi cultura atat capete aspergilare uniseriate, cat si biseriate) sau
- biseriate (prezinta doar capete aspergilare biseriate).
Diagnosticul de laborator
1.Recoltarea produselor patologice trebuie făcută cu precauţie pentru a limita contaminarea.
Produse patologice:
- aspirat bronsic: aspergiloza pulmonara invaziva, aspergiloza bronhopulmonara
alergica
- secretie din punctie sinusala
- LCR
- raclaj tegumentar
- sange in endocardita
Transportul probei se face imediat.
2.Examenul direct poate releva:
- filamente miceliene, septate, cu diametru de 2 – 4 μm, ramificate dihotomic (în
aspiratul bronşic, lavaj brohopulmonar, etc.)
- capul aspergilar (în otite, sinuzite)
3.Cultivare:
Aspergillus se dezvoltă pe mediu Czapek, mediu Sabouraud cu gentamicină sau
cloramfenicol. Apariţia rapidă, în 2 – 3 zile, de colonii caracteristice, permite diagnosticul de
gen.
4.Identificare:
Identificarea speciei se face pe baza caracterelor microscopice si de cultura.
5.Antifungigrama: permite stabilirea sensibilităţii la antifungice.

9
10