CONF. DR.

SECUREANU FLORIN ADRIAN

GENETICA UMANA

MANUAL DE LUCRARI PRACTICE

(METODE DE UZ CURENT IN DIAGNOSTICUL

GENETIC).

BUCURESTI
 2012 -

1
 PREFATA

Aceasta lucrare „Manual de lucrari practice” pentru studentii Facultatii de Medicina,

este o necesitate de a lega evolutia cunostintelor teoretice de genetica cu partea de laborator gentic.
Este o lucrare de a initia pe studenti asupra metodelor uzuale, necesare investigarii cazurilor clinice
cu boli ereditare, de a-i obisnui cu modul cum trebuiesc grupate si recomandate metodele de
investigare in bolile ereditare, asupra criteriilor de interpretare a rezultatelor si a recomndarilor
facute in cazul consultului si efortului genetic.
Aceasta lucrare are rol in formarea viitorilor medici, fiind o reforma instructiv-
formativa profund pedagogica.
Autorii acestui manual sunt cadre didactice care si-ai consacrat activitatea lor
cercetarii si investigarea genetica atat experimental, dar in mod deosebit in munca de investigare
chimica in scopul stabilirii etiologiei genetice a unor boli, considerate multa vreme cu etiologie
necunoscuta.
De retinut ca aceasta lucrare a fost realizata tinand cont de obiectivele pedagogice
definite pentru invatamantul de Genetica.
In invatamantul medicl, studentii desfasoara activitatea didactica de pregatire
profesionala de viitori medici in doua etape:
- ca prima etapa sunt prelegerile de curs unde sunt prezentate cunostintele teoretice
fundamentale de genetica umana cunostint e indispensabile pentru activitatea pe care o vor
desfasura dupa absolvirea Facultatii de Medicina, imbogatindu-si cunostintele stiintifice de genetica
medicala.
- a doua etapa conexata la prima etapa este legata de precizarea notiunilor si a datelor
necesare pentru practica medicala si investigarea genetica.
Speram ca acest manual reprezinta o lucrare de baza care ajuta in procesul de
invatamant de genetica medicala.

Autorii.

2
 Cuprins

I. STUDIUL MEIOZEI LA OM.

SEMNIFICATIA BIO-GENETICA SI MEDICALA.

1 - Definitie.
2 - Importanta meiozei.
2.1 - Seminicatia bio-genetica.
2.2 - Semnificatia medicala a meiozei.
3 - Metoda de analiza a cromozomilor in meioza.
3.1 - Metoda FORD.
3.2 - Metoda EVANS si SCOTT.
3.3 - Metoda amprentelor testiculare.
4 - Analiza meiozei. Fazele diviziunii meiotice.
4.1 - Prima diviziune. Diviziunea reductionala.
4.2 - Diviziunea secundara a meiozei.
5 - Comportamentul cromozomilor sexuali in spermatogeneza.
6 - Diferenta intre ovogeneza si spermatogeneza.
6.1 - Caracteristicile ovogenezei.
6.2 - Caracteristicile spermatogenezei.

II. STUDIUL CROMOZOMILOR UMANI.

METODA CITOGENETICA „CLASICA”.

1 - Definitia cariotipului.
2 - Metode citogenetice pentru evidentierea cromozomilor.
2.1 - Materialul necesar.
2.2 - Tehnica culturilor celulare.
2.2.1 - Microcultura.
2.3 - Evidentierea cromozomilor in celulele din maduva osoasa.
3 - Analiza cromozomilor si intocmirea cariotipului
3.1 - Criterii de identificare, numerotarea si clasificarea cromozomilor.
3.2 - Intocmirea si citirea cariotipului.

III. METODA BANDARII CROMOZOMILOR UMANI.

1 - Ce sunt benzile cromozomiale.

2 - Numerotarea si identificarea benzilor.
2.1 - Metoda culturilor celulare (macrocultura).
2.1.1 - Reguli generale.
2.2 - Metoda de lucru.
3 – Tehnici de bandare a cromozomilor umani
3.1 - Bandarea Q.
3.2 - Bandarea G.
3.3 - Bandarea C.
3.4 - Bandarea R.

3
 3.5 - Bandarea T.
4 - Semnificatia bio-medicala a bandarii cromozomilor umani.

IV. ANALIZA CROMOZOMILOR SEXIALI LA OM.

1 - Principiu.
2 - Corpusculul sexual „X”.
2.1 - Nomenclatura, forma, pozitie, dimensiune.
2.2 - Numar per / celula si frecventa.
2.3 - Metoda de lucru.
2.3.1 - Corpusculul Barr in mucoasa bucala.
2.3.2 - Apendicii perinucleari polimorfonucleari din neutrofilele
leucocitare.
3 - Corpusculul sexual „T”.
3.1 - Metoda fluorescenta de analiza.
3.2 - Analiza si interpretare.
4 - Importanta biologica si medicala.
4.1 - Valozare biologica.
4.2 - Valozarea medicala.

V. TRANSMITEREA CARACTERELOR MENDELIENE.

1 - Informatii asupra transmiterii caracterelor.

2 - Definitia notiunilor genetice.
3 - Modul de transmitere a caracterelor ereditare.
3.1 - Legile lui Mendel.
3.1.1 - Definitia si legile ereditatii autozomal dominanta.
3.1.2 - Definitia si legile ereditatii autozomal recesive.
3.1.2.1 - Dificultati si exceptii de la legile ereditatii recesive.
3.1.3 - Ereditatea codominanta sau intermediara.
3.1.4 - Ereditatea legata de sex.
3.1.4.1 - Ereditatea recesiva legata de X.
3.1.4.2 - Ereditatea dominanta legata de cromozmul X.
3.1.4.3 - Ereditatea dominanta legata de Y.
4 - Dihibridarea sau ereditatea bifactoriala.
4.1 – Retroincrucisarea.

VI. SISTEME GENETICE UMANE ERITROCITARE.

1 - Generalitati si definitia sistemului genetic.

1.1 - Componentele sistemului genetic.
1.2 - Tipuri de sisteme gentice.
1.3 - Importanta cunoasterii sistemelor genetice.
2 - Sisteme genetice eritrocitare.
2.1 - Sistemul genetic al hemoglobinelor umane.
2.2 - Genetica hemoglobinelor.

4
 2.1.1 - Mutante de hemoglobina. Importanta.
2.1.2 - Metoda de evidentiere selectiva a tipurilor de hemoglobina.
2.3 - Sistemul de grup sanguin ABO.
2.3.1 - Metoda de evientiere a grupelor ABO.
2.4 - Sistemul Rh.
2.4.1 - Determinarea sistemului Rh.
2.5 - Sistemul genetic MNSs.
2.5.1 - Descrierea sistemului.
2.5.2 - Genotipuri di fenotipuri.
2.5.3 - Tehnica de determinare a sistemului MN.
2.5.4 - Tehnica de determinare a sistemului Ss.
2.6 - Sistemul genetic Xg.
2.6.1 - Xg – sistem x-linket.
2.7 - Sistemul - 6-fosfat-dehidrogenaza.
2.7.1 - Sistem genetic x-linkat.
2.7.2 - Genotipuri, fenotipuri, variante.
2.7.3 - Tehnica de determinare a G6-pd.
2.8 - Fosfataza acida eritrocitara (PAE).
2.8.1 - Gene, genotipuri, fenotipuri.
2.8.2 - Tipuri de PAE in populatii. Corelatii cu unele boli.

VII. TRANSMITEREA UNOR SISTEME GENETICE PLASMATICE.

1 - Generalitati.
1.1 - Polialelia si izoenzimele.
2 - Sistemul genetic al haptoglobinic.
2.1 - Genetica sistemului haptogenetic.
2.2 - Genotipuri si fenotipuri.
2.3 - Evidentierea electroforetica a haptoglobinelor.
2.4 - Repartitia geografica a sistemului.
2.5 - Importanta studierii sistemului Hp.
3 - Sistemul genetic al transferinelor (Tf).
3.1 - Sinteza transferinelor si rolul lor.
3.2 - Genetica sistemului.
3.2.1 - Relatia genotip-fenotip.
3.2.2 - Electroforeza si autoradiografia, metode de analiza a Tf.
4 - Sistemul secretor ABH.
4.1 - Genetica sistemului ABH.
4.2 - Metoda de determinare a Tf.
5 - Sistemul gustator-negustator.
5.1 - Reactia farmacogenetica.
5.2 - Genetica sistemului.
5.3 - Evidentierea calitatii de gustator.
5.4 - Starea de gustator in populatii.
5.5 - Starea de gustator, marker genetic.
6 - Lactic dehidrogenaza.
6.1 - Genele sistemului.
6.2 - Izoenzimele LDH-ului.

5
 6.3 - Separarea electroforetica a izoenzimelor.
6.4 - Importanta medicala.
7 - Pseudocolinesteraza serica.
7.1 - Pseudocolinesteraza serica si estul de dibucaina.
7.2 - Genetica sistemului.

VIII. ANALIZA BIOMETRICA A EXTREMITATII CEFALICE.

1 - Tipul morfo-genetic constitutional.

2 - Instrumentarul pentru determinari cefalometrice.
3 - Cefalometria si viscerometria.
3.1 - Repere pentru masurarea viscero-craniului.
3.1.1 - Repere craniometrice.
3.2 - Diametre cefalice frecvent folosite.
3.3 - Calcularea indicilor cefalometrici.
3.4 - Clasificarea craniilor si fetelor.
3.4.1 - Stabilirea tipului de profil si simetria fetii.
3.4.2 - Analiza fetii din norma frontala.
3.4.3 - Analiza fetii din norma laterala.

IX. EREDITATEA CARACTERELOR MORFOLOGICE.

-DERMATOGLIFELE-

1 - Definitie.
2 - Morfogeneza si cronologia diferentierii dermatoglifelor.
2.1 - Factorii genetici si non-genetici si morfogeneza dermatoglifelor.
2.1.1 - Factorii genetici.
2.1.2 - Factorii non-genetici.
3 - Importanta bio-medicala si socio-antropologica a dermatoglifelor.
4 - Tehnici de analiza a dermatoglifelor.
4.1 - Examenul direct.
4.2 - Analiza amprentelor inregistrate.
4.2.1 - Metoda fotografica.
4.2.2 - Inregistrarea amprentei cu tus tipografic pe hartie.
5 - Dermatoglifele normale.
5.1 - Examenul calitativ al crestelor dermice.
5.1.1 - Regiunea digitala.
5.1.2 - Regiunea palmara propriu-zisa.
5.1.3 - Regiunea plantara.
5.2 - Pliurile de reflexie.
5.2.1 - Pliurile digitale.
5.2.2 - Pliurile palmare.
5.3 - Examenul cantitativ al dermatoglifelor
6 - Valoarea diagnostica a dermatoglifelor.
6.1 - Principalele anomalii dermatoglifice.
7 - Dermatoglifaze si dermatoplioze.

6
X. EXAMENUL CITOGENETIC IN SINDROAME CU MUTATII GENOMICE.

1 - Cand recomandam examenul citogenetic.

1.1 - Anomaliile cromozomiale constitutionale.
1.2 - Cercetarea anomaliilor cromozomiale dobandite post-natal.
2 - Cariotipul „patologic”, codificarea aneuploidiilor.
3 - Aneuploidii autozomale.
3.1 - Sindrom Down (trizomia 21).
3.2 - Sindrom Patau (trizomia 13).
3.3 - Sindromul Edwards (trizomia 18).
4 - Aneuploidii gonozomiale.
4.1 - Sindromul Klinefelter (47, Xxy).
4.2 - Sindromul Turner (45, X).
5 - Anomalii in structura cromozomilor.
5.1 - Remanieri produse la un singur cromozom.
5.2 - Remanieri produse intre cromozomii neomologi.

XI. METODA ARBORELUI GENEALOGIC.

(METODA PEDIGREE-ULUI).
1 - Generalitati.
2 - Datele genealogice (ancheta familiala).
2.1 - Investigarea cazului proband (cazul index).
2.1 - Investigarea membrilor directi si colateralii familiei.
3 - Inregistrarea genealogiei (arborele genealogic).
3.1 - Semnele conventionale.
3.2 - Model de intocmire a arborelui genealogic (pedigree-ul).
4 - Analiza genealogica si stabilirea tipului de transmitere a bolii.
4.1 - Tipul autozomal dominant.
4.2 - Tipul autozomal recesiv.
4.3 - Ereditatea legata de sex.
4.3.1 - Ereditatea recesiva legata de X.

XII. CONSULTATIA GENETICA.

1 - Consultul „cazului index”(proband).

7
 2 - Etapele consultului genetic.
2.1 - Consultul genetic propriu-zis.
2.1.1 - Examenul clinic al „cazului index”.
2.1.2 - Consultul membrilor familiei a „cazului index”.
3 - Examenul bio-morfo-genetice recomandate la consultul genetic.
3.1 - Analiza dermatoglifelor.
3.2 - Corpuscul X inactivat interfazic.
3.3 - Examenul citogenetic.
3.4 - Analiza markerilor tumorali, oncoproteine, sau a unor markeri specifici unei
malformatii congenitale genetica.
3.5 - Receomandarea amniocentezei.
4 - Concluzia consultului genetic.

XIII. SFATUL GENETIC.

1 - Circumstantele prospective.
1.1 - Circumstantele sfatului genetic.
1.1.1 - Sfatul genetic prenuptial.
1.1.2 - Sfatul genetic pregenezic.
1.1.3 - Sfatul genetic postnatal.
2 - Stabilirea riscului genetic de a transmite gena mutanta la descendent.
2.1 - Afectiunea autozomal dominanta.
2.2 - Afectiunea autozomal recesiva.
2.3 - Ereditatea determinata de cromozomii sexuali.
2.3.1 - Ereditatea recesiva legata de X.
2.3.2 - Ereditatea dominanta legata de X.
2.3.3 - Ereditatea legata de Y.
3 - Calcularea probabilitatii de transmitere a genei mutante.
4 - Studiul consangvinitatii si sfatul genetic.
5 - Importanta sfatului genetic.

- Bibliografia selectiva -

8
 I. STUDIUL MEIOZEI LA OM,
SEMNIFICATIA BIOGENETICA SI MEDICALA

1. Definitie.

Meioza este un tip particular de diviziune la organismele cu reproducere sexuata.

Este mecanismul de injumatatire a numarului de cromozomi rezultati, dupa
parcurgerea a doua diviziuni inseparabile a celulei diploide, la sfarsitul carora rezulta celulele
sexuale, gametii cu numar haploid de cromozomi.
In timpul meiozei, cromologii omologi se imperecheaza si se duplica o dingura data,
fiind distribuiti in cele patru celule rezultate la sfarsitul celor doua diviziuni ce succed, fiecare
continand numar injumatatit de cromozomi din garnitura initiala.
Numarul diploid de cromozomi (2n), (denumit si numar zigotic), existent in celula
initiala diploida spermatogonia sau ovogonia, se reduce la jumatate, numarul n, haploid sau
gametic.
Cele doua diviziuni ale meiozei sunt:
- diviziunea primara sau heterotipica, denumita si diviziunea reductionala
propriu-zisa;
- diviziunea secundara sau homeotipica, denumita si meioza ecuationala.
Meioza este un mecanism controlat genetic, are o ordonare „precisa” in spatiu si
timp. Variatiile rezultate din meioza, controlate si ele genetic, sunt consecinta amplitudinii
imperecherii cromatidelor, producerea, frecventa si localizarea cheasmelor, orientarea fusului la
cromozomii cuplati, de deplasarea si modul de derulare a citochinezei.

2. Importanta meiozei.
2.1 – Semnificatia bio-genetica.

Din punct de vedere biologic si genetic, semnificatia meiozei este de a reduce la

jumatate numarul diploid al cromozomilor „zigotici” (existent in celulele somatice). Prin acest
emcanism se asigura mentinerea numarului constant de cromozomi in succesiunea generatiilor
pentru fiecare specie cu repreoducere sexuata.

9
 Figura nr.1
Un cuplu de cromozomi omologi cu planurile de clivaj cromozomial si cromatidic

Ca mecanism biologic, meioza conduce la repartizarea echipotenta a materialului

genetic intre gametii haploizi rezultati, care gameti, prin fecundare (ovul-spermie) vor da nastere la
randul lor unui zigot diploid din care se va dezvolta un nou organism. Este mecanismul biologic
genetic care asigura continuitatea, in spatiu si timp, organismelor cu reproducere sexuata.
Dar meioza are importanta deosebita ca rol in evolutia si deversificarea indivizilor, in
evolutia speciilor. Acest rol este posibil deoarece in meioza se realizeza recombinarea
intercromozomica si intracromozomica a cromozomilor de origine paterna (adusid e spermie) si
materna (adusi de ovul). Prin aceste recombinari se asigura o mare variatie genotipica a gametilor si
o mare diversitate fenotipica la organismele rezultate din gametii recombinati.

Prin recombinarea realizata in meioza se realizeaza marea diversitate a genotipurilor

indivizilor intraspecifici sau conspecifici. Marea diversitate a fenotipurilor este rezultatul segregarii
a diferitelor alele, recombinare aleatorie a genelor cu locusuri pe diversi cromozomi, dar si o
recombinare a genelor cu locusuri pe cuplul de cromozomi omologi. Din aceste recombinari
genetice se formeaza, noi constelatii genice diferentiind in prima etapa, diferente genice intre
cromozomii omologi.

10
 2.2 – Semnificatia medicala a meiozei.

In general studiul meiozei prezinta interes pentru dezvoltarea normala a

organismului, dar explica si deficientele de crestere si diferentierea embrio-fetala a viitorului
organism, daca apar dereglari ale cromozomilor sexuali, cu modificarea numarului sau structurii
cromozomilor sexuali.
Din punct de vedere medical, prin mutatia cromozomilor produsa in dinamica
diviziunii meiotice, poate explica etiologia unor sindroame genetice intalnite in patologia medicala
umana (fig.2, 3, 4, 5).
Sunt sindroame determinate de modificarea numarului de cromozomi sau a structurii
acestora.
Deasemenea meioza explica daca recombinarea cromozomilor si remanierile
cromozomilor s-au realizat normal sau cu modificari (non-disjunctii, non-conjunctii, cromozomi
remanenti).

3 – Metode de analiza a cromozomilor in meioza.

Sunt elaborate multe metode citologice care permit analiza corecta a cromozomilor
in meioza, analiza numarului sau a comportamentului cromozomilor in meioza.
Frecvent folosite sunt metodele elaborate de FORD si EVENS-SCOTT.

SCANARE FIGURILE 2,3,4,5 PAGINILE 14, 15

Figura nr.2
Gametogeneza normala la om.

Figura nr.3
Non-disjunctia simpla in prima diviziune a meiozei (diviziunea reductionala).

Figura nr.4
Non-disjunctie simpla in diviziunea secundara a meiozei (diviziunea ecuationala).

Figura nr.5
Non-disjunctie dubla in gametogeneza.

11
 3.1 – Metoda FORD.

a) Materiale necesare.
- Solutie hipotona de citrat de Na (1,1%) si solutie de NaCl (0,45%);
- Alcool etilic;
- acid adetic glacial;
- solutie de acid clorhidric (Hcl) – 1N;
- Reactiv Schiff.
b) Metoda de lucru.
Se recolteaza, prin biopsie testiculara (daca dorim sa analizam spermatogeneza –
fig.6 si 7) 1 cmc produs biologic (proaspat recoltat). Dupa recoltarea tesutului, aceasta se introduce
intr-o solutie de NaCl (0,45%) sau in solutie citrat de Na (1,1%).
Cu ajutorul unor ace histologice se delacereaza tubii seminifieri. Se lasa la
temperatura camerei timp de 30 minute in solutiile mentionate.
Urmeaza indepartarea supernatantului, retinand in eprubeta numi sedimentul cu
produsul biologic. Peste acest desiment se adauga un amestec de alcool etilic – acid acetic glacial
(solutia se prepara extemporaneu, folosind urmatoarele raporturi: 3 parti alcool etilic glacial); deci
un raport de 3:1. Aceasta solutie (amestec) fixeaza celulele care au fost eliberate din tubii seminiferi
prin delacerare. Timpul necesar pentru fixare este de 1 ora.
Dupa fixarea celulelor, celulele sunt hidratate, folosind pentru aceasta solutie
alcoolica (alcool etilic) de 30%. Hidratarea dureaza 3-5 minute.
Urmeaza centrifugarea lenta si indepartarea supernatantului alcoolic. Se repeta
aceasta operatiune (de hidratare a celulelor) dar acum se foloseste apa bidistilata, mentinand
celulele in acest mediu 3-5 minute.
Dupa efectuarea acestor operatiuni treceau celulele din sediment intr-o solutie de Hcl
1N la temperatura de 60ºC unde sunt tinute timp de 8 minute, provocand hidrolizarea. Hidroliza este
intrerupta (oprita) prin introducerea eprubetelor cu amestec (celule + Hcl 1N) intr-un vas cu apa si
gheata.
Urmeaza centrifugarea la turatie mica, se decanteaza o parte din supernatant.
Sedimentul biologic din supernatantul retinut, emulsionat usor, este folosit la obtinerea de frotiuri,
celulele vor fi colorate cu reactiv Schiff (este fucsina bazica decolorata cu metabisulfit de sodiu).
Colorarea dureaza 1 ora. Se indeparteaza colorantul, iar frotiurile se spala cu apa sulfuroasa si acid
acetic (45%) rece. Fiecare spalare dureaza 3-5 minute.
Se usuca frotiurile la temperatura camerei, dupa care sunt examinate la microscop.
Prin metoda FORD se evidentiaza, clar, spermatocitele de ordinul I (primare) in
stadiul de diachineza si metafaza.

12
 3.2 – Metoda EVANS si SCOTT.

a) Materialul necesar.
- Solutie citrat de sodiu 2,2%;
- Solutie citrat de sodiu 1%;
- alcool etilic;
- acid acetic glacial;
- Colorant Giemsa.
b) Tehnica de lucru.
Prelevam testiculul intr-o solutie izotona de citrat de sodiu (2,2%) la temperatura
camerei. Incizam tunica pentru a elibera masa de tubi seminiferi (in figura 6 puteti observa o
sectiune prin tubii seminiferi ).

SCANARE FIGURA 6 PAGINA 18

Figura nr.6
Sectiuni prin tubii seminiferi.

Dupa aceasta operatiune, se introduc tubii seminiferi intr-un recipient care contine
solutie izotona de citrat de Na (2,2%). Aici, cu ajutorul unor ace foarte fine, se incearca desfacerea
lumenului tubilor in scopul eliberarii celulelor seminale.
Dupa aceasta etapa, filtram prin tifon continutul din recipient. Se obtine filtratul cu
celulele seminale. Acest filtrat se supune centrifugarii moderate (la 500g/min) timp de 5 minute.
Indepartam apoi supernatantul si recuperam sedimentul cu celulele seminale intr-o solutie de citrat
de Na (1%), unde sunt tinute 12 minute.
Urmeaza centrifugarea moderata, indepartam supernatantul, iar peste sediment
adaugam solutie amestec alcool etilic – acid acetic glacial (3:1), pentru fixare. Timpul de fizare a
celulelor este de 5 minute.
Se centrifugheaza moderat, indepartam 80% din volumul solutiei supernatant.
Continutul retinut in eprubeta se omogenizeaza prin agitare usoara, iar din acest
amestec se obtin frotiuri pe lame de sticla.
Dupa uscarea frotiurilor, lamele cu frotiul celular se flambeaza foarte usor si rapid la
flacara pentru aderarea celulelor pe lama.
Urmeaza colorarea cu Solutie Giemsa.

13
 Prin acest procedeu de lucru putem observa la microscop celulele ce se gasesc in
diverse stadii si faze ale meiozei (fig.7).

SCANARE FIGURA 7 PAGINA 20

Figura nr.7
Schema structurii unui tub seminifer (dupa Carlson – 1988).

Metoda Evens si Scott se recomanda mai putin pentru analiza stadiilor pahinem si
diplonem, deoarece nu asigura o dispersare clara a bivalentilor.
Preparatele se examineaza la microscopul optic cu imersie (90x).

3.3 – Metoda amprentelor testiculare.

(Procedeul SCUASH).

Animalul de sex masculin la care vrem sa analizam spermatogeneza, este supus

colchicinizarii ( i se injecteaza o solutie colchicina 0,2%). Dupa aceea i se recolteaza testiculele, la
care se indeparteaza albugineea.
Cu ajutorul unei pense se iau sectiuni din testicul (fragmente de cca 2 mmc) care se
suspenda intr-o solutie azotona (mediu 859, solutie Hanks) la temperatura de 3ºC pentru 10 minute.
Operatiunea se repeta de 2-3 ori.
Dupa aceasta fixare, fragmentele testiculae se strivesc pe lame de sticla, urmand a fi
colorate. Celulele obtinute le gasim in profaza si telofaza meiotica.
Pentru a obtine metafazele I si II la masculul analizat se recomanda introducerea unui
bloc de tesut testicular, proaspat recoltat, in solutie izotona de citrat de Na, dupa care se preleveaza
tubii seminiferi de circa 2 cm cu ajutorul unei pense. Tubii prelevati se fixeaza pe o lama de sticla,
se acopea cu apa bidistilata timp de 30 minute.
Se fixeaza apoi timp de 15 minute cu 0,5 ml acid acetic 50%. In acest timp tesutul
testicular se fragmenteaza marunt cu ajutorul unei pense. Se strivesc tubii seminiferi sub lamela, se
usuca la aer. Se introduc lamele cu tubii seminiferi striviti in metanol pentru a extrage substantele
grase din tesutul gonadal.
Se usuca din nou lamele, se spala cu apa de robinet, preparatele se supun apoi
hidrolizei cu HCl 1 N la 60ºC timp de 15 minute.
Colorarea se face prin metoda Fenlgen timp de 3 re, sau cu Giemsa timp de 5-10
minute. In cazul folosirii fuxinei bazice (0,25%), timpul de colorare este de 1 minut. Se usuca
lamele iar preparatele se examineaza la microscop cu imersie.

14
 4 – Analiza meiozei. Fazele diviziunii meiotice.

Diviziunea meiotica porneste dintr-un stadiu de „ repaus” celular relativ, denumit

interfaza. In stadiul G2 a interfazei premeiotice (preleptonemul) materialul nuclear cromatic este
distribuit neomogen in nucleu. Se observa formatiuni cu aspect „corpuscular”, hipercromatice, a
caror numar ajunge la 15.
Tot in interfaza apar filamentele euromatice care sunt foarte fine, subtiri,
despiralizate, slab colorate.
Din punct de vedere citologic, meioza este trecerea celulelor germinale nediferentiate
initial, prin doua diviziuni succesive. Celula initiala de la care incepe meioza are numar diploid de
cromozomi (2n). La sfarsitul celei de a doua diviziuni meiotice rezulta patru celule cu numar
haploid de cromozomi (n), care pot fi sau nu gameti (fig.8).

SCANARE FIGURA 8 PAGINA 23

Figura nr.8 – Meioza in microradiografii.
a – Cromatina incepe a se condensa in interfaza (leptonem).
b – Incepe procesul de sinaps intre cromozomii omologi (zigonem).
c – Aspectul cheasmatic (cheasme intre omologi)(zigonemul tardin).
d – Coninua condensarea cromozomilor bivalenti (pahiten).
e – Metafaza I – bivalentii se dispun in placa ecuatoriala.
f – Anafaza I – bivalentii se separa. Din cuplul bivalent, fiecare fiecare cromozom este
dicromatidic. Dupa separare fiecare cromozom va migra pe unul din polii celulei in diviziune.
g – Telofaza I – formarea a doua celule haploide cu cromozomi dicromatidici.
h – Profaza II.
i – Metafaza II.
j – Anafaza II – Separarea cromatidelor si repartitia lor spre polii celulei.
k – Telofaza II.
l – Sfarsitul meiozei cu producerea a 4 celule haploide.

4.1 – Prima diviziune meiotica .

Este diviziunea reductionala sau heterotipica.

Prima diviziune meiotica este denumita diviziunea reductionala in cursul careia

numarul cromozomilor la sfarsitul telofazei primare se reduce de la 2n (numar diploid) la doua
celule cu numar n de cromozomi (numar haploid). Numarul cromozomilor este redus la jumatate

15
fata de celula de la care incepe meioza.
Datorita dinamicii si comportamentului cromozomilor (in special profaza meiotica)
diviziunea reductionala este denumita si diviziunea heterotipica.
Diviziunea primara a meiozei incepe de la citele primare (ovocite sau spermatocite
primare), celule rezultate din etapa de multiplicare mitotica a ovogoniilor sau spermatogoniilor
(celule nediferentiate, sunt celulele germinale primordiale).
Diviziunea primara reductionala comporta patru faze: profaza, metafaza, anafaza si
telofaza.
Procesul de desfasurare a celor patru faze este continuu, iar „frontierele” intre ele
sunt arbitrare.

4.1.1 – Profaza primara.

Profaza primara este cea mai lunga ca desfasurare in timp. Are o derulare continua si
pregateste mecanismul de reductie a numarului de cromozomi.
Datorita dinamicii si comportamentului cromozomilor, in functie de aspectul
morfologic parcurs de cromozomii nucleari, profaza primara este compartimentata in cinci stadii
distincte (fig.9): leptonem, zigonem, pahinem, diplonem si diachineza .

SCANARE FIGURA 9 PAGINA 24

Figura nr.9
Fazele meiozei. Meioza reductionala si meioza ecuationala.

Leptonem (leptos = subtire; nema = filament).

Stadiul de leptonem este marcat de cresterea in volum a nucleului. Incepe
individualizarea cromozomilor din masa cromatinei nucleare, care au aspect filamentos (filamente
cromozomale foarte fine si subtiri), necondensati. In leptonem, cromozomii cu ingrosari cu aspect
corpuscular, dispuse discontinuu pe axul longitudinal, ingrosari pe care unii geneticieni le denumesc
cromaniere. Volumulsi dimensiunea cromomerelor, precum si pozitia lor sunt particulare pentru
fiecare pereche de cromozomi omologi.
In leptonem cele doua cromatide ale fiecarui cromozom nu apar delimitate de un plan
ecuational in axul longitudinal al cromozomilor (fig.8 si 9).
In figura nr.8 este prezentata microfotografia unei meioze, iar in figura nr.9 sunt
prezentate fazele meiozei cu cele doua diviziuni: reductionala si ecuationala.
Zigonem (zyos = unire; nema = filament). Zigonemul este marcat prin imperecherea
(cuplarea) cromozomilor omologi. Imperecherea cromozomilor omologi incepe din puncte
„precise”, denumite puncte de contact sau zigomere. Punctee de contact sunt distribuite pe axul
longitudinal al cromozomilor. Cuplarea cromozomilor omologi incepe de la extremitatile polarizate,

16
respectiv de la telomere si inainteaza spre centromer.
Punctele de fixare reprezinta complexul sinaptonemal (sinapse, deoarece cuplarea se
realizeaza prin contiguitate intre cei doi cromozomi omologi).
Prin cuplarea sinaptonemala a cromozomilor omologi, se formeaza cupluri denumite
„bivalenti”. Prin formarea cuplurilor bivalente in nucleu, putem identifica, aparent, un numar „n” de
bivalenti. Un aspect fals haploid.
Pahinem (pachis = gros; nema = filament). In pahinem are loc o crestere progresiva a
volumului nuclear, cu maximum de crestere la sfarsitul acestui stadiu. In pahinem toti cromozomii
autozomi sunt complet imperecheati, prezentand sinaptoane (zigomere) pe toata lungimea fiecarui
cuplu omolog.
In pahinem cromozomii cuplati sunt mai scurti datorita contracturii longitudinale, iar
prin spiralizaremaxima devin mai grosi.
O remarca: in spermatogeneza avem doi cromozomi neomologi: sunt cromozomii
sexuali X si Y. Datorita neomologiei cromatidice, incepand din zigonemul tardiv si definit in
pahinemul primar, cei doi cromozomi nu se vor cupla prin procesul sinaptonemal. Ei se vor dispune
in tandem la nivelul bratelor „p” sau „q” formand „corpusculul sexual X-Y”. Acest corpuscul sexual
denumit si vezicula sexuala sau „unitcrom” este bine conturat cu aspect corpuscular intens si
uniform heterocromatic. Este formatiunea nucleara de a deosebi spermatogeneza de ovogeneza (in
ovogeneza, datorita omologiei intre cei doi cromozomi sexuali X, nu se formeaza vezicula sexuala,
ei comportandu-se in profaza asemanator unui cuplu de cromozomi autozomi / somatici).
In pahinem pot deveni observabile microscopic cele doua planuri de separare a
cromatidelor fiecarui cromozom, dar si tendinta de separare a cromozomilor omologi cuplati in
zigonem.
Prin clivajul ecuational (este planul longitudinal al fiecarui cromozom din cuplu)
devin distincte si observabile patru crmatide (cate doua pentru fiecare cromozom din cuplu). Este
momentul cand se formeaza „ tehada” cromatidica.
In acelasi timp incep a se desface chiasmele prin care sunt cuplati cromozomii
omologi. Acesta separare este o delimitare in axul longitudinal al planului de cuplare a omologilor.
Acest plan de separare este planul de „clivaj reductional”.
Cand cromozomii dicromatidici se separa in plan reductional se pot produce fisuri
transversale intre cromatidele cromozomilor omologi. Prin aceste fisuri are loc schimb de segmente
cromatidice care vor fuziona cu segmentele nefisurate. Este procesul numit „crossing over”
(Crossing-over-ul este schimbul reciproc de segmente cromatidice intre cromozomii omologi).
Citologic echivalentii vizibili ai acestui proces sunt recombinarile
intracromozomiale, detectabile la sfarsitul pahinemului si inceputul diplonemului.
De mentionat ca intre cromozomii omologi alipiti (contiguitate) se interpun, in
timpul pahinemului si diplonem, elemente fibrilare care formeaza complexul sinaptonemal.
Complexul are ca structura un element central cu un diametru de 1000 Å, flancat de doua elemente
laterale a caror fata externa este acolata la substanta fiecarui cromozom omolog. Aceste componente
sunt de natura proteica (fig. din teza pg 94).
Diplonem (diplos = dublu; nema = filament). Diplonemul este stadiul cel mai
important pentru rolul indeplinit in meioza pe plan genetic.
In diplonem sunt vizibile locul unde sunt prezente chiasmele. Prin fisurarea

17
chiasmelor se realizeaza procesul meiotic „crossing-over”. Punctele unde apar chiasme si se produc
fisuri cu schimb reciproc de segmente cromatidice sunt denumite „chiasmatas” ( fig.de la pag
106 din teza).
Teoria chiasmatipiei postuleaza ca, chiasmele sunt rezultatul crossing-over-ului cu
efect de recombinare intracromozomica. Numarul chiasmelor este variabil in raport cu dimensiunea
fiecarui cuplu de cromozomi omologi.
Diachineza (dia = devergent; kinesis = miscare). La sfarsitul diplonemului cuplurile
de cromozomi omologi raman cuplati la nivelul chiasmelor telomerice. Este starea de terminalizare
a chiasmelor care se accentueaza in diachineza. In acelasi timp cuplurile de omologi uniti prin
chiasme telomerice contracta foarte mult prin hiperspiralizarea cromatidelor. Prin aceste procese
cromozomii devin foarte scurti.

SCANARE FIGURILE PAGINILE 28,29,30

4.1.1 – Metafaza primara.

Prin dispozitia anvelopei nucleare, se formeaza fusul de diviziune. Cromozomii

dicromatidici, cuplati inca prin chiasmele telomerice se dispun la nivelul zonei mediane a fusului de
diviziune (fusuri acromatice) unde cei doi omologi isi orienteaza cei doi centromeri simetric in
raport cu planul ecuatorial, formand placa metafazica.
Distanta celor doi centromeri fata de planul ecuatorial al celulei in diviziune
meiotica, pentru fecare cuplu de omologi depinde de pozitia chiasmelor terminale (telomerice) in
raport si de centromer.
Distanta este mica si apropiata de planul ecuatorial cand chiasmele sunt apropiate de
centromer. Cu cat chiasmele sunt mai indepartate de centromer si distanta de separare a celor doi
cromozomi cuplati va fi mai mare. Deci distanta celor doi cromozomi cuplati prin chiasme este
direct proportionala cu distanta chiasmelor fata de centromeri.
Daca la un bivalent sunt mai multe chiasme in raport cu centromerul fiecarui omolog
cuplat, atunci bucla care ii cupleaza se poate dispune perpendicular pe planul ecuatorial ale celulei
meiotice. In metafaza primara, cromozomii ating un grad maxim de condensare, determinata de o
itnensa spiralizare a cromatidelor fiecarui omolog.

4.1.3 – Anafaza primara.

Dupa desfacerea ultimelor chiasme in plan reductional, cromozomii omologi

dicromatidici se separa intre ei. Din numarul de 46 cromozomi (numar diploid), 23 cromozomi
dicromatidici se deplaseaza spre un pol al celulei, 23 la polul opus (seturi haploide orientate spre
polii celulei).
Prin separarea cromozomilor la jumatate, se realizeza reductia numarului de
cromozomi la jumtate in prima diviziune meiotica.
Prin separarea cromozomilor omologi de origine materna (23) si paterna (23) in

18
anafaza primara se asigura regruparea lor in seturi haploide. Dar in aceasta faza meiotica are loc
asortarea aleatorie (independenta) a cromozomilor omologi. Prin asortarea aleatorie a omologilor se
realizeaza recombinarea intercromozomica. Recombinarea intercromozomica este o forma
importanta prin care se realizeaza varibilitatea umana. De exemplu posibilitatile de asortare a celor
23
23 perechi de omologi sunt de 2 , ceea ce reprezinta ca in meioza sunt 8388608 variante de
1
23
recombinare a gametilor, iar un gamet este este expresia de 2 .
1 1
23 23
Prin combinatia gametilor 2 × 2 celor doi genitori rezulta zigotul care este 46 ×
1
12 46
10 , iar un zigot este expresia de 2 , este coeficientul de recombinare intercromozomica de cca
72 bilioane de ori.
In anafaza primara reductionala, fiecare cromozom se prezinta dicromatidic, cele
doua cromatide ramanand unite prin centromer.

4.1.4 – Telofaza primara.

Cromozomii dupa ce ajung la polii celulei in diviziune, incep a se despiraliza, incepe

formarea anvelopei nucleare, se refac nucleii in cele doua celule fiice. Are loc plasmodiereza,
rezulta doua celule, fiecare cu numar haploid de cromozomi.
Celulele rezultate din diviziunea reductionala, sunt denumite ovocite sau
spermatocite secundare, de ordinul doi, cu numar haploid de cromozomi.

4.2 – Diviziunea secundara a meiozei.

Diviziunea secundara a meiozei, sau ecuationala, se separa de prima diviziune printr-

un interval interfazic. Uneori interfaza poate lipsi, sau este foarte scurta. Lipsa interfazei este
determinata de starea cromozomilor dicromatici. Deci nu mai necesita interfaza cand, de regula are
loc replicarea semiconservativa a ADN, pentru realizarea celor doua cromatide surori unite prin
centromer, caci fiecare cromozom, din setul haploid, este dicromatidic.

4.2.1 – Metafaza secundara.

Cele doua celule haploide cu crmozomii dicromatidici, dupa disparitia anvelopei

nucleare si formarea fusului de diviziune acromatic, cromozomii se dispun in zona mediana a
celulelor, formand placa ecuatoriala.
In metafaza secundara, cele doua cromatide ale fiecarui cromozom se vor separa la
nevelul centromerului in planul de clivaj ecuational, in axul longitudinal al cromozomilor.

19
 Prin separare cromatidele devin cromozomi monocromatidici.

4.2.2 – Anafaza si telofaza secundara.

Dupa separare, cromatidele (cromozomi monocromatidici) in anafaza incep a migra

spre cei doi poli ai fiecarei celule finalizand la sfarsitul telofazei vor rezulta patru celule haploide cu
cromozomi monocromatidici.
Este setul cromozomial si cantitatea (n) de ADN existenta in fiecare gamet care
rezulta.

5 – Comportamentul cromozomilor
sexuali in spermatogeneza.

Datorita neomologiei constitutionale si neomologiei lor, cromozomii sexuali au un

comportament deosebit in profaza primara fata de cuplurile de cromozomi autozomi omologi.
Cromozomii X si Y nu se vor alipi prin sinapse de contiguitate si nu se vor realiza
chiasme si nici crossing-over.
Aceste diferente sunt observabile in interfaza, dar in mod cu totul deosebit in profaza
primara a diviziunii reductionale.

SCANARE FIGURA PAGINA 36

Cariograma haploida a cromozomilor in metafaza primara.

In interfaza si profaza primara, cromozomii sexuali X si Y se dispun in tandem (cap

la cap), sunt densificati, heterocromatici. Acest tandem se distinge de cuplurile cromozomilor
autozomi alipiti prin sinapse, pe axul longitudinal al cromozomilor, prin dimensiune si forma
corpusculara. Este cunoscuta sub denumirea de vezicula sexuala.
In leptonemul crecoce, cromozomii X si Y sunt decondensati, nu observam nicio
structura heterocromatica.
In leptonemul mediu, toti cromozomii (sutozomi si sexuali) se despiralizeaza, nu se
mai deosebesc morfologic.
In cariolimfa identificam numai aspectul de filamente eucromatice foarte fine ale
cromozomilor.
In leptonemul tardiv reapare complexul heterocromatic Xy, cromozomii sexuali
prezentand regiuni foarte dense alternand cu altele palide.

20
 In zigonem incepe spiralizarea cu formarea veziculei sexuale care poate fi vizualizata
sub forma unei structuri globuloase, intens si uniform colorata, heterocromatica.
In polinem vezicula sexuata persista.
In diplonem tandemul X si Y nu prezinta modificari semnificative, in schimb in
diachineza si in mod deosebit in metafaza primara cromozomii X si Y se separa si sunt
individualizati.

6 – Diferente intre ovogeneza si spermatogeneza.

Atat in gametogeneza la sexul masculin cat si la cel feminin, celulele initiale sunt:
spermatogoniile si respectiv ovogoniile. Sunt celule nediferentiate, de tip embrionar.
Atat spermatogoniile cat si ovogoniile parcurg initial o faza de multiplicari mitotice (
o serie de 7-8 mitoze) rezultand spermatocitele si ovocitele de ordinul I, celule diploide.

6.1 – Caracteristicile ovogenezei.

Faza de multiplicare pana la stadiul de ovocit primar se deruleaza in perioada fetala a

vietii intrauterine. Ovocitele sunt prezente in ovarul impuber de fetite sub forma unor foliculi
ovarieni.
Dupa nastere stocul de ovocite primare se mentine pana la pubertate. Incepand cu
pubertatea, ciclic, la intervale de aproximativ 28 de zile este expulzat, cate un folicul, proces care
urmeaza pana la menopauza.
O alta caracteristica este urmatoarea:
La sfarsitul primei diviziuni, reductionala, rezulta doua celule cu numar haploid de
cromozomi. Fiecare celula continand 23X cromozomi dicromatidici. Daca genotipurile sunt
asemanatoare intre cele doua celule, ele sunt diferentiate prin volum. O celula este incarcata de
vitelus nutritiv, are volumul mare, este ovocitul secundar. Cea de-a doua celula cu nucleul tot
haploid, dar lipsita de masa citoplasmatica. Este primul globul polar.
Tot caracteristica este si rezultatul celei de-a doua diviziuni ale meiozei, diviziunea
ecuationala. Rezultatul acestei diviziuni: trei globuli polari si celula care contine intreg vitelusul cu
rol nutritiv este ovula haploida cu cromozomi monocromatidici.
Spre deosebire de spermatogeneza, cea de-a doua diviziune in ovogeneza se
deruleaza in treimea superioara a trompei Faloppio, unde are loc si fecundatia de catre spermie.
Globulii degenereaza.

21
 6.2 – Caracteristicile spermatogenezei

Spermatogeneza incepe la pubertatea persoanei de sex masculin.

Faza de multiplicare incepe, de fiecare data de la spermatogonie. Toate etapele
spermatogenezei se desfasoara in tubii seminiferi ai testiculului.
Procesele care incep de la stadiul de spermatogonie si pana la stadiul de spermie
matura, apta de fertilizare dureaza 74 zile : 8 zile spermatogoniile A, 9 zile spermatogoniile B, 28
zile spermatocitele primare, 1 zi spermatocitele secundare, 23 zile spermiogeneza, la sfarsit rezulta
spermia.
Spermatogeneza este functionala din perioada pubertatii pana la andropauza.
Diviziunea primara, reductionala, incepe de la spermatocitul primar diploid, iar la
sfarsitul primei diviziuni rezulta doua spermatocite de gradul doi (secundare) care au aproximativ
acelasi volum, dar diferite prin continutul genomului: un spermatocit haploid, contine cromozomul
sexual X (23,X), al doilea cromozomul sexual Y (23, Y).
La sfarsitul diviziunii secundare se obtin patru spermatide, celule germinale imature,
nonfertilizante.
Pentru a deveni celule fertilizante, spermii, spermatidele intra in procesul de
spermiogeneza.
Repetam toate etapele spermatogenezei, au loc in tubii seminiferi, iar spermiile le
gasim in lumenul tubilor.
Spermatogonia este localizata la periferia tubilor seminiferi si etapizat, procesele
stadiolizate pornesc de la periferia tubului seminifer spre lumen.

Lucrare practica – Aplicatii.

- Identificarea diverselor stadii si faze ale meiozei pe frotiuri de testicul de sobolan

colorate cu May-Grünwald-Giemsa.
- Se va examina sectiune pe testicul uman.

22
 II. STUDIUL CROMOZOMILOR UMANI.
- METODA CITOGENETICA CLASICA -

1. Definitia cariotipului.

Prin cariotip intelegem aranjarea cromozomilor intr-o celula mitotica sau meiotica,
respectand gradientul de marime, forma, pozitia centromerului sau alt caracter reprezentativ pentru
complementul unei varietati celulare, individ sau specie (HUGHES).

Analiza cromozomilor si intocmirea cariotipului este o metoda citogenetica de mare

valoare biologica si practica medicala, deoarece permite sa stabilim: numarul si caracteristicile
morfologice ale cromozomilor la subiectul normal al speciei, sau sa stabilim eventualele modificari
de numar si structura cromozomiala in diferite sindroame clinice cu etiologie genetica sau
presupusa genetica.

Pentru analiza cromozomilor si intocmirea cariotipului celular este necesara

stimularea diviziunii celulelor prin metoda culturilor celulare in vitro.

2. Metode citogenetice pentru evidentierea cromozomilor.

Metodele citogenetice sunt folosite pentru studiul „in vivo” sau „in vitro” a efectelor
factorilor mutageni asupra cromozomilor umani, sau ca modalitate de investigatie paraclinica in
diagnosticul diferitelor sindroame genetice.

2.1. Materialul necesar.

Evidentierea cromozomilor se face in orice tip de celula capabila sa se divida, sau a

carei diviziune poate fi declansata de un stimulent mitotic.

Ca tipuri de celula notam:

- Fibroblastii din piele servesc pentru culturi de lunga durata. In acest scop biopsiile cutanate
furnizeaza din abundenta, celule necesare analizelor „in vitro”. Datorita sincronizarii cresterii si
diviziunii celulare, aceste culturi sunt folosite pentru studiul „in vitro” a efectelor agentilor
mutageni asupra cromozomilor din genomul celulelor umane.

- Celule epiteliale din lichidul amniotic provenite de pe suprafata embrionului sau fatului.
Recoltate prin amniocenteza, sunt solosite in diagnosticul prenatal a aberatiilor cromozomice.

- Maduva osoasa serveste pentru studiul aberatiilor cromozomice din celulele care, „in vitro”
sunt capabile de diviziune permanenta. Evidentierea si analiza cromozomilor din aceste celule se
face prin metoda directa, fara o prealabila cultura celulara.

23
 - Limfocitele din sangele periferic sunt folosite, -preferential, pentru studiul „in vivo” si „in
vitro” a efectelor agentilor mutageni asupra cromozomilor umani. Acest sistem celular ofera unele
avantaje:
6
- putem obtine usor un numar mare de celule (1 ml sange contine intre 1-3 × 10
limfocite), iar prelevarea este nedureroasa si se poate repeta fara dificultate;

- limfocitele sanguine sunt repartizate in intregul organism si circula in toate

tesuturile;

- in sangele periferic toate limfocitele se gasesc in acelasi stadiu a interfazei G 1 sau

G0 si care in mod normal nu se mai divid;

- in cultura putem sa stimulam transformarea blastica a limfocitelor, obtinand rapid

un numar mare de celule in mitoza.

Figura nr.1

Dezvoltarea celulelor sanguine in cultura.

(G1 = perioada intitiala a cresterii; S = perioada de sinteza a ADN;

G2 = faza premitotica).

24
 Acest sistem celular prezinta si cateva inconveniente:

- cu toate ca in sangele periferic aproape toate celulele sunt in stadiul G 1 sau G0 se

gasesc si populatii celulare a caror ciclu este, probabil, diferit;

- este necesar sa observam aberatiile cromozomice in prima diviziune ce urmeaza

acriunii agentului mutagen, pentru care cronologia diviziunii este importanta. Dar aceasta
cronologie are variatii individuale si depinde de conditiile de cultura;

- sangele periferic contine o mica parte din totalul populatiei limfocitare din
organism;

- limfocitele (in afara capacitatii lor de a se divide, in cultura pot participa la forma
intima de raspuns imunitar. Gradul de stimulare imunologica obtinut dupa expunerea „in vivo”
poate modifica numarul celulelor cu aberatii cromozomice.

2.2 – Tehnica culturilor celulare din sangele periferic.

Este o metoda „rapida”, laborioasa, comporta materiale de buna calitate si o stricta

etapizare a timpilor de lucru.

Materialul necesar.

Mediul de cultura. Se pot folosi diferite medii artificiale ce stimuleaza cresterea

celulara. Mult folosite sunt mediile I C – 65 si T C – 199.

Antibiotice. Sunt adaugate pentru securitatea celulelor cultivate de eventualele

infectari bacteriene, posibile in timpul recoltarii si insamantarii celulelor. Curent sunt folosite:
penicilina (100 UI/ml) si streptomicina (100 UI/ml).

Serul. In mediul de cultura se pot adauga diferite seruri, cum ar fi: serul sanguin de la
subiectul investigat, ser uman heterolog de grup sanguin AB, ser de bovine, ser fetal de vitel etc.
Aceste seruri influenteaza cresterea celulelor in cultura.

Stimulentul mitotic. Pentru stimularea mitozei lifocitelor in cultura, recurgem la

fitohemaglutinina M si P.

Inhibitorul fusului de diviziune. Pentru distrugerea fusului de diviziune in cultura

introducem colchicina sau demecolcina.

Solutii hopotonice. Clorura de potasiu 0.075 M; citrat de sodiu 0,95%; solutie Hanks
(dilutie 1 : 4 in apa distilata).

Solutie fixator. Preparata extemporaneu dintr-un amestec alcool etilic – acid acetic

25
glacial (3 : 1).

Anticoagulant. Heparina pentru recoltarea sangelui.

Coloranti. Giemsa sau orceina acetica.

Recipiente de cultura. Tuburi sterile din material plastic sau din sticla neutra, ce pot
fi inchise ermetic. Capacitatea tubului are mare importanta: pentru o cultura de 5 ml se recomanda
tuburi cu capacitatea de 15-20 ml.

Controlul pH-ului. In cultura finala valoarea pH-ului trebuie sa fie intre 6,8 si 7,2.
Pentru a creste alcalinitatea se adauga bicarbonat de sodiu; pentru a creste aciditatea, barbotam aer
cu 5% CO2.

Metode de cultura.

Recoltarea sangelui. Pentru subiectul adult recoltam 5 – 10 ml sange, la copil, intre

0,1 – 0,5 ml. Recoltarea se face prin punctie venoasa intr-o seringa sterila pe care-l trecem intr-un
recipient steril ce contine heparina intre 10 si 100U.I./ml sange. Se agita usor petru a impiedica
formarea cheagului. Termenul de punere in cultura a celulelor recoltate influenteaza viabilitatea
celulelor si indirect totalul de aberatii cromozomice. Se recomanda insamantarea celulelor in
primele 24 de ore de la recoltare.

2.2.1 – Microcultura.

Intr-un recipient steril cu volumul de 15 ml introducem 5 ml mediu de cultura

compus din: 4 ml mediu special (sintetic) pentru cultura celulara, 0,60 ml ser heterolog de grup AB,
0,15 ml fitohemaglutinina M si P. Daca mediul sintetic nu contine antibiotice in compozitia sa,
atunci adaugam antibiotice: penicilina 100 U.I./ml total 400 U.I. Si streptomicina 100 U.I./ml total
400 U.I.

26
 Figura nr.2

Etapele culturilor celulare.

27
 Pentru studiul aberatiilor cromozomice, concentratii superioare de antibiotice nu sunt
recomandate deoarece pot avea loc efecte mutagene asupra celulelor in cultura.

Peste acest amestec nutritiv se adauga 0,2 – 0,5 ml sange total, heparinizat. Se
controleaza pH-ul continutului din recipientul de cultura (mentinut permanent intre pH 6,8 – 7,2).
Inchidem ermetic recipientul de cultura, se agita usor si se introduce la incubat la 37ºC timp de 70
ore.

Macrocultura.

Reducem la 1/3 volumul initial de sange periferic prin separarea plasmei

supernatante impreuna cu stratul leucocitar. Izolarea masei leucocitare recoltate se obtine prin
sedimentarea globulelor rosii dupa o centrifugare menajata. Conditiile optime sunt realizate cand, in
cultura finala, concentratia leucocitelor este de 1000/mm³. O asemenea concentratie celulara se
obtine din amestecul: 1 ml din omogenatul plasma – leucocite + 4 ml mediu de cultura. Se adauga,
in plus, 0,6 ml ser heterolog de grup AB. Antibioticele si fitohemaglutinina M si P se adauga ca in
cazul microculturii. Se controleaza pH-ul culturii, se inchide recipientul si se incubeaza 70 ore la
temperatura de 37ºC.

Pretratarea, fixarea, prepararea si colorarea lamelor.

Dupa perioada de incubare a celulelor urmeaza cateva etape necesare pentru

individualizarea si evidentierea cromozomilor. Acestea sunt (in ordine):

- Blocajul metafazelor. Dupa 70 ore de incubatie la 37ºC introducem in recipient

inhibitorul (toxicul) fusului de diviziune. Distrugerea fusului mitotic determina oprirea celulelor ce
se divid in stadiul de metafaza. Se folosesc urmatorii inhibitori ai fusului de diviziune: colchicina in
concentratie de 0,25 – 0,50 micrograme/ml cultura sau demecolcina cate 0,20 micrograme/ml
cultura.

- Recoltarea si socul hipotonic. Din acest stadiu nu este obligatoriu sa se lucreze in

conditii sterile. Scoatem cultura de la incubator pentru sacrificare. O trecem intr-un tub de
centrifuga si o centrifugam la 800 t/min, timp de 5 min. Dupa formarea sedimentului celular pe
fundul tubului, indepartam supernatantul, se umple tubul cu solutie hipotonica de clorura de potasiu,
se agita usor si lasam in repaos timp de 6-8 minute, la temperatura camerei.

- Fixarea. Centrifugarea menajata a tubului cu suspensia celulara in solutie

hipotonica. Se decanteaza supernatantul, dupa care se repun in suspensie celulele, adaugand lent 5
ml fixator rece, agitang usor. Se lasa 60-180 minute la rece (4ºC), apoi centrifugam si indepartam
supernatantul. Se repeta fixarea de 3 ori. Dupa ultima fixare si pana la prepararea lamelor
(frotiurilor), celulele pot fi pastrate in fixator mai multe zile la temperatura de 4ºC.

- Prepararea si colorarea lamelor. Dupa ultima centrifugare si decantare se face o

suspensie celulara intr-o cantitate convenabila de fixator. Apoi aplicam, prin picurare, 2-3 picaturi
suspensie celulara pe lame curate si degresate. Frotiurile sunt lasate sa se usuce la aer. Dupa uscare

28
se flambeaza usor la flacara. In final coloram lamele cu unul din colorantii: Giemsa, orceina-
acetica, sau reactiv Schiff.

- Examenul microscopic si fotografierea metafazelor. Dupa colorare si uscare lamele

sunt examinate la microscopul optic cu imersie. Sunt examinate metafazele si se aleg pentru
fotografiat cele care prezinta interes. Microfotografiile servesc pentru intocmirea cariotipului:
individualizarea si clasarea cromozomilor pe perechi si grupe.

2.3 – Evidentierea cromozomilor in celulele din maduva osoasa.

Aceasta metoda nu solicita cultura celulelor.

Este un procedeu direct si rapid de obtinere a cromozomilor celulari. Modul de lucru

este urmatorul:

- recoltam maduva osoasa (intre 0,2 – 0,5 ml) prin punctie sternala sau femurala;

- introducem maduva recoltta intr-un tub de centrifuga steril care contine 6 ml mediu
de cultura, 2 ml ser uman heterolog de grup AB. 0,1 ml heparina (1000 U.I./ml mediu) si colchicina
0,1 ml/ml mediu. Omogenizam amestecul si lsam sa sedimenteze masa celulara. Centrifugare
moderata. Trecem sedimentul in alt tub de centrifuga care contine un mediu identic cu tubul
precedent. Lasam la temperatura camerei timp de 1-2 ore;

- centrifugam la 800 t/min timp de 10 min. Eliminam suprnatantul si adaugam peste

sediment 6 ml solutie hipotonica (KCL 0,075 M), obtinandu-se suspensia celulara. Lasam la
temperatura camerei timp de 10 minute;

- centrifugarea, fixarea, prepararea si colorarea lamelor se desfasoara dupa criteriile

prezentate la metoda culturii celulelor din sangele periferic;

- dupa colorare examinam metafazele la microscopul optic cu imersie si fotografiem.

3 – Analiza cromozomilor si intocmirea cariotipului.

Omul (normal) este o specie somatic diploida si cu gameti haploizi. Numarul

cromozomilor din setul haplod gametic este de 23 (n=23). Celula somatica diploida contine 46
cromozomi (n=46) respectiv 23 perechi de cromozomi, adica suma a 2 seturi haploide. Dupa
„functia” genetica, in celula exista doua categorii de cromozomi: autozomii si heterozomii
(cromozomii sexuali). De exemplu, in celula somatica diploida sunt 44 de cromozomi autozomi
dispusi in perechi omoloage (22 perechi) si 2 cromozomi sexuali: XX la femeie, XY la barbat.
Formula generala de reprezentare a garniturii de cromozomi din celula somatica normala va fi:
46,XY la barbat si 46,XX la femeie.

29
 3.1 – Criterii de identificare, numerotare si clasificarea cromozomilor.

Cromozomii umani prezinta o serie de particularitati legate de talie (lungime), pozitia

centromerului, prezenta constrictiilor secundare si a satelitilor, care pot fi observate usor cand
cromozomii se gasesc in metafaza precoce a diviziunii celulare. In aceasta faza fiecare cromozom
prezinta doua cromatide la nivelul centromerului (Fig.nr.3).

Figura nr.3
Elementele descriptive (morfologice) ale unui cromozom.
p - brat scurt.
q - brat lung.
c.p. (cm) – constrictie primara (centromer).
c.s - constrictie secundara.
s - satelit.
t – telomer.

30
 Aceste caracteristici morfodimensionale au constituit criteriile unice pentru
nomenclatura si clasificarea cromozomilor umani stabilite la consfatuirile internatonale de
citogenetica tinute la Denver (1960), Londra (1963), si Chicago (1966).

Talia si numerotarea cromozomilor.

La om, cele cele 23 perechi de cromozomi au o simensiune ce variaza in limite foarte

mari: 1,5 – 10microni (sunt cazuri cand cromozomii umani au lungimea pana la 25 microni). Talia
cromozomului poate fi stabilita prin indicele: lungimea relativa a cromozomului (L.r.c.) care se
obtine prin raportarea lungimii unui cromozom la lungimea insumata a 22 autozomi, plus lungimea
unui cromozom X exprimata la mie:
Lungim ea crom ozom ului analizat pq
L.r.c. = lungimii a 22 autozomi lungimea unui X • 1000 = 22A X  • 1000

Conform acestei relatii, talia cromozomilor variaza intre 80 – 90 pentru perechea nr.1
si 12 – 20 pentru perechea nr.22. Ca urmare, dupa talie, putem vorbi in general de cromozomi mari
(perechile 1 – 5 de cromozomi), mijlocii (6 – 18) si mici (19 – 22).

Stabilirea lungimii cromozomilor ajuta sa numerotam perechile de cromozomi

autozomali in ordinea descrescanda a taliei lor. Deoarece la cele doua sexe cromozomii sexuali nu
sunt omologi, acestia se desemneaza prin simbolurile de X si Y.

Pozitia centromerului si lungimea bratelor.

Centromerul, locul de intalnire a celor doua cromatide, poate fi situat in orice punct
intre capatul si zona centrala a cromozomului. Centromerul imparte cromatidele in doua brate:
bratul scurt „p” si bratul lung „q”. Pozitia centromerului si lungimea bratelor cromozomului poate fi
stailita prin trei indici de exprimare: indicele centromeric (i.c.), raportul intre brate (r) si diferenta de
lungime a bratelor (d).

Indicele centromeric este raportul centezimal dintre bratul scurt (p) si lungimea totala
a cromozomului:
lungim ea bratului scurt p
i.c. = lungim ea totala a crom ozom ului • 100 = pq • 100

Raportul intre bratele cromozomului:

lungim ea bratului lung q
r= lungim ea bratului scurt = p

31
 Diferenta de lungime a bratelor cromozomului:

d = lungimea bratului lung – lungimea bratului scurt = q – p.

In raport de pozitia centromerului si lungimea bratelor s-a atribuit cromozomilor

urmatoarea nomenclatura (Fig.nr.4).

- cromozomi mediocentrici (mediani) cand bratele p si q sunt de lungime egala sau

aproape egala;

- submediocentrici (submediani) cand bratul p este mai scurt fata de bratul q, bratul p
reprezinta cam 1/3 din lungimea totala a crmozomului;

- cromozomi acrocentrici, cu centromerul in pozitia aproape terminala. Bratul p

reprezinta circa 1/5 din lungimea totala a cromozomului.

Figura nr.4
Tipuri morfologice de cromozomi din cariotipul uman.
a. mediocentric (median);
b. submediocentric (submedian);
c. acrocentric.

Analiza pozitiei centromerului si lungimea bratelor reprezinta criteriul de repartizare

a cromozomilor in cele 7 grupe desemnate prin literele A-G, alaturi de criteriul taliei cromozomilor
(Tabelul nr.1).

Prezenta constrictiilor secundare si satelitilor.

Criterii de omologare a cromozomilor omologi si de individualizare a perechilor de

32
cromozomi in interiorul unei grupe in cariotip sunt: constrictiile secundare si satelitii.

Constrictia secundara este cinsiderata acea zona putin ingrosata („strangulata”) fata
de restul cromatidei cromozomului. Asemenea constrictii pot fi observate pe bratul q sau p. Cele
mai proeminente si variate constrictii secundare sunt gasite pe cromozomii perechilor 1, 9, grupa E.
Cand constrictia secundara secudara are o pozitie distala pe bratul p, atunci partea terminala a
cromatidei ne apare sub forma corpusculara, iar zona ce corespunde constrictiei ca un filament fin.
O asemenea formatiune este cunoscuta sub numele de satelit cromozomial, intalnita frecvent la
cromozomii acrocentrici.

Tabelul nr.1

Valoarea medie a lungimii (L) si indicele centromeric (Ic).

(dupa TURPIN)

CROMOZOMUL L L L Ic Ic Ic
1 88,68 5,38 0,54 0,4767 0,0216 0,0022
2 82,36 4,41 0,44 0,3881 0,0258 0,0026
3 67,91 4,47 0,45 0,4512 0,0244 0,0025
4 62,59 3,27 0,33 0,2715 0,0151 0,0015
5 58,60 2,96 0,30 0,2530 0,0185 0,0019
X 58,04 2,57 0,26 0,3724 0,0250 0,0020
6 54,52 2,73 0,27 0,3592 0,0215 0,0022
7 50,18 2,88 0,29 0,3655 0,0248 0,0025
8 47,04 2,58 0,26 0,3045 0,0289 0,0029
9 45,77 2,21 0,22 0,3696 0,0331 0,0033
10 44,71 2,00 0,20 0,3020 0,0284 0,0029
11 43,19 1,97 0,20 0,3742 0,0311 0,0031
12 43,20 2,07 0,21 0,3081 0,0250 0,0025
13 32,52 2,59 0,26
14 31,93 2,82 0,28
15 31,23 2,40 0,24
16 29,88 1,90 0,19 0.3983 0,0347 0,0035
17 28,68 2,02 0,20 0,3054 0,0391 0,0039
18 25,40 1,92 0,19 0,2821 0,0322 0,0032
19 22,34 1,58 0,16 0,4321 0,0334 0,0034
20 21,32 1,51 0,15 0,4332 0,0370 0,0037
21 15,40 1,73 0,17
22 15,67 2,30 0,23
Y 15,70 2,28 0,34

33
 Legenda:

L = abaterea tip a distributiei L

L = abaterea standard a mediei L

Ic = abaterea tip a distributiei Ic

Ic = eroarea standard a mediei Ic

3.2 – Intocmirea si citirea cariotipului.

Asa cum sa aratat, dupa talie, pozitia centromerului si lungimea bratelor (tipul de
cromozom), cromozomii sunt repartizati in 7 grupe mari, notate de la A – G (Fig.nr. 5-6).

SCANARE FIGURILE 5,6 PAGINA 48

Grupa A. Cuprinde primele trei perechi de crmozomi cu talia cea mai mare.

- Cromozomii perechii nr.1 sunt aproape mediocentrici. Pe bratul lung se poate

observa, in apropierea centromerului (uneori) o constrictie secundara.

- Cromozomii perechii nr.2 sunt submetacentrici.

- Cromozomii nr.3 sunt aproape mediocentrici.

Grupa B. Cuprinde perechile de cromozomi 4 si 5, sunt de tip submetacentric. Daca

sunt usor de diferentiat de cromozomii din grupa A (prin talie si lungimea bratelor), nu putem sa
diferentiem usor, intre ele, cele doua perechi.

Grupa C. In aceasta grupa sunt inclusi cromozomii 6 – 12 si cromozomul X. Au un

indice centromeric cuprins intre 28 si 40. Sunt cromozomi de talie medie, iar ordonarea lor este
dificil de realizat. Perechile 7, 9 si 11 au centromerul submediu, iar perechile 8,10 si 12 prezinta
centromerul in pozitie relativ distala.

Cromozomul 6 este relativ metacentric si mai mare decat celelalte perechi din grupa.
Cromozomul 9 se caracterizeaza prin prezenta constrictiei secundare pe bratul lung in apropierea
centromerului.

Grupa D. Cuprinde cromozomii 13 – 15, de talie mijlocie, cu un indice centromeric

in jurul valorii 15. Sunt de tip acrocentric si se particularizeaza prin prezenta satelitilor in bratul p.

34
 Grupa E. Cu trei perechi de cromozomi: 16, 17 si 18. Cromozomul 16, cu un
indice centromeric de 40 este considerat aproximativ metacentric. Cromozomii 17 si 18, cu indicele
centromeric intre 28 – 30, sunt de tip submetacentric. Pe bratul lung al cromozomului 16 poate fi
observata o constrictie secundara, pozitionata proximal.

Grupa F. Cuprinde doua perechi de cromozomi metacentrici de talie mica: nr.19 si

20, cu un indice centromeric in jur de 44. Cele doua perechi sunt greu de diferentiat.

Grupa G. Include cromozomii 21 si 22, cu talia cea mai mica si de tip acrocentric. Au
un indice centromeric in jur de 20 – 25. Frecvent intalnim sateliti pe bratul p. Cat priveste
cromozomul Y, dupa talie si dimensiune apartine grupei G. Este lipsit de sateliti, iar bratele Q au o
dispozitie paralela in comparatie cu cromozomii 21 si 22. Bratele q ale cromozomului Y, ca
lungime, prezinta variabilitate individuala.

Dupa aranjarea cromozomilor in cele 7 grupe (respectand criteriile mentionate),

urmeaza citirea cariotipului. Desigur ca, citirea unui cariotip, nu solicita reguli speciale, dar putem
urmari cateva elemente care ajuta sa stabilim valoarea diagnstica:

- mai intai urmarim cromozomii sexuali pentru a stabili sexul genetic al subiectului
analizat: XX pentru femeia normala, pereche gasita de regula la grupa C; XY pentru barbatul
normal, cromozomul X trebuie cautat in grupa C, iar cromozomul Y in grupa G;

- urmeaza apoi examinarea celor 7 grupe si a cromozomilor autozomi in scopul de a

stabili numarul si morfologia. La subiectul normal numaram 22 perechi autozomi si cu morfologia
aratata in lucrare, iar scrierea rezultatului va fi: 46,XX la femeie, 46,XY la barbat.

Abateri de la formulele 46,XX si 46,XY privind numarul cromozomilor autozomali

si sexuali sau prezenta de cromozomi cu morfologie si talie modificata fata de normal, sunt
elemente sa consideram ca este un cariotip anormal si apartine unui subiect cu importante
modificari anatomo-structurale sau comportamentale (a se vedea aberatiile cromozomiale).

Importanta cariotipului uman.

Analiza cromozomilor si intocmirea cariotipului sunt importante pentru a stabili

formula cromozomiala a unui subiect normal ce apartine speciei umane si ca metoda de diagnostic
citogenetic in stabilirea etiologiei unor boli din patologia umana.

SCANARE FIGURILE PAGINILE 50,51, 52

Cunoasterea tipului de modificare si distributia acestora in populatie are importanta

pentru a deosebi variantele normale de cele patologice. Dintre modificarile care determina
polimorfismul cromozomilor si pot fi identificate prin marcaj in benzi enumeram: dimensiunea
satelitilor, lipsa satelitilor, dublarea numarului lor, variatii ale dimensiunii constrictiilor secundare,
variatii ale intensitatii flurescentei etc.

35
 5 - Aplicatii practice.

III. METODA BANDARII CROMOZOMILOR UMANI.

Metoda clasica de analiza si intocmirea cariotipului, prin respectarea dimensiunii si

morfologiei cromozomilor nu permite evidentierea tuturor modificarilor in structura si morfologia
cromozomilor, produse prin actiunea factorilor mutageni externi.

Prin metoda de analiza clasica citogenetica, desi folosita, posibilitatile de identificare

a sindroamelor a caror etiologie gnetica sunt modificarile morfologice intercromatidice sunt reduse,
sau chiar imposibile.

In consecinta, in perioada 1968 – 1971, au fost elaborate metode de analiza a

benzilor cromozomilor, metode mai fine, care pot identifica modificarile intracromatidice. Prin
metoda bandarii cromozomilor s-au putut identifica etiologia multor sindroame cauzate de mutatii
intracromozomiale (inversii) deletii intracromatidice, translocatii, discontinuitati, duplicatii, etc.).

Metoda bandarii cromozomilor pe langa valoarea diagnostica mai corecta, prezinta si

avantajele:

- identificarea corecta a cromozomilor omologi;

- pozitionarea perechilor de cromozomi in cariotipul celulei analizate;

- identificarea corecta unde s-a produs defectul in cromozomi.

Din aceste motive, metodele bandarii cromozomilor s-au extins ca aplicabilitate si

analiza citogenetica in diagnosticul clinic.

1 – Ce sunt benzile cromozomiale.

Prin banda cromozomiala intelegem un segment cromatidic delimitat de doua

segmente diferit colorate.

Tehnicile modern elaborate intre 1968 – 1970, dar si in prezent, evidentiaza benzi
transversale dispuse pe axul longitudinal al cromozomilor, prezente atat pe bratul scurt (p) cat si pe
bratul lung (q).

Numarul, dimensiunea si ordinea acestor benzi sunt caracteristici pentru fiecare

cuplu de cromozomi omologi si care, in general, sunt caracteristice genomului uman.

Tehnicile de bandare se bazeaza pe compozitia in baze a ADN-ului din cromozomi,

pe diferentele de organizare a fibrilei de ADN, polinucleozomica si polisolenoidica, (plicaturare
discontinua si neuniforma a fibrilei de ADN), gradul de spiralizare discontinua a cromozomului si
ADN-ului.

Cele mai multe studii se bazeaza pe relatia dintre conpozitia in baze ale ADN-ului

36
cromozomial si aditia colorantului cu evidentierea benzilor.

De exemplu ADN bogat in cuplul complementar AT intensifica fluorescenta prin

fixarea quinacrinei, iar ADN bogat in GC, diminueaza fixarea substantei fluorescente.

Metodele de bandare permit evidentierea structurii fine a cromozomilor, datorita

colorarii diferentiale a diverselor segmente din cromatidele cromozomiale sub forma unor benzi
alternative: intens colorate sau palid colorate.

Daca banda cromozomica este acea portiune din cromatida clar distincta de regiunile
adiacente prin aditia si intensitatea coloratiei; regiunea este acea portiune cromozomica cuprinsa
intre doua puncte de reper adiacente.

SCANARE FIGURA PAGINA 56

Reperul este trasatura morfologica constanta si distincta a fiecarui cromozom.

De exemplu reper poate fi: centromerul, telomerele, unele benzi extinse si bine
colorate.

2 – Numerotarea si identificarea benzilor.

In metafaza mitotica fiecare cromozom are doua cromatide, unite prin centromer.

Cromatidele sunt subimpartite in doua brate delimitate de centromer: bratul scurt „p”
si bratul lung „q”. Bratele, la randul lor, sunt subimpartite in regiuni si benzi. Numerotatea benzilor
pentru fiecare brat, incepe de la centromer, spre partea distala (terminala a bratelor), atat pentru
regiuni ct si pentru benzi.

De exemplu,

37