UNIVERSITÉ MOHAMMED V

FACULTÉ DES SCIENCES RABAT

N°d’ordre : 2772

THÈSE DE DOCTORAT
Présenté Par
Damien Dagbedji TOFFA

Discipline : Biologie
Spécialité : Mycologie-Environnement

Étude de la contamination de certains aliments d’origine végétale

de la République du Niger les moisissures toxinogènes

Soutenue à Rabat le 12 juin 2015

Devant le jury composé de :

PRÉSIDENT
Mohamed FEKHAOUI PES Institut Scientifique - Rabat

EXAMINATEURS
Fatima Ezzahra El ALAOUI FARIS PES Faculté des Sciences de Rabat
Aïcha El AISSAMI PES Faculté des Sciences de Rabat
Abdellah ZINEDINE PH Faculté des Sciences d’EL Jadida
Abdallah El ABIDI Dr en Toxicologie Institut National d’Hygiène-Rabat

INVITÉS
Laïla OUAFFAK Dr Mycologie Institut National d’Hygiène - Rabat
Abderlrhafour TANTAOUI-ELARAKI PES Société Marocaine de Mycotoxicologie

I
PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS

Publications
- D.D. Toffa, N. Mahnine, L. Ouaffak, A. El Abidi, F.Z. El Alaoui Faris, & A. Zinedine,
2013. First survey on the presence of ochratoxin A and fungi in raw cereals and peanut
available in the Republic of Niger, Food Control 32 (2013) 558-562.

- D.D. Toffa, A. Zinedine, N. Mahnine, A. El Abidi, M. Fekhaoui, F.Z. El Alaoui Faris,

2014. Determination of aflatoxins in Maize, rice and millet available in the Republic of
Niger. International Food Research Journal (en cours de soumission)

Communications
- D.D. Toffa, N. Mahnine, A. El Abidi, M. Fekhaoui, F.Z. El Alaoui Faris, A. Zinedine.
Cooccurrence des Aflatoxines et de l’Ochratoxine A dans le riz et dans l’alimentation
animale commercialisée au Maroc. 4ème Edition des Doctoriales de la Faculté des
Sciences de Rabat « Employabilité, la création d’entreprise et la formation par la
recherche » 19, 20 et 21 Février 2015 à la Faculté des Sciences de Rabat.

- D. D. Toffa, N. Mahnine, A. El Abidi, M. Fekhaoui, F.Z. El Alaoui Faris, A. Zinedine.

Détermination des aflatoxines dans le maïs et le riz disponibles sur les marchés de
Niamey en République du Niger. 1er Congrès International : Substance Naturelle
Modélisation : Application Thérapeutique, Environnement et Développement
Durable (CISNEM TAZA 2014) 15 et 16 Décembre 2014.

- D. Toffa, N. Mahnine, L. Ouaffak, A. El Abidi, F.Z. El Alaoui Faris, A. Zinedine.

Natural occurence of ochratoxin A and fungi in cereals and oilseeds from Republic of
Niger. The second Edition: MICROBIOD 2 «Microbial Technology for
Development». Marrakech, 02-04 Octobre 2012. Morocco.

II
- D. Toffa, L. Ouaffak, F.E. El Alaoui Faris, A. Zinedine. Présence d'ochratoxine A et
isolement des moisissures dans certaines céréales et oléagineux. Journées
Internationales « Substances Naturelles et Développement Durable ». Rabat, 22-23
Juin 2012.

- D. Toffa, A. El Abidi, N. Mahnine, L. Ouaffak, A. Sifou, El Alaoui Faris, A. Zinedine.

Contamination of cereals and oilseeds from Niger with ochratoxin A. 9ème édition du
séminaire résidentiel des «Doctoriales du Maroc. Marrakech, 04-10 Décembre 2011
Maroc.

III
 A ceux qui me sont les plus chers

A ceux qui ont toujours cru en moi

A ceux qui m’ont toujours encouragé

Je dédie cette thèse

IV
 DEDICACES

A mes très chers parents

Chère mère

Aucune dédicace ne saurait exprimer l’amour et l’affection que j’ai toujours eus
pour toi.

Tes conseils, ta bienveillance et tes encouragements m’ont permis de dépasser toutes

les difficultés.

Ce travail est le fruit des efforts et sacrifices que tu as consenti pour mon
éducation et ma formation.

Que Dieu te prête longue vie et bonne santé.

Avec beaucoup de patience et de volonté, tu t’es sacrifiée pour nous, tu as tout fait
pour que j’arrive à mon but.

Ta prière et ta bénédiction m’ont été d’un grand secours pour mener à bien mes
études.

Je te dédie ce travail en gage de mon amour et de mon estime les plus profonds.

Tu es une mère formidable, je t’aime…

V
 Cher père

A qui je dois tout, et pour qui aucune dédicace ne saurait exprimer l’amour, l’estime
et la reconnaissance pour l’ampleur des sacrifices que tu as endurés pour nous éduquer.

Pour tes immenses sacrifices, ton courage et ton dévouement pour le bonheur et le
succès de notre foyer et de notre famille.

Je n’ai été guidé que par le désir de t’honorer.

J’espère qu’aujourd’hui tu es fier de moi.

Que ce travail soit le témoignage de ma gratitude et de toute mon affection.

Tu mérites sans conteste qu’on te décerne le prix ‘père exemplaire’, je t’aime…

Que Dieu vous garde et vous procure, maman et toi, longue vie, santé et bonheur,
afin que vous demeuriez le soleil qui illumine notre vie.

A vous, je dois ce que je suis.

Je suis fier et content de réaliser une partie de ce que vous avez tant espéré et
attendu de moi.

VI
 A la mémoire de mes grands – père et grands - mère

J'aurais bien voulu que vous soyez parmi nous en ce jour mémorable.

Que la clémence de dieu règne sur vous et que sa miséricorde apaise vos âmes

A Mes chers frères et sœurs

En témoignage de toute l'affection et des profonds sentiments fraternels que je

vous porte et de l'attachement qui nous unit.

Je vous souhaite du bonheur et du succès dans toute votre vie.

A mes familles maternelles et paternelles

Mes oncles, mes tantes, cousins, cousines. Puisse ce travail être la preuve de mon
estime.

VII
 REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au laboratoire de Botanique - Mycologie – Environnement de la Faculté des

Sciences de Rabat en collaboration avec les laboratoires de Toxicologie et de Myclogie de l’Institut National
d’Hygiène sous la direction Professeur Fatima Ezzahra EL ALAOUI-FARIS, de la Faculté des Sciences
Rabat et la codirection Professeur Abdellah ZINEDINE, de la Faculté des sciences, Université Chouaib
Doukkali, EL Jadida.

Je remercie le soutien du Centre National pour la Recherche Scientifique et Technique, à travers le

projet RS/2011/34 (Programme National de Développement de la Recherche Sectorielle du CNRST). Aussi
J’adresse mes remerciements à l’Agence Nigérienne des Allocations et des Bourses (ANAB) ainsi qu’Agence
Marocaine de Coopération Internationale (AMCI) pour l'aide financière et le soutien technique apporté.

A Monsieur le Doyen de la Faculté des Sciences de Rabat, pour avoir accepté de m'inscrire au sein de
la Faculté des Sciences de Rabat pour continuer mes études doctorales.

A Madame Fatima Ezzahra EL ALAOUI-FARIS, Professeur à la Faculté des Sciences Rabat, pour
avoir accepté de m’accueillir au sein de son laboratoire. Je la remercie du fond du cœur pour son encadrement,
sa disponibilité, sa confiance, ses conseils et encouragements. Quoique je dise, les mots ne sauraient exprimer
ma profonde gratitude pour m'avoir encadré tout au long mes recherches.

A Monsieur Abdellah ZINEDINE, Professeur à la Faculté des sciences, Université Chouaib

Doukkali, EL Jadida ; qui a bien voulu avec rigueur Scientifique et compétence, accepter de m’aider dans le
choix du sujet, m’encadrer et diriger ce travail. Outre le choix du sujet, j’ai énormément apprécié l’intérêt
qu’il accorde à la recherche scientifique et à l’enseignement. Qu’il reçoit ma profonde gratitude et estime pour
ses conseils, son aide, son soutien matériel, sa patience tout au long de l’élaboration de ce travail.

VIII
 Mes remerciements vont également à Monsieur Mohamed FEKHAOUI Directeur de l’Institut
scientifique de Rabat pour son soutien indéfectible, ses conseils et sa contributin en tant que rapporteur. Je
le remercie pour avoir accepté de lire mon manuscrit et de présider le jury.

Je remercie chaleureusement Madame Aïcha EL AISSAMI du Laboratoire de Botanique, Mycologie

et Environnement de la Faculté des Sciences de Rabat d’avoir accepté de participer à mon jury de thèse en
tant que rapporteur. Je la remercie pour sa gentillesse, ses conseils, sa disponibilité et sa contribution. Elle
m’a été d’un grand soutien dans la correction de ce manuscit.

Mes remerciements vont également à Monsieur Abderlrhafour TANTAOUI-ELARAKI, ex

Professeur à l’IAV Hassan II de Rabat et ex-Secrétaire Général du CNRST, Directeur de l’École Sup-Agro
à Casablanca et Président de la Société Marocaine de Mycotoxicologie, pour avoir accepté de juger cette
thèse en tant qu’invité d’honneur.

A Monsieur Abdallah El ABIDI, chef du Département de Toxicologie-Hydrologie de l’Institut

National d’Hygiène de Rabat ; j’exprime toute ma reconnaissance pour m’avoir intégré au Département de
toxicologie, composé d’une équipe formidable et dynamique. Merci pour ses conseils, sa disponibilité et
d’avoir accepté de participer à mon jury de thèse en tant que rapporteur.

A Madame L. OUAFFAK, Responsable du Laboratoire de Mycologie de l'Institut National

d'Hygiène Rabat, pour son encadrement, sa disponibilité, ses conseils, ses encouragements et d’avoir accepté
de participer à mon jury de thèse en tant qu’invité d’honneur. Sa passion pour la recherche et son esprit
innovateur sont exemplaires et ont été une source de stimulation pour mon apprentissage du métier de
Chercheur.

IX
 A Madame N. MAHNINE, Ingénieur au département de toxicologie-hygrologie de l’Institut
National d’Hygiène. Vos remarques et vos conseils m’ont été d’une grande aide depuis le début de travail.
Vous avez toujours su me diriger, participer sans limite à la réalisation de ce travail qui est aussi le votre. En
étant un des chercheurs dans le domaine de l’étude de la contamination des denrées alimentaires par les
mycotoxines, vous avez su m’inviter au travail avec une réelle sincérité et une grande patience en vous
impliquant corps et âme. Pour votre disponibilité votre aide et vos précieux conseils, soyez assurée Mme
Mahnine, de toute ma sincère et profonde gratitude.

A Monsieur J. MANES chef du département de médecine préventive et de santé publique, faculté de

Pharmacie, université de Valencia. C’est un réel plaisir et un grand honneur que vous nous faites en
acceptant de juger notre travail. En dépit de vos nombreuses occupations vous avez accepté de juger notre
travail. Veuillez trouver ici la marque de mon profond respect et toute ma respectueuse considération. Je ne
saurai continuer sans adresser mes sincères remerciements à Madame Guillermina Font Perez, du
Laboratoire de Toxicologie et Bromatologie de l'Université de Valence (Espagne) pour sa collaboration, sa
gentillesse, son soutien, sa disponibilité et son amitié.

A Madame Monica Fernandez, et à Mademoiselle Lara Manyes du Laboratoire de toxicologie

alimentaire de l'Université de Valence (Espagne), pour avoir la gentillesse de diriger ma formation sur les
mycotoxines. Qu’elles y trouvent ma profonde gratitude et mes remerciements pour leur entière collaboration,
leur disponibilité et leurs remarques précieuses.

A Tous mes collègues et amis étudiants, aux stagiaires de l'Institut National d'Hygiène de Rabat,
sans oublier le personnel du Département de Toxicologie et Hydrologie. Il va de soi que ceux du Laboratoire
de toxicologie alimentaire de l'Université de Valence (Espagne), reçoivent aussi mes sincères remerciements.

Mes années d’études au Maroc m’ont permis de faire de belles rencontres. Que l’ensemble de mes amis
et le personnel de l’Ambassade du Niger au Maroc reçoivent ma profonde gratitude. Je les remercie pour leur
soutien inconditionnel, et pour tous les merveilleux moments passés ensemble.

X
 ACRONYMES

A Aspergillus

AF Aflatoxine

AFB1 Aflatoxine B1

AFB2 Aflatoxine B2

AFG1 Aflatoxine G1

AFG2 Aflatoxine G2

AFM1 Aflatoxine M1

AFM2 Aflatoxine M2

AFs Aflatoxines totals

Aw Activité de l’eau

CYA CzapekYeast Extract Agar

CYP Cytocromes P

DAS Diacétoxyscirpénol

DEM Dimetylmaléate

DMSO Diméthylsulfoxide

DON Déoxynivalénol

EU Union européenne

F Fusarium

FAO Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture

XI
FB1 Fumonisine B1

GST Glutathions S-transférases

HCCP Analyse des dangers - points critiques pour leur maîtrise

HPLC Chromatographie Liquide à Haute Performance

IAC Colonne d’Immuno-Affinité

MEA Malt Extract Agar

OTA Ochratoxine A

P Penicillium

PDA Patatoes Dextrose Agar

PGF α Prostagladine

PGHS Prostagladine-H-Synthétase

T2 toxine T2

TFA Acide Trifluoroacétique

ZEA Zéaralénone

XII
 RÉSUMÉ
Le présent travail a porté sur l’étude de la qualité microbiologique et mycotoxicologique
d'échantillons de céréales et arachide commercialisés en République du Niger.

123 échantillons de céréales (maïs : n=65 ; riz : n=45 ; sorgho : n=6 ; millet : n=7) et 7
échantillons d’arachide ont été prélevés de différents marchés de la ville de Niamey.

L’étude mycologique de 22 de ces échantillons a montré un grand nombre de

contaminants fongiques. Parmi ceux-ci, on dénote la présence des principaux genres
incriminés dans la production de mycotoxines : Aspergillus spp (65%), Fusarium sp (10%) et
Penicillium spp (3%), Alternaria sp (2%).

Après l’étude de la contamination par l’OTA de 74 échantillons de céréales (riz : n =

22 ; maïs : n = 39 ; sorgho : n = 6 ; millet : n = 7) et 7 échantillons d’arachide, il en ressort que
86% et 5% des échantillons d’arachide et de riz sont respectivement contaminés par l’OTA,
avec les moyennes de contamination respective ; 3,7 µg/kg et 0,1 µg/kg. La plus forte
concentration d’OTA dans les échantillons d’arachide est de 5 µg/kg.

L’étude de la contamination des 48 autres lots d’échantillons de céréales restant (maïs :

n=25, riz : n= 23) a révélé la présence des aflatoxines totales (56%, 48%) et de l’aflatoxine B1
(48%, 48%) dans ces proportions respectives. Les plus fortes teneurs d’AFB1 retrouvées dans
le riz et le maïs sont respectivement 7 µg/kg et 5 µg/kg. Seul 17% et 9% de ces échantillons
respectifs ont dépassé la limite maximale tolérable (2 µg/kg) fixé pour l’AFB1 par les
règlements de l’Union Européenne.

En tenant compte du poids corporel moyen et de la consommation de céréales par jour

de la population nigérienne ; l’estimation de l’exposition cette population aux mycotoxines a
montré que les prises journalières de l’OTA et de l’AFB1 à travers la consommation du riz et
des céréales en générale ; chez un adulte sont respectivement de l’ordre de (0,2 et 0,92 ng/kg)
et de (1 et 0,5 ng/kg) de poids corporel par jour.

Mots clés : Mycotoxines, aflatoxines, ochratoxine A, céréales, arachide, moisissures,

République du Niger.

XIII
 SUMMARY
This work focused on the study of microbiological and mycotoxicological quality of
cereals and peanut samples marketed in the Republic of Niger. For this purpose, 123 samples
of grain [corn (n = 65), rice (n = 45), sorghum (n = 6), millet (n = 7)] and 7 samples of peanut
were taken in different markets in Niamey.

Mycological study of 22 of these samples showed a large number of fungal

contaminants. Among them, it indicates the presence of the principal genera implicated in the
production of mycotoxins: Aspergillus spp (65%), Fusarium sp (10%), Penicillium spp (3%),
and Alternaria sp (2%).

After the study of OTA contamination of 74 cereal samples (rice, maize, millet,
sorghum) and 7 samples of peanuts, it appears that 86% and 5% of peanut samples and rice
are contaminated with OTA respectively, with respective averages of contamination; 0.1 mg /
kg and 3.7 mg / kg. The highest concentration of OTA was detected in peanut (5 µg / kg).

The study of the contamination of other 48 batches of cereal samples (corn: n = 25,
Rice: n = 23) showed the presence of total aflatoxins (56%, 48%) and aflatoxin B1 (48 %,
48%) in the respective proportions. The highest levels found for AFB1 are 5 µg / kg in corn
and 7 µg / kg in rice respectively. Only 17% and 9% of these respective samples exceeded the
maximum tolerable limit (2 µg / kg) fixed for AFB1 by the regulations of the European Union.

The assessment of the exposure of the population of Niger to mycotoxins has shown
that daily doses of OTA and AFB1, through the consumption of rice and cereals in general; in
an adult are respectively of the order of (0.2 to 0.92 ng / kg) and (1 and 0.5 ng / kg) body
weight per day.

Keywords: Mycotoxins, aflatoxins, ochratoxin A, cereals, peanut, mold, Republic of

Niger.

XIV
 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Les grands groupes des eumycètes (Durrieu, 2008). ........................................... 13

Figure 2 : Schéma de la structure de quelques espèces d’Aspergillus ................................... 18
Figure 3 : Schéma de la structure de Penicillium .................................................................. 20
Figure 4 : Schéma de la structure de Fusarium..................................................................... 21
Figure 5 : Schéma de la structure d’Alternaria ..................................................................... 22
Figure 6 : Structure chimique de l’OTA et ses dérivés en fonction de R1 (-COOH) et R2
(-Cl), (Höhler, 1998). .................................................................................... 26
Figure 7 : Dérivés métaboliques de l'OTA (Pfohl-Leszkowicz & Manderville, 2006). ........ 29
Figure 8 : Structures chimiques et masses molaires (en g) des différentes aflatoxines. .......... 37
Figure 9 : Structures chimiques et masses molaires (en g) de l’aflatoxine B1. ....................... 39
Figure 10 : Métabolisme des aflatoxines et préparation de l’AFB1-exo-8, 9-epoxide par
le Dimethyldioxirane (DMDO) oxidation de l’AFB1 en dichloromethane. ..... 41
Figure 11 : Structure chimique de la fumonisine B1 ............................................................. 46
Figure 12 : Structure chimique de la zearalenone ................................................................. 48
Figure 13 : Structure chimique de la toxine T-2 .................................................................... 49
Figure 14 : Structure chimique du Déoxynivalénol .............................................................. 50
Figure 15 : Structure chimique de la patuline ....................................................................... 51
Figure 16 : Structure chimique de l’AFD1. .......................................................................... 83
Figure 17 : Localisation géographique et conditions climatiques de la République du
Niger.FAO - AQUASTAT, (2005) ................................................................. 92
Figure 18 : Zones climatiques du Niger .............................................................................. 93
Figure 19 : Échantillons de céréales et d’arachides non moulus (500g) ................................ 94
Figure 20 : Protocole suivi pour le dosage de l’OTA dans les céréales et l’arachide ........... 103
Figure 21 : Schéma général de l’analyse des aflatoxines dans les produits alimentaires ...... 108
Figure 22 : Schéma de la purification des échantillons sur gel de silice. ............................. 112
Figure 23 : Taux d’humidité (%) m/m des échantillons analysés ........................................ 119
Figure 24 : Moisissures isolées des denrées alimentaires analysées .................................... 124
Figure 25 : Souche d’Aspergillus flavus sur milieu PDA .................................................... 128
Figure 26 : Souche d’Aspergillus niger sur milieu PDA ..................................................... 129
Figure 27 : Souche d’Aspergillus flavus et A. fumigatus sur milieu PDA ............................ 130
Figure 28 : Souche d’Aspergillus terreus sur milieu PDA................................................... 131

XV
Figure 29 : Souche Penicillium sp sur milieu PDA............................................................. 132
Figure 30 : Souche Fusarium sur milieu PDA .................................................................... 133
Figure 31 : Taux de contamination fongique des échantillons de riz par les moisissures ..... 136
Figure 32 : Taux de contamination fongique des échantillons de maïs par les
moisissures ................................................................................................. 138
Figure 33 : Nombre de moisissures isolées des échantillons de sorgho en fontion de
genres fongiques. (Aspergillus : Asp, Bipolaris : Bip, Culvularia ; Cul,
Mucor : Mu, Rhizopus) ................................................................................ 140
Figure 34 : Nombre de moisissures isolées des échantillons de millet en fonction genres
fongiques .................................................................................................... 142
Figure 35 : Nombre de moisissures isolées des échantillons d’arachide en fonction des
genres fongiques (Aspergillus : Asp, Mucor ; Mu, Rhizopus ; Rhiz) ............. 144
Figure 36 : Nombre d’échantillons analysé par matrice ...................................................... 145
Figure 37 : Chromatogramme : (A) une solution standard d’OTA (3 ng/ml), (B) un
échantillon d’arachide naturellement contaminé ........................................... 149
Figure 38 : Nombre d'échantillons contaminés par l'OTA en fonction des matrices ............ 151
Figure 39 : Niveau de contamination de l'ensemble des échantillons analysés .................... 151
Figure 40 : a) Chromatogramme du standard aflatoxine total (5 µg/kg) et b) celui d’un
échantillon positif de maïs (4,5 µg/kg d’AFB1)............................................ 160
Figure 41 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs en fonction des
aflatoxines (G1, B1, G2, B2)........................................................................ 160
Figure 42 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs en fonction de
l’aflatoxine B1 ............................................................................................. 161
Figure 43 : Pourcentage de contamination en aflatoxines des échantillons de riz en
fonction des aflatoxine totales ...................................................................... 165
Figure 44 : Pourcentage de contamination en aflatoxines des échantillons de riz en
fonction des aflatoxines (G1, B1, G2, B2) .................................................... 166
Figure 45 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs et de riz en fonction
des aflatoxines totale et de l’aflatoxine B1. .................................................. 169
Figure 46 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs et de riz en fonction
des aflatoxines (G1, B1, G1, G2) ................................................................. 169
Figure 47 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs et de riz en fonction
des teneuses en aflatoxines supérieures aux normes fixées par l’UE dans
les céréales analysées ................................................................................... 170

XVI
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Catégories de champignons selon leur gamme de température de

développement (Roquebert, 1997). ...................................................................12
Tableau 3 : Espèces de champignons des genres Aspergillus et Penicillium productrice
d’ochratoxines (Holmberg et al., 1999) .............................................................24
Tableau 4 : Les différentes ochratoxines en fonction des radicaux R (Höhler, 1998). ............... 26
Tableau 5 : Espèces de Fusarium et mycotoxines associées .....................................................53
Tableau 6 : Moisissures et mycotoxines associées ...................................................................54
Tableau 7 : Moisissures et mycotoxines associées ayant des impacts ponctuels sur la
santé humaine et la santé animale (AFSSA, 2009 ; Boudih, 2011 )....................54
Tableau 8 : Évolution des productions agricoles (tonnes) 2012/2013 et comparaison par
rapport à celles de 2011/2012 et à la moyenne des cinq (5) années.
(MADS, 2012)...................................................................................................63
Tableau 9 : Résultats définitifs de la campagne agricole 2012/2013. Unités : Superficie
en Ha, rendement en kg/Ha, production en tonne (INS, 2013). ...........................80
Tableau 10 : Adsorption des mycotoxines par des levures ou produits dérivés de levure
(Jard, 2009). .....................................................................................................86
Tableau 11 : Adsorption des mycotoxines par des bactéries lactiques (Jard, 2009). .................87
Tableau 12 : Répartition des échantillons de céréale en fonction du marché. ............................98
Tableau 13 : Composition des différents solvants utilisés pour l’analyse de l’OTA .................. 100
Tableau 14 : Composition des différents solvants utilisés pour l’analyse des AFs et
d’OTA ...............................................................................................................107
Tableau 15 : Nombre d’échantillons analysés ..........................................................................119
Tableau 16 : Taux de contamination des denrées alimentaires analysées ..................................123
Tableau 17 : Souches de moisissures isolées des échantillons de céréales et d’arachide ............125
Tableau 18 : Souches de moisissures isolées des échantillons de céréales et d’arachide
(suite) ................................................................................................................126
Tableau 19 : Moisissures mycotoxinogène ...............................................................................134
Tableau 20 : Résultats de l’analyse de l’OTA dans les denrées alimentaires en
provenance de la République du Niger ...............................................................149
Tableau 21 : Temps de rétention des aflatoxines (G1, B1, G2, B2) ...........................................160
Tableau 22 : Teneur des AFs et de l’AFB1 dans le maïs en provenance de la république
du Niger. ............................................................................................................161
Tableau 23 : Teneur des aflatoxines dans les échantillons de Maïs par les aflatoxines ..............162
Tableau 24 : Teneur des AFs et de l’AFB1 dans le riz en provenance de la république
du Niger ............................................................................................................166
Tableau 25 : Teneur des aflatoxines dans les échantillons de Riz par les aflatoxines .................167

XVII
 LISTE DES ANNEXES

ANNEXE 1- ASPECTS MACROSCOPIQUE ET MICROSCOPIQUE DE

QUELQUES MOISISSURES ISOLEES...................................................... 221
ANNEXE 2- PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURES ........................................ 223
ANNEXE 3- REGLEMENTATION SUR LES AFs ET L’OTA........................................... 226
ANNEXE 4- PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DES AFs ET DE L’OTA ................ 233
ANNEXE 5- BIOSYNTHÈSE DES AFLATOXINES ET DE L’OCHRATOXINE.............. 236
ANNEXE 6- ALIMENTS, CONTAMINANTS FONGIQUES et MOYENS DE LUTTE
CONTRE LES MYCOTOXINES ................................................................ 238
ANNEXE 7- ÉTUDE RÉTROSPECTIVE (1992-2006) DES CANCERS AU NIGER ........ 241
ANNEXE 8- MÉTHODES D’ANALYSES ........................................................................ 243

XVIII
 SOMMAIRE
PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS .................................................................... II
DEDICACES ......................................................................................................................... V
REMERCIEMENTS ........................................................................................................ VIII
ACRONYMES .................................................................................................................... XI
RÉSUMÉ ........................................................................................................................... XIII
SUMMARY .......................................................................................................................XIV
LISTE DES FIGURES ...................................................................................................... XV
LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................... XVII
LISTE DES ANNEXES ................................................................................................. XVIII
SOMMAIRE......................................................................................................................XIX
Introduction Générale ............................................................................................................1
PARTIE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE ..........................................................................4
I. Introduction .....................................................................................................................5
CHAPITRE I : MOISISSURES ALIMENTAIRES .................................................................8
A-Généralité sur les moisissures ...........................................................................................8
1. Introduction .................................................................................................................8
2. Usage des moisissures ..................................................................................................8
3. Caractéristiques des moisissures ................................................................................10
4. Classification des moisissures ....................................................................................12
5. Isolement et identification des moisissures .................................................................14
6. Principaux genres fongiques responsables de la synthèse d’AFs et d’OTA .................16
7. Autres genres fongiques responsables de la synthèse de mycotoxines.........................21
CHAPITRE II : CONTAMINATION DES ALIMENTS PAR LES MYCOTOXINES ..........23
A-Ochratoxine A ................................................................................................................23
1. Introduction ...............................................................................................................23
2. Ochratoxines et moisissures associées ........................................................................23
3. Structure et propriétés physico-chimiques de l’OTA ..................................................25
4. Toxicité de l’ochratoxine A. .......................................................................................27
5. Métabolisation de l’ochratoxine A .............................................................................28
B-Les Aflatoxines (AFs).....................................................................................................34
1. Introduction ...............................................................................................................34

XIX
 2. Conditions de production des aflatoxines par Aspergillus ...........................................35
3. Structure chimique des aflatoxines .............................................................................36
4. Propriétés physico-chimiques des Aflatoxines ............................................................38
5. Toxicité des Aflatoxines ............................................................................................39
6. Métabolisation des l’aflatoxines .................................................................................42
C-Autres Mycotoxines .......................................................................................................46
1. Les fumonisines .........................................................................................................46
2. La zearalenone (ZEA) ................................................................................................47
3. Les toxines T-2 et HT-2 .............................................................................................49
4. Le déoxynivalenol (DON) ..........................................................................................50
5. La Patuline (PAT) ......................................................................................................51
D-Mycotoxines et champignons toxinogenes ......................................................................52
1. Moisissures des champs .............................................................................................52
2. Moisissures de stockage .............................................................................................52
CHAPITRE III : MÉTHODES DE CONTRÔLE DES MYCOTOXINES DANS LES
PRODUITS ALIMENTAIRES, VALIDATION, PREVENTION ET REGLEMENTATION . 55
A-Procédure de contrôle .....................................................................................................55
1. Échantillonnage .........................................................................................................55
2. Méthodes d’analyses ..................................................................................................56
3. Méthodes rapides de criblage .....................................................................................59
B-Validation .......................................................................................................................60
1. Validation de la Méthode ...........................................................................................60
C-Production agricole et prévention et décontamination des aliments par les mycotoxines . 62
1. Production Agricole ...................................................................................................62
2. Prévention de la contamination des aliments par les mycotoxines...............................81
3. Décontamination des aliments par les mycotoxines ....................................................81
4. Procédés chimiques ....................................................................................................83
5. Procédés biologiques .................................................................................................85
D-Réglementations .............................................................................................................88
1. Réglementation nationale ...........................................................................................88
2. Réglementations internationale ..................................................................................89
PARTIE II - MATERIEL ET METHODES ........................................................................90
CHAPITRE I : ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES MOISISSURES DES
CÉRÉALES ET ARACHIDES .............................................................................................91

XX
 1. Principe .....................................................................................................................91
2. Description du site .....................................................................................................91
3. Présentation des échantillons ......................................................................................94
4. Mesure de l’humidité des grains .................................................................................95
5. Isolement et identification des moisissures .................................................................95
6. Conservation des souches...........................................................................................97
CHAPITRE II : ETUDE DE LA CONTAMINATION DES ALIMENTS PAR
L’OCHRATOXINE A (OTA) ................................................................................................98
1. Échantillonnage .........................................................................................................98
2. Analyse de l’OTA ......................................................................................................99
3. Préparation du standard de l’OTA ..............................................................................99
4. Conditions chromatographiques ............................................................................... 100
5. Analyse de l’ochratoxine A ...................................................................................... 101
6. Dosage de l’OTA ..................................................................................................... 102
7. Confirmation OTA................................................................................................... 104
8. Estimation de l’exposition de la population de Niamey à l’OTA pour chaque
aliment .................................................................................................................... 104
CHAPITRE III : ETUDE DE LA CONTAMINATION DU MAÏS ET DU RIZ PAR LES
AFLATOXINES (AFs) ....................................................................................................... 105
PARTIE III- RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................... 116
CHAPITRE I : ETUDE MYCOLOGIQUE DES CEREALES ET ARACHIDES. ............... 117
1. Taux d’humidité des échantillons de céréales et d’arachides .................................... 117
2. Discussion de nos résultats....................................................................................... 119
3. Espèces fongiques identifiées ................................................................................... 127
4. Souches fongiques isolés de chaque denrée alimentaire ............................................ 135
5. Moisissures isolées et mycotoxines associées ........................................................... 146
6. Conclusion ............................................................................................................... 147
CHAPITRE II : ETUDE DE LA CONTAMINATION DES CEREALES ET DE
L’ARACHIDE PAR L’OTA ................................................................................................ 148
1. Performance de la méthode et choix du solvant ........................................................ 148
2. Analyse de l’OTA .................................................................................................... 148
3. Estimation de l’exposition à l’OTA à Niamey .......................................................... 156
4. Conclusion ............................................................................................................... 158
CHAPITRE III : ETUDE DE LA CONTAMINATION DU MAÏS ET DU RIZ PAR LES
AFLATOXINES (AFs) ....................................................................................................... 159

XXI
 1. Analyse des aflatoxines (Afs) ................................................................................... 159
2. Contaminations des céréales par les AFs et l’incidence du Cancer du Foie. .............. 168
3. Estimation de l’exposition aux AFs à Niamey .......................................................... 172
4. Conclusion ............................................................................................................... 175
Conclusion générale et perspectives ................................................................................... 176
REFERENCES ................................................................................................................... 178
WEBOGRAPHIE ............................................................................................................... 220
ANNEXES ........................................................................................................................... 221

XXII
Introduction Générale

1
 Jadis, autosuffisant en denrées alimentaires et même exportateur de céréales jusqu'à la
fin des années soixante, le Niger est devenu un pays fortement déficitaire en matière de
production de ces denrées. Les statistiques des services nationaux font ressortir un déficit
céréalier assez inquiétant, une année sur trois (FAO, 2011).

Les besoins céréaliers nationaux sont de l’ordre de 3.500.000 tonnes pour une moyenne
de production céréalière disponible de 2.800.000 tonnes en année de bonne production. Le
fort taux d’accroissement de la population réduit les taux de couverture alimentaire. La
production céréalière moyenne par tête est de l’ordre de 215 kg/personne et par an. Ce chiffre
descend jusqu’à 190 voir 150 kg/personne/an pendant les années de mauvaise production
comme celles de 1973, 1984 ou 2004 (Yayé et Gado, 2006).

L’insécurité alimentaire est caractérisée par une période de soudure longue et sévère, et
par une forte vulnérabilité structurelle qui rend la population rurale très sensible aux chocs de
nature climatique ou économique (FAO, 2009). En 2010, l’insécurité alimentaire a atteint
globalement 17,3% de la population. Environ 6 familles sur 10 ne peuvent couvrir leurs
besoins alimentaires que pour 3 mois.

Le modèle alimentaire de la République du Niger est basé sur la consommation de

céréales, principalement de millet en milieu rural. Les autres céréales ; sorgho, mais, riz et blé
ont une importance bien moindre. Toutefois avec les fréquents déficits céréaliers que connaît
le pays ; les racines, les tubercules et les légumes sont de plus en plus produits et consommés
comme repas principaux (RdN, 2006 ; FAO.FAOSTAT, 2006).

Aussi avec la malnutrition qui sévit de manière endémique, notamment chez les
enfants de moins de 5 ans ; environ 4 enfants sur 10 sont dans une situation de sous nutrition
chronique et 1 sur 10, dans une situation de sous‐nutrition aigue. Avec le déficit chronique des
produits vivriers, notamment céréaliers, l’insécurité alimentaire devient de plus en plus
inquiétante.

Face à cette précarité que vit le Niger, s’ajoute les contaminations des denrées
alimentaires par les molécules chimiques polluantes et parfois toxiques à faibles doses
(xénobiotiques) notamment ; les mycotoxines, les pesticides, les métaux lourds, les additifs
alimentaires etc. Ces contaminants peuvent s’avérer très dangereux et par conséquent,
susceptibles d’être à l’origine de maladies très graves.

2
 Parmi ces contaminants alimentaires, les mycotoxines sont celles qui ont
particulièrement retenu notre attention. Ce sont des métabolites secondaires, hautement
toxiques à faible dose et sécrétées par des champignons microscopiques. Elles sont connues
surtout en raison des intoxications (chroniques ou aigües) qu’elles provoquent chez les
animaux et l’Homme, suite à la consommation d’aliments contaminés.

Les mycotoxines sont reconnues pour leurs caractères cancérogènes,

immunosuppresseurs, œstrogènes, tératogènes etc. Elles peuvent aussi être à la base
d’énormes pertes économiques à l’agriculture et aux industries agroalimentaires.

Au vu des gigantesques pertes économiques et des problèmes sanitaires dont les

mycotoxines sont la cause ; un grand intérêt leur est actuellement accordé à travers le monde.
Ainsi pour garantir la santé des consommateurs, chaque pays se voit dans l’obligation
d’adopter une législation spécifique pour les principales mycotoxines dans les aliments
susceptibles d'héberger des moisissures toxinogènes (Boudra, 2009 ; Lubulwa and Davis,
1994).

L’objectif du présent travail est la réalisation pour la première fois, d’une étude sur
l’état sanitaire en termes de mycotoxines (AFs et OTA), des denrées alimentaires notamment,
le maïs, le riz, le millet, le sorgho et l’arachide ; très consommées en République du Niger.

3
PARTIE I : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE

4
I. Introduction

Les mycotoxines sont des substances chimiques (toxiques pour l’Homme et les
animaux), synthétisées par des champignons microscopiques tels qu’Aspergillus, Penicillium,
Fusarium, Alternaria et Claviceps,… Actuellement il existe plus de 400 mycotoxines qui
peuvent contaminer de nombreuses denrées alimentaires (Steyn, 1998).

Au contact (ingestion, Toucher, inhalation), celles-ci peuvent être à l’origine de toxicité

chronique ou aiguë allant des effets délétères sur le système nerveux central, l’appareil
cardiovasculaire, l’appareil respiratoire, ainsi que sur l’appareil digestif et à la mort (Dao,
2005). La palette des effets néfastes des mycotoxines est très étendue. Elles peuvent avoir des
effets carcinogènes (cancer du rein, du foie), mutagènes, tératogènes, immuno-modulateurs,
œstrogènes (dérèglements hormonaux ou avortement), nécrosants, hépatotoxiques, hémato
toxiques (Hope & Hope, 2012).

La contamination des aliments par les mycotoxines est un phénomène connu depuis
plusieurs décennies dans de nombreuses contrées du monde. La plus connue de ces maladies
est celle qui a sévi en Europe, dès le moyen âge, et provoquant suite à la consommation de
seigle contaminé par des alcaloïdes de l’ergot (produits par la moisissure Claviceps purpurea)
des hallucinations collectives attribuées longtemps à des effets de sorcellerie.

On donna à cette maladie le nom de « Feu de Saint Antoine». Les victimes se comptent
par milliers. Ces dernières se rendaient en grand nombre sur la tombe de Saint Antoine en
France, dans l’espoir d’être guéries. Des hommes, femmes et enfants mouraient avec des
douleurs atroces (Bove, 1970 ; Beardall et Miller, 1994).

De manière générale, les mycotoxines sont définies comme étant des métabolites
secondaires, de faible poids moléculaire, produites par les moisissures et provoquant de
nombreuses maladies chez l’homme et l’animal (Coker, 1997).

Les alcaloïdes de Claviceps purpurea sont historiquement, les premières mycotoxines

décrites dans la littérature (Bove, 1970). Une autre mycotoxine ayant marquée l’histoire de la
mycotoxicologie est l’acide pénicillique, isolé à partir de maïs contaminé par le genre
Penicillium (Alsberg et Black, 1913).

On désigne sous le terme « mycotoxines », les métabolites secondaires toxiques qui sont
produits par les moisissures. Les maladies qu’elles provoquent sont appelées
« mycotoxicoses ». Ce terme n’existe que depuis les années 60 du XXème siècle.

5
 Entre 1942 et 1947, dans l'Est de la Russie, la consommation de farines (blé, orge)
contaminées par des moisissures appartenant aux genres Fusarium et Trichoderma a provoqué
une intoxication collective sévère, l’Aleucie Toxique Alimentaire (ATA) ; décimant les
populations de villages entiers. Les toxines élaborées par ces espèces seront isolées plus tard
et étudiées sous le nom de Trichothécènes.

Une autre maladie chronique rénale humaine, évoluant lentement vers la mort, localisée
dans les Balkans (Roumanie, Bulgarie, Croatie… le long du Danube et de ses affluents), avait
provoqué chez les populations (surtout les femmes de 30 à 50 ans) une diminution de la taille
des reins avec une dégénérescence des tubules proximaux.

Au Maroc, dès 1945 on signalait déjà à l’Institut d’Hygiène où une intoxication de porcs
est provoquée par une alimentation moisie (Lafont, 1970).

Bien que la découverte de l’ochratoxine A (OTA) ait eu lieu en 1965 par une équipe
Sud Africaine au cours d’une recherche systémique sur les mycotoxines, l’étiologie de la
maladie des Balkans est restée longtemps inconnue, malgré d'importantes recherches
financées par l'OMS dans les années 1980 (investigations sur virus, métaux lourds, facteurs
génétiques). L’espèce de moisissure incriminée dans la production de cette mycotoxine est
Aspergillus ochraceus (Van der Merwe et al., 1965 a,b).

Toutes ces «épidémies» sont passées plus ou moins inaperçues des «autorités sanitaires»
de ces époques. Il a fallu attendre l’année 1960 pour qu’on prenne conscience que, ces
moisissures ne sont pas que de simples souillures sur des denrées alimentaires ; mais qu’elles
sont destructrices, ravageuses des cultures et qu’elles peuvent aussi produire de substances
toxiques.

Aux environs de Londres en 1960, des élevages de dindonneaux ont été atteints d’une
grave intoxication, appelée autrefois « maladie X des dindons » ou «Turkey-X-Disease»,
provoquée par l’ingestion de tourteaux d’arachides en provenance du Brésil. Pour la première
fois, la relation a été établie entre une intoxication et la présence d’une moisissure
(Aspergillus flavus) parasitant les champs d’arachides. Un an plus tard, les anglais isolèrent
pour la première fois une des molécules responsables : l’aflatoxine B1 (AFB1) (Bradburn,
1994).

Plus tard, un grand nombre d’espèces au sein des genres Aspergillus et Penicillium ont
été reconnues ochratoxinogènes. Plusieurs maladies humaines sont spéculées ou attribuées à
cette mycotoxine, telles que la néphropathie endémique des pays du Balkans (Petrova-

6
Bocharova et al., 1988), les tumeurs du tractus urinaire et rénales observées en Tunisie
(Zinedine et al., 2007) et en Égypte (Waffa et al., 1998) ; (Pfohl-Leszkowicz et al., 2002) ;
(Chapeland- Leclerc et al., 2005).

Les recherches ultérieures, amenèrent à la découverte d’autres mycotoxines et

aboutirent à la mise en évidence d’un pouvoir cancérogène intense de certaines de ces toxines,
entraînant ainsi le début de travaux scientifiques d’envergure. La liste de ces mycotoxines est
impressionnante (plus de 300) et ne cesse d’augmenter (Chapeland-leclerc et al., 2005 ;
Intercéréales, 2014 ; Darwish et al., 2014).

Les mycotoxines sont présentes dans toute une série de produits de l’alimentation
humaine et animale, et elles provoquent de nombreuses maladies (Coker, 1997). Ces
métabolites secondaires produits par les moisissures (en l’occurrence Aspergillus, Penicillium,
Fusarium), représentent un réel danger pour la santé humaine et animale.

Chaque année, des milliers de tonnes de denrées alimentaires sont contaminés par les
mycotoxines, causant ainsi des pertes économiques considérables (Saleemi et al., 2012). Dans
les pays d’Amérique du Nord, la productivité des animaux a connu des pertes énormes
estimées à des billions de dollars par année (Miller, 1988).

Certaines études ont montré que 20 à 29 % de la production du maïs et même 22 à 45%

de la production d’arachides en provenance de l’Indonésie, des Philippines et de la Thaïlande
dépassent une concentration en aflatoxines de 50 μg/kg (Lubulwa et Davis, 1994).. De ce
fait, ces denrées sont soumises à des restrictions d’exportations vers les pays disposant des
réglementations sur les limites des résidus de mycotoxines.

On estime à plus de 130 millions de dollars les pertes économiques annuelles du sorgho
dues aux moisissures en Asie et en Afrique (Chandrashekar et al., 2000).

7
 CHAPITRE I : MOISISSURES ALIMENTAIRES

A- Généralité sur les moisissures

1. Introduction

Les moisissures sont des champignons microscopiques, ubiquistes, eucaryotes,

hétérotrophes, pluricellulaire, filamenteux, sans organisation tissulaire et qui peuvent se
reproduire soit sexuellement soit de façon asexuée (Nishio et al., 2008). L’appareil végétatif
(le thalle), est formé de longs filaments ramifiés et souvent cloisonnés (hyphes mycéliens).

Dans les conditions environnementales appropriées, l’ensemble des hyphes constitue un

mycélium visible à l’œil nu et chargé de spores de couleur variée (vert, jaune, blanc, noir,
gris…).

En raison de la structure filamenteuse du thalle qui les rend particulièrement aptes à

coloniser des substrats solides ; les moisissures peuvent alors acidifier, décolorer, fermenter et
altérer la qualité organoleptique des aliments.

Les moisissures regroupent des milliers d’espèces. Ces champignons produisent des
spores qui sont invisibles à l’œil nu et qui peuvent passer, chez la plupart des espèces, en
suspension dans l’air. Elles peuvent également élaborer des substances chimiques susceptibles
de demeurer à l’intérieur des spores, ou d’être libérées dans les matériaux qu’elles colonisent
ou encore d’être libérées dans l’air ambiant (D’Halewyn, 2002).

2. Usage des moisissures

Les champignons sont d'un grand intérêt pour l'Homme dans plusieurs domaines
d'activités.

En agroalimentaire, certains champignons, à l'instar de la levure Saccharomyces

cereviceae, sont utilisées en fromagerie et en pâtisserie, mais également dans la production de
boissons alcooliques par fermentation (Piskur et al., 2006).

Dans le domaine médical, la levure Saccharomyces cerevisiae est un organisme modèle

pour l’étude des processus cellulaires, et le premier eucaryote dont le génome a été
complètement séquencé (Goffeau et al., 1996).

8
 En écologie, les champignons saprophytes participent au maintien de l'équilibre
écologique en libérant dans l'environnement, à partir de la matière qu'ils décomposent, du
carbone et des sels minéraux (Joffin, 2003).

En biotechnologie, les champignons tels que Ashbya gossypii, sont exploités dans la
production de vitamines A, B ou D (Santos et al., 2009). Dans le domaine de la pharmacie,
plusieurs espèces de champignons sont utilisées pour la synthèse de médicaments. Le
polysaccharide K, produit chimique dérivé de Trametes versicolor, est utilisé comme adjuvant
dans le traitement du cancer (Dongmo, 2009). Les pénicillines sont utilisées dans le
traitement d'infections bactériennes, principalement contre des bactéries à Gram positif.
Environ 22% des antibiotiques identifiés sont produits par les champignons filamenteux
(Strohl, 1997). La pénicilline est produite par P. chrysogenum, la céphalosporine par
Cephalosporium acremonium etc.

En agriculture, les champignons tels que Beauveria bassiana sont utilisés dans la lutte
biologique. Ce champignon permet de lutter contre le doryphore dans la culture des pommes
de terre ou contre une chenille responsable de la pyrale du maïs (Becker., et al., 1998).

Bien que les champignons soient exploités dans tous ces domaines, plusieurs sont des
parasites des plantes et peuvent produire des substances chimiques (connues sous le nom de
mycotoxines) hautement toxiques pour l'Homme et les animaux.

Ainsi Le groupe des Deutéromycètes comprend de nombreuses espèces d'importance

économique mondiale. Les genres majeurs sont : Penicillium, Fusarium, et Aspergillus.

Comme souligné précédemment, les champignons qui contaminent les aliments,

envahissent l'air que nous respirons par l'intermédiaire de leurs spores disséminées par le vent.
Ces spores sont responsables de certaines allergies et maladies graves. L'aspergillose
pulmonaire est un exemple de maladie de l'appareil respiratoire, causée par inhalation des
spores de moisissures du genre Aspergillus, (Kamanfu et al., 1993).

Les récoltes poussant sous des climats chauds, humides et exposées aux moisissures
toxinogènes peuvent être contaminées par les mycotoxines. C'est le cas notamment des fruits
à coque, des arachides, des graines de coton, des noix, des épices, du soja, des fruits secs, des
céréales et leurs dérivés etc. Ainsi la consommation de ces denrées alimentaires contaminées
conduit à des mycotoxicoses récurrentes à travers le monde (Maslin, 2004).

9
 3. Caractéristiques des moisissures

3.1. Caractéristique structurale

Les moisissures sont caractérisées par une paroi cellulaire qui contient, des glucanes (α-
1,3-glucane) cellulose, des mannanes et de la chitine. La membrane cellulaire des
champignons est constituée de stérols (l'ergostérol principalement), et leur cytoplasme est
dépourvu de chlorophylle.

Les moisissures ont un matériel génétique confiné dans un noyau au même titre que les
plantes et les animaux. Elles possèdent toutefois un certain nombre de caractéristiques, qui
font en sorte que les taxonomistes les classent dans un règne distinct, soit celui des mycètes
ou cinquième règne (Kendrick, 1999 ; Malloch, 1997).

La plupart des champignons microscopiques possèdent un mycélium, constitué de tubes

appelés hyphes. Chez les champignons supérieurs, les hyphes sont cloisonnés ou septés,
tandis que chez les champignons inférieurs ou primitifs, les cloisons intercellulaires sont rares
ou inexistant (Stevens et al., 2006).

3.2. Composition chimique du substrat

Le développement d’un champignon sur un substrat donné, est lié à des propriétés
inhérentes au champignon, telle que la capacité à produire des métabolites (enzymes,
pigments, synthèse de toxines).

Outre les propriétés inhérentes au champignon à dégrader un substrat, la composition

même de celui-ci influe sur le développement du champignon. En effet, la présence d’atomes
tels que le carbone ou l’azote favorise la croissance du champignon (Meletiadis et al., 2001).

3.3. Humidité relative et activité en eau (aw)

Le maintien d’une humidité ambiante à des taux inférieurs à la gamme de

développement des moisissures est primordial afin de préserver les aliments d’une
colonisation fongique.

Dans les greniers ou magasins, les denrées alimentaires se mettent en équilibre avec
l’humidité relative ambiante. Ainsi, le développement fongique dépend non seulement de
l’humidité relative ambiante, mais aussi de l’activité en eau du substrat (RH = aw *100).

10
 L’activité en eau mesure la disponibilité en eau d’un substrat donné. Les valeurs de l’aw
vont de 0 à 1. C’est le rapport de la pression partielle d’eau de ce substrat sur la pression de
l’eau pure à la même température selon la formule : aw = P H2O substrat / P H2O pure.

La majorité des moisissures se développent à une aw située entre 0,85 et 0,99. Les
champignons se développant à fort taux d’humidité sont qualifiés d’hygrophiles. C’est le cas
par exemple de Cladosporium, Fusarim et des Mucorales. D’autres champignons xérophiles
ont la capacité de se développer à une aw inférieure à 0,85 (Pitt et Hacking, 1997 ; Boudih,
2011).

3.4. Température

La température joue un rôle prépondérant sur la croissance, le développement, la

physiologie des moisissures (la compétition entre les espèces, production de mycotoxines...).

Suivant la gamme de température à laquelle les moisissures se développent, on peut

distinguer quatre catégories de moisissures, des plus fréquentes au moins fréquentes, citées
dans le tableau1.

La plupart des moisissures sont mésophiles et se développent très bien à température

ambiante (20-25°C), mais leur croissance peut commencer en-dessous de 4°C. Les Aspergillii
se développent plutôt bien vers 30°C sous des climats tropicaux, chauds et humides (Pitt et
al., 2000). Des espèces thermophiles d’A. fumigatus peuvent croître même à des températures
avoisinant 55°C. Les Fusaria se développeront plutôt vers 20-25° C et elles sont couramment
rencontrées dans les climats tempérés. Les Penicillia (70-80 % de ses espèces sont aptes à
synthétiser des mycotoxines) peuvent également croître à des températures assez fraîches (<
10°C) (Nguyen, 2007).

Les spores des moisissures sont thermorésistantes. La majorité des spores supportent les
températures normales de stérilisation (120°C pendant 20 min). En général, la température
optimale pour la production des mycotoxines est inférieure à celle requise pour la croissance
du microorganisme producteur.

Le pH du milieu est un facteur important dans la croissance des moisissures et la

production des mycotoxines. La plupart des moisissures croissent dans des pH acides et
peuvent tolérer des valeurs de pH très basses.

11
 Tableau 1 : Catégories de champignons selon leur gamme de température de
développement (Roquebert, 1997).

Types de champignons Gamme de température Température optimale

Mésophiles 0 à 50°C 15 à 30°C

Thermophiles 20 à 50°C 35 à 40°C

Thermotholérants 0 à 50°C 15 à 40°C

Psychrophiles 0 à 20° 0 à 17°C

4. Classification des moisissures

L’ensemble de ces caractéristiques citées ci-dessus fait en sorte que les taxonomistes
classent les champignons dans un règne distinct, soit celui des mycètes (Kendrick, 2000 ;
Malloch, 1997).

Les champignons constituent un règne à part au sein des eucaryotes (fungi). Les
classifications les plus récentes font apparaître les champignons dans le groupe des
Opisthokonta (Adl et al., 2005 ; Simpson et Roger, 2002, 2004). À l’instar des autres
organismes vivants, les champignons sont subdivisés en classes, en ordres, en familles, puis
finalement, en genres et en espèces. Ces deux derniers termes sont utilisés pour les désigner.

La classification des moisissures, tout comme celle des autres champignons, est
d’abord basée sur le mode de reproduction sexuée. Ce critère définit quatre des cinq classes
des mycètes, soit les Chytridiomycètes, les Zygomycètes, les Basidiomycètes et les
Ascomycètes. Certaines moisissures sont le plus souvent ou exclusivement rencontrées à un
stade de multiplication asexuée, dit anamorphe. Ces organismes sont alors classés d’après le
mode de production des spores asexuées ou conidies. Ces espèces sont insérées dans la
cinquième classe, les Deutéromycètes (figure 1 et tableau 2).

Chez les champignons supérieurs, au stade anamorphe le mycélium végétatif est formé
d’hyphes septés colorés ou non. Une cellule hyphale à parois épaisse donne naissance au
conidiophore. Celui-ci se termine par une vésicule qui peut être de forme allongée (c’est le
cas d’Aspergillus), elliptique ou globuleuse donnant naissance aux cellules fertiles

12
conidiogènes portant les conidies. La zone fertile de la vésicule s’appelée stérigmate, peut être
unisérié.

Tableau 2 : Classification des mycètes (Blackwell et al., 1998).

Protozoaires

Chromistes

Plantes

Animaux

Chytridiomycètes
Eucaryote
Monde vivant Zygomycètes
(Matériel génétique dans un noyau)
Mycètes →
Basidiomycètes
(champignons)
Ascomycètes

Deutéromycètes

Procaryote Eubactéries
(Matériel génétique diffus) Archaebactéries

Chytridiomycota

Neocallimastigomycota

Blastocladiomycota

Zygomycotina

Glomeromycota

Ascomycotina

Basidiomycota

Figure 1 : Les grands groupes des eumycètes (Durrieu, 2008).

13
 Dans ce cas, les cellules conidiennes naissent alors directement des phialides. Dans le
cas où le stérigmate est bisérié, il y a présence des métules entre la vésicule et les phialides.

Certains champignons, chez qui les deux formes coexistent sont appelés holomorphes.
Différents groupes de moisissures ont été définis suivant leur mode de reproduction sexuée et
les caractéristiques de leur spore. Les Zygomycètes possèdent des spores contenues à
l’extérieur d’une cellule renflée, les Ascomycètes ont des spores regroupées dans des sortes de
sacs « asques », les Basidiomycètes qui ont des spores portées par des basides, et les
Hyphomycètes qui sont un groupe hétérogène dont on ne connaît pas actuellement, pour la
plupart, la forme de reproduction sexuée (Kiffer et Morelet, 1997 ; Cahagnier et al., 1998).

Les Deuteromycota ou Deutéromycètes ou « champignons imparfaits » appartiennent

aux champignons septés, à hyphes septés, se multipliant de façon non sexuée, dite
« végétative ». Ceci étant, on ne connaît pas encore leur forme de reproduction sexuée, s'ils en
ont une. Ils constituent donc un ensemble hétérogène et polyphylétique. Ainsi, la
classification des champignons est généralement basée sur les caractéristiques de leurs
structures de reproduction.

5. Isolement et identification des moisissures

Les champignons microscopiques filamenteux sont nommés selon des règles

internationales précises énoncées au XVIIIème siècle par Carl Von Linné.

La nomenclature comprend essentiellement un nom de genre, suivi du nom de l’espèce

et du nom de l’auteur l’ayant décrit. L’identification de la très large panoplie d’espèces
fongiques susceptibles de coloniser les aliments et d’en altérer les qualités organoleptiques et
nutritionnelles, voire de produire des mycotoxines, est une étape nécessaire à l’évaluation des
risques mycologiques et toxicologique.

Cette identification a pendant longtemps été exclusivement basée sur l’observation des
caractères culturaux et morphologiques de l’espèce.

Les progrès récents de la biologie moléculaire ont permis de proposer des outils d’aide à
l’identification. Toutefois, la complexité du règne fongique fait qu’à l’heure actuelle, ces
outils ne peuvent pas encore remplacer complètement l’examen morphologique, qui reste la
base de l’identification.

14
 5.1. Isolement des moisissures et milieux de cultures

Le choix des milieux de cultures est aussi déterminant dans l’isolement et le

dénombrement de la microflore du produit à analyser.

Trois catégories de milieux peuvent être distinguées :

− les milieux de routine peu sélectifs, permettant l’isolement d’un grand nombre de
moisissures ;

− les milieux sélectifs adaptés à la recherche d’une espèce ou d’un groupe d’espèces à
écologie particulière et difficile à mettre en évidence avec un milieu ordinaire ;

− et enfin les milieux différentiels utilisés pour la détermination de champignons

appartenant le plus souvent à des genres difficiles à identifier.

5.2. Identification des moisissures

L’identification d’une espèce fongique repose sur l’analyse de critères culturaux

(température et vitesse de croissance) et morphologiques. Ces derniers sont constitués des
paramètres macroscopiques (parmi lesquels nous avons : l’aspect des colonies, la couleur, leur
revers….) et microscopiques (entre autres, l’aspect du mycélium, des spores, des phialides,
des conidiophores) (Cahagnier et Richard-Molard, 1998).

5.3. Critères d’identification macroscopique

L’aspect des colonies représente un critère important d’identification. Les champignons

filamenteux forment des colonies duveteuses, laineuses, cotonneuses, veloutées, poudreuses
ou granuleuses. Parfois certaines colonies peuvent avoir une apparence glabre (l’absence ou
pauvreté du mycélium aérien).

Le relief des colonies : il peut être plat ou plissé et la consistance des colonies peut être
variable (molle, friable, élastique ou dure).

La taille des colonies : elle peut-être très variable en fonction des genres fongiques.

La couleur des colonies est un élément très important d’identification (recto-verso), (les
couleurs les plus fréquentes sont le blanc, le crème, le jaune, l’orange, le rouge allant jusqu’au
violet ou le bleu, le vert, le brun allant jusqu’au noir).

15
 Les pigments peuvent être localisés au niveau du mycélium (Aspergillus, Penicillium)
ou diffuser dans le milieu de culture (Fusarium) (Botton et al., 1990).

5.3.1. Critères d’identification microscopique

L’examen microscopique d’une colonie fongique se fait après réalisation d’un étalement
entre lame et lamelle et coloration de la préparation au Bleu Cotton.

Généralement, un examen à l’objectif 40 est suffisant pour mettre en évidence la plupart

des éléments importants d’identification : appareil végétatif, les spores et leur aspect, les
modes de formation des conidies, le mode de reproduction. (Cahagnier Richard-Mollard,
1998 ; Peterson, 2006 ; De Hoog et Guarro, 1995).

6. Principaux genres fongiques responsables de la synthèse d’AFs et

d’OTA

Les mycotoxines sont essentiellement produites par 5 genres de moisissures

d’importance économique : Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Claviceps et Alternaria
(Miller et Trenholm, 1994). Les genres les plus importants dans la production des
aflatoxines de l’ochratoxine A sont Aspergillus et Penicillium. Ils représentent les
contaminants les plus fréquents des aliments. On les retrouve principalement dans les
céréales, les arachides, mais aussi dans de nombreux autres produits végétaux et d’origine
animale (Delage et al., 2003 ; Lopez De Cerain et al., 2002 ; Filali et al., 2001 ; Otteneder
et Majerus, 2000).

6.1. Le genre Aspergillus

Les champignons du genre Aspergillus appartiennent au sous-embranchement des

Ascomycotina par leur mode de reproduction sexuée. Le thalle, hyalin ou coloré, présente un
mycélium cloisonné portant de nombreux conidiophores dressés, terminés en vésicule (Eltem
et al., 2004). La couleur de la partie aérienne des Aspergillus résulte de l’association du
mycélium, des têtes conidiennes, et des cléistothèces ou des sclérotes. C’est le premier critère
de classification des Aspergillus

16
 Ce genre comprend environ 185 espèces réparties en 18 groupes morphologiquement,
génétiquement et physiologiquement proches (Botton et al., 1990 ; Roquebert, 1998). Une
vingtaine d’espèces est impliquée dans des pathologies animales et humaines. Dans les
mauvaises conditions de stockage, ces champignons peuvent évoluer et devenir des parasites.

Certaines espèces peuvent être directement pathogènes pour l’Homme et les animaux en
étant capables d’envahir les tissus vivants et provoquer des aspergilloses (Aspergillus
fumigatus, A. niger) des mycoses pulmonaires, des allergies (Morin, 1994).

De nombreuses espèces d’Aspergillus sont aussi connues pour leur capacité à produire
des mycotoxines responsables de pathologies animales et humaines (mycotoxicoses).

Les Aspergillus ont une large répartition géographique, mais sont plus souvent associés
aux régions à climat chaud (Castegnaro et Pfohl-Leszkowicz, 2002). La plupart des
Aspergillus sont saprophytes, ils colonisent les végétaux déjà abimés par des blessures, des
piqûres d’insectes ou des attaques d’autres champignons, mais ils sont aussi présents à la
surface des graines (céréales, oléagineux…), des denrées alimentaires. Ils se développent sur
la matière organique en décomposition, dans le sol, les détritus, dans les composts.

En fonction de la température et du milieu de culture, la croissance dans le temps de la

moisissure ainsi que le diamètre atteint par celle-ci sur un milieu défini ; sont caractéristiques
de chaque espèce. Une colonie d’Aspergillus se développe en général dans l’intervalle de 7
jours sur milieu PDA ou MEA.

Sur certains milieux de culture, les Aspergillus se pigmentent. Ce caractère n’étant pas
toujours observé, il ne peut donc être utilisé comme critère de classification au niveau de
l’espèce. Le contour de la colonie varie en fonction de l’espèce. Il peut être mince, lisse,
épais, rugueux et lobé. La colonie peut avoir un aspect floconneux, velouté... ce caractère
facilite aussi le diagnostic.

Enfin, certaines espèces d’Aspergillus sont utilisées dans l’industrie agro-alimentaire et

dans l’industrie des produits biotechnologiques notamment pour la production d’enzymes,
d’acides organiques, (Botton et al., 1990). La figure 2 représente le dessin de la structure de
quelques espèces d’aspergillus

17
 Figure 2 : Schéma de la structure de quelques espèces d’Aspergillus
a : Aspergillus fumigatus ; b : Aspergillus nidulans ; c : Aspergillus niger ; d : Aspergillus terreus ; e :
Aspergillusversicolor ; a : Aspergillus flavus ;1 : conidie ; 2 : metule ; 3 : phialide ; 4 : vésicule ; conidiophore

18
 6.2. Le Genre Penicillium

Ce genre réunit des champignons filamenteux, appartenant au phylum des Ascomycètes.

Ce genre comprend environ 227 espèces définies essentiellement d’après les caractères du
thalle, des pénicilles et des spores (Pitt, 1988).

Les Penicillia sont des champignons pour la plupart très communs dans
l’environnement, polyphages, pouvant être responsables de nombreuses dégradations. Les
espèces du genre Penicillium se développent normalement sous les climats tempérés. Ils sont
saprophytes et peuvent devenir parasite en présence d’humidité lors du stockage. Il s’agit de
contaminants fréquents des régions tempérées.

Ce genre contamine divers substrats organiques notamment les céréales, les arachides,
les fruits, les légumes et les produits laitiers. Ces micro-organismes sont des saprophytes
considérés comme agents de contamination des denrées alimentaires ou utilisés comme agents
de synthèse ou de fermentation et comme producteurs d’antibiotiques (Pénicilline,
griséofulvine).

Les Penicillia (figure 3) sont caractérisés par un filament dressé (le stipe), qui porte des
cellules conidiogènes (phialides) groupées en pinceaux (d’où le nom de Penicillium), formant
des conidies en chaînes. Entre les phialides et les stipes, il peut y avoir des éléments
intermédiaires (branches et/ou métules) qui rendent l’organisation du pinceau plus complexe.

19
Penicillium verrucosum P. expansum P. brevicompactum

P. citrinum P. roqueforti P. commune

Figure 3 : Schéma de la structure de Penicillium

20
 7. Autres genres fongiques responsables de la synthèse de mycotoxines.

7.1. Le genre Fusarium

Les Fusarium sont des champignons filamenteux imparfaits appartenant à la classe des
Deutéromycètes. Les formes parfaites (sexuées) connues appartiennent à la classe des
Ascomycètes (Gibberella, Calonectria, Nectria, Plectosphaerella). Ce genre comprend 50 à 70
espèces, dont plusieurs sont phytopathogènes, provoquant sur les plantes cultivées des
maladies regroupées sous le terme de fusarioses.

Les Fusarium sont cosmopolites et ubiquitaires (céréales, plantes, graines, sol, etc.), très
communs. Certaines espèces saprophytes sont accessoirement capables de se développer en
tant que pathogènes secondaires sur des tissus végétaux sénescents. D’autres espèces sont
impliquées dans des allergies de type I, d’autres dans des pathologies graves, notamment chez
les individus immunodéprimés et chez les grands brûlés. Elles peuvent produire de
nombreuses mycotoxines relativement dangereuses (trichothécènes, toxine T-2, zéaralénone,
vomitoxine, déoxynivalénol, fumonisine, etc.). Les Fusarium ont un intérêt vétérinaire
important par la production de zéaralénone qui est un anabolisant et un stimulant de
croissance animale, en même temps une substance contraceptive (figure 4).

Figure 4 : Schéma de la structure de Fusarium

21
 7.2. Le genre Alternaria

Les Alternaria sont des champignons filamenteux imparfaits appartenant à la classe des
Deutéromycètes. Quelques formes parfaites (sexuées) sont connues et appartiennent à la
classe des Ascomycètes (Clathrospora, Leptosphaeria, Lewia, Pleospora). On connaît 44
espèces mais il y en a certainement près d’une centaine. Ce taxon est un pathogène de plantes
(notamment sur les céréales), mais il est également retrouvé sur des plantes sénescentes, sur
des débris organiques divers, sur le sol, sur des produits alimentaires, etc.

Les spores d’Alternaria sont relativement grandes, colorées (brunâtres) et

compartimentées par des septa (cloisons) transversaux, longitudinaux et/ou obliques. Même si
leur forme et leur taille peuvent être sujettes à de nettes variations, les spores d’Alternaria
sont pour la plupart ovoïdes à la naissance avec un sommet qui s’allonge progressivement
pour prendre finalement la forme d'une raquette ou d'une massue (figure 5).

Si cette moisissure a été quelques fois isolée chez l’homme au niveau de lésions
cutanées d’origine traumatique elle est surtout considérée comme un allergène majeur

Figure 5 : Schéma de la structure d’Alternaria

22
CHAPITRE II : CONTAMINATION DES ALIMENTS PAR LES
MYCOTOXINES

A- Ochratoxine A

1. Introduction

L'ochratoxine A (OTA) est un métabolite secondaire fongique découvert en 1965 par

une équipe Sud Africaine au cours d’une recherche systémique sur les mycotoxines (Van der
Merwe, 1965). Elle a reçu l’attention des chercheurs notamment en raison de son association
avec l'activité favorisant le cancer (IARC, 1993). L’OTA est également décrite comme étant
un puissant néphrotoxique, tératogène, avec des propriétés immunotoxiques, (Clark and
Snedeker, 2006).

Plusieurs maladies humaines sont spéculées ou attribuées à cette mycotoxine, telles que
la néphropathie endémique des pays des Balkans (Petrova-Bocharova et al., 1988), les
tumeurs du tractus urinaire et rénales observées en Tunisie (Maaroufi et al., 1996) et en
Egypte (Waffa et al., 1998).

L’OTA est largement documentée en tant que contaminant global d'une grande variété
d'aliments y compris les produits à base de céréales, les noix, les épices, le café, les raisins et
le vin (Urbano et al., 2001 ; Lin et al., 2005). La première espèce de moisissure incriminée
dans la production de cette mycotoxine est Aspergillus ochraceus. Plus tard, plusieurs espèces
au sein des genres Aspergillus et Penicillium ont été reconnues ochratoxinogènes.

2. Ochratoxines et moisissures associées

L’OTA est l'un des premiers métabolites fongiques qui s’est révélé toxique pour les
animaux, et qui, avec les aflatoxines, a lancé la science distinctive et diversifiée de
Mycotoxicologie durant les années 60.

L’ochratoxine A (OTA), ainsi que les ochratoxines B, C sont des mycotoxines produites
par des moisissures des genres Penicillium (P. verrucosum, P. nordicum, etc) et Aspergillus :
A. ochraceus, A. alliaceus, A. albertensis (dans la section Circumdati), A. niger, A.
carbonarius (dans la section Nigri) (Abarca et al., 1994 ; Varga et al., 1996) (tableau 3).

23
 Le genre Aspergillus est bien adapté aux climats chauds et humides alors que
Penicillium se développe bien dans les climats tempérés et dans les régions froides (Sweeney
and Dobson, 1998). C’est pour cette raison que l’OTA a été détectée dans de nombreux
produits agricoles de différentes régions du monde (Smith et al., 1994).

Tableau 3 : Espèces de champignons des genres Aspergillus et Penicillium

productrice d’ochratoxines (Holmberg et al., 1999)

Aspergillus Penicillum

A. ochraceus P. virvidicatum

A. sulphureus P. palitans

A. melleus P. commune

A. sclerotiorum P. variable

A. alliaceus P. purpurescens

A. ostianus P. cyclopium

A. petrakii P. verrucosum

A.elegans P.chrysogenum

A.fresenii P.expansum

A.glaucus (Eurotium herbariorum) P.nordicum

24
 3. Structure et propriétés physico-chimiques de l’OTA

Les ochratoxines résultent de la condensation d’un résidu phénylalanine et d’un dérivé

isocoumarinique. Elles sont assez stables à la température, quoique de façon moindre que les
aflatoxines. La formule brute de l’ochratoxine A est : C20H18ClNO6 Son numéro « Chemical
Abstracts Service » (CAS) est 303 (IARC, 1993). Sa dénomination scientifique est : L-
Phenylalanine, N-[(5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-méthyl-1-oxo-1H-2-benzopyranyl-7)-
carbonyl]-,(R), (IARC, 1993 ; Weidenburner, 2001). En fonction des substituants que
portent les radicaux R1, R2, R3 et R4 ; différentes ochratoxines peuvent être recensées (figure
6, tableau 4).

Parmi ces composés, l’OTA est la plus abondante et la plus toxique. C’est un solide
blanc de masse molaire 403,08 g/mole, ayant un point de fusion de 169°C lorsqu’elle est
cristallisée dans du xylène ; et 94 à 96°C dans le benzène.

Son spectre d’absorption UV varie avec le pH et la polarité du solvant. Le pic

d’émission maximale en fluorescence de l’ochratoxine A se situe à 428 nm.

L’OTA possède un maximum d’absorption à 333 nm avec un coefficient d’extinction

molaire de 6400 mol-1.cm-1 dans le méthanol. Dans les mêmes conditions, ce coefficient est de
7000 pour l’Ochratoxine C. L’OTB absorbe à 318 nm et a un coefficient d’extinction de 6900
(Cole et al., 2003b).

L’OTA est partiellement dégradée dans des conditions normales de cuisson, mais peut
aussi être transformée en 3-S-OTA (Bruinink et al., 1997). Elle est complètement dégradée
par un traitement à l’hypochlorite de sodium 4% (Castegnaro et al., 1991). L’ochratoxine B
diffère de l’ochratoxine A par l’absence d’un atome de chlore rendant cette molécule moins
toxique. Les ochratoxines sont modérément solubles dans les solvants organiques polaires
acidifiés mais leur sel de sodium est soluble dans l’eau.

25
Figure 6 : Structure chimique de l’OTA et ses dérivés en fonction de R1 (-COOH) et
R2 (-Cl), (Höhler, 1998).

Tableau 4 : Les différentes ochratoxines en fonction des radicaux R (Höhler, 1998).

NOM R1 R2

Ochratoxine A (OTA) H Cl

Ochratoxine B (OTB) H H

Ochratoxine C (OTC) CH2 Cl

CH3

Ochratoxine A méthyl ester H Cl

(phénylalanyl, méthyl ester)

Ochratoxine B méthyl ester H H

(phénylalanyl, méthyl ester)

Ochratoxine B éthyl ester H H

(phénylalanil, éthyl ester)

26
 4. Toxicité de l’ochratoxine A.

L’OTA est toxique pour l’homme et les animaux. Elle est potentiellement
néphrotoxique chez toutes les espèces testées, à l’exception des ruminants adultes,
(Krogh, 1992).

L’OTA est considérée comme un cancérogène rénal au moins lors d’une exposition à
long terme. Elle a été classée dans le groupe 2B « cancérogène possible pour l’homme » par
l’IARC. C’est un cancérogène formant des adduits à l’ADN suite à la formation de quinone
(Pfohl-Leszkowicz & Castegnaro, 2005 ; Tozlovanu et al., 2006 ; Pfohl-Leszkowicz &
Manderville, 2007). Cette mycotoxine est tératogène chez l’animal. Elle provoque, par
exemple, des anomalies morphologiques diverses chez le rat, la souris, le hamster, le porc et
l’embryon de poulet.

Chez les animaux, L’OTA est métabolisée dans le rumen en phénylalanine et en

ochratoxine α, qui n'est pas toxique. Elle peut également être estérifiée en ochratoxine C de
toxicité équivalente. L’OTA est bio-convertie par le cytochrome P450 des microsomes
hépatiques en hydroxy-ochratoxine A (OH-OTA) qui aurait des propriétés
immunosuppressives identiques à l’OTA.

L’OTA affecte l’immunité cellulaire et humorale. Elle est mutagène et génotoxique

dans des tests effectués sur mammifères (Pfohl-Leszkowicz & Manderville, 2007).

Au Danemark, des chercheurs ont mis en évidence la responsabilité de l'ochratoxine A

dans la néphropathie mycotoxique rencontrée chez les porcs et les volailles qui avaient ingéré
des aliments contaminés par cette toxine. Il semblerait que l’OTA agit en synergie avec une
autre mycotoxine (la citrinine) se développant sur les mêmes substrats (blé, maïs). A l'heure
actuelle, les 3 ochratoxines connues sont : OTA, OTB et OTα. (Pfohl-Leszkowicz et al., 2002
; Chapeland-Leclerc et al., 2005).

Les normes d’OTA tolérées par les pays européens dans les produits alimentaires ont
été fixées à 3 µg/kg dans les céréales transformés, 5 µg/kg dans les céréales brutes, 5 µg/kg
dans les grains de café, 2 µg/l dans le vin et le jus de raisin (Olsen et al., 2003 ; CE, 2006).

27
 5. Métabolisation de l’ochratoxine A

5.1. Métabolites formés.

Le métabolisme de l’OTA a été étudié de façon extensive, in vitro et in vivo, par

plusieurs équipes à travers le monde (Schwerdt et al., 1997,1998 ; Azémar, 2000 ; Faucet-
Marquis 2005 ).

Les différents métabolites identifiés à ce jour sont présentées dans la figure 7.

L’ochratoxine A est hydrolysée in vitro en OTα et en phénylalanine par les enzymes
protéolytiques de digestion : l’ α-chymotrypsine et la carboxypeptidase (Tozlovanu, 2008).

Des études ont montré que l’absorption ainsi que l’élimination s’effectue via des
transporteurs (Ringot et al., 2006 ; Pfohl-Leszkowicz & Manderville, 2007). Dans
l’organisme l’OTA est métabolisée en 4-R-hydroxyochratoxine A (4R-OHOA) ; 4-S-
hydroxyochratoxine A (4S-OHOA) ; 10 OH-OTA, OTB (forme déchloré de l’OTA) ; OP-
OTA (forme ouverte de l’OTA) ; OTHQ (forme quinone) pouvant être retrouvés dans le sang
ou les urines sous ces formes là ou conjugués au glutathion (Pfohl-Leszkowicz, 1999 ; Li et
al., 2000 ; Mally et al., 2004 ; Faucet-Virginie, 2005 ; Pfohl-Leszkowicz & Manderville,
2007). Un mécanisme de métabolisation a été proposé (Pfohl-Leszkowicz et al., 2002 ;
Manderville & Pfohl-Leszkowicz, 2006) (figure 7).

Ces transformations sont dépendantes du système microsomique des mono-oxygénases

à cytochrome P-450 (Størmer, 1992 ; Oster et al., 1991 ; Omar et al., 1996 ; Grosse et al.,
1995b, 1997a).

Il a été montré que la plus grande susceptibilité des rats mâles vis-à-vis de la
génotoxicité et de la carcinogénicité de l’OTA, était due au CYP 2C11, constitutivement
exprimé chez le mâle, alors qu’à l’inverse le CYP 2C12 des femelles protège contre ces effets
(Pfohl-Leszkowicz et al., 1998).

Le prétraitement de souris par le phénobarbital, inducteur des CYP 2B mais aussi 2C et

3A (Bars et al., 1989 ; Waxmann & Azaroff, 1992 ; Chen et al., 1992) ainsi que des
glutathions-S-transférases α (Li et al., 1997) diminue la toxicité de l’OTA (Moroi et al.,
1985), mais augmente l’apparition de tumeurs hépatiques (Suzuki et al., 1986). Ceci suggère
que la détoxification par un ou plusieurs de ces enzymes génère paradoxalement un ou
plusieurs métabolites génotoxiques.

28
 En effet le prétraitement de cellules bronchiques humaines ou bien l’incubation in vivo
de microsomes d’organes de lapins prétraités au phénobarbital, conduit à une augmentation
significative de la génotoxicité. Trois métabolites : 10-OH-OTA et deux métabolites de
structure inconnue, dont l’un plus lipophile que l’OTA, sont formés dans ces conditions et
sont en relation avec l’activité génotoxique. Leur formation est due au CYP 2C (El Adlouni
et al., 2000).

Figure 7 : Dérivés métaboliques de l'OTA (Pfohl-Leszkowicz & Manderville, 2006).

29
 Les cytochromes P450 (CYP) éventuellement impliqués dans la génotoxicité de l’OTA
ont été recherchés par l’utilisation de cellules humaines dans lesquelles ont été clonés
différents CYP. Les CYP utilisés sont 1A2, 2A6, 2D6, 2E1 et 3A4. Dans tous les cas des
adduits ont été observés, mais la quantité varie de 4 à 85 adduits par 109 nucléotides (Grosse
et al., 1995 b, 1997 a).

Certains adduits sont communs à tous les types de cellules y compris celles n’exprimant
que des enzymes de conjugaison mais pas de CYP, d’autres sont spécifique du CYP cloné. Le
taux le plus élevé d’adduit est obtenu avec le CYP 1A2.

Une autre voie de métabolisation conduit à l’obtention de la tyrosine-OTA via la

phénylalanine hydrolase (Creppy et al., 1995).

L’ochratoxine B, correspond à l’OTA déchlorinée, peut être associé à l’OTA dans

certains produits céréaliers. Chez le rat, elle est moins toxique que l’OTA et, est métabolisable
en 4-hydroxyochratoxine B et ochratoxine β (Størmer et al., 1983). La formation de
différents métabolites de l’OTA est représentée dans la figure ci-dessus (figure 7).

5.2. Rôle de la peroxydation

Les dommages oxydatifs sont des manifestations toxiques provoquées par l’OTA. Il a
été montré que, dans les microsomes de foie de rat, la peroxydation lipidique participe
activement à la conversion de l’OTA en 4(S)-OH-OTA (Omar and Rahimtula 1993).

Dans le but de voir si la voie oxydative de métabolisation de l’OTA était en relation

avec la génotoxicité, il a été testé la formation d’adduit à l’ADN dans les reins et les testicules
de souris en faisant varier cette voie de métabolisation.

L’administration simultanée de superoxyde dismutase et de catalase avant le gavage des

souris par l’OTA a provoqué une diminution des adduits totaux dans l’ADN des reins et des
testicules de 90% et 30% respectivement. Ces adduits sont donc probablement produits par
voie oxydative (Pfohl-Leskowicz et al., 1993b).

En utilisant des cellules de vésicules séminales de bélier particulièrement riches en

prostaglandine synthétase (PGHS) (enzyme permettant la cooxydation des xénobiotiques lors
de la synthèse de la prostaglandine, (Eling et al., 1990), il a été montré que l’OTA provoque
la formation de micronoyaux (Degen et al., 1994).

30
 Des souris sont aussi prétraitées avec de l’aspirine ou de l’indométacine (un anti-
inflammatoire non stéroïdien) avant l’administration de l’OTA. Ces deux substances inhibent
particulièrement la PGHS. Les premiers résultats montraient une modification du profil des
adduits avec la disparition totale de certains adduits aussi bien dans le rein que dans le foie,
(Obrecht-Pflumio et al., 1996).

En culture de cellules pulmonaires humaines, l’utilisation d’indométacine ou de NDGA

(l’acide Nordihydroguaiaretique) à permis de montrer que l’OTA était métabolisée en
métabolites génotoxiques par la lipoxygénase, alors que la PGHS a plutôt un effet protecteur,
(Pinelli et al., 1995, 1999).

Pour prouver que la métabolisation de l’OTA peut s’effectuer par un métabolisme

oxydatif, des animaux ont été prétraités par 3 vitamines connues pour avoir un pouvoir
antioxydant : la vitamine A, la vitamine E et la vitamine C. cette dernière est la plus efficace
des trois pour diminuer la génotoxicité de l’OTA. Mais dans tous les cas, une grande partie
des adduits disparait (Pfohl-leszkowicz et al., 1994 ; Grosse et al., 1997b). Ce résultat
confirme celui obtenu par Bose & Sinha en 1994 ; montrant que la vitamine C est capable de
diminuer les anomalies lors de la mitose et la méiose induite par l’OTA (Hoehler et al., 1996
c), ont aussi étudié l’effet des vitamines E et C sur la toxicité de l’OTA et ont obtenu des
résultats similaires.

5.3. Implication de la conjugaison au glutathion

Généralement, la voie de métabolisation par conjugaison au glutathion est considérée

comme une voie de détoxification (Jakoby & Habig, 1980). Néanmoins, certains dérivés
provenant de la conjugaison au glutathion génèrent des composés électrophiles pouvant être
mutagènes et cancérogènes (Bladeren et al., 1980 ; Vadi et al., 1985 ; Dekant et Vamvakas,
1989 ; Lafleur & Retèl, 1993). De plus, il est évident que l’accumulation de conjugués du
glutathion peut être neurotoxique dans certains cas (Monks & Lau, 1987).

Deux classes de conjugués peuvent être distinguées : ceux agissant directement, sans
activation métabolique (leur action est donc indépendante des microsomes) et ceux devenant
toxiques ou génotoxiques après métabolisation.

Au niveau des reins, les dérivés conjugués du glutathion vont être métabolisés par
action de la γ-glutamyltranférase et de la glycinase en dérivé cystéine correspondant. Ces
dérivés S-cystéines sont transportés dans les cellules rénales où ils auront 3 possibilités :

31
 • Ils sont excrétés sous forme inchangés dans le plasma,

• Ils sont N-acétylés en dérivés mercapturiques correspondant (Jakoby & Habig, 1980),

• Ils sont soumis à l’action de la β-lyse et forment des dérivés thiols très réactifs
responsables notamment des effets neurotoxiques (Dekant et al., 1988).

Le fait de diminuer le taux de glutathion au niveau rénal diminue donc la formation de

conjugués toxiques. D’autre part, au niveau rénal, ces dérivés thiols bloquent l’action de la
glutathion peroxydase. Si cet enzyme est bloqué, il y aura augmentation de H2O2 qui va
générer des formes OH* à l’origine de la lipoperoxydation, pouvant conduire à la formation
de produits radicalaires très réactifs.

Cette voie de métabolisation a été également testée par l’administration de dépléteur de

glutathion ou de substance pouvant augmenter le taux de glutathion. L’administration de
phorone à des souris provoque la diminution du taux de glutathion de 66% et de 11%
respectivement dans les reins et les testicules après 4h. Cette substance administrée avant
l’OTA abaisse le taux d’adduit dans les reins et les testicules.

La N-acétylcystéine (NAC) qui diminue également le taux de glutathion dans ces 2

organes, induit aussi une diminution des adduits dans ces tissus. En revanche dans le foie où
cette substance augmente le taux de glutathion, on observe une augmentation dramatique du
taux d’adduits. Ces résultats indiquent que le glutathion joue un rôle primordial dans la
génotoxicité l’OTA, soit par la formation de dérivés conjugués génotoxiques, soit par ses
propriétés oxydo-réductrices (Pfohl-Leszkowicz et al., 1993b, 1994).

Deux autres substances, qui diminuent la fixation de glutathion aux xénobiotiques, ont
été testées ; le diétylmaléate (DEM) et la buthionine sulfoximine (BSO) qui agissent par deux
mécanismes différents :

• Le premier par compétition au niveau de la glutathion transférase,

• Le deuxième par inhibition de la γ-glutamine synthétase.

Les résultats obtenus permettent de conclure à l’implication de la conjugaison au

glutathion dans la génotoxicité de l’OTA. L’effet bénéfique est observé essentiellement au
niveau rénal. Dans le foie, le diétylmaléate augmente le nombre d’adduits (Pfohl-Leszkowicz
et al., 1994 ; Grosse et al., 1994).

L’implication plus particulière de la leuctriène C4 synthétase qui est une glutathion-S-

transférase microsomique (Scoggan et al., 1997) a clairement été démontrée sur cultures

32
cellulaires bronchiques humaines. L’adjonction d’acide éthacrynique après traitement de
cellules par l’indométacine, inhibe la formation d’adduit à l’ADN, par blocage de la
leucotriène C4 synthétase. Le profil d’adduit est aussi modifié (Pinelli et al., 1995, 1998).

5.4. Relation structure-activité toxique de l’OTA

Xiao et al., (1995) ont synthétisé chimiquement 5 analogues structuraux de l’OTA et

ont entrepris une série d’étude de relation structure-activité toxique in vito chez Bacillus
brevis et dans des cellules HeLa, in vivo chez le rat et la souris (Xiao et al., 1996 a, b). Ils en
ont déduit que la présence (par ordre décroissant) des groupements carboxyle (de la
phénylalanine) chloro en (C5) et hydroxyle en (C8) favorisait la toxicité in vivo et in vitro de
l’OTA sans pour autant être essentielle à sa manifestation.

En revanche Rahimtula et al., (1998) et Xiao et al., (1996) estiment que la toxicité de
l’OTA n’est pas corrélée à sa capacité à chélater l’ion Fe2+ (de l’hémoglobine), et que par
ailleurs, c’est le groupement carboxyle de la Phe qui est responsable de la formation du
chélate. Autrement dit, la toxicité de l’OTA est liée à la présence de l’atome de chlore sur la
molécule. L’ochratoxine B, dérivé déchloré de l’OTA es 10 fois moins toxique que cette
dernière chez le poussin (Chu et al., 1972).

Xiao et al., (1996 b et b, 1997) supposent plutôt que le groupement phénylalanyl

permet à l’OTA d’être guidé vers les cibles cellulaires (ce qui expliquerait le peu de toxicité
de l’OTα). Seul le groupement isocoumarinique serait responsable de la toxicité via la
formation d’une forme ouverte de l’OTA (OP-OTA) à la suite de l’hydrolyse de la fonction
lactone dans certaines conditions physiologiques. Ces chercheurs ont confirmé que des
radicaux hydroxyles étaient produits à partir de différents métabolites d’OTA par les
microsomes en présence de NADPH, sans adjonction de fer exogène. Cette formation de
radical libre peut être inhibée par la catalase.

Malaveille et al., (1991 et 1994) estiment que la toxicité de l’OTA serait due à un
radical alkoxy en C8 et un dérivé thiol issu de la conjugaison au glutathion.

Ces auteurs constatent que, dans la bile des rats traités par l’OTA (mais pas dans l’urine
ou le sang) environ 50% de cet OTA est de l’OP-OTA et que cette forme ouverte est encore
plus toxique que l’OTA chez cet animal.

33
 Ils ont encore constaté (Xiao et al., 1996) que l’OTA se liait aux molécules biologiques
par une liaison ester covalente impliquant les liaisons carbonyle de cette fonction lactone et
concluent que cette liaison, serait responsable de la toxicité et de la génotoxicité de l’OTA qui
se lierait respectivement aux protéines enzymatiques et nucléiques.

B- Les Aflatoxines (AFs)

1. Introduction

Les aflatoxines (AFs) sont des métabolites secondaires hautement toxiques produites
par différentes espèces fongiques toxinogènes (Aspergillus flavus, A. parasiticus…). Ces
contaminants naturels de l’alimentation humaine et animale sont à la base de divers
problèmes tels que les déficiences nutritionnelles, l’immunosuppression, le cancer du foie, les
effets mutagènes et tératogènes (Wagacha & Muthomi, 2008). Elles ont été isolées pour la
première fois en Angleterre en 1960, suite à des intoxications dans un élevage de dindonneaux
(Adams et al., 2002 ; Chapeland-Leclerc et al., 2005).

Le mot aflatoxine est composé de « a » qui dérive du genre Aspergillus, la seconde

syllabe « fla » vient de l’espèce flavus et le terme « toxine » vient de l'adjectif « toxique ».

Dans le groupe des aflatoxines, 18 composés sont connus, mais seulement les
aflatoxines B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1), G2 (AFG2), M1 (AFM1) et M2 (AFM2)
sont habituellement surveillées. Ces dernières sont produites par Aspergillus flavus et/ou
Aspergillus parasiticus (Papp et al., 2002 ; Coppock & Christian, 2007).

Les noms de ces 4 aflatoxines B1, B2, G1, et G2) sont basés sur leur fluorescence sous
la lumière ultra-violette (bleu « blue » ou vert « green ») et la mobilité chromatographique
relative pendant la chromatographie (Bennett et klich, 2003).

Par contre les aflatoxines M1 et M2 tiennent leur appellation du fait de leur détection
dans le lait « milk » des vaches laitières nourries par une alimentation contaminée.

Cependant, les autres aflatoxines (telles que P1, Q1, B2a, et G2a) ont été décrites,
particulièrement en tant que produits de biotransformation des métabolites principaux chez les
mammifères, (Guerre et al., 1996).

34
 2. Conditions de production des aflatoxines par Aspergillus

Le développement des moisissures (A. flavus, A. parasiticus, A. bombycis, A.

ochraceoroseus et A. pseudotamari) et la production d’aflatoxines dans les céréales et les
arachides, sont dû aux mauvaises conditions de productions et de conservations des aliments.
L’inadéquation des facteurs d’humidité, de température, et la durée de stockage au magasin
peuvent faire ressortir le potentiel toxinogène de ces moisissures (Dilkin, 2002).

La chaleur et l’humidité des zones tropicales et subtropicales sont les conditions idéales
pour la colonisation et la domination des moisissures (Klich et al., 2000 ; Mishra & Das,
2003 ; Zain, 2011).

Dans les conditions arides, le stress de la sécheresse peut entraîner la fissure des gousses
d’arachides et l'infiltration des spores aboutissant ainsi à une importante accumulation
d'aflatoxines ces arachides (Ellis et al., 1993 ; Giorni et al., 2008 ; Luchese & Harrigan,
1993).

Les AFs sont des sous-produits d’autres métabolites (métabolites primaires) de

moisissures. Dans le premier métabolisme des moisissures, beaucoup d’interactions catalysées
par les enzymes surviennent. L’objectif de celui-ci est de promouvoir de l’énergie. Les
métabolites primaires formés (intermédiaires synthétiques, macromolécules), assurent la
production et la croissance des moisissures.

En fonction de la combinaison particulière des paramètres externes de croissance ; la

biosynthèse des aflatoxines peut soit être complètement inhibée (mais la croissance normale
est encore possible) ou peut être complètement activée.

Les métabolites secondaires sont synthétisés par une variété de voies de métabolites
primaires (Obrian et al., 2003; Wild & Montesano, 2009). La biosynthèse des aflatoxines,
comme celle de tous les métabolites secondaires, est fortement dépendante des conditions de
croissance tels que la composition du substrat ou des facteurs physiques comme le pH,
l'activité de l'eau, la température ou des atmosphères modifiées.

Les conditions propices à la germination, la croissance et production d'aflatoxines par A.

flavus, A. parasiticus in vitro sur milieu de culture ont été étudiées par plusieurs chercheurs.
Celles-ci montrent que la germination se produit sur une gamme plus large que celle de la
croissance. Cependant, la gamme de production d'aflatoxine est plus restreinte que pour la
croissance.

35
 Les conditions optimales pour la production d'aflatoxine par A. flavus et A. parasiticus
sont de 33 ºC et 0,99 aw; tandis que pour la croissance elles sont de 35 ºC et 0.95 aw. A. oryzae
et les deux précédentes moisissures ont des croissances semblables en fonction des facteurs
environnementaux, avec des minima de 0,81 aw à 30 et 37°C ; 0,82 aw à 25°C (Pitt et
Miscamble, 1995).

3. Structure chimique des aflatoxines

A la suite de la maladie « Turkey X disease », Sargeant et al., (1961) ont isolé de la

nourriture de ces volailles, une substance capable d’induire expérimentalement la même
maladie. Ce fut le début d’une série de recherches qui aboutit à l’isolement et à la
caractérisation de la structure des aflatoxines (Asao et al., 1963, 1965).

La mycotoxines la plus célèbre et possédant le profil toxicologique le plus sérieux ; et

dont le nom chimique est le suivant : 6-Méthoxydifurocoumarone2,3,6aα,9aα-tétrahydro-4-
méthoxy-cyclopenta- [c]furo[3’,2’:4,5]furo [2,3-h][l]benzopyran-1,11-dione, est l’aflatoxine
B1 (AFB1).

Des dérivés secondaires de l’ AFB1 (AFB2, AFG1, AFG2, AFM1) ont été identifiés. Ils
sont caractérisés au niveau moléculaire par des structures de coumarines bifuraniques
auxquelles sont accolées des pentanones (AFB) ou des lactoses hexatomiques (AFG). Toutes
les aflatoxines se rattachent à l’un de ces deux types de structures (AFB, AFG) et ne diffèrent
entre elles que par la position de divers radicaux sur le noyau. Les structures chimiques ainsi
que les masses molaires de ces différents dérivés sont représentés en figure 8.

36
 AFB1 : C17H14O6 Masse molaire : 314,3 AFG1 : C17H12O7 Masse molaire : 328,3

AFB2 : C17H14O6 Masse molaire : 214 AFG2 : C17H14O7 Masse molaire : 330.3

AFM1 : C17H12O7 Masse molaire : 328 AFM2 : C17H14O7Masse molaire : 330

AFB2a : C17H14O7 Masse molaire : 330.3 AFG2a : C17H14O8 Masse molaire : 346.3

Figure 8 : Structures chimiques et masses molaires (en g) des différentes aflatoxines.

37
 4. Propriétés physico-chimiques des Aflatoxines

A l’état sec, les aflatoxines sont très stables à la chaleur, jusqu’au point de fusion.
Cependant, en présence d’eau et à température élevée, il y a une destruction des AFs en
fonction du temps. Une telle destruction des AFs peut se produire dans les farines de graines
oléagineuses, dans une solution aqueuse à pH 7. Bien que les produits de réaction n’aient pas
été examinés en détail, il est probable qu’un tel traitement provoque l’ouverture du cycle
lactone avec possibilité de décarboxylation aux températures élevées (Castegnaro et al.,
2006).

Aussi les résidus alcalins sur la verrerie ou les adsorbants (créant un pH >10) peuvent
entraîner l’ouverture de la lactone de la coumarine, ayant pour résultat la formation de
phénolate et de carboxylate de sodium, susceptible respectivement de changements et de
décarboxylation oxydative. L’hydrolyse de la lactone observée en solution alcaline paraît être
réversible puisqu’une acidification permet de retrouver les AFs.L’aflatoxine pure, en solution
standard ou après purification, est plus sensible à des modifications que les aflatoxines
protégées par les composants d'un extrait (Andrellos et al., 1967).

Les combinaisons de solvants et d'irradiation, susceptibles d’engendrer une

décarboxylation, ont produit jusqu'à quatre nouveaux dérivés de dégradation fluorescents.

En présence d’acides minéraux comme l’acide tifluoracétique, l’AFB1 et l’AFG1 sont

converties en AFB2a et AFG2a correspondant à l’addition de l’eau sur la double liaison dans
le cycle de furane. En milieu acide, la dégradation solaire est augmentée (Samarajeewa et al.,
1988).

Plusieurs agents oxydants, comme le permanganate de potassium, le chlore, le peroxyde

d’hydrogène, l’ozone, réagissent avec l’AFs et changent cette molécule comme indiqué par la
perte de la fluorescence (Reddy et Waliyar, 2009).

Dans l’eau les aflatoxines sont généralement peu solubles (10-30 mg /ml) présentant
une instabilité totale dans les solvants non polaires. Par contre elles sont très solubles dans les
solvants organiques de polarité moyenne (CHCl3, CH3OH, DMSO) (Cole et Cox, 1981).

Les aflatoxines se trouvent instables sous la lumière ultraviolette en présence d’oxygène

avec des pH extrêmes (pH < 3 ou pH > 10). Elles sont aussi dégradées par l’ammoniaque
(NH4OH) et l’hypochlorite de sodium (NaOCl) et lors de cette dernière réaction, il se forme
le 2,3-dichloro-aflatoxine B1 qui est directement génotoxique (Cole et Cox, 1981).

38
 Les aflatoxines B1, G1 et M1, de masses moléculaires situées entre 300 et 400 g/mol
renferment un portant une double liaison en position 8-9 qui les rendent potentiellement
cancérogènes. La métabolisation hépatique de cette double liaison conduit à la formation du
dérivé 8,9 époxydes qui, par son caractère électrophile prononcé, est susceptible d’interagir
avec l’ADN ou l’ARN. La figure 9 représente la structure chimique de l'AFB1.

Noyau bi-furanne

AFB1 : C17H14O6 Masse molaire : 314,3

Figure 9 : Structures chimiques et masses molaires (en g) de l’aflatoxine B1.

La structure chimique des aflatoxines les rend extrêmement stables à la température

(jusqu’à 250°C). En revanche, elles sont sensibles aux pH alcalins par ouverture du noyau
lactone et cette propriété est d’ailleurs exploitée pour décontaminer les effluents de
laboratoire.

5. Toxicité des Aflatoxines

Les aflatoxines (AFs) causent de grands soucis, à cause de leurs effets nuisibles sur la
santé humaine et animale (IARC, 1993). La pénétration dans l’organisme des AFs peut avoir
lieu par voie orale (Dao, 2005). L’absorption est rapide et s’effectue au niveau de l’intestin
grêle dans la partie duodénale. L’AFB1 rejoint le foie par la veine porte. La distribution à
partir du plasma dans les hépatocytes est réalisée par diffusion passive à travers les
membranes.

39
 Une partie de l’AFB1 est éliminée dans la bile après biotransformation sous forme
conjuguée au glutathion, à l’acide glucuronique et au sulfate. Cette excrétion biliaire
représente environ 50% de la dose excrétée chez la plupart des espèces animales. 15% à 25%
de la dose ingérée sont éliminés par la voie urinaire sans transformation ou sous forme de
dérivés conjugués. Ceci est dû, entre autre, au fait que l’AFB1, au niveau du plasma, se fixe
sur l’albumine sur le même site que la phénylbutazone (Castegnaro et al., 1999).

L’épithélium intestinal, le foie et les reins sont le siège de biotransformations d’un

grand nombre de composés impliquant deux phases de réactions. La première phase fait
intervenir des réactions de réduction, d’oxydation et d’hydrolyse.

Les cytochromes P450 microsomaux, les mono-oxygénases contenant de la flavine, des

prostaglandines synthases, des amines-oxydases et des alcools déshydrogénases sont les
enzymes majeures impliquées dans les oxydations, tandis que les réactions réductrices sont
gouvernées par des époxyde-hydrolases, et des aldéhydes réductases ou cétone réductases.

La deuxième phase comporte les réactions de conjugaison des molécules formées durant
la première phase. Ces réactions diminuent la toxicité et augmentent la solubilité dans l’eau
des mycotoxines, ce qui facilite leur excrétion dans l'urine (et dans le lait) et protège l'animal.

Les enzymes majeures de conjugaison sont des glucuronosyl-transférases microsomales

et des sulfonyl-, méthyl-, aminoacyl-, S glutathion- et N-acétyl-transférases cytosoliques
(Galtier, 1999). A titre d'exemple, la figure 10 présente certaines bioconversions de l'AFB1
dans le foie ainsi que l’époxydation de l’AFB1 qui constitue une étape essentielle dans
l'acquisition des caractères mutagène et carcinogène de la mycotoxine.

40
Figure 10 : Métabolisme des aflatoxines et préparation de l’AFB1-exo-8, 9-
epoxide par le Dimethyldioxirane (DMDO) oxidation de l’AFB1 en
dichloromethane.

41
 6. Métabolisation des l’aflatoxines

Pour être toxique ou mutagène, l’aflatoxine B1 (AFB1) doit être métabolisée. Sans
action métabolique l’AFB1 n’est pas mutagène et ne se fixe pas sur les molécules (Hecht &
Trushin, 1988).

La métabolisation de l’AFB1 est principalement réalisée par l’intervention des

cytochromes P450s (CYP) hépatiques. Mais elle peut aussi être cooxydée par la
prostaglandine-H-synthétase (PGHS) et la lipoxygénase (Massey et al., 1995 ; Guerre et al.,
1996). Elle est principalement transformée en 8 métabolites : l’époxyde-AFB1, l’AFM1 l-
AFB2a, l’AFQ1, l’AFP1, l’aflatoxicol, l’aflatoxicol H1 et l’aflatoxicol M1 (figure 10). Ces
métabolites à l’exception de l’époxyde et de l’AFM1 sont également non toxiques.

6.1. Epoxyde-8,9-AFB1

La mutagénicité et le risque cancérogène de l’aflatoxine B1 sont le résultat de

l’époxidation en position 8,9 (Essigman et al., 1982 ; Gurtoo & Dave, 1973 ; Campbell &
Hayes, 1976). Au cours du métabolisme, l’AFB1 est époxydée soit en dérivé exo soit en
dérivé endo (Figure 10) (Raney et al., 1992). seule la forme exo se fixe sur la guanine
(Baertschi et al., 1989 ; Iyer et al., 1994).

Les quantités de métabolites formés au cours du métabolisme de l’AFB1 et les CYP

impliqués dépendent de l’espèce animale. Ainsi les microsomes de hamster sont 3 à 5 fois
plus actifs que ceux du rat, dans la formation du métabolite réactif (Lotlikar et al., 1984). De
même, les microsomes de singe et de souris forment environ 2 fois plus d’époxydes que ceux
du rat (Ramsdell & Eaton, 1990).

Concernant le métabolisme des AFs chez l’Homme, plusieurs cytochromes

interviennent (Forrester et al., 1990). Les travaux de Aoyama et al., (1990) ; Crespi et al.,
(1991) ; Gallagher et al., 1994 ; et Ueng et al., (1995) ont montré que les CYP : 1A2, 2A3,
3A3, 2B7, 3A4 avaient un rôle à y jouer. C’est par le 3A4 qu’une plus grande quantité de
forme exo se forme.

Une étude réalisée en utilisant des microsomes de foie humain de thaïlandais a montré
une corrélation étroite entre l’expression importante des CYP 3A3/4 et l’activation
métabolique de l’AFB1 (Kirby et al., 1993).

42
 L’utilisation des cellules hépatiques humaines dans lesquelles sont clonées de gènes
spécifiques de CYP humain, ont aussi montré que le CYP 1A2 génère un adduit AFM1.
(Macé et al., 1997).

Ces réactions ont lieu dans différentes cellules du foie (Steinberg et al., 1990 ;
Jennings et al., 1992), Mais également dans les voies aériennes (Ball et al., 1990 ; Ball &
Coulombe, 1991) et les poumons (Daniels & Massey, 1992). Certaines parties du tube
digestif et les reins sont capables de bioactiver l’AFB1 (Imaoka et al., 1992).

6.2. Conjugaison au glutathion

L’époxyde de l’AFB1 peut être désactivé par conjugaison au glutathion. Ce mode de

détoxification est la voie majeure d’excrétion chez un grand nombre d’espèces animales
(Lotlikar et al., 1984 ; Neal & Green, 1983 ; Monroe & Eaton, 1988).

La désactivation par conjugaison au glutation de l’AFB1 est catalysée par les

glutathions-S-Transférases (GST) dont il existe 5 classes différentes (alpha = α, mu = μ, pi =
π, theta = θ, et une micosomique) (Gopolan et al., 1992).

Coles et al., (1985) ont montré que c’est la GST alpha qui est la forme la plus active
pour conjuguer l’époxyde AFB1 dans le foie du rat. La forme exo est conjuguée par la GST
alpha, alors que la forme endo est conjuguée par la GST μ (Raney 5., 1992b).

Quinn et al., (1990) ont en effet montré que les microsomes et le cytosol sont des
organites riches en GST et ceux-ci protègent contre la formation des adduits à l’ADN.

Chez l’homme, la GST mu présente un polymorphisme génétique. Peu d’études ont été
réalisées sur la possible relation entre celle-ci et le risque cancérogène de l’AFB1. Liu et al.,
1991 ont montré que le foie des humains ayant une forte activité en GST mu inhibe la
formation d’adduit d’AFB1-époxyde. Cet organe est capable de conjuguer les 2 formes
d’époxyde (Raney et al., 1992b).

Certains additifs alimentaires tels que le butylhydroxytoluène (BHT) utilisé en tant

qu’anti-oxydant, a pour propriété de stimuler l’activité des GST. Les travaux réalisés par
Allameh et al., (1997) montrent qu’un taux de 0,75% dans la nourriture des rats pendant
15jours, diminue de 48% la formation d’adduit d’AFB1 à l’ADN. En revanche des doses 10
fois plus faibles, correspondant aux doses utilisées comme conservateur alimentaire, n’ont
aucun effet.

43
 6.3. Transformation en diol-époxyde

Chez les animaux, la toxicité aiguë due à l’AFB1 est corrélée par la production de
l’AFB1-8,9 dihydrodiol. En effet l’AFB1-8,9-époxyde est transformé en 8,9-dihydro-8,9-
dihydroxy-AFB1 (AFB1-8,9-dihydrodiol) soit spontanément soit par l’action de l’époxyde
hydrolase (Johnson et al., 1997).

Ce dernier se lie aux protéines et conduit à la formation d’un adduit majeur (Wild et al.,
1990 ; Sabbioni et Wild, 1991) qui ne peut être conjugué au glutathion (Coles et al., 1985).

En revanche, le fait qu’il puisse être transformé en un dialcool par l’intervention d’un
aldéhyde réductase, est un point important en termes de protection contre les effets toxiques.
Une telle activité existe chez l’homme (Judah el al., 1993).

6.4. Hydroxylations

6.4.1. Aflatoxine M1

Les CYP réalisent aussi des réactions d’hydroxylation en AFM1, Q1, P1, B2a. L’AFM1
est le dérivé hydroxylé en position 9 et se retrouve dans le lait, ainsi que dans le foie, le rein et
les muscles (Kuilman et al., 1998).

L’AFM1 est légèrement mutagène dans le test d’Ames. Les cancers étant souvent liés à
des dommages causés dans l'ADN, Ce test rapide et peu onéreux est un test biologique
permettant de déterminer le potentiel mutagène d'un composé chimique.

Le principe du test d’Ames repose sur différentes souches bactériennes de Salmonella

typhimurium portant des mutations dans les gènes nécessaire à la synthèse de l'histidine.
Ainsi, celles-ci sont donc auxotrophes pour l'histidine et requierent par conséquent un apport
d'histidine pour se développer. Le test permet donc d'évaluer la facilité que possède une
substance à induire une réversion de la souche auxotrophe. Dans le cas d'une substance
mutagène, on observe ainsi l'apparition de souche prototrophes, ne nécessitant plus d'histidine
pour croître mais d'un milieu minimum seulement.

Le pouvoir cancérogène de l’AFM1 est quinze fois plus faible chez le rat et cent fois
plus faible chez la truite que celui de l’AFB1. L’AFM1 est capable de se fixer à l’ADN. Sa
métabolisation est catalysée par le CYP 1A2 (Ueng et al., 1995).

44
 Dans la province Fujian en Chine, un plus grand nombre de cas de cancer hépatiques a
été observé chez les non-fumeurs que chez les fumeurs de plus de 50 ans (Lin et al., 1991).

Il semblerait que ce soit dû à l’induction de CYP 1A1 par les hydrocarbures

polycycliques aromatiques contenus dans les cigarettes, donc à une plus grande
métabolisation en AFM1 moins cancérogène.

6.4.2. Aflatoxine P1

L’AFB1 peut être déméthylée en AFP1. Le taux de ce métabolite est particulièrement

élevé dans les tissus tumoraux (Kirby et al., 1993). Comme les deux métabolites précédents,
il est moins mutagène (Gurtoo et al., (1978).

6.4.3. Réduction en aflatoxicol

La NADPH réductase est capable de réduire le groupement carbonyl du cycle penténone

de l’AFB1 en hydroxyl, pour donner l’aflatoxicol (AFL). Comme cette réaction est réversible,
l’aflatoxicol est considéré comme une forme de stockage de l’AFB1 et non comme une voie
de détoxification (Salhab et Edwards, 1977).

La réduction de l’AFB1 s’effectuée dans le cytosol du foie (Chen et al., 1981), mais
pourrait également se dérouler dans le rein (Liu et al., 1993).

L’aflatoxicol est un métabolite fortement produit chez la truite. C’est un métabolite

cancérogène chez cette dernière (Schoenhard et al., 1976).

La réaction de réduction de l’AFB1 est inhibée par l’androsténedione, l’androsténetrione

et l’œstrone. L’enzyme impliqué pourrait être l’hydroxystéroïde déshydrogénase (Patterson
& Roberts, 1972).

45
 C- Autres Mycotoxines

A l’heure actuelle, en plus des aflatoxines et des ochratoxines, d’autres mycotoxines

sont fréquentes et importantes. Il s’agit des toxines de Fusarium parmi lesquelles on peut
citer : les Fumonisines, la zéaralénone (ZEA) et le déoxynivalénol (DON), et les toxines T-2,
HT-2, etc. à cette liste s’ajoute aussi de nouvelles mycotoxines dites émergentes.

1. Les fumonisines

Ce sont des mycotoxines qui apparaissent fréquemment sur le maïs, souvent en même
temps que d’autres types de mycotoxines. Elles n’ont été identifiées que tardivement, au
milieu des années 1980, bien que leurs effets, sur les chevaux notamment, soient connus
depuis plus de 150 ans. La fumonisine B1 (figure 11) est la substance la plus toxique dans ce
groupe, (Soriano et al., 2005).

Figure 11 : Structure chimique de la fumonisine B1

46
 2. La zearalenone (ZEA)

La zéaralénone est une lactone macrocyclique dérivée de l'acide résorcyclique

(Resorcyclic Acid Lacton RAL). C’est une toxine insoluble dans l’eau. Elle est soluble
uniquement dans les bases diluées, le benzène, les alcools, le chloroforme et l’eau mélangée
au méthanol. Elle entraîne des perturbations physiologiques au niveau des organes génitaux
males et femelles. Sa formule développée est représentée dans la figure 12.

La zéaralénone est produite par certaines espèces de Fusarium, pendant les saisons
fraîches et humides de croissance et de récolte des céréales (Zinedine et al., 2007a). Elle a été
isolée pour la première fois en 1962 à partir du maïs contaminé par Giberella zeae (Stob et
al., 1962). Sa structure fut élucidée en 1966 (Urry et al., 1966). Sa synthèse totale et la
détermination de sa configuration absolue ont été réalisées en 1968 (Taub et al., 1968).

La zéaralénone est un métabolite secondaire de Fusarium graminearum (Gibberella

zeae). Cette mycotoxine a été nommé la zéaralénone comme combinaison de « Zeae » ;
« lactone d’acide resorcylique, - ène » (pour la présence du double liaison C-1’ à C2), et –
« one » pour la cétone de C-6’ (Urry et al., 1966).

La zéaralénone est une mycotoxine que l'on trouve en faibles quantités, principalement
dans le maïs, en Amérique du Nord, au Japon et en Europe.

Au Maroc, Zinedine et al., (2006, 2007, 2009) ont rapporté la présence de faibles
teneurs (allant jusqu’à 16 μg/kg) de ZEA dans le maïs.

La consommation du maïs contaminé est à l'origine d'une hyperoestrogénie chez le

bétail, principalement chez le porc, qui se caractérise essentiellement par une tuméfaction
vulvaire et mammaire et une infertilité (Udagawa, 1988).

Quelques éléments recueillis dans des expérimentations animales permettraient de

conclure à un effet carcinogène de la zéaralénone (FAO, 2003).

La ZEA subit l’action de réductases dans le foie conduisant à la formation de l’α-

zéaralénol et du β-zéaralénol. Des disparités génétiques inter-espèces peuvent expliquer les
différences de sensibilité des animaux à la ZEA (Galtier, 1999).

Les principales toxines ingérées par les ruminants sont donc modifiées dans le tube
digestif de ceux-ci avant d'être excrétées par la voie biliaire. Ces processus limitent leur
absorption dans le tube digestif et favorisent leur excrétion dans les milieux aqueux comme
l'urine ou le lait.

47
 Le ruminant est donc naturellement protégé, mais la présence de résidus toxiques dans
les produits animaux que sont le lait et la viande, pourrait constituer un risque pour le
consommateur (Yazar and Omurtag, 2008).

Figure 12 : Structure chimique de la zearalenone

48
 3. Les toxines T-2 et HT-2

La toxine T-2 et la toxine HT-2 (figure 13) sont produites par de nombreuses espèces de
Fusarium, en particulier F. tricinctum, F. sporotrichioides, F. poae, F. equiseti, F.
acuminatum. Les grains les plus contaminés sont le blé, le maïs, l’avoine, le seigle, le riz
(Creppy, 2002).

La toxine T-2 étant la plus toxique, elle est responsable de maladies hémorragiques chez
les animaux et associée à la formation des lésions orales et à des effets neurotoxiques chez les
volailles (Moss, 2002).

La T-2 est dé-acétylée en HT-2 et, dans une plus faible proportion, en T-2 triol. Ces
métabolites sont ensuite conjugués à l’acide glucuronique, ce qui facilite leur excrétion dans
la bile.

Figure 13 : Structure chimique de la toxine T-2

49
 4. Le déoxynivalenol (DON)

Il est l’un des 150 composants du groupe des trichothécènes. Il se forme presque
toujours sur les plants avant la récolte. Sa formation dépend étroitement des conditions
climatiques, et va donc varier d’une région à l’autre, voire d’une année à l’autre.

Le DON (figure 14) est également appelé Vomitoxine à cause de ses puissants effets
émétiques et son action en tant que facteur de refus d'alimentation, il a été caractérisé et
nommé après son isolement d’orge infectées par Fusarium au Japon. Le DON est produit par
F. graminearum et F. culmorum parmi d'autres espèces de Fusarium (Pestka and Smolinski,
2005 ; Eriksen, 2003 ; Eriksen and Pettersson, 2004).

Au niveau cellulaire, les principaux effets toxiques du DON sont : l’immunosuppression

ou l’immunostimulation en fonction de la dose et la durée de l'exposition. Bien que ces effets
aient été largement caractérisés chez la souris, plusieurs études sur le DON suggèrent que les
effets immunotoxiques sont également susceptibles chez les animaux domestiques (Rotter et
al., 1996).

Figure 14 : Structure chimique du Déoxynivalénol

50
 5. La Patuline (PAT)

La patuline (figure15) est une mycotoxine produite par différentes moisissures

(Byssochlamys nivea et P. expansum…). Elle a été isolée la première fois comme principe
actif antimicrobien pendant les années 40 à partir de Penicillium patulum. Le même
métabolite a été également isolé chez d'autres espèces et auxquelles différents noms ont été
données comme : le clavacine, le claviformine, l'expansine, le mycoine c, et le penicidine
(Ciegler et al., 1971).

Pendant les années 50 et les années 60, il est devenu évident que, en plus de son activité
antibactérienne, antivirale, et antiprotozoaire, la patuline était toxique pour les plantes et les
animaux, excluant son utilisation clinique comme antibiotique en France.

Au cours des années 60, la patuline a été de nouveau classée dans le groupe des
mycotoxines. De nos jours, la moisissure bleue qui altère la qualité organo-leptique et
nutritionnelle des pommes, des poires, des cerises, et d'autres fruits, est identifiée en tant
qu'un des contrevenants les plus habituels dans la contamination par la patuline (Bennett et
klich, 2003).

Les études expérimentales faites sur la PAT montrent que celle-ci est une neurotoxine et
qu'elle produit des altérations pathologiques sévères dans les viscères.

Selon les rapports existants, elle induit des sarcomes locaux. La plupart des études à
court terme n'ont pas permis de déceler une activité mutagène.

Figure 15 : Structure chimique de la patuline

51
 D- Mycotoxines et champignons toxinogenes

Deux groupes de champignons toxinogènes peuvent être distingués. Le premier groupe

est constitué de champignons envahissant leur substrat et produisant des mycotoxines sur les
plantes sénescentes ou stressées : il sera question de toxines de champs (tableau 5).

Le deuxième groupe rassemble ceux qui produisent les toxines après récolte ; on les
qualifiera de toxines de stockage. Ainsi, des champignons du sol ou des débris de plantes
peuvent disséminer leurs spores sur la plante ou les grains puis proliférer pendant le stockage
si les conditions environnementales le permettent.

1. Moisissures des champs

Les moisissures des champs sont représentées par les espèces du genre Fusarium (F.
moniliforme, F. roseus, F. tricinctum et F. nivale). Elles constituent les principales
moisissures productrices de mycotoxines avant la récolte (Zinedine, 2004).

2. Moisissures de stockage

Les espèces des genres Aspergillus et Penicillium telles que A. flavus et A. parasiticus
sont des contaminants au moment du stockage. Les espèces d' A. clavatus et d' A. fumigatus
sont deux espèces qui n’attaquent que les graines endommagées et nécessitent une grande
rétention des graines en humidité (tableau 6 et 7).

52
 Tableau 5 : Espèces de Fusarium et mycotoxines associées (Dreyfus et Lagache.
2007)

Espèces de Fusarium Mycotoxines produites Principaux substrats

F. pseudigraminearum Trichothécènes B (DON, A-DON, NIV) et / ou

F. graminearum Zearalénone
F. flocciferum
F.cerealis
F.culmorum
F. lumulosporum

F. venenatum Trichothécènes A (T-2, HT-2) et / ou

F. robustum Trichothécènes B (NIV, FX)
F. tumidum Maïs, orge, blé, avoine,
F. sambicinum sorgho

F. poae
F. sporotrichioïdes

F. verticilloïdes Fumonisines et / ou
F.sacchari Beauvericine et / ou
F. fujikuroi Monoliformine
F. proliferatum
F. subglutinans
F. nygamai

53
 Tableau 6 : Moisissures et mycotoxines associées (Journal officiel, 2005)

Moisissures Mycotoxines produites Principaux substrats

Aspergillus versicolor Stérigmatocystine

Aspergillus parasiticus Aflatoxines

Aspergillus flavus
Blé, sorgho, maïs, orge, seigle,
avoine
Aspergillus ochraceus Ochratoxines
Penicillium viridicatum

Penicillium citrinium Citrinine

Tableau 7 : Moisissures et mycotoxines associées ayant des impacts ponctuels sur la

santé humaine et la santé animale (AFSSA, 2009 ; Boudih, 2011)

Principaux
Moisissures productrices Mycotoxines associées
substrats

Alternaria alternata, Alternaria Toxines d’Alternaria (alternariol, alternariol méthyl

les denrées
solani éther…)
alimentaires et
Claviceps purpurea,
les aliments
C. paspali, C. africana, Alcaloïdes de l’ergot de seigle.
pour animaux
C. fusiformis

Neotyphodium coenophialum, N.
Toxines d’endophytes
lolii

Phomopsis leptostromiformis Phomopsines Alimentation

animale
Pithomyces chartarum Sporidesmines

Strachybotrys chartarum Toxines de Stachybotrys

54
 CHAPITRE III : MÉTHODES DE CONTRÔLE DES
MYCOTOXINES DANS LES PRODUITS ALIMENTAIRES,
VALIDATION, PREVENTION ET REGLEMENTATION

A- Procédure de contrôle

1. Échantillonnage

L’une des étapes cruciales pour la détermination qualitative ou quantitative de

différentes mycotoxines est le prélèvement et la préparation d’échantillons.

La répartition de la concentration de mycotoxines dans les produits alimentaires est un

facteur important à prendre en compte lors de l'établissement de critères réglementaires pour
l’échantillonnage. Ainsi la répartition est souvent très hétérogène.

Si l’on ne prend pas suffisamment soin de procéder à un échantillonnage représentatif,

la concentration de mycotoxines dans un lot inspecté peut donc être facilement l’objet
d'erreurs d’estimation.

Le risque à la fois pour le consommateur et pour le producteur doit être pris en compte
lorsqu'on établit des critères d'échantillonnage pour des produits dans lesquels les
mycotoxines sont réparties de façon hétérogène.

La conception de procédures d'échantillonnage fait l'objet d'études internationales

depuis plusieurs années (FAO, 1993 ; Commission du Codex Alimentarius, 2000). Des
groupes de travail et des débats sont organisés par la FAO et par la Commission du Codex
Alimentarius afin d'essayer de trouver une approche internationale harmonisée.

On peut citer comme exemples de plans officiels d’échantillonnage pour les

mycotoxines, ceux qui concernent les aflatoxines dans les arachides et le maïs mis en œuvre
aux États-Unis (FDA, 2001 ; CE, 2002b) et pour les arachides dans l’Union européenne.

55
 2. Méthodes d’analyses

2.1. Méthodes quantitatives et semi-quantitatives

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires de champignons microscopiques

qui peuvent se développer sur la plante au champ ou au cours de la récolte, du transport, du
stockage ou sur le produit fini.

En raison de la présence inévitable des mycotoxines dans les produits agricoles et de

leurs toxicités potentielles pour l’homme et les animaux, il s’avère impératif qu’elles soient
détectées et retirées du marché.

Des méthodes analytiques conventionnelles et émergentes reposant sur les avancées

technologiques récentes dans l’analyse de mycotoxines ont été mises au point par plusieurs
chercheurs à travers le monde.

Bien que la plupart des méthodes analytiques officielles soient chromatographiques

(avec détecteur ultraviolet ou fluorescence), des stratégies alternatives comme les méthodes
immunochimiques et le recours à la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de
masse ont connu une percée importante sur le marché et sont de plus en plus utilisées de par
la relative simplicité de l’extraction et la multi-détection des mycotoxines avec une
sensibilité plus élevée (Huybrechts et al., 2013).

Le défi des technologies naissantes est de démontrer des avantages par rapport aux
méthodes conventionnelles souvent utilisées comme méthodes officielles.

Des efforts sont déployés par les analystes pour développer et valider les méthodes et
fiabiliser les résultats analytiques puisque d’importantes décisions de retrait ou
d’interdiction d’utilisation de matières premières ou de denrées alimentaires peuvent reposer
sur ces résultats.

Parmi les méthodes d’analyse qui existent, nous pouvons citer : les méthodes
analytiques conventionnelles et émergentes incluant les techniques de dépistage rapide des
mycotoxines dans les produits alimentaires (Huybrechts et al., 2013).

Toutes ces méthodes d’analyses, avant d’être adoptées comme méthodes analytiques
de routine en laboratoire sont d’abord validées conformément aux modalités d’application
portant sur les performances des méthodes d’analyses et l’interprétation des résultats.

56
 La procédure classique de validation d’une méthode analytique prend en compte la
linéarité, la répétabilité, la reproductibilité, la spécificité, le rendement, la limite de
détection, la limite de quantification et la robustesse (CE, 2002).

Les laboratoires chargés du contrôle officiel doivent être accrédités conformément à la

norme ISO 17025 (ISO, 1999).

2.2. Chromatographie Liquide à Haute Pression (HPLC)

Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est
introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne
chromatographique.

La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique. Le mélange à analyser est injecté puis transporté à travers le système
chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre
la phase mobile et la phase stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié
les différents solutés sont caractérisés par leur pic. L’ensemble des pics enregistrés est
appelé chromatogramme.

La chromatographie liquide sous haute pression (HPLC) peut être couplée aux
détecteurs à ultraviolet (UV), à barrette diode (photo diode array [PDA]), à fluorescence
(FD) à la masse (MS) (Huybrechts et al., 2013).

• LC-MS ou LC-MS/MS

La chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse est de plus en plus

utilisée pour quantifier plusieurs mycotoxines ou métabolites associés.

Les différentes mycotoxines sont séparées sur une échelle de temps par leur élution
différentielle, ce qui permet l’évaluation dans l’espace de l’ensemble des entités
moléculaires présentes dans un échantillon.

La spécificité, la possibilité de quantifier plusieurs mycotoxines en une fois, la

sensibilité et la simplification de la préparation de l’échantillon font que la LC-MS/MS est
pour le moment la technique la plus prometteuse en analyse de mycotoxines.

57
 • La CG/MS

La chromatographie en phase gazeuse est une technique de chromatographie très

répandue, extrêmement sensible, dont les premières applications, qui remontent au début du
siècle précédent, ont concerné le contrôle des fractions légères des raffineries de pétrole
(Lagues, 1990).

La chromatographie en phase gazeuse est une transposition de la chromatographie sur

colonne dans laquelle la phase mobile liquide a été remplacée par un gaz. C’est une méthode
de séparation des composés gazeux ou susceptibles d’être volatilisés par élévation de la
température sans décomposition. Elle permet ainsi l'analyse de mélanges éventuellement très
complexes dont les constituants peuvent différer de façon considérable par leur nature et
leur volatilité. Les détecteurs peuvent être plus ou moins spécifiques des composés à
détecter. Il existe différents types de détecteurs.

- Les méthodes : Flam Ionization Detector (FID),

- Electron capture detector (ECD) et spectrométrie de masse (MS).

2.3. Chromatographie sur couche mince-CCM

La CCM permet une détection qualitative et semi-quantitative des mycotoxines. Elle a

l’avantage d’être rapide et peut traiter plusieurs échantillons en parallèle. Mais elle est peu
sensible (Krska et Josephs, 2001).

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique analytique basée sur
le partage des solutés entre un adsorbant fixe insoluble (phase stationnaire) et une phase
liquide (phase mobile).

Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par adsorption et une force
d’entraînement par la phase mobile. L’équilibre résultant aboutit à une migration
différentielle des solutés de l’échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation.

Chaque constituant migre d’une certaine hauteur, caractéristique de la substance, que

l’on appelle rapport frontal ou rétention frontale (Rf) :

Rf = Distance parcourue par la substance / Distance parcourue par le Solvant

58
 Chaque spot correspond à un constituant et on l’identifie par comparaison du Rf avec
un témoin (une même substance migre à la même hauteur dans des conditions opératoires
identiques ; même Rf) (Omurtag et Yazicioglu 2001).

3. Méthodes rapides de criblage

3.1. Méthodes immunochimiques (ELISA)

La technique d'ELISA a été conceptualisée et développée en 1971 par 2 scientifiques

suédois, Peter Perlmann et Eva Engvall.

Les tests immunochimiques sont basés sur les interactions entre les anticorps et les
antigènes que constituent les mycotoxines. Les anticorps doivent être fortement spécifiques
pour identifier les composés structurellement très différents.

Les analyses immunochimiques telles que « Enzyme Linked Immunosorbent Assay »

(ELISA) sont devenues très populaires dans le criblage de mycotoxines.

Plusieurs modalités de dosage sont possibles, soit par compétition, soit par révélation
direct ou indirect (technique sandwich). Ils peuvent servir à doser aussi bien des Ag que des
Ac. De nombreux montages sont aussi possibles.

La technique ELISA est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet de

visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action
sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.

3.2. Cas des technologies immunochimiques émergentes

• Lateral flow devices [LFD]

Des « tigettes » immunochimiques (lateral flow devices [LFD]) permettent une

détection rapide basée sur l’interaction entre les anticorps spécifiques, immobilisés sur une
bande de membrane et des récepteurs anticorps coatés (latex ou colloïdal), qui réagissent
avec l’analyte pour former un complexe d’analyte-récepteur (Huybrechts et al., 2013).

59
 3.3. Fourier transform mid-infrared spectroscopy [FT-MIRS]

Au cours des dernières décennies, l'utilisation croissante de la spectroscopie infrarouge

comme une technologie rapide et non destructrice, a permis de maintenir cette méthode pour
l'analyse de différents composés dans un large éventail d'aliments.

L’application de la spectroscopie de Transformation à infrarouge moyenne (FT-MIRS)

de Fourier est une méthode de dépistage viable, de détection de la présence de
déoxynivalénol.

L'utilisation de la spectroscopie proche de l’infrarouge (NIR) et de l’infrarouge moyen

(MIR) a également été évaluée pour la détermination rapide de mycotoxines dans les
céréales.

La FT-MIR-ATR (spectroscopie de réflexion totale atténuée) a également été utilisée

pour la détermination des aflatoxines dans les arachides et les gâteaux d’arachides
(Mirghani et al., 2001).

B- Validation

1. Validation de la Méthode

1.1. Limite de Détection de la Méthode (LDM)

La limite de détection d’une méthode est la plus basse concentration pour un composé
analysé dans une matrice réelle qui, lorsqu'il subit toutes les étapes d’une méthode complète,
incluant les extractions chimiques et le prétraitement, produit un signal détectable avec une
fiabilité définie statistiquement différent de celui produit par un « blanc » dans les mêmes
conditions.

La détermination de la LDM s’effectue selon les

• l’estimation de la LDM ;

• l’établissement de la LDM ;

• l’évaluation du ratio de conformité.

60
 1.2. Limite de Quantification de la Méthode (LQM)

La limite de quantification d’une méthode est la concentration minimale qui peut être
quantifiée à l’aide d’une méthode d’analyse avec une fiabilité définie. C’est la concentration
équivalente à 10 fois l’écart type obtenu lors de l’établissement de la LDM. (CEAEQ, 2015).

LQM = 10 × s

Où LQM : limite de quantification d’une méthode ; s : écart type.

1.3. Limite de Linéarité (LL)

La limite de linéarité est le plus haut niveau fiable de mesure qu’on puisse utiliser en
tenant compte de tous les facteurs à considérer dans une méthode.

L’étendue de concentration des étalons qui se situe entre la LQM et la LL est la zone
quantifiable utilisée dans une méthode d’analyse. Le coefficient de corrélation doit être
supérieur à 0,995 pour respecter le critère de la limite de linéarité.

1.4. Fidélité

La fidélité à un niveau donné correspond à l’étroitesse de l’accord entre les résultats

obtenus en appliquant le procédé expérimental à plusieurs reprises (n = 10 replica) dans des
conditions déterminées. Selon les conditions d’exécution de l’essai, cette caractéristique
s’exprime sous forme de réplicabilité, de répétabilité ou de reproductibilité pour une méthode.

1.5. Justesse

La justesse à un niveau donné correspond à l’étroitesse de l’accord entre la valeur

certifiée par un organisme reconnu et le résultat moyen qui serait obtenu en appliquant dix
fois le procédé expérimental (n = 10 replica). La justesse se mesure, à un niveau donné de
concentration, dans la zone quantifiable pratique de la méthode. Elle s’exprime par l’erreur
relative.

1.6. Sensibilité

La sensibilité à une concentration donnée correspond au rapport de la variable de la

grandeur mesurée à la valeur correspondante de la concentration de l’élément à doser.

61
 1.7. Pourcentage de Récupération

Le pourcentage de récupération permet d’identifier, pour un échantillon donné ou un

type de matrice donné et à un niveau de concentration donné, la présence d’interférence
potentielle lors du processus d’analyse.

Le taux de récupération correspond à la différence (en pourcentage) entre la

concentration mesurée d’un échantillon fortifié et la concentration mesurée du même
échantillon non fortifié, divisée par la concentration de la substance ajoutée. Ce rapport tient
compte de la transformation chimique qui s’est produite, s’il y a lieu. Un minimum de cinq
essais est demandé pour l’évaluation d’une méthode d’analyse (CEAEQ, 2015).

C- Production agricole et prévention et décontamination des aliments

par les mycotoxines

1. Production Agricole

. Les productions agricoles estimées sont de 3.702.370 tonnes pour le mil, 1.354.927
tonnes pour le sorgho, 7610 tonnes pour le maïs, 5.031 tonnes pour le riz pluvial, 5.467
tonnes pour le fonio, 1.109.692 tonnes pour le niébé, 223.966 tonnes pour l’arachide, 57.464
tonnes pour le sésame et 22.948 tonnes pour le souchet.

Pour une population estimée au 30 avril 2013 à 16.839.194 habitants, les besoins
céréaliers (toutes céréales confondues) sont estimés à 4.034.854 tonnes dont 3.610.713 tonnes
pour les céréales sèches constituées de mil, sorgho, maïs et fonio. A cet effet, les normes de
La production céréalière au Niger en 2012/2013 est estimée à 5.075.405 tonnes, soit un
accroissement de 22% par rapport à la moyenne des cinq (5) dernières années et de 43% par
rapport à celle de 2011consommation utilisées sont respectivement de 231 Kg/personne/an
pour toutes les céréales réparties en 207 Kg/personnes/an pour les céréales sèches, 18 Kg pour
le riz et 6 Kg pour le blé. Le bilan prévisionnel céréalier est excédentaire estimé à 805.738
tonnes dont 740.738 tonnes en céréales sèches. Il est cependant déficitaire en riz de -247.523
tonnes. (Diallo et al., 2012).

Les résultats provisoires des études réalisées par le Ministère de l’Agriculture -

Direction des Statistiques montrent que les moyennes de productions céréalières (maïs, riz,
arachide, sorgho et millet) de la République du Niger de 2007 à 2011 sont respectivement

62
(8 886 ; 20 248 ; 302 319 ; 1 003 058 ; 3 117 156) tonnes. Les tableaux 8 et 9 résument
l’évolution des productions durant cinq années.

Tableau 8 : Évolution des productions agricoles (tonnes) 2012/2013 et comparaison

par rapport à celles de 2011/2012 et à la moyenne des cinq (5) années. (MADS, 2012)

Année Maïs Riz Sorgho Millet Céréales Arachide

2007 19 324 6 455 975 223 2 781 928 3 782 930 147 676

2008 7 968 32 475 1 226 251 3 521 727 4 788 421 308 510

2009 1 389 20 117 738 661 2 677 855 3 438 022 253 497

2010 9 381 29 963 1 304 832 3 843 351 5 187 527 406 245

2011 6 366 12 230 770 322 2 760 917 3 549 835 395 669

2012 7 610 5 031 1 354 927 3 702 370 5 069 938 223 966

Moyenne 07 - 11 8 886 20 248 1 003 058 3 117 156 4 149 348 302 319

Taux de croissance 20% -59% 76% 34% -43%

2012/2011

Taux de croissance -14% -75% 35% 19% -26%

2012/Moyenne (07-11)

Résultats provisoires 2012/2013

63
Tableau 9 : Résultats définitifs de la campagne agricole 2012/2013. Unités : Superficie en Ha, rendement en kg/Ha, production en
tonne (INS, 2013).

Produit Agadez Diffa Dosso Maradi Tahoua Tillabery Zinder C.u.n. Ensemble

Superficie 177 178 818 1 319 454 1 528 216 1 318 145 1 430 207 1 293 434 26 656 7 095 107

Millet Rendement 786 510 520 571 575 525 530 677 544

Production 139 91 273 686 103 871 999 757 449 751 149 686 006 18 037 3 862 155

Superficie 35 31 098 134 956 1 055 441 575 062 243 298 1 066 736 4461 3 111 087

Sorgho Rendement 1 119 417 569 380 675 381 376 544 442

Production 39 12 981 76 801 401 519 388 049 92 672 401 208 2 427 1 375 696

Superficie 0 0 3 123 0 0 1 145 1 074 0 5 342

Riz Rendement 0 0 1020 0 0 1 386 612 0 1 016

Production 0 0 3 185 0 0 1 587 657 0 5 429

Superficie 499 0 3 774 2 281 3 092 0 0 0 9 646

Maïs Rendement 1 439 0 1 145 519 708 0 0 0 872

Production 718 0 4 321 1 184 2 189 0 0 0 8 412

Superficie 0 5 890 72 412 360 796 52 434 22 889 226 889 0 741 310

Arachides Rendement 0 411 456 302 487 408 496 0 394

Production 0 2 418 33 015 108 926 25 538 9 334 112 532 0 291 763

Céréales Production 896 104254 770 410 1274702 1 147 687 845408 1087871 20464 5 251 692

80
2. Prévention de la contamination des aliments par les mycotoxines

Compte tenu de l’importance du rôle des facteurs environnementaux sur la présence des
moisissures toxinogènes dans les récoltes et la production de mycotoxines qui est un
phénomène naturel, il serait quasiment impossible d’éliminer toute trace de mycotoxines des
produits alimentaires. Néanmoins, il est possible de minimiser la contamination en prenant
des précautions, avant la récolte, au moment de la récolte et après récolte.

La réduction des taux des mycotoxines relève à la fois du rôle des agriculteurs, des
commerçants et des industriels. Ainsi les bonnes pratiques culturales contribuent efficacement
à diminuer les lésions des plantes, à lutter contre les infestations d’insectes (insecticides), à
réduire l’envahissement par les moisissures (fongicides, lavage, séchage). Après la récolte et
pendant le stockage, une inspection rigoureuse des produits alimentaires doit être
fréquemment effectuée avant la mise sur le marché (Riley and Norred, 1999).

3. Décontamination des aliments par les mycotoxines

Outre les méthodes de prévention contre la contamination des aliments par les mycotoxines, Il
faut également élaborer des stratégies pour décontaminer les matières premières en cas de
contamination.

La réduction du taux de mycotoxines peut s’effectuer pendant le procédé de fabrication de

l’aliment (Bullerman et Bianchini, 2007) ou par ajout d’additifs dans l’aliment qui
éliminent ou désactivent les mycotoxines dans l’organisme. Dans tous les cas, le procédé de
décontamination doit détruire ou inactiver la toxine, ne doit pas générer de résidus
toxiques, doit maintenir la qualité nutritive de l’aliment et ne doit pas modifier les
propriétés technologiques du produit.

Parmi les procédés étudiés afin de lutter contre la contamination des récoltes par les
mycotoxines on peut citer : Procédés physiques, Procédés chimiques et les Procédés
biologiques.

81
 3.1. Procédés physiques

Les méthodes physiques sont nombreuses, elles sont basées en général sur le lavage, le
séchage, le broyage, le tri manuel, la séparation mécanique, le traitement par un choc
thermique et la torréfaction.

3.1.1. Le nettoyage

C’est un processus qui consiste à débarrasser les grains salles de la poussière, des débits et
autres corps étrangers.

3.1.2. Tri et séparation mécanique

Dans ce procédé, le produit pur est séparé de ses grains contaminés par des moisissures.
Des pertes élevées de l’aliment sont possibles en raison de la séparation incomplète et
incertaine. Par conséquent tri mécanique et la séparation ne sont toujours pas rentables.

3.1.3. lavage

Les procédures de lavage utilisant de l'eau ou une solution de carbonate de sodium

provoquent une certaine réduction des mycotoxines dans les grains.

3.1.4. Densité ségrégation

La ségrégation de flottation peut être utilisée pour la séparation des grains sains des grains
contaminés. Cette méthode peut réduire la contamination par les mycotoxines, mais il
convient de noter, que l'apparence et le poids d'un grain particulier ne signifie pas
nécessairement contamination par les mycotoxines.

3.1.5. L'inactivation thermique

Les mycotoxines sont très stables à la chaleur. Les traitements thermiques tels que l’eau
bouillante, grillage ou même à l'autoclavage peuvent ne pas les détruire adéquatement.
Cependant, la technique d’extrusion permet d’éliminer les aflatoxines, Le DON, la ZEA
et la FB1 dans le maïs (Cazzaniga et al., 2001 ; Rustom, 1997 Voss et al., 2008), tout en
réduisant la charge microbienne de façon globale. Ceci implique un passage court de la
denrée contaminée à plus de 150 °C et entraîne des modifications moléculaires qui
gélatinisent l’amidon, dénaturent les protéines et inhibent les activités enzymatiques.

D’autres méthodes physiques sont, l'irradiation (y compris les micro-ondes), les ultrasons ou
l'extraction par solvant.

82
 3.1.6. Radiation

L’AFB1 est sensible aux ultraviolets, rayons x et rayons g. Il est donc possible de
diminuer le taux d’AFB1 par radiation (Rustom, 1997 ; Afifi et al., 2003). Les radiations g
permettent également de réduire la flore microbienne.

3.1.7. le stockage étanche et en atmosphères contrôlées

La conservation des grains secs en silos souterrains étanches et en atmosphère contrôlé est une
technique de stockage qui appauvries en oxygène, d’une part sur les insectes infestant habituellement
les grains stockés et d’autre part sur les microorganismes, et notamment les moisissures qui se
développent aux dépens des produits stockés (Banks, 1981).

4. Procédés chimiques

4.1. Ammoniation

L’ammoniation du maïs, des arachides et autres matières premières est largement

utilisée pour diminuer les teneurs en aflatoxines des aliments. C’est une méthode efficace de
décontamination des nourritures animales, utilisée depuis plusieurs années (Park et al.,
1988). Elle est particulièrement efficace contre l’AFB1 lors de l’utilisation simultanée de
hautes températures et de hautes pressions. Un des produits de dégradation observé pour ce
procédé est l’AFD1 (figure 16). Le problème de cette méthode est son inefficacité contre les
autres mycotoxines, son coût et la possible détérioration de la qualité sanitaire de l’aliment
par une quantité résiduelle d’ammoniac trop importante (Huwig et al., 2001).

Figure 16 : Structure chimique de l’AFD1.

83
 4.2. Bisulfites

Il a été démontré que le bisulfite de sodium (NaHSO3) peut détruire les mycotoxines,
principalement l’aflatoxine B1 dans le maïs et les figues séchées. En outre le NaHSO3 en
solution peut réduire le niveau de DON jusque 85% dans le maïs contaminé. (4.4 mg/ kg) et il
se forme une forme conjuguée (DON – sulfonate) lorsque le traitement est réalisé à 80 ° C
pendant 18 h (Zaki et al., 2012).

4.3. Les antioxydants

Les antioxydants tels que la vitamine E ont été considérées comme des compléments
alimentaires pour contrer l'effet de la toxine T-2. Un effet bénéfique partielle, en termes de
réduction in vivo de la peroxydation lipidique, a été rapporté dans une étude avec des poulets
(Hoehler et Marquardt, 1996). La vitamine C a été inefficace à cet égard.

4.4. L’ozonation

L'ozonation est un traitement chimique par oxydation. L’ozone est une molécule formée
de trois atomes d'oxygène dont le symbole est O3. Dans les conditions usuelles d'utilisation, il
est à l'état gazeux et soluble dans l'eau. C'est un oxydant puissant et donc chimiquement
instable dans les mélanges gazeux et liquides. Cette molécule dégrade et détoxifie les
aflatoxines dans le maïs naturellement contaminé (Riley and Norred, 1999).

4.5. Le charbon actif

Le charbon actif est constitué essentiellement de matière carbonée à structure poreuse

généralement obtenue après carbonisation à haute température et présentant une très grande
surface spécifique qui lui confère un fort pouvoir adsorbant. Ce matériau réduit la conversion
de l'aflatoxine B1 en aflatoxine M1 dans l’alimentation des vaches (Riley and Norred, 1999).

84
5. Procédés biologiques

5.1. Interactions entre les microorganismes

Une diversité de champignons peut infester les produits agricoles avant comme après la
récolte. Il s’agit des genres : Botrytis, Alternaria, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus,
Cladosporium (Fleet, 2001) et différents types de levures. Des interactions entre les
moisissures ou entre levures et moisissures peuvent avoir lieu et peuvent avoir un impact sur
la production de mycotoxines (Le Bars et Le Bars, 1987).

- Des Moisissures plus ou moins compétitives ne permettent pas l’installation d’autres

espèces,

- Bactéries ou levures, dont les vitesses de multiplication sont plus rapides dans la
mesure où les conditions physico-chimiques, notamment l’activité de l’eau, leur sont
favorables,

- Acariens et insectes, qui favorisent la dissémination des spores et altèrent les défenses
naturelles de la denrée par les lésions qu’ils provoquent (Bejaoui, 2005).

5.2. Élimination de l'OTA par des microorganismes

De nombreuses études se sont portées sur les adsorbants biologiques des mycotoxines.
Ces études visent une bonne efficacité et une meilleure spécificité d’adsorption tout en
diminuant l’impact sur la qualité nutritionnelle des aliments.

5.2.1. Les levures ou produits dérivés de levure

Des souches entières de levures, Saccharomyces cerevisiae ou d’autres types de levures

œnologiques ont la capacité d’adsorber les mycotoxines avec une efficacité très variable. Les
éléments responsables de cette adsorption, des glucomannanes extraits des parois de levures,
ont été testés séparément in vitro et in vivo. Les résultats sont répertoriés dans le tableau 10.

85
 Tableau 10 : Adsorption des mycotoxines par des levures ou produits dérivés de
levure (Jard, 2009).

Souche de levures Mycotoxines Remarques Références

S. cerevisiae AFB1 In vitro : In vitro :

Parois de levure 40% de l’AFB1 adsorbée Shetty et al., 2006, 2007
enrichies en In vivo : In vivo :
glucomannanes Baisse des effets génotoxiques de Madrigan-Santillan et
l’AFB1 al., 2006
après ajout de S. cerevisiae chez le rat In vitro :
In vitro : Yiannikouris, 2004
Très efficace (A1=97%)

S. cerevisiae OTA In vitro : In vitro :

Levures 45% d’OTA adsorbée Bejaoui et al., 2004
oenologiques Peu efficace (A=11%) Cecchini et al., 2007
MTB-100 Angioni et al., 2007
Yiannikouris, 2004

Plusieurs types de bactéries lactiques mentionnées dans la littérature possèdent

également la capacité à éliminer l'OTA, telles que: Lactobacillus acidophilus dans le yaourt et
sur milieu MRS (Skrinjar et al., 2002; Piotrowska et Zakowska, 2002a), Lactobacillus
plantarum, L. sanfrancisco et L. brevis testés sur une pâte boulangère (Piotrowska et
Zakowska, 2002a et 2002b). Les propionibactéries et les bifidobactéries possèdent des
structures pariétales capables de se lier aux mycotoxines. L’efficacité d’adsorption dépend
beaucoup des souches étudiées (Peltonen et al., 2001). L’adsorption entre les mycotoxines et
les bactéries lactiques semble être du à des polycarbonates, provoquant des liaisons
hydrophobes (Haskard et al., 2000 et El-Nezami et al., 2004) (tableau 11).

86
 Tableau 11 : Adsorption des mycotoxines par des bactéries lactiques (Jard, 2009).

Souche de levures Mycotoxines Remarques Références

L.rhamnosus AFB1 In vitro : In vitro :

L. gasseri Adsorption de 80% de l’AFB1 Haskard et al., 2001
L. acidophilus Adsorption réversible Pierides et al., 2000
L. amylovirus Adsorption de 60% de l’AFM1 El-Nezami et al., 1998,
2002
L.lactis Inactivation à l’acide ou à la chaleur
Pierides et al., 2000
B.lactis augmente l’efficacité d’adsorption
Bueno et al., 2007
B. animalis Adsorption de 40 à 70% de l’AFB1 par
des Peltonen et al., 2001
B. longum
bactéries vivantes ou mortes El Nezami et al., 2000
B. bifidum
Adsorption réversible Fazeli et al., 2009
B. adolescentis
Propionibacterium
freundenreichii
L. casei
L. plantarum
L. fermentum

L. acidophilus OTA In vitro : Fuchs et al., 2008

B. animalis Adsorption de 95%
Oenococcus oeni Baisse de toxicité de 59% par analyse
de
micronoyaux sur cellules hépatiques
humaines
28% d’OTA adsorbée
Del Prete et al., 2007

5.3. Action des huiles essentielles sur les moisissures.

Les huiles essentielles ainsi que des composés dérivés possèdent d’importantes activités
dont l'activité antifongique. Les tests antifongiques in vitro ont montré que les huiles
essentielles possèdent des activités antifongiques prononcées à faible concentration.
(Nguefacka et al ., 2004, Magan et Olsen, 2004).

87
 Ainsi les huiles essentielles et les extraits aqueux d’Ocimum gratissimum, Ocimum
canum, Hyptis suaveolens, Ageratum conyzoides et de Lantana camaraont ont des activités
antifongiques très prononcées sur les souches toxinogènes Aspergillus flavus, Aspergillus
parasiticus, Aspergillus ochraceus, Fusarium oxysporum testées (Adjou et Soumanou,
2013).

D- Réglementations

1. Réglementation nationale

Une réglementation détermine les concentrations maximales autorisées pour les

principales mycotoxines dans les denrées destinées à l’alimentation humaine ou animale.
Actuellement en république du Niger, il n’existe pas des normes ou des limites réglementaires
spécifiques fixant les teneures maximales des mycotoxines dans l’alimentation humaine et
animale. Les organes de contrôle nigériens se réfèrent aux normes étrangères (FAO, CE…)
pour se prononcer sur les denrées alimentaires fortement contaminées par les mycotoxines.

La plupart des réglementations existantes en matière de mycotoxines se rapportent aux

aflatoxines. Pour les arachides, noix, céréales et produits dérivés destinés à la consommation
humaine directe, le règlement CE n° 466/2001 indique d’une part une teneur d’aflatoxines
totales (B1+B2+G1+G2) limitée à 4μg/kg et d’autre part une limite à 2μg/kg pour l’aflatoxine
B1 uniquement (règlement CE n° 466/2001) (EC, 2001). Pour tous les produits laitiers,
l’aflatoxine M1 doit avoir une teneur inférieure à 0,05μg/kg et 0,03μg/kg pour ceux destinés
aux enfants de moins de trois ans.

Au Laboratoire national de santé publique et d’expertise (LANSPEX), des travaux de

recherches sont menés afin de trouver des solutions aux problèmes des aflatoxines dans les
aliments. Il s’agit principalement d’un projet de recherche sur la détermination des
mycotoxines dans les denrées alimentaire dont l’objectif est de constituer une base de données
qui permettra l’élaboration de normes nationales, tenant compte des procédés locaux de
transformation de ces produits (Le Scientifique, 2009).

88
 2. Réglementations internationale

En mars 1999, la FAO en collaboration avec l’OMS, a parrainé la troisième conférence

mondiale sur les mycotoxines. Cette conférence a été organisée pour sensibiliser les décideurs
aux risques sanitaires et aux conséquences économiques potentiels de la contamination des
denrées alimentaires et des produits d’alimentation animale par les mycotoxines

L’objectif de la conférence était de promouvoir l’harmonisation des réglementations et

des procédures de contrôle, et de recommander des stratégies permettant d’évaluer, de
prévenir et de lutter contre la contamination des aliments par les mycotoxines.

Ainsi, Afin de contrôler le contenu des denrées alimentaires d’origine végétales ou

animales en mycotoxines, plusieurs pays ont établi ou proposé des limites réglementaires. Au
début, environ 100 pays dont, 15 africains, ont établi des règles afin de protéger le
consommateur (Van Egmond, 2002 ; Fellinger, 2006). Le nombre de pays ayant des
réglementations spécifiques pour les mycotoxines a augmenté au fil des années, en raison de
la préoccupation générale des gouvernements au sujet des effets potentiels des mycotoxines
sur la santé humaine et animale et de leurs incidences sur le commerce.

En effet, pour limiter la présence des mycotoxines dans l’alimentation humaine, les
pays de l’Union Européenne ont édité un règlement (CE, 98). Ce règlement a été révisé
plusieurs fois et chaque année la commission européenne publie ces réglementations d’une
manière régulière, comme le règlement N° CE 1881/2006 date du 19 décembre 2006
(Zinedine, et Idrissi, 2007c). Ce dernier a été révisé en 2007 afin d’introduire des limites
pour les toxines de Fusarium. En Avril 2013, une recommandation pour les toxines T2 et HT-
2 est entrée en application (2013/165/UE). Elle préconise également, par recommandation,
une teneur maximale (dite « valeur guide ») pour l'alimentation humaine.

89
PARTIE II - MATERIEL ET METHODES

90
 CHAPITRE I : ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES
MOISISSURES DES CÉRÉALES ET ARACHIDES

1. Principe

Le principe de la méthode consiste à isoler en culture pure des colonies de moisissures à

partir des grains céréales et l’arachide. Ces moisissures sont identifiées grâce à la clef
d’identification qui tient compte des caractéristiques macroscopiques et microscopiques
(Champion, 1997).

En effet dans cette méthode, les grains sont placés sur des milieux de cultures
appropriés. La surface des grains est directement désinfectée avant l’ensemencement, afin
d’éviter d’éventuelles contaminations par le milieu extérieur (poussières d'autres sources).

Cette méthode d’ensemencement direct permet d’identifier les mycètes propres aux
aliments faisant l’objet de notre étude. Les résultats obtenus sont exprimés en taux de
particules contaminées.

2. Description du site

Dans le cadre de notre étude sur la contamination des denrées céréalières et

oléagineuses par les mycotoxines, la problématique identifiée est un sujet d’actualité et
plusieurs pays dans le monde s’y intéressent. La ville de Niamey est celle qui a fait l’objet de
notre étude. Elle est située dans la zone Sahel, alimentée par le fleuve Niger et est soumise à
de nombreuses fluctuations climatiques.

Pays totalement enclavé au cœur de l’Afrique de l’Ouest, le Niger s’étend sur une
superficie de 1 267 000 Km2 faisant de ce pays le plus vaste de l’Afrique de l’Ouest, avec plus
de 80% des terres couvertes par le désert chaud du Sahara.

Avec une population résidente totale recensée (RGPH/2012) de 17. 138. 707, le Niger
partage ses frontières au Nord avec l’Algérie et la Libye, au Sud avec le Nigéria et le Bénin ;
à l’Est se trouve le Tchad et à l’Ouest le Burkina Faso et le Mali (figure 17).

91
 Figure 17 : Localisation géographique et conditions climatiques de la République du
Niger.FAO - AQUASTAT, (2005)

Ainsi c’est un immense plateau d’une altitude moyenne de 500 mètres. La frontière la
plus proche de la mer est à plus de 600 km du golfe de Guinée. Le climat est de type sahélien
caractérisé par une longue saison sèche de huit à 10 mois (Octobre-Mai). Les températures
peuvent dépasser les 40°C entre Mars et Juin, période où souffle l’harmattan.

La pluviosité varie toutefois d’une région à l’autre et sa distribution importante est très
irrégulière, les niveaux tombant abruptement au fur et à mesure qu’on monte vers le Nord.

Une courte saison des pluies qui dure trois ou quatre mois (Juin-Septembre) et une
variation du nombre de jours de pluie du sud au nord, divisant ainsi le pays en quatre zones
climatiques, à savoir la zone Sahel/Soudan, la zone Sahel, la zone Sahel/Sahara et enfin la
zone Sahara (Figure 18).

92
La zone Sahel/Soudan La zone Sahel La zone Sahel/Sahara La zone Sahara
Figure 18 : Zones climatiques du Niger (National Adaptation Programme of
Action, 2006)

La zone Sahel/Soudan : C’est une région avec des précipitations annuelles allant de 600 à
800 mm. Elle constitue environ 1 % du pays, dont la végétation est la savane. C’est une
zone relativement riche dont on peut dire qu’elle est la zone la plus propice à l'agriculture.

La zone Sahel : Il s'agit d’une zone avec des précipitations annuelles allant de 300 à 600
mm, constituant environ 10 % du pays. L’'environnement est relativement propice à
l'agriculture, avec une forte concentration de population.

La zone Sahel/Sahara : C’est une zone avec des précipitations annuelles allant de 150 à
300 mm, et qui constitue environ 12 % du pays. Elle est couverte d’une végétation
d’espèces herbacées et de steppes et est propice aux activités pastorales.

La zone Sahara : C'est une zone très aride avec des précipitations annuelles inférieures à
150 mm. Elle couvre environ 77 % du pays, où la végétation ne se trouve qu’à certains
endroits limités comme dans les vallées et les oasis.

93
3. Présentation des échantillons

En Octobre 2011, des prélèvements ont été réalisés dans différents marchés locaux de la
ville de Niamey (Habou-tédji, Hinni-habou, wadarta, petit marché, Bomkané et Katako).
500g de chaque céréale et arachide sont prélevés au hasard et emballés de façon appropriée
dans des sachets propres puis transportés au laboratoire de Toxicologie pour être analysés
(figure 19).

Figure 19 : Échantillons de céréales et d’arachides non moulus (500g)

50g de chaque échantillon sont ensuite mis dans des boîtes propres pour être analysés au
laboratoire de Mycologie. Ces échantillons qui ont servi à l’analyse mycologique sont secs et
ne présentent pas de fissures. A l’œil nu, ces grains sont sains et dépourvus de toute
moisissure apparente. La présente étude mycologique a porté sur 22 lots d’échantillons de 50g
chacun dont : le millet (n*=7), le sorgho (n=3), le maïs (n=6), le riz (n=1), l’arachide (n=5).

n* : nombre d’échantillons

94
4. Mesure de l’humidité des grains

L’humidité représente la quantité d'eau que contient le grain. Elle a été déterminée par
dessiccation de ces denrées moulues, à une température de 130°C pendant 4 heures. Le taux
d’humidité est exprimé en pourcentage et calculé par la formule suivante (AFSCA, 2013).

H (%) = (M1 – M2)/ M1 x 100

H (%) = taux d’humidité exprimé en pourcentage,

M1= Poids de l’échantillon en gramme avant séchage,

M2 = poids de l’échantillon en gramme après le séchage.

5. Isolement et identification des moisissures

5.1 Isolement de moisissures des grains

10g de grains sont prélevés au hasard à partir de 50g de chaque échantillon. Sous le
PSM, (Poste de Sécurité Microbiologique) La surface de ces grains est désinfectée dans une
solution d’hypochlorite de sodium à 3%, pendant 30 seconde puis rincée pendant 2min à trois
reprises dans de l’eau distillée stérile.

Les grains sont égouttés, puis à l‘aide d’une anse stérile à usage unique, ils sont
ensemencés par groupe de 5 dans des boîtes de Petri de 90 mm de diamètre contenant de la
Gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA).

Trois essais sont réalisés par milieu de culture. Le premier ensemencement est fait sur
PDA et les repiquages on été fait sur de la Gélose à l'extrait de malt (MEA) et du Czapek
Yeast Agar (CYA). Le PDA est un excellent milieu de culture pour l’isolement des
moisissures mycotoxinogènes. Les grains ensemencés sur ce milieu de culture sont incubés à
26°C ± 1 pendant 7 jours.

Durant cette période, un suivi quotidien est effectué. On remarque la croissance et le

développement rapide de la flore fongique des grains de céréales et d’arachide.

95
 5.2 Incubation des cultures isolées et repiquage

Après incubation à 26°C ± 1, on remarque la croissance et le développement progressif

de moisissures, sur le milieu de culture PDA. Au cours des trois premiers jours de suivi de la
croissance des moisissures, on constate que dans certaine boîtes de Petrie, certaine colonies se
développent plus vite que d’autres. Dans ces conditions, pour éviter que ces moisissures à
croissances rapide n’envahissent complètement les boites, nous procédons au repiquage dès le
4ème jour d’incubation.

Cependant les boites de Petri dans lesquelles les moisissures présentent une croissance
et un développement normales sont repiquées au plus tard le 7 ème jour. Ainsi donc, les
repiquages de chaque boite de Petri est fait par ordre de priorité. Les boites qui présentent un
envahissement sont repiquées suivi de boites où les moisissures présentent une évolution
normale et sans compétition.

Les colonies isolées sont aseptiquement repiquées sur les milieux précédemment cités :
le milieu de culture CYA et le milieu MEA. Ces milieux de cultures sont coulés dans des
boîtes de Petrie de 45 mm de diamètre. Trois répliques sont faites par souche en tenant
compte de l’aspect macroscopique de celle-ci. Dans chaque boite on repique deux fois la
même souche. Ces milieux de cultures contiennent les éléments nutritifs et permettent le
développement et l croissance rapide des moisissures isolées.

Les Derniers repiquages sont soigneusement effectués sur les petites boîtes de Petri, à
raison d’une souche par boîte. La température d’incubation est la même que précédemment.
Un suivi et un examen des boîtes ensemencées est fait quotidiennement, pour étudier la
pousse des colonies (Botton et al., 1990 ; Guiraud, 1998).

5.3 Dénombrement des moisissures

7 jours après incubation des cultures sur les petites boîtes de Petri, les examens effectuées
à l’œil nu, pour chaque isolat se sont portés sur les critères suivants : Vitesse de croissance ;
Aspect des colonies (la couleur au fil du temps, l’aspect du mycélium) ; Aspect du revers des
boîtes ; la texture de la colonie… .

Des prélèvements de spores et d’hyphes mycéliens sont effectués en périphérie et un au

centre sur les souches suffisamment développées. Ces prélèvements sont montés entre lame et
lamelle en présence de bleu coton. Les lames préparées pour l’observation microscopique

96
permettent d’observer l’appareil végétatif (thalle), la tête conidiale, l’appareil
reproducteur (types de conidies produites, Vésicule, métules, Conidiospores), etc.…

L’identification des différentes espèces des mycètes a été faite sur la base des critères
macroscopiques et microscopiques (Champion, 1997).

5.3.1. Identification macroscopique

Les critères macroscopiques reposent sur l’observation des colonies et de leur couleur
recto et verso, leur relief, leur aspect (filamenteux, collant …), leur transparence (opaque,
translucide), l’allure des contours et la Pigmentation diffusant parfois dans la gélose.

Aussi comme souligné ci-dessus, la vitesse de croissance, l’odeur dégagée et la texture

sont prises en compte.

5.3.2. Identification microscopique

Les examens microscopiques sont pris en compte :

Aspect du mycélium, aspect des spores, aspect des phialides, aspect des conidiophores et de la
tête conidiale, etc (Cahagnier et Richard-Molard. 1998).

La méthode utilisée pour l’observation au microscope, est celle de (Pitt and Hocking,
1997 ; Klich and Pitt, 1994 ; Moreau, 1991). Ainsi sur une lame porte objet est déposée une
goutte de bleu coton dans laquelle on place délicatement un fragment de thalle à observer.

L’ensemble est recouvert d’une lamelle pour être observé au microscope. Une
observation au faible grossissement (×10 et ×40) nous permet déjà de distinguer la forme (tête
conidiale, conidiophore, mycélium) de la moisissure.

6. Conservation des souches

Après purification des souches identifiées celles-ci sont conservées dans des tubes
inclinés contenant le milieu de culture CYA après une semaine d’incubation.

La conservation à 4°C favorise la viabilité (et limite les possibilités de variations) des
souches. Nous avons préféré le CYA pour la conservation de nos cultures, car c’est un milieu
de culture favorable à la croissance et à l’entretien des moisissures isolées.

97
 CHAPITRE II : ETUDE DE LA CONTAMINATION DES
ALIMENTS PAR L’OCHRATOXINE A (OTA)

1. Échantillonnage

Dans cette étude, les analyses mycotoxicologiques ont porté sur un total de quatre vingt
et un (81) échantillons composés de riz (n = 22), maïs (n = 39), sorgho (n = 6), millet (n = 7)
et arachide (n = 7). Ces échantillons ont été prélevés de façon aléatoire chez différents
commerçants de la ville de Niamey. Cela étant, Chaque élément d’échantillon a la même
probabilité d'être choisi que tous les autres éléments de la population visée.

Les échantillons sont ensuite emballés dans des sacs en plastiques étanches, à l’abri de
la lumière, puis transportés au département de Toxicologie-Hydrologie de l’Institut National
d’Hygiène de Rabat (tableau 12).

Tableau 12 : Répartition des échantillons de céréale en fonction du marché.

Denrées alimentaires Nombre Marché

Arachide 7 Habou-tédji, Hinni-habou

Habou-tédji, Hinni-habou,
Maïs 39 wadarta, petit marché,
Bomkané et Katako

wadarta, petit marché,

Millet 7
Bomkané et Katako

Habou-tédji, Hinni-habou,
Riz 22
wadarta, petit marché

Sorgho 6 Hinni-habou

98
2. Analyse de l’OTA

• Principe d’analyse.

La procédure d’analyse habituelle des mycotoxines dans les céréales comporte

essentiellement les étapes suivantes : l’extraction, purification, et le dosage (Huybrechts et
al., 2013).

Les protocoles destinés à l’analyse de l’OTA renferment systématiquement des étapes

préliminaires de préparation des échantillons (broyage, extraction en milieu organique,
centrifugation). Ces étapes sont souvent très longues, manuelles et doivent être optimisées
pour chaque type de matrice.

Étant donné que l’analyse de l’OTA tient aussi compte des analyses de traces, il est
important de procéder dans la mesure du possible, à une étape de purification puis de
concentration de l’extrait. Après filtration à l’aide de micro-filtres, l’OTA est enfin dosée
grâce à la florescence qu’elle émet sous la lumière ultra-violette (UV) suivant des longueurs
d’ondes d’excitation et d’émission spécifiques (Sifou et al., 2015). Pour l’OTA (PM = 403.8
g/mole), la mesure de l’Absorbance à 330 nm, le coefficient d’absorption molaire de
l’ochratoxine A dans le méthanol est de 5500 mol-1.cm-1.

3. Préparation du standard de l’OTA

Des solutions d'OTA (Sigma -St. Louis, MO, USA) ont été préparées dans du méthanol.
A partir d’une solution mère de concentration 500µg/ml, des solutions filles ont été préparées.
La quantité nécessaire a été évaporée à sec et ensuite dissoute dans 1ml de la phase mobile
dans les conditions chromatographiques appropriées.

Les solutions analytiques sont conservées à -20°C à l’abri de la lumière dans des vials,
marron-jaune adaptées à la conservation des mycotoxines. Tous les solvants utilisés sont de
qualité pour l’analyse HPLC. Le tableau 13 résume la composition des solvants utilisés pour
l’analyse de l’OTA dans les denrées alimentaires étudiées.

99
 Tableau 13 : Composition des différents solvants utilisés pour l’analyse de l’OTA

Mélanges Méthanol Eau Acétonitrile Chloroforme Acide

Volumes
de solvants % % % % acétique %

Solvant
100 - - - - 10 ml
d’extraction (OTA)

Phase mobile OTA - 49 50 - 1 40µl/min

4. Conditions chromatographiques

Le système chromatographique que nous avons utilisé consiste en un système HPLC

type Perkin-Elmer (USA) composé de :

− Une Pompe quaternaire (model Perkin-Elmer série 200),

− Un passeur d’échantillons (model Perkin-Elmer série 200, 100 positions),

− Un Détecteur de fluorescence (Perkin-Elmer série 200),

− Une interface (Perkin-Elmer, NCI 900), Un dégazeur (Perkin-Elmer série 200),

− La séparation a été effectuée sur une colonne Lichrosphere RP C18 (250 x 4,6 mm x 5μm
de diamètre), Pression : (780 à 800) Psi ; Flux : 40 ml/min.

4.1. Description du système HPLC

La pompe quartenaire avec un flux modulable, permet d’alimenter en permanence le

chromatographe en phase mobile. Le soluté préalablement dissout dans la phase mobile est
prélevé par une seringue, puis injecté dans la colonne à l’aide d’un injecteur équipé d’une
boucle d’injection.

La phase mobile draine les constituants du mélange vers la colonne chromatographique

composée de gel de silice (phase stationnaire). Les composés du mélange sont élués de la
colonne en fonction de leur affinité avec cette dernières et avec la phase mobile. Ceci
déterminera le temps de rétention de chaque composé du mélange.

100
 Les composés séparés sont détectés à la sortie de la colonne par un détecteur
fluorimétrique. Lors du passage en fonction du temps de chaque composé, des signaux sont
enregistrés puis traités par l’ordinateur sous forme de données chromatographiques. Les pics
obtenus ; spécifiques à chaque composé, sont déterminés par un intégrateur en fonction des
concentrations. Le traitement des signaux et leur enregistrement est fait par un logiciel adapté.

La concentration de la mycotoxine est calculée à l’aide d’une courbe d’étalon

préalablement établie avec des solutions de concentrations connues de ladite mycotoxine.

5. Analyse de l’ochratoxine A

Comme énoncé précédemment, toute procédure d’analyse de mycotoxines comporte

essentiellement les étapes suivantes : l’échantillonnage, la préparation de l’échantillon,
(extraction, purification ou isolation), et la détermination analytique (dosage).

Dans la présente étude, l’ochratoxine A, a été extraite selon une méthode élaborée et
validée au laboratoire de toxicologie de l’Institut National d’Hygiène de Rabat (Sifou et al.,
2015). Cette méthode économique, écologique, très peu coûteuse et rapide est appropriée à
l’extraction de l’OTA dans les aliments d’origine végétale

5.1. Détermination analytique

5.1.1. Préparation des échantillons

250g de chaque échantillon est moulu à l’aide d’un mixeur (Moulinex). 2,5g
d’échantillon sont prélevés puis mélangés à 10 ml du solvant d’extraction (Méthanol), dans
des flacons de 50ml étiquetés.

5.1.2. Extraction

Après agitation à l’aide d’un vortex durant 1 min, l’OTA est extrait sous l’action d’un
agitateur de grande vitesse « ultra-turrax (Model T25D, IKA) », et ce pendant 3 min.

Les échantillons sont ensuite laissé au repos pendant 4 minutes, afin de permettre la
décantation. Les extraits sont récupérés, dans des tubes à essai étiquetés. Ces derniers sont
ensuite centrifugés pendant 15 min à 3000rpm.

101
 A la fin de la centrifugation, le surnageant clair de chaque tube est récupéré dans un
ballon étiqueté, de 100 ml, puis séché au rota-vapeur à 45°C.

6. Dosage de l’OTA

A la fin de l’évaporation au rota-vapeur, l’extrait sec est repris avec 1000μl de la phase
mobile (acétonitrile-eau-acide acétique : 50 : 49 : 1, v/v/v).

Le mélange est ensuite filtré à l’aide d’un filtre millipore (0,22 µm de porosité) muni
d’une seringue de 3ml. Le filtrat est récupéré dans un vial brun. Après conditionnement de
l’appareil (HPLC), 40μl de cet éluât y sont injectés. La détermination de l’ochratoxine A, a
été effectuée à 333nm et à 464 nm comme longueurs d’onde d’excitation et d’émission
respectivement. La figure 20 résume le protocole suivi pour le dosage de l’OTA dans les
céréales et arachides.

102
 1 250 g prélevés broyés
Préparation de
l’échantillon
2 2,5 g d’échantillon broyé

3 Ajouter 10 ml méthanol

4
Extraction / Ultra-turrax (3min)

5 Centrifugation de l’extrait (15 min à Extraction

6 Évaporation à sec au rota-vapeur (45 °C)

7
Récupération 1 ml ACN/H2O/Ac acétique

8
Filtration (micro-filtre 0,22 µm porosité)

9
Transfert aliquote dans un vial

Injection en HPLC Analyse HPLC

10
Phase mobile : ACN/H2O/Ac acétique (50/49/1)

6 + 0,1ml (HCl) + 1ml (MeOH)

Filtration (micro-filtre 0,22 µm porosité) Confirmation

Analyse HPLC

Figure 20 : Protocole suivi pour le dosage de l’OTA dans les céréales et l’arachide

103
7. Confirmation OTA

L’extrait séché est dilué avec 1 ml de méthanol et 0,1 ml d’acide chlorhydrique (HCl)
concentré. A l’abri de la lumière, la solution est laissée au repos pendant une nuit à
température ambiante.

Le méthanol est évaporé puis le résidu est repris dans 1 ml de phase mobile et filtré.
Plus de 90% de l’OTA, a été méthylé avec cette méthode.

Après filtration à l’aide d’un filtre millipore, l’ester méthylique formé est par la suite
analysé à l’HPLC. (Zinedine et al., 2007).

8. Estimation de l’exposition de la population de Niamey à l’OTA pour

chaque aliment

8.1. Consommation alimentaire en République du Niger

Il y existe peu de données relatives à la consommation alimentaire en République du

Niger. Les seules vraies données disponibles proviennent de l’Enquête Budget Consommation
(EBC), réalisée en 1989-1990 pour la phase urbaine et en 1992-1993 pour la phase rurale
(DSCN/MFP, 1994 ; FAO, 1995a et 1999).

En s’appuyant sur les données existant sur la population de la ville de Niamey, et

sachant que Le poids moyen d'un homme africain est habituellement plus proche de 55 kg que
de 70 kg, et celui d'une femme proche de 45 kg, on peut estimer pour la première fois
l’exposition de la population nigérienne à l’OTA, selon la formule suivante :

DI = Day Intake = prise journalière (en µg toxine/g d’aliment/Jour)

WI = Weekly Intake : prise hebdomadaire

m = moyenne de contamination des aliments par la toxine

DI = m × [consommation] / Jour / Poids Moyen

F = fréquence de la consommation d’un aliment par Jour ou par semaine

104
CHAPITRE III : ETUDE DE LA CONTAMINATION DU MAÏS
ET DU RIZ PAR LES AFLATOXINES (AFs)

1. Principe d’analyse

Dans cette étude, le principe de la détermination des aflatoxines est basé essentiellement
sur l’extraction de celles-ci, par des solvants appropriés (Méthanol/eau), suivie de la
purification sur colonne de verre composé de gel de silice et de sulfate de sodium anhydre.
L’identification et la quantification des AFs est faite à l’aide de chromatographie liquide de
haute performance (HPLC - une colonne C18) couplé à un détecteur de fluorescence.

Les échantillons de céréales ont été analysés suivant une méthode validée et décrite par
la Commission Européenne 74/63/CEE avec quelques petites modifications (CEE, 1992).

2. Échantillonnage

Les échantillons de céréales qui ont fait l’objet des analyses sont, le maïs (n=25) et le riz
(n=23). Au total, 48 échantillons de céréales ont été étudiés. Ces céréales commercialisées en
République du Niger ont été achetées dans différents marchés de la ville de Niamey.

Tout comme dans le cas du premier échantillonnage réalisé pour l’analyse l’OTA, les
nouvelles céréales qui ont servi à l’étude des aflatoxines ont été prélevées dans les mêmes
conditions d’échantillonnage que précédemment.

Les différents lots de 500g d’échantillons sont hermétiquement emballés dans des
sachets plastiques puis transportés au laboratoire « toxicologie-Hydrologie » de l'Institut
National d’Hygiène de Rabat pour y être analysés.

3. Préparation des solutions

3.1. Préparation des standards d’aflatoxines

Des solutions d’aflatoxines (Sigma-Aldrich, USA) ont été préparées dans du méthanol.
A partir d’une solution mère de 500 µg/ml, des dilutions ont été effectuées dans les conditions
appropriées.

105
 Pour chaque solution fille d’aflatoxines (AFG1, AFB1, AFG2, AFB2), les
concentrations 50 µg/ml, 10 µg/µl, 5 µg/µl, 3 µg/µl ont été préparées. Les quantités
nécessaires à la préparation des Afs ont été évaporées à sec et ensuite dissoutes dans la phase
mobile (indiquée ci-dessous) dans les conditions chromatographiques appropriées.

3.2. Préparation des solvants

La préparation des solvants d’extraction et de la phase mobile est réalisée à la veille des
analyses. Tous les solvants ont été filtrés et stockés à l’abri de la lumière.

Quant au solvant d’élution des aflatoxines, il est préparé sur place pendant les analyses.

Le tableau14 résume la qualité et la composition des différents solvants utilisés pour

l’analyse des aflatoxines.

3.3. Préparation de la colonne

La préparation de la colonne de verre (30mm de diamètre × 600 mm de long) munie

d’un disque de verre frité et de robinet en téflon a été effectuée comme suit :

On rince la colonne une fois au méthanol et une deuxième fois à l’hexane, puis on verse
ensuite 20 ml de chloroforme dans la colonne puis on introduit 5 g de sulfate de sodium
anhydre (Na2SO4) préalablement passé à l’étuve 100°C / 24h. Il faut veiller à ce que la paroi
du verre reste propre après passage du Na2SO4.

Les solvants utilisés pendant les analyses sont entre autres le méthanol, l’acétonitrile le
chloroforme, le Dichlorométhane le n-Hexane (de qualité pour analyse) et de l’eau Bi-distillée
Distillée.

106
 Tableau 14 : Composition des différents solvants utilisés pour l’analyse des AFs et
d’OTA

Mélanges de Méthanol Eau Acétonitrile Chloroforme Acide

Volumes
solvants % % % % acétique %

Solvant
80 20 - - - 150 ml
d’extraction (AFs)

Solvant d’élution
3 - - 97 - 33 ml
(AFs)

Phase mobile (AFs) 17 54 29 - - (60µl/min)

Phase mobile OTA - 49 50 - 1 40µl/min

107
 CHCl3//C2H6O
Filtrat
Na2SO4

Si(OH)

Na2SO4

Impuretés Éluât

Purification Elution AFs

Na2SO4 Extrait

Rota-vapeur
Filtrat

Filtratio
Évaporation à sec
Chromatogramme

Mixeur

Extrait sec

Extraction
Dérivatisation

Dosage
(HPLC)
Micro-filtre

Seringue

Filtration
Échantillons

Figure 21 : Schéma général de l’analyse des aflatoxines dans les produits alimentaires

108
 Ensuite 20 g de gel de silice 60 (63-200 RE Panreac, Espagne) préalablement séchés
puis activés à 100°C / 24h sont mélanges au trichlorométhane (CHCl3) avec une spatule pour
obtenir un gel homogène sans bulles d’air. Le mélange est délicatement versé dans la colonne
à l’aide d’un entonnoir, tout en faisant attention à avoir une répartition homogène le long de la
colonne.

Les parois de la colonne de verre sont rincées avec un minimum de chloroforme pour y
récupérer les particules de silice. Après quelques minutes d’attente (2 à 3 min), le solvant
surnageant au dessus du gel de silice devient clair et limpide. On ajoute à nouveau 5 grammes
de sulfate de sodium anhydre, puis les parois de la colonne de verre sont à nouveau rincées au
chloroforme.

On laisse écouler le chloroforme dans un erlenmeyer propre jusqu’à ce qu’il n’en reste
plus que 5 mm au-dessus la couche de Na2SO4. La colonne est laissée au repos pendant 30
min, tout en veillant à ne jamais la laisser sécher.

Il est à noter que, lors de cette opération de remplissage de la colonne de verre, la tâche
la plus délicate est d'avoir une répartition la plus homogène possible du gel de silice et du
sulfate de sodium anhydre tout au long de la colonne. Pour ce faire, Il faut éviter d’avoir un
remplissage de biais, d’avoir des trous et des bulles d'air dans le remplissage.

La figure 21 récapitule les différentes étapes suivies pour l’analyse des aflatoxines dans
les produits alimentaires.

3.4. Conditions chromatographiques

Le système chromatographique utilisé est le même que celui de l’analyse de

l’ochratoxine A. La séparation des aflatoxines a été effectuée sur une colonne lichrosphère RP
C18 (250×4,6 mm× 5µm de diamètre). Cependant la composition de la phase mobile est
différente (voir tableau 14) et le flux est fixé à 0,6 ml/min.

109
 4. Détermination analytique

4.1. Préparation des échantillons

A partir de 500 grammes d’échantillon moulu, 50g sont prélevés puis additionnés à 150
ml d’un mélange de méthanol / eau (80 : 20 / v : v). L’ensemble est introduit dans un blender.
Après 3 min d’extraction à grande vitesse, les aflatoxines sont extraites de la matrice par le
solvant d’extraction.

4.2. Filtration

Le mélange est filtré à sur du papier Watmann n°4 en présence de 15 g de sulfate de

sodium anhydre préalablement séché toute une nuit à l’étuve à 100°C. Notons que lors de la
filtration, seul le surnageant est versé dans l’entonnoir, afin d’éviter le colmatage du sulfate de
sodium par la l’extrait.

4.3. Purification de l’extrait et élution des aflatoxines

Afin de purifier les échantillons, nous avons utilisé la technique de purification sur
colonne de verre. Le principe de cette technique est basé sur la séparation des composés en
fonction de la différence d'affinité existante entre ces composés, la phase mobile qui entraîne
les composés, et la phase stationnaire qui les retient.

Le filtrat obtenu auparavant est versé délicatement dans la colonne de verre, à l’aide
d’un entonnoir tout en évitant de creuser la couche superficielle du sulfate de sodium. On
ouvre le robinet puis on le règle à raison d'une goutte toutes les 4 secondes.

Dans un premier temps, on laisse l’extrait percoler la colonne de silice. En présence de

10 ml de dichlorométhane (à pression atmosphérique), on fixe alors l’ensemble des solutés sur
la phase stationnaire (le gel de silice) et l’éluât (dichlorométhane) est éliminé. Ensuite on élut
la colonne avec du n-hexane. Les solutés faiblement polaires tels que les impuretés (extraites
au méthanol-eau) vont ainsi être décrochées de la phase stationnaire et migrer le long de la
colonne chromatographique. L’éluât (n-hexane + impuretés) est également éliminé. Les
aflatoxines restent fixées sur le support siliceux.

110
 4.4. Élution

L'élution se fait selon un gradient de solvants polaires, en faisant varier les proportions
de solvants composant l'éluant.

Ainsi après purification des échantillons, les aflatoxines (Afs) de la phase stationnaire
sont finalement éluées goûte à goûte de la colonne avec 33 ml d’une phase mobile de polarité
supérieure. Le mélange est composé de chloroforme-méthanol (97:3, v/v). L’éluât, contenant
les aflatoxines est recueilli dans un ballon étiqueté de 100 ml.

Le schéma ci-dessous représente les différentes étapes de purification et d’élutions des

aflatoxines le long de la colonne de verre (figure 22).

4.5. Évaporation et dérivatisation des AFs

L’éluât est récupéré dans un ballon de 100 ml puis évaporé au rota-vapeur (Stuart RE
300B). A l’extrait sec on ajoute 100 µl de l'acide trifluoroacétique (TFA) puis on laisse sécher
à l’aire libre pendant une nuit à l’abri de la lumière.

Il faut protéger l’extrait de la lumière et de la température élevée, car l’AFB1 peut se

transformer en d’autres composés. La dérivatisation des AFB1 et AFG1 est nécessaire afin
d'augmenter leur fluorescence naturelle et de pouvoir ainsi mieux les détecter.

L'extrait sec dérivatisé est repris avec 1000 µl de la phase mobile (méthanol -
acétonitrile – eau : 17 / 29 / 54, v / v / v). Cette solution finale est récupérée par une seringue
puis filtrée à travers un micro-filtre Millipore de 0,22 µm de porosité. Les filtrats sont
récupérés dans des vials jaune-marron de 1500 µl puis immédiatement injectés à l’HPLC.

111
Étapes 1 2 3 4
Filtrat de Solution Solution Binaire Filtrât ou
l’échantillon dichlorométhane CHCl3/CH3OH
n-hexane Solutions

Na2SO4 Na2SO4 Na2SO4 Na2SO4

Colonne

Gel de silice Gel de silice Gel de silice Gel de silice

Na2SO4 Na2SO4 Na2SO4 Na2SO4

Eluât = Eluât = Eluât = n-hexane + Eluât = binaire + Éluât

dichlorométhane aflatoxines
filtrat impuretés

= Elution

Figure 22 : Schéma de la purification des échantillons sur gel de silice.

4.6. Dosage des aflatoxines

112
 60μl du filtrat dilué ont été injectés à un HPLC (Perkine-Elmer 200). La colonne C18
[Phenomenex LC (5 mm) (150 mm x 4,6 mm ID)] est celle utilisée dans notre étude.

Le débit d’injection à été fixé à 0,6 ml. min-1. Le fluorimètre a été opéré à des longueurs
d’ondes d’excitation et d’émission, respectivement, de 365 et 435 nm.

5. Précautions de manipulation et décontamination du matériel utilisé

Les mycotoxines sont des substances toxiques, leur pouvoir d’induire le cancer a été
confirmé (IARC, 1993). Leur manipulation doit être faite avec le maximum de précautions.

Le manipulateur doit porter des gants de protection et toute manipulation de standards

de ces substances doit être effectuée avec le maximum de précautions sous une hotte de
sécurité chimique.

La décontamination du matériel contaminé par les mycotoxines a été faite selon les
procédures internationales de l’IARC décrite par Castegnaro et al., (1991). A la fin de
chaque série d’analyse, tout le matériel utilisé est décontaminé par une solution
d’hypochlorite de sodium (eau de javel dilué au ½) pendant toute la nuit sous une hotte de
sécurité chimique.

Un lavage normal par un détergent suivi par deux rinçages à l’eau de robinet et un
rinçage à l’eau distillée est effectué après décontamination. La verrerie est ensuite séchée à
l’étuve à 100°C pendant une nuit.

6. Performance de la méthode utilisée

Le contrôle de qualité des mycotoxines a été réalisé selon les recommandations décrites
par Brera et Miraglia, (1996).

Pour chaque série d’analyse, des échantillons à analyser ont été fortifiés avec des
concentrations bien déterminées des mycotoxines. Ensuite, une homogénéisation des
échantillons est réalisée et le solvant est laissé évaporer pendant toute la nuit.

Les échantillons fortifiés ont été analysés avec chaque série d’analyse pour déterminer
le pourcentage de recouvrement de la méthode utilisée.

113
 6.1. Pourcentage de recouvrement (Rc)

Le pourcentage de recouvrement (Rc) détermine l’efficacité de la méthode d’analyse

après fortification de certains échantillons à analyser avec des quantités bien connues des
mycotoxines. Après détermination des Rc, tous les résultats analytiques trouvés ont été
corrigés en fonction des Rc obtenus. A l’échelle internationale, il est recommandé que les Rc
acceptés se situent entre 70 et 120 %.

Rc %= [Cm (éch fortifié) – Cm (éch)] / C fortification* 100

o Cm (éch fortifié): Concentration moyenne de la mycotoxine dans les échantillons

fortifiés.

o - Cm (éch) : Concentration moyenne de la mycotoxine dans les mêmes échantillons

non fortifiés.

o - C fortification: Quantité de mycotoxine ajoutée aux échantillons fortifiés.

• Correction des résultats

Cc (éch) = Cm (éch) / Rc * 100

Cc (éch) : Concentration finale corrigée de l’échantillon.

• Déviation du standard (SD) et Coefficient de variation (CV)

Pour chaque échantillon d’une matrice donné, une série de trois analyses est effectuée,
le coefficient SD représente la variabilité qui peut avoir lieu entre l’analyse simultanée des
mêmes échantillons.

SD = √Σ (Xi – Xm) 2/ n-1

114
 o Xi: Concentration de la mycotoxine pendant l’analyse « i »

o Xm: Moyenne des concentrations de la mycotoxine.

o n: Nombre d’analyse effectuée.

o Le Coefficient de variation est :

Cv = SD / Xm * 100

115
PARTIE III- RESULTATS ET DISCUSSION

116
CHAPITRE I : ETUDE MYCOLOGIQUE DES CEREALES ET
ARACHIDES.

1. Taux d’humidité des échantillons de céréales et d’arachides

Le taux d’humidité est l’un des critères très importants en termes de qualité des céréales
et oléagineux. L’humidité relative est pression de vapeur / pression de vapeur d'eau saturante.
L’humidité absolue est la masse de vapeur d'eau / volume unitaire d'air.

De façon général, l’humidité est la présence d'eau ou de vapeur d'eau dans l'air ou dans
une substance. C’est l’un des paramètres favorisant la croissance, le développement des
moisissures et la toxinogenèse.

Les moisissures toxinogènes peuvent se développer sous tous les climats, sur tous les
supports solides ou liquides dès l’instant qu’il y a des éléments nutritifs, de l’humidité
(activité en eau aw supérieure à 0,6), d’où la grande variété des substrats alimentaires pouvant
être contaminés. (AFSSA, 2009).

La figure 23 représente le taux d’humidité des échantillons de céréales et d’arachides

étudiés. Les échantillons de maïs et de sorgho ont chacun un taux d’humidité de 10%. Cette
valeur est en dessous des normes en vigueur en Côte d’Ivoire et dans la région de l’Afrique de
l’Ouest, (Kouable, 2010).

Quant aux échantillons de riz, leur teneur en eau est de 11%. Ce qui indique que ce riz
analysé a été bien séché. Il en est aussi de même pour les échantillons d’arachides qui eux
également présentent une teneur en eau très faible (6%) comparativement aux autres denrées
analysées (figure 23).

Ces valeurs sont en accord avec la réglementation de la Commission européenne

(réglementation 2006/576/CE), qui limite le taux d’humidité du riz, du maïs, du sorgho, du
millet à 13 – 15 % et entre 6 et 8 % Pour l’arachide. Selon la commission mixte FAO/OMS
du Codex Alimentarius, les taux d’humidité maximale (%) m/m (max) admis pour le millet, le
sorgho, le maïs (grade 1, grade2, grade 3) et le riz blanchi sont respectivement 13 ; 14,5 ;
(15,5 ; 19 ; 22) et 14. (Kouable, 2010).

117
 Il est à noter que la valeur de l’humidité des grains de céréales ou d’oléagineux peut
varier selon la législation de chaque pays. Aussi les critères de qualité exigés varient selon
l’opérateur et le type de céréales.

Compte tenu de la faible humidité de ces échantillons, ceux-ci représentent un

environnement défavorable à la croissance des moisissures ; essentiellement celles de
stockage. Malgré l’apparence saine des échantillons, l’analyse toxicologique a révélé la
présence des AFs et de l’OTA dans certains échantillons. Ce qui signifie qu’au cours du
stockage, les moisissures des genres Aspergillus et Penicillium ont pendant un moment, eu le
temps de produire leurs mycotoxines.

La toxinogenèse c’est-à-dire les conditions de synthèse et d’excrétion des mycotoxines,

est un phénomène d’une grande complexité. Les conditions optimales de la toxinogenèse
dépendent étroitement des conditions optimales de croissance des moisissures. Celles-ci se
combinent étroitement aux phases d’élaboration et de sécrétion des mycotoxines (Le BAR,
1982). Ainsi, les facteurs température et humidité interviennent non seulement sur la
croissance du mycélium mais aussi sur la germination des spores. De même, les facteurs
nutritionnels au sens large du terme, et les interrelations entre paramètres conditionnent la
toxinogenèse, dont les optima sont plus étroits que ceux autorisant la croissance fongique.

Par exemple, la diminution de la pression partielle en O2 et l’accroissement en CO2 ont

un effet dépresseur plus intense sur la toxinogenèse que sur la croissance (cas de l’atmosphère
confinée des ensilages et de l’aflatoxinogenèse).

Certaines mycotoxines (patuline) sont produites même en anaérobiose. En revanche, la

ventilation ou la remise à l’air libre permettent aux moisissures de se développer de nouveau,
ce qui s’accompagne en général d’une intense mycotoxicogenèse. (Le Bars et Le Bars,1987).
Le tableau ci-dessous représente le nombre d’échantillons utilisé par aliment.

118
 Tableau 15 : Nombre d’échantillons analysés

Échantillons Maïs Riz Sorgho Millet Arachide Total

Nombre 6 1 3 7 5 22

Figure 23 : Taux d’humidité (%) m/m des échantillons analysés

2. Discussion de nos résultats

2.1. Genres fongiques isolés des denrées alimentaires.

L’une des particularités des marchés de céréales est qu’ils sont parfois très exposés aux
pollutions de la vie urbaine : poussières de sable, fumées des pots d’échappement des
véhicules, débris soulevés par le vent etc. Ces produits alimentaires, entreposés à l’air libre,

119
dans de grandes bassines et sans protection adéquate ont donc de fortes chances d’être
contaminés par des spores et des bactéries.

Au total, dix (10) genres fongiques ont été identifiés au cours de l’étude mycologique de
l’ensemble des échantillons étudiés. Les principaux genres identifiés sont : Absidia,
Alternaria, Aspergillus, Bipolaris, Curvularia, Fusarium, Mucor, Penicillium, Rhizopus et
Stemphylium. Ceux-ci sont répartis en 92 souches différentes sur l’ensemble des matrices.

2.2.1. Absidia sp

Le genre Absidia est une moisissure ubiquitaire retrouvée dans le sol et dont la
température optimale de croissance est comprise entre 20 à 42 ° C. Certaines des espèces
mésophiles sont importantes en biotechnologie (biotransformation de stéroïdes) ou en tant que
producteurs de composants des « liaisons Rénines ». D’autres, par contre, essentiellement
celles qui ont une plus haute température optimale de croissance sont, d'importance clinique et
sont connues en tant qu’agents pathogènes, opportunistes pour les humains. ( Kerstin et al.,
2007). 2 souches d’Absidia sp ont été isolées des échantillons de millet.

2.2.2. Alternaria

Les espèces d'Alternaria sont parmi les agents pathogènes les plus courants, en post-
récolte de fruits et légumes. Au cours de la pathogenèse ; plusieurs espèces sont capables de
produire plusieurs mycotoxines qui provoquent des effets indésirables chez les humains et les
animaux. Parmi ces mycotoxines on peut citer : l'acide ténuazonique, alternariol, l'éther
méthylique, l’altenuen, et les altertoxins . (Barkai-Golan, 2008)

2.2.3. Aspergillus

C’est une moisissure ubiquiste, très repandue dans les pays chauds et les zones
tropicales. Les principales espèces du ce genre impliquées dans la production de l’OTA sont
A. alutaceus (Syn . ochraceus) , A. carbonarius , A. melleus , A. sclerotiorum, A. sulphureus,
Aspergillus niger (Wagacha and Muthomi. 2008).

Les Aspergillus contaminent de nombreux aliments destinés à l'alimentation humaine

tels que les fèves de cacao , grains de café, farine de manioc , céréales, poissons , arachides,
fruits secs , du vin, œufs de volaille et lait (Weidenbörner, 2001). Dans notre étude, les
Alternaria sp représentent 2% de l’ensemble des contaminations. Ils ont été isolés des
échantillons de maïs (1 souche) et de millet (1 souche).

120
 Dans les aliments étudiés, les principales espèces d’Aspergillus identifiées sont
essentiellement Aspergillus flavus (17 souches) ; Aspergillus fumigatus (5 souches) ;
Aspergillus glaucus (2 souches) ; Aspergillus nidulans (1 souches) ; Aspergillus niger (15
souches) ; Aspergillus sp (15 souches) ; Aspergillus terreus (2 souches) ; Aspergillus
versicolor (3 souches). Au total, 60 souches du genre Aspergillus ont été isolées. En d’autres
termes, 65% des moisissures isolées de ces échantillons sont du genre Aspergillus.

2.2.4. Bipolaris sp

Différentes espèces de ce genre attaquent les céréales et peuvent causer des pertes
économiques considérables. L’une des espèces connues est le Bipolaris sorokiniana (SACC)
Schoem responsable de l’helminthosporiose du blé. Au Brésil, des cas de contamination de
blé par ce dernier et par Bipolaris bicolor (Mitra) Shoem (Morejon et al., 2006). Par ailleurs
l’helminthosporium est pathogène sur l’Homme et est responsable de maladies respiratoires
et de différentes allergies.

2.2.5. Curvularia sp

Curvularia est un champignon filamenteux pigmenté, omniprésent dans le sol. Il est

rarement remis en cause dans les infections humaines. Cependant, il peut être parfois
impliqué dans des maladies graves chez l’Homme. Il attaque le système nerveux central
provoquant à long terme une forme rare de sinusite chez le patient. Il peut provoquer la
kératite, une infection cutanée, une infection des voies respiratoires, une endocardite, un abcès
du cerveau et est responsable de la céssité (Gadgil et al., 2013).

Les espèces de Curvulaia sp isolées de nos échantillons proviennent uniquement du

maïs (1souche) et du sorgho (2 souches).

2.2.6. Fusarium

Les Fusarium sont responsables des maladies émergentes chez l’homme. Ce sont des
champignons des champs qui contaminent les racines, les tiges et les épies de la plupart des
céréales à petits grains (blé, orge, avoine, seigle et maïs, riz, etc). En Europe, les énormes
pertes économiques liées aux contaminations par Fusarium sont estimées entre 10 % et 40 %.
(Creppy, 2002 ; Jestoi, 2008)

Certaines moisissures de ce genre produisent des mycotoxines telles que les

fumonisines (maïs), les toxines T- 2 et HT-2 (dans l’avoine, le blé et l'orge), la zéaralénone
(maïs, blé), le deoxynivalenol (dans le blé, le maïs, l'orge, l'avoine et le seigle) et d’autres

121
mycotoxines dites émergentes (fusaproliferine, beauvericine, enniatines, and moniliformine-
A).

La biosynthèse ces mycotoxines peut être affectée par un certain nombre de facteurs :
la température, l'humidité, les fissures des céréales, l’oxygène et la présence de spores de
moisissures (Pleadin et al., 2013).

Dans le présent travail, seul 10% de Fusarium a été retrouvé dans les échantillons de
maïs sorgho et millet. Il est représenté par : Fusarium moniliforme (1 souches), Fusarium
oxysporum (4 souches) ; Fusarium sp (2 souches) ; Fusarium verticilloides (2 souches).

2.2.7. Mucor sp et Rhizopus sp

Les champignons tels que Mucor spp et Rhizopus spp envahissent rapidement les
milieux d’isolement et gênent la croissance des autres espèces fongiques. Ces moisissures
colonisent les céréales et les fruits et légumes. Les principales catégories de maladies
humaines en rapport avec les Mucorales sont la sinusite-rhinocérébrale ; les maladies
pulmonaires, cutanées, sous-cutanées, gastro-intestinales, et zygomycoses diffusées. (Ribes.,
2000)

La présence de ces deux genres a été notée dans les échantillons de riz (2 Mucor sp),
l’arachide (1 Mucor sp et 5 Rhizopus sp), le sorgho (1 Mucor sp) et (1 Rhizopus sp) et enfin le
millet (1 Rhizopus sp).

2.2.8. Penicillium

Il est très commun aux régions à climat tempéré et froid du monde (spécialement au
Nord de l’Europe). En général, les espèces de Penicillium sont capables de produire des
mycotoxines à des températures inférieures à celles nécessaires aux espèces d’Aspergillus
(Weidenbörner, 2001)

Dans cette étude, Penicillium ne représente que 3% de l’ensemble des souches isolées.
En effet, seulement 3 souches de Penicillium spp ont été retrouvées dans le riz et le maïs ce la
ville de Niamey.

2.2.9. Stemphylium sp

C’est une moisissure pathogène pour certains fruits (mangues), légumes (asperges,
laitues, luzerne), légumineux (haricot, soja), etc. Certaines espèces de des Stemphylium

122
produisent une toxine appelée stamphol, mais la toxicité de cette mycotoxine n’a pas encore
été prouvée sur chez les mammifères. (Pitt and Hocking. 2009).

Une seule souche de cette moisissure (Stemphylium) sp à été identifiée dans nos
échantillons de millet.

La figure 24 et les tableaux 16 ; 17 et 18 représentent les pourcentages de

contaminations des denrées alimentaires ayant fait l’objet de l’étude mycologique.

Tableau 16 : Taux de contamination des denrées alimentaires analysées

Genre pourcentage de contamination

Aspergillus 65%

Penicillium 3%

Fusarium 10%

Autres Genres 22%

123
Figure 24 : Moisissures isolées des denrées alimentaires analysées

124
Tableau 17 : Souches de moisissures isolées des échantillons de céréales et d’arachide

*Almts Nbre d’éch Moisissures Nbre de moisissures Total % ctmnt espèce/éch

Aspergillus flavus 1 4%

Aspergillus glaucus 2 8%

1 4%
Aspergillus nidulans

Riz 1 Aspergillus niger 1 24 4%

Aspergillus sp 14 58%

Aspergillus versicolor 1 4%

Mucor sp 2 8%

Penicillium sp 2 8%

Alternaria sp 1 7%

Aspergillus flavus 4 29%

Aspergillus fumigatus 3 21%

Aspergillus niger 2 14%

Maïs 6 14
Aspergillus versicolor 1 7%

Curvularia sp 1 7%

Fusarium oxysporum 1 7%

Penicillium sp 1 7%

Aspergillus flavus 5 28%

Aspergillus niger 6 33%

Arachide 5 Aspergillus terreus 1 18 6%

Mucor sp 1 6%

Rhizopus sp 5 28%

Total 56

*Almts = Aliments, Nbre = Nombre, ctmnt = contamination, ech =échantillons

125
Tableau 18 : Souches de moisissures isolées des échantillons de céréales et d’arachide
(suite)

*Almts Nbre d’éch Moisissures Nbre de moisissures Total % ctmnt espèce/éch

Aspergillus flavus 2 13%

Aspergillus niger 2 13%

Aspergillus terreus 1 7%

Aspergillus versicolor 1 7%

Bipolaris sp 1 7%

Sorgho 3 Curvularia sp 2 15 13%

Fusarium oxysporum 1 7%

Fusarium sp 1 7%

Fusarium verticiloides 2 13%

Mucor sp 1 7%

Rhizopus sp 1 7%

Absidia sp 2 10%

Alternaria sp 1 5%

Aspergillus flavus 5 24%

Aspergillus fumigatus 2 10%

Aspergillus niger 4 19%

Millet 7 Aspergillus sp 1 21 5%

Fusarium moniliform 1 5%

Fusarium oxysporum 2 10%

Fusarium sp 1 5%

Rhizopus sp 1 5%

Stemphylium sp 1 5%

Total 92

126
3. Espèces fongiques identifiées

3.1. Isolement des souches

Les moisissures sont des champignons filamenteux qui se développent sur une large
gamme de produits alimentaires. Les principaux substrats sur lesquels elles prolifèrent sont
les cultures oléagineuses, protéagineuses et céréalières pour ne citer que ceux là.

Les ensemencements réalisés nous ont permis l’isolement de 92 souches de moisissures

(tableaux 17 et 18). Toutes les boîtes ont été incubées pendant au moins 7 jours.
L’identification des espèces fongiques a été réalisée selon les clés de détermination de Pitt
and Hocking. (1997) ; Klich and Pitt. (1994) ; Chabasse et al., (2002) ; Champion, (1997).

3.2. Isolement des souches d’Aspergillus

3.2.1. Aspergillus flavus

A l’œil nu, Aspergillus flavus présente des colonies à croissance rapide, floconneux,
l’appareil végétatif est d'abord blanc à vert pâle puis peu à peu devient jaune-vert sur (MEA),
vert-olive à vert-brun sur (CYA) (figure 25).

On remarque ; qu’au cours de la sporulation, les colonies deviennent plus vertes sur
l’ensemble des milieux de culture. Le revers de la boîte de pétri est jaune sur les milieux
(MEA), (CYA) et incolore sur SC. On note l’absence de pigments solubles. Sur les vieilles
cultures, on observe des sclérotes globuleux brun-rougeâtre qui noircissent sur les cultures
avec le temps.

L’observation au microscope montre des conidies jaune-vertes, globuleuses avec une

paroi légèrement rugueuse, ou parfois lisse et elliptique. Les vésicules sont globuleuses ou
subglobuleuses.

Les phialides et les métules sont hyalines ou avec une coloration verte. Les
conidiophores sont longs, nombreux, incolores, et généralement à paroi rugueuse. Chez
Aspergillus flavus, le conidiophore n’est pas septé. Il est de même que pour les filaments du
mycelium.

127
 Vue de face Revers de laculture

Figure 25 : Souche d’Aspergillus flavus sur milieu PDA

Les photos sont prises après 7 jours d’incubation

3.2.2. Aspergillus niger

Les colonies d’Aspergillus niger ont aussi une croissance rapide. Elles ont un aspect
velours ou cotonneux, avec une couleur blanche au début de leur croissance. Au fil du temps,
les colonies deviennent poudreuses et forment des spores noires. Ce qui donne la couleur
noire à la culture (figure 26).

Le thalle est de taille plus ou moins grande. Le revers de la boite de Petri est blanchâtre
sur le milieu PDA, mais légèrement orangée sur CYA

La microscopie montre des têtes de conidies plus grandes que chez A. flavus. Elles ont
une forme globuleuse radiale, avec une teinte qui varie en fonction de l’état d’avancement de
la colonie (noire-verdâtre, brun-noir, noire).

Les vésicules sont hyalines, parfois légèrement colorées (brunes). Les conidies sont
globuleuses, elliptiques à paroi lisse ou échinulée. Les cultures plus vieilles présentent des
sclérotes globuleux grisâtres. Les phialides assez longues, ont une teinte noire.

128
 Vue de face

Revers de la culture

Figure 26 : Souche d’Aspergillus niger sur milieu PDA

Les photos sont prises après 7 jours d’incubation

3.2.3. Aspergillus fumigatus

Avec A. fumigatus, les colonies sont plus veloutées avec une croissance rapide. De
couleur grise avec une périphérie blanche qui disparait au cours du vieillissement et devient
noirâtre (figure 27).

129
 Sur le milieu CYA on peut remarquer la présence de pigment légèrement violet. Le
revers de la boîte de Petri peut varier en fonction du milieu de culture. Il parait jaune pale
avec un centre brun sur le CYA, jaune-verdâtre sur MEA sans pigmentation.

Les conidies sont globuleuses et forment parfois de longues chaînes. Les têtes de
conidies sont simplement unisériées ne portant des phialides que sur la moitié supérieure de la
vésicule. Cette dernière est hyaline et pyriforme allongée. Les conidiophores ont une paroi
lisse.

Vue de face Revers de laculture

Figure 27 : Souche d’Aspergillus flavus et A. fumigatus sur milieu PDA

Les photos sont prises après 7 jours d’incubation

3.2.4. Aspergillus glaucus

A l’œil nu, on peut voir des colonies, poudreuses ou duveteuses de couleurs variables et
à croissance rapide. Leurs couleurs varient du vert foncé au jaune (lorsque des cléistothèces
commencent à apparaître). Sur CYA comme sur MEA, les colonies présentent un revers jaune
qui devient marron avec le temps.

A l’objectif ×40, on peut voir des conidies globuleuses à sub-globuleuses et finement

rugueuses. Celles-ci sont disposées en chaînes sur des phialides qui recouvrent la vésicule de
forme globuleuse et unisériée. Cette dernière est hyaline tout comme les hyphes septés.

130
 Les conidiophores lisses, sont assez longs et brunâtres. Les têtes conidiennes, vert-gris
sont radiaires. Les cléistothèces par conte de couleur jaune, sont de grande taille et couverts
d’hyphes. A l’intérieur de ces dernières on peut observer des asques plus ou moins
sphériques, contenant des ascospores lisses et hyalines.

3.2.5. Aspergillus terreus

Veloutées parfois poudreuses, les colonies présentent une bonne croissance aussi bien
sur CYA que sur MEA. De couleur beige à jaune chamois elles sont parfois brunes et
terreuses. Avec le temps, les colonies deviennent finement granuleuses. Le revers des boîtes
de Petri est jaune sale à brun avec très souvent la présence de pigment jaune sur l’un comme
l’autre des milieux (figure 28).

La microscopie montre de petites conidies, lisses, hyalines et globuleuses disposées en

colonnes. La tête aspergillaire est bisériée (métules et phialides bien disposées) avec une
vésicule hyaline elle aussi en forme de massue. Les phialides recouvrent la moitié supérieure,
parfois envions les 2/3 de la vésicule. L’ensemble porté par un conidiophore pas assez long,
lisse et incolore. Le mycélium hyalin est septé.

Vue de face Revers de laculture

Figure 28 : Souche d’Aspergillus terreus sur milieu PDA

Les photos sont prises après 7 jours d’incubation

131
 3.3. Isolement des souches de Penicillium sp

La plupart des colonies sont blanches au début, puis virent au vert lorsque les conidies
commencent à apparaitre. En vieillissant elles sont grisâtres. La colonie a un aspect poudreux.
Le revers de la boîte peut varier en fonction de l’espèce et du milieu de culture (blanc et
opaque, rosâtre, orange, brun…) (figure 29).

Les têtes laissent penser à un pinceau. Les conidiophores septés ont une paroi lisse (pas
toujours). Les métules sont groupées sur chaque branche. Chez certaines espèces on remarque
l’absence de branches où les métules portent directement à leur extrémité des phialides. Ces
dernières se terminent chacune par une chaine de deux à 5 de conidies ou plus. Les conidies
ont une forme elliptique à paroi lisse parfois verdâtre.

Vue de face revers de la culture

Figure 29 : Souche Penicillium sp sur milieu PDA

Les photos sont prises après 7 jours d’incubation

3.4. Isolement des souches de Fusarium

Les colonies ont une croissance généralement rapide. Sur milieux usuels le thalle
des Fusarium donne un mycélium plus ou moins aérien. De couleur rarement blanche ou
crème, il peut être ochracé ou plus souvent de coloration vive : rose, rouge ou violet (figure
30).

132
 Les fusarium ont une forme en pinceau, les spores sont en forme de fuseau. Chez
certaines espèces les conidiophores sont regroupés et forment des coussinets (sporodochies)
sur le thalle. Les conidies peuvent former une masse d’aspect graisseux (pionnotes) sur les
coussinets ou sur l’ensemble du thalle. Les espèces de Fusarium se différencient
essentiellement sur la forme de leurs macroconidies (tableau 19).

Vue de face Revers de la culture

Figure 30 : Souche Fusarium sur milieu PDA

Les photos sont prises après 7 jours d’incubation

133
 Tableau 19 : Moisissures mycotoxinogène

Espèces Aspect macroscopique Aspect microscopique

Classification Surface Couleur Aspect Mycélium revers

boîte
Aspergillus Ordre Épaisse Jaune, Vert, Floconneuse Blanchâtre Incolore  Conidies globuleuses à sub globuleuses, échinulées
Hyphomycetes uniforme Noir,  Têtes unisériées ou bisériées, radiées
Famille  métules et/ou phialides
Moniliaceae
 Vésicules : sphériques et rugueuses, étirées ou
gonflées
 Conidiophores : paroi épaisse, lisse, hyalin, non
cloisonnés
 mycélium cloisonné

Fusarium sp Ordre Epaisse Blanc- Cotonneuses Blanches puis Pigment rose  Thalle à croissance rapide
Hypocreales uniforme crème souvent rose- diffusible au revers  Conidiophores parfois très ramifiés
Famille violacé. de la culture.
 macroconidies fusiformes et cloisonnées.
Nectriaceae  microconidies septées fusiformes ou ovoïdes
 Chlamydospore

Penicillium Ordre Plane Vert Velouté Blanchâtre Jaunâtre  Conidiophores isolés, simples ou ramifiés, terminés
spp Eurotiales Verdâtre floconneux par un pénicille
Famille granuleuse  Pénicilles constitués de phialides branchés
directement à l’extrémité du conidio- phore.
Trichocomaceae
 Conidies en longue chaîne, globuleuses, cylindriques
ou fusi- formes, lisses ou rugueuses
 Mycélium cloisonné

134
 4. Souches fongiques isolés de chaque denrée alimentaire

4.1. Souches fongiques isolées du riz (Oryza sativa)

Le riz est l’une des denrées alimentaires la plus cultivée dans le monde après le maïs
(FAOSTAT, 2014). Aliment naturellement contaminé par A ochraceus, c’est une plante
aquatique qui est habituellement récoltée avec une très forte contamination de moisissures
(35-50%). De plus, les moisissures productrices de mycotoxines pourraient contaminer les
grains et y produire d’importantes quantités d’OTA et d’AFs au cours du stockage (Park et
al., 2005 ; Je et al., 2005)

C’est un aliment particulièrement important au Niger et dans d’autres pays d’Afrique,

où vit près de 16% de la population mondiale.

En 2006, 43% du riz de la zone CEDEAO (Communauté Économique des États de

l’Afrique de l’Ouest) est produit par le Nigéria. Le Niger, le Burkina Faso et le Mali se
disputent la seconde place. Le riz est cultivé autour des fleuves Niger et Komadougou
(Geesing and Djibo. 2001). Globalement la frange soudano-sahélienne de l’Afrique de
l’Ouest demeure le principal bassin de production céréalière. (Soule et Gansari. 2010).

Le riz représente également une part très importante du régime alimentaire des habitants
du Proche - Orient, d’Asie et, dans une moindre mesure, des Amériques. Une part importante
est produite en Asie, sur de petites surfaces irriguées ou inondées. Mais on fait également
pousser du riz dans des régions dites pluviales, où l’irrigation n’est pas forcément nécessaire
(FAO, 2002).

Le riz est considéré comme étant un très bon substrat pour la croissance fongique et la
toxinogenèse, le riz est utilisé comme un milieu de culture idéal pour tester la potentialité
toxinogène des souches isolées (Le Bars and Le Bars. 1993).

De tous les échantillons de céréales et arachides analysés, le riz s’est avéré le plus
contaminé par Aspergillus, avec une teneur qui s’élève à plus de 80% (figure 31). 24 souches
d’Aspergillus sont isolées parmi lesquelles on peut citer : Aspergillus flavus, Aspergillus
niger, Aspergillus versicolor, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans ; et Aspergillus spp.

Seulement 9% des contaminations sont représentées par Penicillium spp. Quant aux
autres contaminants isolés, ils appartiennent au genre Mucor.

135
 Cette forte contamination des échantillons de riz par Aspergillus est sans doute due à la
présence de spores, bien que ces échantillons soient bien secs, avec un taux d’humidité
relativement bas (11% m/m).

En Corée, Park et al., 2005 ont rapporté la présence A. candidus, A. flavus, A. niger, A.
ochraceus, A. versicolor dans 88 échantillons de riz, avec les fréquences de contamination
26% ; 17% ; 18% ; 7% ; 20% respectivement (Je et al., 2005).

Aussi au Vietnam, (Tran et al., 2001) ont montré la contamination de 25 échantillons

de riz par le genre Aspergillus. Les espèces A flavus, A. fumigatus, A.oryzae ont été isolées
dans les proportions 40% ; 23% ; 11% respectivement.

Une autre étude effectuée en Inde sur 1200 échantillons de riz a montré que l’ensemble
des grains de riz paddy était infecté par Aspergillus. Quatre différentes espèces d’Aspergillus
ont été identifiées : A. flavus (1002), Aspergillus niger (910), Aspergillus ochraceus (154) et
Aspergillus parasiticus (331). (Reddy and al., 2009).

Figure 31 : Taux de contamination fongique des échantillons de riz par les

moisissures (Asp : Aspergillus, Fus : Fusarium, Peni : Penicillium)

136
 4.2. Souches fongiques isolées du maïs (Zea maïs)

Les analyses mycologiques des échantillons de maïs ont montré que plus de 70% des
échantillons sont contaminés par Aspergillus (figure 32). Les espèces du genre Aspergillus
contaminent de nombreuses cultures et une grande variété de fruits secs. A.flavus se retrouve
plus fréquemment sur le maïs et le coton (Ruppol et al., 2004).

Les principales espèces d’Aspergillus isolées du maïs sont : A. flavus (29%), A.

fumigatus (21%), A. versicolor (7%), A. niger (14%). Seulement 7% des contaminations sont
attribuées à Penicillium spp. Les autres contaminants sont essentiellement, Fusarium
oxysporum, Curvularia sp, Alternaria sp isolés en des proportions égales (7%). Au total, 14
souches ont été isolées des échantillons du maïs.

Ces résultats se rapprochent de ceux réalisés en Argentine par (Magnoli et al., 2006,
2007 ; Dalcero et al., 2002). La fréquence de contamination par Apergillus niger, A.
ochraceus, A. flavus variait entre 5 et 10% (Magnoli et al., 2006).

Au Pakistan, Shah et., al 2010 ont étudié la contamination du maïs par les moisissures.
Leurs résultats ont montré la présence d’Aspergillus, Fusarium, Penicillium et Rhizopus. Le
genre fongique prédominant fut Aspergillus flavus.

Les travaux réalisés (par Silvério A et al., 2010 ; Visconti et al., 2008), aussi ont
prouvé qu’A. niger est parmi les majeures moisissures de stockage habituellement retrouvées
dans les grains de maïs stockés.

En effet, en 2012 en Espagne, Alborch et al ont étudié la contamination du maïs destiné

à la consommation humaine par les moisissures. Les espèces prédominantes identifiées étaient
Aspergillus spp, et Penicillium spp.

En République du Niger, la production du maïs est marginale en dépit des efforts

consentis dans les aménagements hydro agricoles tant autour du fleuve Niger, qu’à l’intérieur
du pays.

Le Nigeria, pays voisin, se positionne pour la totalité des céréales comme le premier
bassin de production régionale. Il a totalisé en 2006, plus de la moitié de la production de
l’ensemble des pays de la Communauté Économique Des États de l’Afrique de l’Ouest
(CEDEAO) pour le maïs et le mil (Soule et Gansari. 2010).

137
 Tout comme le riz, les grains de maïs peuvent être contaminés par une variété de
moisissures lorsque les bonnes pratiques de stockage ne sont pas respectées (Cardwell et al.,
2000 ; Nesci et al., 2003).

Les stress thermique, hydrique (sècheresse) et physique (lésions causées par les
insectes) favorisent la contamination par les moisissures et la synthèse de mycotoxines
(Yiannikouris et Jouany., 2002). Ces conditions sont fréquemment rencontrées en Afrique
subsaharienne.

L’invasion des épis de maïs par A. flavus est surtout observée dans une atmosphère
chaude et humide (exp : durant la saison des pluies). Les souches d’Aspergillus de la section
flavi peuvent être isolées de différents systèmes agricoles que ce soit le maïs, le riz ou
l’arachide (Cotty 1997 ; Horn and Dorner 1998 ; Wicklow et al., 1998).

Les espèces fongiques qui concernent habituellement le maïs sont entre autre
Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. ochraceus, Penicillium verrucosum, Fusarium
verticilliodes et F. proliferatum (Cardwell et al., 2000; Abbas et al., 2006).

Figure 32 : Taux de contamination fongique des échantillons de maïs par les

moisissures (Alternaria : Alt, Aspergillus : Asp, Fusarium : Fus, Penicillium : Peni,
Culvularia : Cul)

138
 4.3. Souches fongiques isolées du sorgho (Sorghum bicolor)

Le sorgho analysé présente 40% de contamination par Aspergillus (figure 33). Tout
comme les échantillons d’arachides, le sorgho ne présente pas non plus de contamination par
Penicillium.

Parmi les espèces retrouvées dans cette céréale, on peut citer : A. flavus, A. niger, et
Fusarium verticilloides qui sont présentes à proportion égale (13%). A. versicolor, A.terreus,
Fusarium oxysporum et Fusarium spp y sont aussi identifiées à taux égal (7%). L’ensemble
des souches fongiques isolées des cette denrée alimentaire font un total de 15 souches.

Les espèces du genre Fusarium contaminent également diverses cultures dont

principalement le maïs, le blé, le mil et le sorgho ainsi que des plantes ligneuses.

F.verticillioides est l’espèce la plus rencontrée en région tropicale mais aussi dans les
zones Sahel ou Sahel/Soudan où les précipitations sont supérieures à 300 mm. Il s’agit d’un
champignon cellulolytique opportuniste qui se développe préférentiellement sur des plantes
sénescentes ou ayant subi un stress.

Dans notre étude cette espèce a été retrouvée avec un taux de 13% dans les échantillons
de sorgho nigérien. Bien que la prolifération des moisissures et l’excrétion des mycotoxines
puissent avoir lieu durant l’entreposage, Fusarium nécessite une activité hydrique plus élevée
que les Aspergillus. Il est plutôt considéré comme un «champignon des champs» qui secrète
ses toxines lorsque les conditions deviennent défavorables pour la plante (Whitlow, 2001 ;
Whitlow et Hagler, 2002).

En Argentine, Magnoli et al., (2007) ont rapporté la présence d’Aspergillus de la

section nigri responsable de la production de l’ochratoxine A dans les échantillons de sorgho.
Une autre étude similaire portant sur des échantillons de sorgho, réalisée en Inde a montré la
présence de toutes ces moisissures dans les échantillons de sorgho analysés (Bandyopadhyay
et al., 2000).

139
 Figure 33 : Nombre de moisissures isolées des échantillons de sorgho en fontion de
genres fongiques. (Aspergillus : Asp, Bipolaris : Bip, Culvularia ; Cul, Mucor : Mu,
Rhizopus)

4.4. Souches fongiques isolées du millet (Panicum miliaceum)

Le Niger est l’un des premiers producteurs du millet en Afrique de l’Ouest. Le volume
de la production du millet, au cours des années qui ont bénéficié d’une bonne conjoncture
climatique culmine à environ 3,5 millions de tonnes faisant de ce pays le second producteur
régional de cette céréale (après le Nigeria). (Soule. et Gansari., 2010). Cette céréale
représente à elle seule environ 78% des quantités totales de céréales consommées et 62% des
quantités totales d'aliments consommés au Niger (RdN, 2006).

Les analyses mycologiques ont montré que, plus de la moitié des échantillons de millet
sont contaminés par Aspergillus. On y dénombre 24%, 19%, 10% et 5% respectivement
d’Aspergillus flavus, A. niger, A. fumigatus, Aspergillus sp. 20% de ces échantillons sont
souillés par Fusarium. Ce dernier est essentiellement représenté par les espèces F.
moniliforme, F. oxysporum identifiées dans les proportions de 5% et 10% respectivement.
Absidia a été isolé avec un taux de 10%. Alternaria, Fusarium sp, Stemphylium et Rhizopus y
sont retrouvés à quantité égale (5%) (Figure 34). Au total, 21 souches des moisissures furent
isolées du millet.

140
 Malgré cette forte contamination du millet par Aspergillus, cette céréale ne présente
quasiment pas de contamination par l’OTA et l’AFs (voir chapitre Analyse
mycotoxicologique). Rhisopus et Mucor sont essentiellement des moisissures de
contamination qui envahissent les milieux de culture et rendent assez pénible l’isolement et
l’identification.

Plusieurs travaux ont porté sur l’identification des moisissures et de la toxicité de leurs
mycotoxines dans le domaine alimentaire (Bennett et Klich 2003; Bouhet et Oswald 2005;
Centeno et Calvo 2002; Chapeland-Leclerc et al., 2005; Makun et al., 2010; Rundberget
et al., 2004; Tanaka et al., 2000).

La contamination des graines de céréales par une multitude de moisissures a été

documentée dans d’autres études (Atehnkeng et al., 2008; Logrieco, et.,al 2002, Gwary et
al., 2012), et nos résultats confirment aussi cet état de fait.

Quoique les études sur la contamination du millet et du sorgho par les moisissures
toxinogènes soient rares; une étude réalisée aux Etats-Unis a révélé la contamination
relativement légère du millet par Pennisetum glaucum (L.), (Wilson et al., 2006), suggérant la
possibilité que ces petites céréales pourraient être moins sujettes à la contamination fongique,
comparativement à d’autres céréales.

Cependant, des récentes études réalisées sur le sorgho et le millet des régions Sud-Est et
Nord-Ouest de l’Éthiopie, ont montré que l'infection du sorgho par les Fusarium et
Aspergillus à été supérieure à 48% et 56%, respectivement, à celle du millet. Les grains de
sorgho et de millet analysés dans cette même étude étaient presque deux fois plus susceptibles
d'être contaminés par Fusarium que les espèces d'Aspergillus.

Il est à signaler, qu’à l’instar des échantillons de sorgho, le millet ne présente pas de
contamination de par Penicillium. Cependant ces céréales sont très susceptibles d’être
contaminé par Fusarium et Aspergillus s.

141
 Figure 34 : Nombre de moisissures isolées des échantillons de millet en fonction
genres fongiques (Absidia : Abs, Alternaria : Alt, Aspergillus : Asp, Alternaria : Alt,
Rhisopus : Rhiz, Stemphylium : Ste)

4.5. Souches fongiques isolées des arachides (Arachis hypogaea)

Les résultats des analyses ont démontré que 67% des échantillons d’arachides achetés
dans la ville de Niamey sont contaminés par Aspergillus (figure 35). Les taux de
contamination en A. flavus, A. niger et A. terreus sont respectivement 28% ; 33% ; et 6%. Ces
échantillons en dépit de leur fort taux de contamination en Aspergillus sont cependant
dépourvus de Penicillium. Les autres moisissures isolées de cet oléagineux étaient Mucor et
Rhizopus qui sont des contaminants généralement rencontrés dans les aliments. Un total de 18
souches ont été isolées des échantillons d’arachides.

Ces résultats s’alignent sur le même ordre d’idée que ceux obtenus par (Palencia et al.,
2009) aux USA. Un grand nombre d’espèces du genre Penicillium et bien d’autres espèces
peuvent coloniser les arachides et y produire des mycotoxines. Ces chercheurs ont montré que
plusieurs espèces d’Aspergillus peuvent contaminer les grains d’arachide obtenus du centre-
Ouest, et du Sud de la Géorgie.

142
 Après l’effondrement de l’exportation de l’arachide en 1977, le Niger tente peu à peu à
se relancer dans la production de cette culture de rente. La principale région de production de
l’arachide au Niger est la région de Maradi. En 2010 cette dernière note une production de
305 000 tonnes d’arachide sur une superficie de 676 000 hectares.
http://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89conomie_du_Niger.

En République du Niger, la consommation quotidienne d’arachide est très élevée. Par

conséquent, l’étude de la contamination de cette culture, par les moisissures toxinogènes est
une question très importante.

Ces moisissures ont déjà fait l’objet de plusieurs études à travers le monde,
particulièrement au Maroc et dans certains pays de l’Afrique de l’Ouest (Bénin, Guinée
Conakry, Sénégal, Nigéria …) (Wild, 1996 ; Bankole and Adebanjo, 2003 ; Zinedine et al.,
2007), où des rapports relatant leurs présences dans les arachides et les effets carcinogènes,
mutagènes, hépatotoxiques, tératogènes qu’induisent leurs métabolites secondaires sur les
consommateurs sont établis.

Selon ces auteurs, A. Niger, Aspergillus foetidus et A. japonica sont isolées des
échantillons d’arachide. A.parasiticus est un genre spécifique de l’arachide.

Il s’agit d’un champignon qui prolifère à des températures élevées et qui supporte une
activité hydrique relativement faible. Il est considéré comme un «champignon d’entreposage»
bien que la contamination débute fréquemment dans les champs (Whitlow et Hagler, 2002).

Dans des conditions de croissances optimales, Aspergillus est capable de produire une
quantité biologiquement significative de toxines en l’espace de quelques jours. Les travaux
réalisés très récemment en Iraq par Houshyarfard et al., 2014 ont montré que les champs
d’arachides et les grains peuvent être contaminés par Aspergillus.

Les principales espèces fongiques qu’ils ont identifiées sont majoritairement Aspergillus
parasiticus (non identifiée dans notre cas) suivi d’A. flavus qui par contre est majoritairement
isolé de nos échantillons d’arachide. En République de Zanjan, Rostami et al., 2009 ont aussi
démontré que les arachides sont des denrées aptes à la contamination fongique lorsque les
conditions environnementales (température et humidité) sont favorables. Les moisissures
isolées sont Aspergillus flavus (39.1%), Penicillium (9.2%), Rhizopus (7.2%), Mucor (2.5%),
Alternaria (1.03%) et Nigrospora (0.5%).

143
 Le stress hydrique, fréquent en région sahélienne en fin de cycle de culture, favorise
également l’infection des gousses d’arachide au champ (ICRIS, 1988). La prolifération des
moisissures et la synthèse des mycotoxines sont donc un phénomène d’une grande complexité
qui dépend d’une combinaison des facteurs température et humidité ainsi que de
l’oxygénation au niveau du substrat.

Figure 35 : Nombre de moisissures isolées des échantillons d’arachide en fonction des

genres fongiques (Aspergillus : Asp, Mucor ; Mu, Rhizopus ; Rhiz)

4.6. Répartition des Genres de moisissures par matrice analysée

Nos échantillons de millet et de sorgho présentent plus de variété de flore fongique que
les autres échantillons. Malgré la forte contamination par Aspergillus, l’absence de
mycotoxine dans les grains résulte probablement du fait que ces souches Aspergilli ne soient
pas mycotoxinogènes. Les propriétés intrinsèques d’une part et les meilleures conditions de
conservation et de culture de ces céréales d’autre part ont sans doute permis de limiter la
croissance de certaines moisissures telles que Penicillium dans le millet et le sorgho. On
notera au passage que ces produits ont un taux d’humidité qui répond aux normes
commerciales internationales.

144
 Après ces deux céréales précédemment citées, le maïs vient en deuxième position. Nous
y avons identifié cinq (5) genres fongiques (figure 36), parmi lesquels figurent des espèces
d’Aspergillus sp et de Penicillium sp qui pourraient être des souches productrices d’AFs et
d’OTA. En effet, une étude de toxicologique de ces souches est nécessaire, pour lever toute
équivoque quant à leurs capacités à synthétiser des mycotoxines.

L’étude mycologique du riz a permis de mettre en évidence trois (3) genres fongiques,
parmi lesquels on retrouve des espèces incriminées dans la production d’AFs et de l’OTA. Le
riz étant une plante aquatique, il est plus susceptible aux contaminations fongiques pendant le
stockage, et les risques de contamination par les mycotoxines sont encore plus grands pour cet
aliment (Park et al., 2005)., Les grains d’arachide ont aussi affiché le même nombre de
genres fongiques que ceux du riz.

Figure 36 : Nombre d’échantillons analysé par matrice

145
5. Moisissures isolées et mycotoxines associées

Les conditions climatiques en Afrique subsaharienne sont favorables à la croissance des

moisissures. L’augmentation des transports internationaux de denrées alimentaires et
l’intensification des méthodes culturales induisent un risque accru de contaminations croisées
par les mycotoxines (Bennett et Klich, 2003).

Un compte rendu de l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et

l’Agriculture (FAO) estime que dans les zones d’Asie et d’Afrique, 8 à 18 % des denrées
alimentaires (céréales, racines et tubercules, graines oléagineuses, gousses, fruits et légumes)
sont perdues durant la manipulation post-récolte et au stockage.

En Afrique sub-saharienne, les pertes économique des céréales et arachides, ont été
récemment estimées à 16 millions de dollars US par an. La majorité de ces pertes peut être
attribuée à la croissance fongique et la contamination par les mycotoxines.

Les champignons d’altération les plus courants et les plus destructrices des aliments,
appartiennent aux genres Aspergillus, Penicillium, Eurotium et Fusarium.

Les analyses mycologiques réalisées, ont montré la présence, d’Aspergillus (A. niger, A.
flavus, A. versicolor, A. fumigatus, A. glaucus, A. terreus, A. nidulans) et Penicillium spp. Ces
genres sont décrits dans plusieurs travaux de recherche comme étant parmi les moisissures
productrices d’ochratoxine A (OTA) et d’aflatoxines.

Les principales moisissures des genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium, sont celles
qui produisent les mycotoxines majoritairement rencontrées dans la littérature. Les aflatoxines
sont produites par les moisissures des genres Aspergillus, principalement Aspergillus flavus,
Aspergillus parasiticus et rarement par Aspergillus nomius et Aspergillus tamari (Iqbal et al.,
2012).

Les Aspergilli sont des moisissures cosmopolites (Pařenicová et al., 1997). Ils ont une
valeur économique très importante vu leur capacité à produire divers métabolites intéressants
pour l’homme mais sont également très dangereux en raison de leur capacité à produire des
métabolites toxiques.

Aussi la production d’OTA a été attribuée à plusieurs espèces du genre Aspergillus.

Parmi ces espèces ; la plus anciennement réputée ochratoxinogène est A. ochraceus (non
isolée dans notre étude), agent de destruction fatale dans les céréales et autres denrées
alimentaires humaines et animales.

146
 On peut donc supposer que les souches (Penicillium spp et Aspergillus spp) isolées dans
cette étude pourraient être à l’origine de l'OTA retrouvée dans nos échantillons ayant servi à
l’étude toxicologique.

La section «Nigri» est aussi très importante vu l’ochratoxigénicité qui a été récemment
attribuée à certains de ces représentants, tel qu’A. niger (retrouvée dans nos échantillons de
maïs, riz, sorgho et arachide). A. niger a été l’un des contaminants majeurs de certaines de nos
denrées alimentaires (arachide, riz, maïs, Sorgho).

6. Conclusion

En République du Niger, le riz, le maïs, le millet, le sorgho et les arachides sont des
aliments de base très prisés par la population. Plusieurs études à travers le monde ont montré
que les céréales ainsi que l’arachide peuvent être contaminées par les moisissures.

Dans la présente étude, nous avons démontré que le riz, le maïs, le sorgho, le millet et
l’arachide peuvent héberger une grande variété de moisissures.

Au sein de cette flore fongique, certaine moisissures peuvent être mycotoxinogènes.

Ainsi, plus de 60 % des espèces fongiques identifiées dans notre étude appartiennent à au
genre Aspergillus. Le genre Penicillium s’est illustré avec un faible taux, soit 3% de
l’ensemble des moisissures identifiées. Ces deux genres sont décrits dans la littérature comme
étant les principaux producteur d’ochratoxine A et d’aflatoxines.

Bien d’autres genres sont identifiés : Fusarium spp, Mucor sp, Rhizopus sp, Culvularia
sp, Alternaria sp, Bipolaris sp, Stemphylium sp, Absidia sp. Quelques unes de celles-ci
(Fusarium, Alternaria) sont aussi incriminées dans la production des mycotoxines. Elles
causent de graves problèmes de santé publique et sont à la base d’importantes pertes
économiques reconnues à travers le monde.

Les moisissures représentent de graves menaces pour la santé de l’Homme et celle des
animaux. Il importe donc aux pouvoirs publics, de disposer de données et d’outils d’analyses
adéquates permettant de prévenir les risques liés à ces contaminations.

147
 CHAPITRE II : ETUDE DE LA CONTAMINATION DES
CEREALES ET DE L’ARACHIDE PAR L’OTA

1. Performance de la méthode et choix du solvant

La moyenne de récupération des échantillons de céréales et des arachides enrichies (n =

5) à un niveau d’OTA de 5 ng / g était au dessus de 71,8% avec un écart-type relatif de 12%.

Les valeurs obtenues pour la récupération et écart-type relatif à la méthode utilisée sont
en accord avec la directive 2002/26/CE de la Commission européenne pour les méthodes
d’analyses de l'OTA dans les denrées alimentaires (CE, 2002).

La variation des valeurs à un niveau de fortification de 3,0 ng / g de l’intra-day (n = 5)

et l’inter-jour (5 jours différents), étaient de 10% et 8%, respectivement.

Les valeurs de la limite de détection (LD) et la limite de quantification (LQ) ont été
calculées en fonction de s / n = 00,00 et s / n = 10, respectivement. La (LD) et la (LQ) ont été
de 0,1 ng / g et 0,3 ng / g, respectivement. La (figure 37) représente le chromatogramme du
standard d’ochratoxine A. Le temps de rétention de ce dernier est 30min.

2. Analyse de l’OTA

Pour une population estimée au 30 avril 2013 à 16.839.194 habitants, les besoins
céréaliers (toutes céréales confondues) sont estimés à 4.034.854 tonnes dont 3.610.713 tonnes
pour les céréales sèches constituées de mil, sorgho, maïs et fonio. A cet effet, les normes de
consommation utilisées sont respectivement de 231 Kg/personne/an pour toutes les céréales
réparties en 207 Kg/personnes/an pour les céréales sèches, 18 Kg pour le riz et 6 Kg pour le
blé. (MADS, 2013).

Face à la forte présence des céréales dans le régime alimentaire de la population

nigérienne, l’étude de la présence naturelle de l’ochratoxine A (OTA) a été réalisée. Des
échantillons de maïs, riz, arachide, sorgho et millet ; achetés dans différents marchés de la
ville de Niamey ; à été analysés (tableau 20).

148
Figure 37 : Chromatogramme : (A) une solution standard d’OTA (3 ng/ml), (B) un
échantillon d’arachide naturellement contaminé

Tableau 20 : Résultats de l’analyse de l’OTA dans les denrées alimentaires en

provenance de la République du Niger

Ech Nbre Ech Ech Positifs OTA (µg/kg)

Moyenne Maximum

Maïs 39 Nd Nd Nd

Riz 22 1 0 .1 0 .1

Millet 07 Nd Nd Nd

Arachide 07 6 3.7 5

Sorgho 06 Nd Nd Nd

Total 81 7 8/81 5

Nd : non déterminé ; Ech : Échantillons ; Nbre : Nombre

149
 Comme l’on peut le voir, sept (7) échantillons sur un total de quatre vingt et un (81) ont
été contaminés par l'OTA. En d’autres termes, seul 9% (figure 39) de l’ensemble des produits
alimentaires analysés, sont souillés par la présence de l’OTA avec des teneurs inférieures ou
égales à la limite maximale fixée par l’Union européenne.

Ces résultats d’analyses de l’OTA ne représentent qu’une infirme partie de la situation

sanitaire des denrées alimentaires commercialisées en République du Niger. Dans la présente
étude, 5% et 87% des échantillons totaux de riz et d’arachide analysés sont respectivement
contaminés par l’OTA (figure 38). Les moyennes de l'OTA dans ces échantillons est 0,1 et 3,7
µg/kg respectivement.

La teneure moyenne de l’OTA dans les échantillons contaminés est de 3,5 µg/kg et la
concentration moyenne d’OTA enregistrée pour les échantillons d’arachide est 3,7 µg/kg.
Aussi pour cette dernière, la teneure la plus élevée (5 µg/kg) a été enregistrée dans
l’échantillon n°4. Les résultats de nos analyses n’ont montré qu’une seule contamination des
échantillons de riz par l’ochratoxine A.

Quant aux autres échantillons de céréales tels que le maïs, le millet et le sorgho, ils sont
exempts de contamination. Ces derniers présentent une concentration en OTA, inférieure à la
limite de quantification. Le tableau 20 récapitule l’ensemble des résultats obtenus pour
l’analyse de l’OTA des échantillons étudiés. Le taux d’humidité des céréales étudiées est
inférieur à 12%. Cette valeur en dessous de 15% répond aux normes commerciales.
Cependant la contamination des échantillons d’arachides et de riz, par l’OTA ; laisse croire
qu’Aspergillus pourrait être à la base de la synthèse de l’OTA.

Le séchage des grains a contribué à la perte en eau des échantillons. Ceci à permis
d’avoir des arachides saines, en apparence, mais contaminés par l’OTA. Ainsi, l’absence de
moisissures ochratoxinogènes ne signifie pas toujours absence d’OTA ou de mycotoxines.
Les moisissures on certainement eu à un moment donné (lorsque les conditions à favorables
l’ochratoxicogenèse sont réunies) le temps de produire l’OTA dans les arachides et ont laissé
des traces de spores à l’intérieur des grains séchés. Les figures 38 et 39, résument l’ensemble
des contaminations par l’OTA des échantillons analysés.

La présence de l’ochratoxine A dans les produits végétaux a été démontrés dans

plusieurs pays à travers le monde. Ainsi, nombreux sont les travaux qui ont montré que, les
céréales, les oléagineux, les fruits et légumes peuvent êtres sujet à la contamination (aussi
bien par les moisissures que par les mycotoxines… .).

150
 En effet, en Afrique, dans certains pays tels que le Nigeria (Makun et al., 2011), le
Bénin (Bouraima et al., 1993), la Côte d' Ivoire (Sangare - Tigori et al., 2006), le Maroc
(Zinedine et al ., 2009), l’Égypte (Abdelhamid, 1990) et la Tunisie (Zaied et al ., 2009),
plusieurs travaux ont démontré cet état de fait.

Figure 38 : Nombre d'échantillons contaminés par l'OTA en fonction des matrices

Ar : arachide, Mil : millet, Sor : sorgho, Ech : échantillons

Figure 39 : Niveau de contamination de l'ensemble des échantillons analysés

Ech : échantillon

151
 2.1. Étude de la contamination des échantillons de riz par l’OTA

Très peu d’investigations sont menées dans l’étude de la contamination des denrées
céréalières par les mycotoxines, notamment l’ochratoxine A ; quoique les moyennes de
production et rendements (mil, sorgho, maïs, riz et arachide) calculées sur la base des données
2002‐2009 de la Direction des Statistiques Agricoles/MAGEL montrent que la République du
Niger est l’un des gros consommateurs de céréales au monde.

Les études menées sur la contamination du riz en provenance de la ville de Niamey, par
l’OTA, ont révélé une fréquence de contamination d’environ 5% avec une faible teneur (0,1
µg/kg).Au Vietnam, l’OTA a été détecté dans le riz avec des nivaux de contamination entre
21,3 et 26,2 µg/kg (Trung et al., 2001). Au Maroc, Zinedine et al., 2007 ont rapporté une
forte fréquence (avoisinant 90%) de contamination du riz commercialisé à Rabat-Salé.
Environ 15% de l’ensemble des échantillons étaient au dessus de la limite maximale fixée par
la législation de l’Union Européenne.

Plusieurs pays européens ont eu à étudier la présence naturelle de l’OTA dans le riz, car,
c’est l’une des plus importantes cultures vivrières au monde. Il fournit 27,0 % de
l'approvisionnement en énergie alimentaire et 20,0 % de l'apport en protéines alimentaires
partout dans le monde (FAO, 2004).

Ainsi on peut citer la Turquie, où les travaux de Serkan et al,. (2010) ont conduit à
l’identification de 38 (38.0%) d’échantillons contaminés sur les 100 échantillons de riz
analysés. Seulement trois (3) échantillons ont présentés des niveaux de contamination
supérieurs aux limites tolérables.

En Tunisie, l’étude de la contamination des échantillons de riz par l’OTA, fait ressortit
25% de contaminations, avec des teneurs comprises entre 0.8-2.3 µg/kg (Ghali et al., 2008).
Ces concentrations montrent des contaminations aussi que faibles celles de la ville de
Niamey. Cependant en Grande Bretagne (Scudamore et al., 1997) et en Espagne (Gonzalez
et al., 2006), bien qu’lis affichent des fréquences de contaminations assez faibles et
relativement proches (7.5% et 7.8% respectivement), on dénote des contaminations élevées
d’OTA (min 1,0 µg/kg et 4.3 µg/kg ; max, 19.0 µg/kg et 27.3 µg/kg) respectivement.

Les travaux de Park et al. (2005) en Corée du Sud font ressortir une fréquence de
contamination assez proche des deux dernières, mais toujours supérieure à la nôtre. Ainsi, 9%
des échantillons de riz coréens étaient contaminés par l’OTA ; avec des teneurs qui varient
entre 2.1 et 6.0 µg/Kg.

152
 Bien d’autres études ont été réalisées dans plusieurs pays. La Côte d’Ivoire (Sangare-
Tigori et al., 2006) ; le Brésil (Simionato et al., 2003) ; le Portugal (Pena et al., 2005) ; le
Vietnam (Nguyen et al., 2007).

Les différences et variations de contaminations des céréales peuvent être dues à leurs
différentes origines de provenance. L’année de la récolte associée aux conditions de
conservations jouent aussi un rôle important dans l’infection des céréales par les mycotoxines
(Kuiper-Goodman, 1999).

2.2. Étude de la contamination des échantillons de Maïs par l’OTA

La détection de la l’OTA dans le maïs est un problème de santé publique, dans les
endroits où le produit est consommé comme un aliment de base et est également utilisé
comme ingrédient dans l'alimentation animale. En République du Niger, tout comme dans les
autres pays en voie de développement, le maïs représente l’un des aliments de base de la
population. Il est consommé sous forme de boulle d’akassa, ou de boulle consistante connue
sous le nom de « crouba crouba » en République du Niger et du nom de « worh ou akoumin »,
au Bénin.

Dans la présente étude, la totalité des trente neuf (39) échantillons maïs analysés, sont
bien secs et sont en apparence propres. Les résultats de la contamination de cette céréale par
l’OTA n’ont pas montré de contaminations. De la même manière au Pakistan, Irama. et al.,
(2014) n’ont pas obtenu de contamination par l’OTA des échantillons de maïs qu’ils on eu a
étudier. Cependant leurs maïs sont deux à trois fois plus humides (%H moyennes : 23,6 ; 27,1
et 30,03)% que les nôtres (%H moyenne= 10).

Contrairement à Irama et al., 2014 les travaux de Majeed (2013) au Pakistan ont
montré que sur un total de 105 échantillons de maïs et 102 produits dérivés du maïs analysés,
28 et 26 échantillons sont respectivement contaminés par l’OTA. Les moyennes de
contaminations obtenues pour ces derniers étaient 5.29 et 3.69 µg/kg respectivement.

A l’opposé de nos résultats, d’autres études ont démontré la présence de l’OTA dans le
maïs. En Angleterre, Scudamore and Patel. (2000) ; ont rapporté la contamination du maïs
par l’OTA avec un maximum de contamination de 1,5 µg/kg. Des résultats similaires sur la
présence de l’OTA dans des céréales pour petit déjeuné ont été obtenus au Canada. À cet
effet, 30% des échantillons analysés étaient contaminés, avec des niveaux de contamination
faibles et qui s’étalent de 0.01 à 0.38 µg/kg (Roscoe et al., 2008).

153
 Dans la présente étude, la contamination du maïs par l’OTA n’a donné aucun résultat
positif, comparativement à celui de plusieurs études menées en Europe, où les contaminations
vont de 60 à 90% (Araguás et al., 2005 ; Villa and Markaki, 2009 ; Molinié et al., 2005).

2.3. Étude de la contamination des échantillons de sorgho par l’OTA

Le sorgho est une importante culture de céréale grossière qui est rangée parmi les cinq
plus importantes céréales dans le monde. Il a dernièrement reçu une attention particulière de
la part des populations diabétiques et obèses et est aussi considéré comme un produit
alternatif potentiel pour ceux qui ont la maladie cœliaque (céréale sans gluten).

En République du Niger, les travaux faisant trait à la contamination du Sorgho, par

l’OTA sont inexistants. La présente étude vient combler cette lacune et apporte des
renseignements sur l’état sanitaire de certaines céréales et arachides commercialisées dans ce
pays. De la même façon que les autres céréales, le sorgho est un aliment de base consommé
sous forme de bouille au Niger et dans les pays de la sous région, il est aussi utilisé dans les
élevages, pour l’alimentation des volailles et du bétail.

Les résultats d’analyse des échantillons de sorgho n’ont point révélé de contaminations
par l’OTA. Ceux-ci ont rapporté la présence de l’OTA dans 98% des échantillons de sorgho
analysés. La moyenne de contamination de l’OTA retrouvée dans notre étude est deux fois
plus élevée que la leur (1.93 µg/kg).

2.4. Étude de la contamination des échantillons de millet par l’OTA

Les résultats d’analyse des échantillons de millet nous ont permis de constater que ceux-
ci étaient exempts de contamination par l’OTA, de la même manière que le maïs et le Sorgho
précédemment cités.

Cependant, plusieurs études ont prouvé la contamination de cette céréale par

l’ochratoxine A. Makun et al., (2013) ont rapporté la contamination du millet de certains
marchés du Nigéria par l’OTA avec des concentrations qui varient entre 10.20 et 46.57 µg/kg.

Toujours au dans ce même pays, d’autres résultats d’analyses de l’OTA des échantillons
de millet de différentes régions, ont montrés des contaminations moyennes de 0.24 µg/kg et
0.02 µg/kg respectivement des régions Biu et Gubio, (Gwary et al., 2012). Ces concentrations
très faibles par rapport à celles de Makun et al., (2013).

154
 2.5. Étude de la contamination des échantillons d’arachides par l’OTA

Les arachides jouent un rôle important en termes de nutrition et de revenu pour les
populations rurales du Niger. Cette denrée est une importante source de nutriments,
particulièrement pour les enfants, en raison de sa forte teneur en protéines, de matière grasse,
glucide ; et micronutriments (calcium, potassium, phosphore, magnésium et vitamine E).

Dans le monde, environ 25,7 millions de tonnes d'arachides sont produites chaque
année sur environ 21 millions d'hectares de terres cultivées. 23 % de la production de
l'arachide du monde vient de Afrique sub-saharienne, dont environ 78 % de l’Afrique de
l’Ouest (IFPRI, 2010).

L’Union européenne a interdit l’importation d’arachides avec une teneur au dessus de 5

µg/kg d’OTA, car elles sont impropres à la contamination.

En République du Niger comme dans la plus part des pays en voie de développement,
une grande attention a été accordée aux contaminations par les aflatoxines, l’OTA et les autres
mycotoxines de façon générale. Les autres problèmes de qualité des arachides produites sont
aussi pris en compte avant l’exportation des marchandises vers les pays développés. Par
contre, très peu d’intérêt est accordé aux arachides produites pour la consommation locale.

Par rapport à ce problème, on estime que 95 % des d'arachides en Afrique de l'Ouest

sont consommées par le ménage ou le commerce local (IFPRI, 2010). La consommation à
long et à moyen terme, d’arachides contaminées par les l’OTA entraine des maladies très
graves. Cette mycotoxine est reconnue pour ses effets carcinogènes, tératogènes,
néphrotoxiques et immunotoxiques. Plusieurs cas de cancer sont détectés chaque année au
Niger (Garba, 2014), malheureusement il n’existe pas de travaux établissant un rapport entre
l’OTA et ces cancer enregistrés.

Dans la présente étude, 86% des échantillons d'arachide sont contaminés par
l’ochratoxine A, avec une teneur moyenne 3,7 µg/kg. La plus forte concentration détectée est
5 µg/kg. Les arachides montrent une forte fréquence de contamination par l’OTA,
comparativement à celles analysées en Côte d’Ivoire par Sangare-Tigori., et al., (2006).

Cependant Bacha et al., (1999) ont rapporté en Tunisie la contamination de l’arachide

par l’OTA avec des concentrations qui oscillent entre 5 à 46000 µg/kg. Elles sont très élevées
en comparaison avec nos résultats. Très peu d’études ont été rapportées sur la contamination
des arachides par l’OTA à travers le monde (Ediage et al., 2014 ; Magnoli et al., 2007 ; Zhu
et al., 2015).

155
 3. Estimation de l’exposition à l’OTA à Niamey

L’exposition aux mycotoxines en Afrique subsaharienne est très élevée. Les souches de
moisissures sont des contaminants très fréquents de plusieurs denrées alimentaires ; de plus
les conditions climatiques dans ces régions sont très favorables, aussi bien pour la croissance
fongique que pour la production et à l’accumulation de toxines dans les aliments.
(Gnonlonfin et al., 2013).

Des études réalisées dans certaines régions d’Afrique sub-saharienne ont montré que
chez 99% des enfants étudiés, les mycotoxines y sont présentes. Cette forte exposition
contribue à l’apparition d’une hépatomégalie chronique observées chez les enfants (Gong et
al., 2002, 2004; Khlangwiset et al., 2011). La contamination des aliments par des niveaux
élevés de mycotoxines peut entrainer des conséquences fatales, telles que celles rapporteés par
Lewis et al., (2005) ; Probst et al., (2007) sur la mort des 125 kényans.

En milieu urbain, à Niamey, le modèle de consommation alimentaire s'est fortement

modifié au cours des 20 dernières années (CILSS, 1991). La consommation du riz a connu
une augmentation croissante. Elle est aujourd'hui estimée à 40 kg par personne et par an (plus
d'un tiers des céréales consommées à Niamey), alors qu'en milieu rural elle est de 5,6 kg. Le
poids moyen d'un homme africain ou d'un asiatique est habituellement plus proche de 55 kg
que de 70 kg, et celui d'une femme proche de 45 kg.

En se basant sur la consommation moyenne des céréales au Niger, nous avons estimé la
prise journalière de l’OTA à partir du riz et des céréales totales. De ce fait, la Prise Journalière
(DI) de l’ochratoxine A chez un adulte (55kg) dans la ville de Niamey à travers la
consommation du riz ou la consommation des céréales totales, peut être estimée selon la
formule suivante :

[
DI = mOTA (µg/kg)× TC (g) / jour) /P (kg) ] en ng/kg p.c./j
- mOTA: Moyenne de contamination de l’aliment par l’OTA en (µg/kg)

- TC : Taux de consommation de l’aliment en g par jour

- P : Poids corporel d’un adulte au Niger en Kg

156
 3.1. Cas du riz

A Niamey, on estimée à 40 kg, la consommation annuelle de riz par personne et par an en

milieu urbain ; alors qu'en milieu rural elle est de 5,6 kg.

- mOTA: Moyenne de contamination par l’OTA en (µg/kg) = 0,1 µg/kg

- TC : Taux de consommation du riz en g par jour = 0,111kg / jour

- P : Poids corporel d’un adulte au Niger = 55kg

DI = 0.2 ng d’OTA /Kg p.c./jour

3.2. Cas des céréales en général

A Niamey, la consommation moyenne de céréales kg/personne/an est de 18 kg.

- mOTA: Moyenne de contamination par l’OTA en (µg/kg) = 0,1 µg/kg

- TC : Taux de consommation du riz en g par jour = 0,503kg / jour

- P : Poids corporel d’un adulte au Niger = 55kg

DI = (0,1 µg/kg × 0,503kg/jour) / 55kg

DI = 0.92 ng d’OTA/Kg p.c./jour

Ces valeurs du DI du riz et des céréales totales sont inférieures à la prise journalière
tolérable fixée par les autorités européennes qui est de 17,1 ng/kg pc/j (EFSA, 2006) et à la
prise journalière tolérable fixée par le comité FAO/OMS qui est de l’ordre de 14 ng/kg pc/j.
Ces résultats indiquent que les céréales commercialisées en République du Niger sont peu
contaminées par l’OTA, ce qui indique que la population Nigérienne est probablement
faiblement exposée aux effets toxiques de l’OTA.

157
 4. Conclusion

Vu la quasi inexistante de données disponibles sur la présence de mycotoxines dans les

denrées alimentaires en République du Niger, la présente étude portant sur la présence de
l'ochratoxine A dans les produits (maïs, riz, arachide, sorgho et millet) commercialisés dans
les marchés locaux de la ville de Niamey, est la première jamais réalisée.

Au terme de cette étude, 8% de l’ensemble des denrées alimentaires analysées est

contaminé par l’OTA. La présence d'OTA a été déterminée dans le riz et les arachides. Ainsi,
seul un échantillon de riz s’est révélé positif avec une teneur très faible. Par contre les
arachides ont montré une plus forte fréquence de contamination, avec des teneurs atteignant la
valeur limite fixée par la réglementation de l’UE. Les autres échantillons de céréales sont,
cependant exempts de contaminations détectables par l’HPLC.

Les valeurs de la dose journalière (du riz et des céréales en général) dégagées à travers
cette étude montrent que ces céréales échantillonnées dans la ville de Niamey sont peu
contaminées par l’OTA.

Ces résultats peuvent contribuer à encourager les responsables des secteurs

agroalimentaires et de la santé publique, à œuvrer pour la promotion des bonnes méthodes de
productions et de stockages des denrées céréalière et oléagineuses en République du Niger.

158
CHAPITRE III : ETUDE DE LA CONTAMINATION DU MAÏS
ET DU RIZ PAR LES AFLATOXINES (AFs)

1. Analyse des aflatoxines (Afs)

A l’issue des analyses, les résultats de la présence naturelle des aflatoxines dans les
échantillons analysés sont résumés dans les tableaux 22 et 23 ci-dessous. Le chromatogramme
du standard AFs et celui d’un échantillon de maïs positif sont représentés par la figure 40 et le
Tableau 21.

1.1. Étude de la contamination du maïs par les aflatoxines

Les résultats d’analyse montrent une forte contamination des échantillons de maïs
comme l’illustre la figure 41. Les contaminations maximales observées pour l’ensemble des
aflatoxines (B1, G1, B1, B2) et en particulier pour l’AFB1, sont respectivement 10. 6 μg/kg et
5,7 μg/kg (tableau13). Ces résultats prouvent une assez forte contamination des échantillons
de maïs analysés. 44% de ces échantillons sont contaminés par l'AFB1, soit 11 échantillons
sur 25 (figure 41).

Les concentrations d’AFB1 varient de 0,03 à 5,7µg/kg avec une moyenne de 0,6µg/kg.
Seul un échantillon de l’ensemble des maïs acheté au marché « Albarika » dépasse la limite
maximale (2µg/kg) fixée par la réglementation de l'UE pour l'AFB1.

En ce qui concerne l’AFB2, elle s’est affichée à hauteur de 40% des contaminations sur
l’ensemble des échantillons de maïs analysés. Le maximum observé pour cette mycotoxine
est de 4µg/kg.

Quant à la présence de l'aflatoxine G1 ; ces mêmes échantillons ont montré 20 % de

contaminations avec des teneurs variant de 0,01 à 5μg/kg. Juste une infirme partie (4%) des
échantillons de maïs sont souillés par l’AFG2.

159
 Tableau 21 : Temps de rétention des aflatoxines (G1, B1, G2, B2)

Aflatoxines G1 B1 G2 B2

temps de rétention (min) 9.34 9.91 11.54 12.97

a b)

Figure 40 : a) Chromatogramme du standard aflatoxine total (5 µg/kg) et b) celui d’un

échantillon positif de maïs (4,5 µg/kg d’AFB1).

Figure 41 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs en fonction des

aflatoxines (G1, B1, G2, B2)

160
 Figure 42 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs en fonction de
l’aflatoxine B1

Tableau 22 : Teneur des AFs et de l’AFB1 dans le maïs en provenance de la

république du Niger.

Ech total Ech contaminés (AFB1) AFB1

[Moyenne] µg/kg [Max] µg/kg n>2µg/kg

25 11 0,6 0,6 1

Ech total Ech contaminés (AFs) AFs

[Moyenne] µg/kg [Max] µg/kg n>2µg/kg

25 14 1,6 10,6 2

n= nombre concentration

161
 Tableau 23 : Teneur des aflatoxines dans les échantillons de Maïs par les aflatoxines

Teneur en aflatoxines (µg/kg)

Maïs (n=25)
[AF G1] [AF B1] [AF G2] [AF B2] [ AFs]

3M - 0,048 - 0,002 0,050

4M - 0,044 - - 0,044

6M 0,529 - - 0,269 0,797

28 M HT - 0,026 - 0,001 0,027

32 MHT 0,242 0,108 - 0,022 0,371

37 M N1 0,013 0,038 - - 0,051

40 M N2 - 0,502 - 0,023 0,525

48 M N2 - - - 0,034 0,034

56 MW 5,022 - - 1,833 6,855

59 MW - 0,569 - - 0,569

69 MK - 1,035 - 0,386 1,422

73 MK - 0,221 - 0,179 0,400

78 M Al 0,408 5,652 0,594 3,918 10,573

81 M Al - 0,270 - - 0,270

Moyennes (µg/kg) 0,44 0,61 0,04 0,48 1,57

Échantillons positifs (%) 20 44 4 40 56

M Al: Maïs Albarika, M HT: Maïs Habou Tédji, M N1: Maïs Nouveau Marché, MK: Maïs Katako, MW: Maïs
Wadata

162
 Plusieurs études rapportées pas des auteurs à travers le monde, ont maintes fois
démontré la contamination des céréales par les aflatoxines, (Liu et al., 2006 ; Reiter et al.,
2010 ; Makun et al., 2007).

Au Maroc, dans le cadre d'une campagne de contrôle de la contamination des denrées

alimentaires distribuées dans les marchés locaux, 336 échantillons ont été analysés durant la
période 1991-1992. Sur un total de 50 de maïs analysés, seul 1 échantillon s'est révélé
contaminé par l'aflatoxine B1 ([AFB1]=18 µg/kg), et 1 échantillon sur 6 des arachides était
fortement pollué (820 µg/kg d'aflatoxines B1, B2, G1 et G2) (Tantaoui-Elaraki et Bartine,
1994).

Des céréales destinées à la consommation humaine et celles destinées aux volailles ont
été analysées, également afin de déterminer la présence des aflatoxines (AFs). Les résultats
ont montré que de 10% des échantillons de maïs étaient contaminés ; avec une teneur au-
dessus du niveau maximum fixé par la réglementation de l'Union européenne pour les
aflatoxines Afs et l’AFB1, (4 µg/kg et 2 µg/kg) respectivement, (Zinedine et al., 2007).

Les travaux de cette même équipe de recherche ont aboutit à l’identification des Afs
dans la farine de maïs et dans l’alimentation du poulet. Les teneurs les plus fortes sont
signalées dans les échantillons de maïs et les aliments de volaille avec des valeurs en AFB1
comprises entre de 0,05 à 5,38 µg/kg.

Les enquêtes menée dans d'autres pays tel que le Kenya ont signalé la présence
d'aflatoxines dans le maïs et de certains produits dérivés (Ellis et al., 1991). D’autres enquêtes
similaires ont été menées au Bénin, au Ghana (Kpodo et al., 2000, James 2005), en Iran
(Yazdanpanah et al., 2001).

Selon un rapport publié par Ahsan et al., (2010), sur 40 échantillons de maïs analysés,
34 ont été trouvés contaminés par les aflatoxines. Le pourcentage de contamination par les
aflatoxines dans ces échantillons de maïs est de 80%, 87%, 90% et leur valeur moyenne
respective de 45 µg/kg, 54 µg/kg et 62 µg/kg en milieu urbain, semi-urbain et les zones
rurales, respectivement.

En Argentine et en Inde, MacDonald et Castle. (1996) ont montré que 20% et 47% des
échantillons de maïs analysés étaient contaminés par les aflatoxines (5-560) µg/kg et (5-666)
µg/kg respectivement. De même au Brésil, la consommation d'aliments souillés par les
aflatoxines a été évaluée. La détermination des aflatoxines dans le maïs a montré 42%

163
d’échantillons positifs (allant de 0,05 à 8,3 µg/kg), avec une incidence plus grande dans la
farine de maïs (Jager et al., 2013).

1.2. Étude de la contamination du riz par les aflatoxines

Les résultats de l'analyse du riz ont démonté que, l’échantillon de riz 19 RK présente
une contamination en AFB1 (4.5μg/kg) deux fois plus supérieur à celle prévue par la
législation de l’Union européenne.

48% de l’ensemble des échantillons de riz analysés sont contaminés par l’aflatoxine B1,
soit 11 échantillons sur les 23 analysés ; avec une teneur moyenne de 0,5μg/kg. Il faut
également ajouter que ; 13 % des échantillons étudiés sont contaminés par l'aflatoxine G1
avec des teneurs oscillant entre 0,02 μg/kg et 6,6 μg/kg.

Seuls 4% des échantillons de riz sont contaminés par l’AFG2 (figure 44). Quand à
l’AFB2, elle s’affiche avec la même fréquence de contamination que l’AFG1. En définitive,
près de la moitié des échantillons de riz sont contaminés par les Afs.

La fréquence de contamination en aflatoxines totales de ces échantillons atteint 48%

(figure 43). Le maximum en AFs est retrouvé dans l’échantillon de « Katako » comme signalé
ci-dessous (tableau 25). Ainsi ce maximum est de 13,8 μg/kg avec une concentration
moyenne de 0,6 μg/kg.

Les récentes études comme les précédents travaux ; sur le niveau de contamination des
céréales par les aflatoxines ; viennent confirmer nos résultats de recherche (Lutfullah et
Hussain. 2012 ; Reiter et al., 2010).

En Tunisie, Ghali et al., (2008) ont testé 16 échantillons de riz et ; 12,5 % de ces
échantillons étaient contaminés par les AFs avec un niveau moyen de 4,7 µg/kg. Par contre
leurs résultats n’ont pas montré la présence de l’AFB1.

En Inde, les études de Reddy et al., en 2002 ont démontré que présence d’AFs dans 3
échantillons de riz sur les 48 analysés avec des niveaux de contaminations supérieures à la
limite acceptable. Dans le respect des résultats, les valeurs maximales en AFs dans cette
étude, étaient inférieures à celles de Bandara et al., (1991) ; Ghali et al., (2008), mais
supérieure à celles de Liu et al., (2006). Dans une autre étude, Toteja et al., (2006) ont
analysé 1511 échantillons de riz étuvé en Inde et 38,5 % des échantillons étaient contaminés
par l'AFB1.

164
 Cespedez et Diaz. (1997) ont rapporté que l’AFB1 a été trouvée dans 36,3 % de leurs
échantillons. Les pourcentages d’AFB1 dans cette étude étaient similaires à ces résultats.
Cependant, Osman et al., (1999) ont constaté que 48,2 % des échantillons de riz ont été
contaminés par l'AFB1.

Aux Philippines, Sales et Yoshizawa. (2005) ont démontré que l'AFB1 a été détectée
dans 74 des 78 (94,8%) échantillons de riz. Au Vietnam, 51,0 % des 100 échantillons de
riz (Nguyen et al., 2007) ; et en Inde 67,8 % des 1 200 échantillons, Reddy et al., (2009) ont
détectés des échantillons positifs à la contamination par les AFs.

Aucun pays au monde n’est épargné par la contamination des céréales par les
mycotoxines. En Chine, 37 échantillons de riz ont été analysés. Les échantillons de riz
décortiqué ont montré une teneur moyenne de 3,87 µg/kg d’aflatoxines (Liu et al., 2006).

Toujours dans ce même pays ; les récents travaux réalisés par Lai et al., (2015) ont
montré que 63,5% des échantillons de riz analysés sont contaminés par les aflatoxines. Les
niveaux moyens d’AFB1 et de l’ensemble des aflatoxines AFs dans les échantillons positifs
sont 0,60 et 0,65 µg/kg respectivement. L’AFB1 et l’AFB2 sont présentes dans les
échantillons des l’ensemble des six provinces ayant fait l’objet de l’enquête.

Plusieurs pays à traves le mondes se sont intéressés à la problématique des aflatoxines

dans le riz. Sur un total de 500 échantillons analysés Aux Émirats Arabes Unis, 48,2% de
ceux-ci étaient contaminés pas l’AFB1 avec des valeurs comprises entre 1.2-16.5 µg/kg.

Figure 43 : Pourcentage de contamination en aflatoxines des échantillons de riz en

fonction des aflatoxine totales

165
 Figure 44 : Pourcentage de contamination en aflatoxines des échantillons de riz en
fonction des aflatoxines (G1, B1, G2, B2)

Tableau 24 : Teneur des AFs et de l’AFB1 dans le riz en provenance de la république

du Niger.

Ech total Ech contaminés (AFB1) AFB1

[Moyenne] µg/kg [Max] µg/kg n>2µg/kg

23 11 0,5 4,5 1

Ech total Ech contaminés (AFs) AFs

[Moyenne] µg/kg [Max] µg/kg n>2µg/kg

23 11 1,34 13,8 1

n= nombre concentration

166
Tableau 25 : Teneur des aflatoxines dans les échantillons de Riz par les aflatoxines

Teneur en aflatoxines (µg/kg)

Riz (n=23)
[AF G1] [AF B1] [AF G2] [AF B2] [AFs]

6 RB 0,132 0,169 - 0,094 0,395

16 RK - 0,015 - - 0,015

18 RK - 0,060 - - 0,060

19 RK 6,559 4,496 0,252 2,471 13,778

21 RK - 0,155 - - 0,155

22 RK 0,015 0,038 - - 0,054

24 RK - 0,057 - - 0,057

26RK - 0,090 - 0,005 0,094

36 R HT - 0,033 - - 0,033

38 R HT - 0,060 - - 0,060

41 RW - 0,037 - - 0,037

Moyennes (µg/kg) 0,61 0,47 0,02 0,23 1,34

Échantillons positifs (%) 13 48 4 13 48

167
 2. Contaminations des céréales par les AFs et l’incidence du Cancer du
Foie.

En comparant les résultats d’analyse des deux céréales, on remarque que la fréquence de
contamination du riz par l’AFB1 est légèrement supérieure celle du maïs (figure 46). Sur
l’ensemble des échantillons (maïs et de riz) analysés, seuls 6% et 4% de ceux-ci ont montré
respectivement des contaminations en AFs et en AFB1 dépassant la limite maximale fixée par
la commission européenne (figure 47).

En revanche nos résultats ont montré une fréquence très élevée de contamination des
échantillons de céréales analysés, soit 52% et 46% des respectivement pour les Afs et pour
l’AFB1 (figure 45).

Les travaux effectués par Li et al., (2014) ont montré la présence d’aflatoxines dans
14,5% des céréales analysées et la teneur en AFB1 détectée était très supérieure aux limites
fixées par la législation en vigueur en Chine (5,0, 10,0 et 20,0 µg kg-1 pour différents
produits). En Afrique, plus précisément en République du Niger, une épidémie alimentaire
avait touché le village Wada Rafin causant plusieurs victimes, dont plus de 7 décès et 20 cas
d'intoxication grave. Les études toxicologiques qui ont suivi cet événement ont démontré la
relation existant entre cet incident et la contamination par l'aflatoxine B1.

Par ailleurs Toteja et al., (2006) ont évalué la teneur en Afs dans le riz décortiqué, qui
en outre a été échaudé. Les teneurs maximales allant de 60 à 600 μg.kg-1 ont été enregistrées.
Les résultats obtenus sont dus aux mauvaises conditions de stockage aussi bien dans les zones
rurales que dans les zones urbaines de l'Inde.

Nguyen et al., (2007) emboitent le pas à Toteja et son équipe, en évaluant la teneur des
mycotoxines AFB1, citrinine et l'ochratoxine A dans le riz du Vietnam. Ils ont analysé près de
100 échantillons recueillis au hasard. 51% de tous les échantillons ont montré une
contamination par l’AFB1 avec une concentration moyenne de 3,31 µg/kg et teneur maximale
de 29,82 µg/kg enregistrée.

168
Figure 45 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs et de riz en
fonction des aflatoxines totale et de l’aflatoxine B1.

Figure 46 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs et de riz en

fonction des aflatoxines (G1, B1, G1, G2)

169
 Figure 47 : Pourcentage de contamination des échantillons de maïs et de riz en
fonction des teneuses en aflatoxines supérieures aux normes fixées par l’UE dans les céréales
analysées

Vingt et un (21) échantillons de riz de (dix) champs, de (six) magasins et de (cinq) marchés
des zones rizicoles traditionnelles de l'État du Niger (au Nigeria) ont été analysés. Des
aflatoxines ont été détectés dans tous les échantillons, avec des concentrations d’Afs totales
allant de 28 à 372 µg/kg.

Dans le cas de notre étude, les niveaux de contamination en aflatoxines trouvés dans le
riz pour la consommation humaine sont plus faibles que ceux (1,600-12,000 mg / kg) qui ont
causés plusieurs décès dans les deux épidémies d’intoxication aux aflatoxines au Kenya (afla-
Guard, 2005). Toutefois, les insuffisances de la purification des échantillons par la méthode
de colonne de verre nous laisse croire que l’utilisation de colonnes d'immuno-affinité (IAC)
avec LC-MS/MS nous aurait peut être permis d’obtenir des teneurs d’Afs un peu plus élevées
par rapport à nos résultats obtenus.

170
 A l’instar des travaux des différents chercheurs, nos résultats sont en accord avec les
conclusions ci-dessus, ce qui suggère un besoin urgent de surveillance des céréales et des
produits oléagineux nigériens, contre les moisissures mycotoxinogènes et les mycotoxines
(aflatoxines, ochratoxine A). Les contaminations des échantillons d’arachides et de céréales
dans la présente étude, peuvent être attribuées aux mauvaises pratiques agricoles
(manipulation lors de la récolte) ou aux conditions de stockage (température, humidité),
comme mentionné par les auteurs ayant travaillé sur les mycotoxines (Smith & Moss. 1985).

L’exposition aux aflatoxines conduit à l’affaiblissement immunitaire, le cancer du foie,

la cirrhose du foie, et les problèmes de nutrition tels que le retard de croissance chez les
enfants (Wu ., and Khlangwiset, 2010 ; Wu et al., 2011). Les aflatoxines peuvent également
aggraver les problèmes qui préexistent de santé. Les personnes infectées par le virus de
l’hépatite B qui s’exposent aux aflatoxines ont 30 fois la chance de contracter le cancer du
foie que celles qui n’en souffrent pas (Liu et Wu 2010, Kirk et al., 2006).

Au niveau mondial, on estime que les aflatoxines contribuent à entre 4,6 et 28,2
pourcent des cas de cancer du foie. Chaque année, 550,000-600,000 nouveau cas du cancer du
foie sont enregistrés dans le monde, et environ 25,200-155,000 des cas sont attribuables à
l’exposition aux aflatoxines. En 2008, le cancer du foie représentait la troisième cause
principale des décès liés au cancer dans le monde (Who, 2008). L’Afrique subsaharienne, le
Sud-est Asiatique et les pays du pacifique occidentale enregistrent une plus grande prévalence
du cancer du foie.

Les aflatoxines sont sans doute les mycotoxines les plus importantes dans le monde,
avec une estimation de 20 000 décès liés au cancer du foie induite par l'aflatoxine par an en
Indonésie (Lubulwa et Davis, 1994). L’étude de la fréquence des cas de cancers et décès
enregistrés au niveau du Registre du Cancer du Niger (1992-2006) a montré 797 cas de cancer
du foie avec 293 décès (Garba et al., 2010).

La prédominance du cancer du foie pourrait s’expliquer au Niger, par l’endémicité du

virus de l’hépatite B (Garba et al., 2013), associé à une alimentation contaminée par les
aflatoxines. La réduction de l'exposition de la population nigérienne aux mycotoxines et la
réduction conséquente des risques pour la santé ne sera possible qu’avec un travail avec les
producteurs de denrées alimentaires et des actions efficaces de vigilance sanitaire.

171
3. Estimation de l’exposition aux AFs à Niamey

[ ]
DI = mAFs (µg/kg) × TC (g) / jour) /P (kg) en ng/kg p.c./j

- mAFs : Moyenne de contamination de l’aliment par les AFs en (µg/kg)

- TC : Taux de consommation de l’aliment en g par jour

- P : Poids corporel d’un adulte au Niger en Kg

3.1. Cas du riz

A Niamey, on estimée à 40 kg, la consommation annuelle de riz par personne et par an en

milieu urbain ; alors qu'en milieu rural elle est de 5,6 kg.

- mAFB1 : Moyenne de contamination par l’AFB1 en (µg/kg) = 0,5 µg/kg

- mAFs : Moyenne de contamination par les AFs en (µg/kg) = 1,34 µg/kg

- TC : Taux de consommation du riz en g par jour = 0,111kg / jour

- P : Poids corporel d’un adulte au Niger = 55kg

DI = 1 ng d’AFB1 /Kg p.c./jour

DI = 2,7 ng d’AFs /Kg p.c./jour

3.2. Cas des céréales en général

A Niamey, la consommation moyenne de céréales kg/personne/an est de 18 kg.

o Riz

- mAFB1 : Moyenne de contamination par l’AFB1 en (µg/kg) = 0,5 µg/kg

- mAFs : Moyenne de contamination par les AFs en (µg/kg) = 1,34 µg/kg

172
 o Maïs

- mAFB1 : Moyenne de contamination par l’AFB1 en (µg/kg) = 0,61 µg/kg

- mAFs : Moyenne de contamination par les AFs en (µg/kg) = 1,57 µg/kg

o Céréales (Maïs & riz)

- mAFB1 : Moyenne de contamination par l’AFB1 en (µg/kg) = 0,555 µg/kg

- mAFS : Moyenne de contamination par les AFs en (µg/kg) = 1,455 µg/kg

- TC : Taux de consommation du riz en g par jour = 0,05kg / jour = 50g/jour

- P : Poids corporel d’un adulte au Niger = 55kg

[ ]
DI = mAFs (µg/kg) × TC (g) / jour) /P (kg) en ng/kg p.c./j

DI = 0,5 ng d’AFB1/kg p.c./jour

DI = 1,32 ng d’AFs/kg p.c./jour

En 1993, le Centre International de Recherche sur le Cancer (CIRC) a classé l’AFB1

dans le groupe 1, l’AFG1 dans le groupe 3. Ces substances présentant des effets cancérogènes
génotoxiques sans seuil, la seule approche réaliste est de réduire l’exposition à un niveau
aussi faible que possible suivant le principe ALARA (As Low As Reasonnably Achievable).
Le JECFA et le SCF n’ont pas fixé de dose journalière tolérable (DJT) pour les aflatoxines.

Cependant, en 1997, des valeurs indicatives calculées ont été proposées par le Conseil
supérieur d'hygiène publique de France (CSHPF) telles que 0,15 ng/kg p.c./j pour l’ AFB1
(AFSSA, 2009). Dans le cas de notre étude, la dose journalière d’AFB1 pour une alimentation
à base de riz est 6 fois plus élevée que celle proposé par le CSHPF. Dans les céréales, la dose
journalière en AFB1 est 3 fois plus grande que la dose journalière tolérable proposée par
CSHPF. Ainsi ces données démontrent que les risques d’aflatoxicoses pourraient être 3 à 6
fois plus grands au Niger qu’en France.

173
 Selon les données épidémiologiques du JECFA (49e rapport, 1998), on considère qu'en
Europe ; l'ingestion de 1 ng d'aflatoxines/kg p.c./j augmenterait l'incidence du cancer du foie
de 0,013 cancer par an pour 100 000 personnes.

La dose journalière (DI) des aflatoxines (AFs) est de (2,7 et 1,32) ng/kg p.c./j pour le riz
et les céréales respectivement. Cela sugère que l'incidence annuelle du cancer du foie chez la
poplulation nigérienne (Niamey) est de 0,035 (pour le riz) et 0,017 (pour les céréales) pour
100 000 personnes.

174
 4. Conclusion

Dans cette étude, les fréquences de contaminations des échatillons de maïs et du riz par
les aflatoxines totales et l’aflatoxine B1 ont été déterminées. Les résultats ont montré une
forte fréquence de contamination de ces céréales par les aflatoxines totales et l’aflatoxine B1.

Environ la moitier des échantillons de riz est contaminé par l’AFB1. Il en est de même
que pour le maïs. Ainsi, les pourcentages de contamination en AFB1 du maïs et le riz, sont
quasiment les mêmes.

Par ailleurs, la contamination de ces céréales par les aflatoxines montre que, 4% et 6%
de l’ensemble des céréales sont respectivement contaminées par l’AFB1 et les aflatoxines
totales AFs (B1, G1, B2 G2) avec des valeurs supérieures aux limites fixées par l’Union
européenne.

D’autre part, en considérant les valeurs indicatives calculées et proposées par le Conseil
supérieur d'hygiène publique de France (CSHPF), les valeurs de la dose journalière en AFB1
dégagées à travers cette étude montrent que les céréales commercialisées en République du
Niger sont assez contaminées par les Aflatoxines. Ains le risque d’incidence du cancer du foie
au Niger est assez élevé (0,035), soit au moins 2 fois plus que celui de la France (0,013).

175
 Conclusion générale et perspectives
Ce travail de recherche est une étude de la contamination de céréales et arachides par les
moisissures, et de leurs mycotoxines associées, notamment les aflatoxines et l’ochratoxine A.
Dans nos essais, nous avons utilisé des échantillons commercialisés dans la ville de Niamey
(Niger).

Nous avons montré à travers cette étude que ces denrées alimentaires sont d’une part
contaminées aussi bien par des moisissures de champs (Fusarium) que par des moisissures de
stockage (Aspergillus, Penicillium…). D’un autre côté, malgré le faible taux d’humidité de
ces aliments, ceux-ci montrent quand même des niveaux de contaminations assez inquiétants,
d’aflatoxines et d’ochratoxine A.

L’étude quantitative des mycotoxines par HPLC nous a permis, de mettre en exergue
des concentrations dépassant parfois les normes réglementaires fixées par la législation
européenne pour l'OTA et les AFs.

Bien que les concentrations des aflatoxines dans les échantillons de céréales soient
assez faibles ; 4% et 6% de celles-ci ont respectivement montré des teneurs en AFB1 et en
aflatoxines totales (AFs) dépassant des limites maximales fixées par la réglementation de
l’Union européenne. Néanmoins, ces aliments sont bien secs et ils respectent en termes de
taux d’humidité, les normes du commerce international.

Nous avons également montré que ces échantillons de céréales et arachides sont
contaminées par l’OTA avec de très fortes fréquences de contaminations pour certaines. C’est
le cas des arachides où plus de 80% sont contaminées par l’OTA. D’autres sont cependant
moins contaminées (riz) ou pas du tout contaminées (maïs, sorgho et millet).

Les valeurs de la dose journalière (DJ) en AFB1 à travers cette étude, indiquent que le
risque d’exposition de la population nigérienne aux aflaoxines est assez élevé. Cepandant les
valeurs de la DJ de l’OTA sont moins élévées que celles des AFs.

176
 En perspectives il serait intéressant :

• Poursuive les travaux puis étudier la toxicogenèse des souches isolées ;

• d’élargir la gamme des aliments à analyser (produits à base de maïs, produits

destinés aux enfants et aux bébés, lait en poudre, lait pasteurisé, café, boissons…) et
de rechercher d’autres mycotoxines (celles du Fusarium et les mycotoxines
émergentes) pour mettre à jour les connaissances en matière de contamination des
aliments Nigériens par les mycotoxines ;

• déterminer la dose de prise journalière (daily intake) des aliments consommés ;

• Mettre en place le bilan de connaissances sur la contamination des produits agricoles

nigériens par les mycotoxines et renforcer le contrôle de ces produits au niveau
national. ceci nous permettrait de rassembler des données pour l’information et la
sensibilisation des autorités nationales, ainsi que les producteurs (agriculteurs,
industriels…) et les organisations civiles de défense des droits des consommateurs.

• Les résultats obtenus constitueront une base de données qui servira au lancement
d’un projet national pour la réglementation des mycotoxines dans les aliments et la
protection du consommateur nigérien et étranger à d’éventuels effets toxiques
chroniques associés aux mycotoxines.

• Étudier le degré d'exposition de la population nigérienne aux mycotoxines en

analysant ces toxines dans les produits biologiques en particulier dans le sérum et
dans le lait maternel d'une population cible (population à fort taux de cancer).

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219
 WEBOGRAPHIE
http://www.embassyofniger.org/docs/otherofficialdocs/Conceptnote3N_rev5.pdf

http://www.mycotoxins.info/myco_info/science_cs.html

220
 ANNEXES

ANNEXE 1- ASPECTS MACROSCOPIQUE ET MICROSCOPIQUE

DE QUELQUES MOISISSURES ISOLEES

MUCORALES

1. Aspect macroscopique
• Couleur : culture blanchâtre à gris brun noirâtre

• Aspect : culture plate, épaisse, cotonneuse, poudreuse,…

• Développement rapide

2. Aspect microscopique
• Hyphes siphonnées (= non cloisonnées) - Zygomycètes

• Présence de stolons (filaments aériens) et de rhizoïdes (filaments racinaires) pour les genres

Rhizopus et Absidia, absence de rhizoïde pour le genre Mucor.

Mucor

Sporangiophore : Non ramifié en général

Sporange : sporanges sphériques de grande taille, présence d’une columelle : membrane

séparant le sporangiophore du sporange (pas toujours visible)

Sporangiospores : spores sphériques ou ovoïdes contenues dans le sporange, en train d’être

libérées ou déjà libres.

Rhizopus

Sporangiophore : Solitaire ou en bouquet au niveau des rhizoïdes

Sporange : sporanges sphériques et bruns, columelle volumineuse s’aplatissant après

ouverture du sporange

Sporangiospores : spores lisses ou striées, parfois brunâtres, contenues dans le sporange, en

train d’être libérées ou déjà libres.

221
Absidia

Sporangiophore : ramifié naissant dans le trajet aérien du stolon et non au niveau des
rhizoïdes.

Sporange : sporanges sphériques et bruns, columelle plus colorée que le sporangiophore

Sporangiospores : spores lisses et ovales contenues dans le sporange, en train d’être libérées
ou déjà libres.

GENRE ASPERGILLUS

1. Aspects macroscopiques

• Couleur : blanc, vert, jaune, noir suivant les espèces et l’âge de la culture

• Aspect : poudreuse, duveteuse à granuleuse

• Zonation éventuelle

2. Aspects microscopiques

Hyphes septées : mycélium à détailler selon les espèces

• Vésicule portée par un conidiophore

• Présence ou non de métules (selon l’espèce) : éléments stériles situés sur une vésicule et
portant les phialides.

• Phialides : cellules spécialisées donnant naissance aux phialospores par bourgeonnement

• Conidiospores = phialospores sphériques en chaînettes (aspect différent selon l’espèce)

GENRE PENICILLIUM

1. Aspects macroscopiques

• Couleur : culture blanchâtre au début puis de couleur variable suivant les espèces (souvent
bleu-vert)

• Aspect : culture poudreuse, plissée, cratériforme,…

• Pigmentation diffusant parfois dans la gélose

222
 2. Aspects microscopiques

2.1. Mycélium

Hyphes septées (à détailler selon l’espèce)

• Pénicille = structure en forme de pinceau (mono verticillé ou ramifié selon l’espèce) porté
par un conidiophore, Avec ou sans métule, Phialide, Phialospores : Plus ou moins ramifié ,
Pas de ramification : pénicille monoverticillée, Si ramifications : pénicille verticillée
symétrique ou asymétrique, Conidiospores = phialospores sphériques ou ovoïdes en
chaînettes. (Larcher, 1992).

ANNEXE 2- PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURES

7. Milieux de culture

Les milieux de culture utilisés, sont le PDA (Gélose dextrosée à la pomme de terre)
« Potato Dextrose Agar » le MEA (Gélose à l'extrait de malt) « Malt Extract Agar », le CYA
« Czapek Yeast Agar et le SC « sabouraud chloramphénicol ».

5.1. Préparation du milieu PDA

Le PDA est un milieu de culture courant, produit à base de bouillon de pomme de terre et
de dextrose. C’est le milieu de culture le plus largement utilisé pour cultiver des champignons
qui attaquent les plantes vivantes, la matière organique végétale ou animale. Sa préparation
nécessite 19,5 g de poudre de PDA mélangé avec 500 ml d’eau distillée dans un ballon de
1000 ml muni d’un bouchon en coton. L’ensemble est porté à ébullition pendant 30min dans
un bain Marie.

Le bouillon de culture est ensuite réparti par 10ml dans des tubes de culture en verre de
28 ml. Ces tubes à vis munis de leur bouchon, sont ensuite stérilisés à l’autoclave à 121°C
pendant 20min.

A la fin de la stérilisation ces tubes sont inclinés puis laissés refroidir et ensuite
conservés au frais à 4°C en attendant leur utilisation.

223
 5.2. Préparation du milieu CYA

Le CYA est reconnu pour son caractère facilitant la forte croissance et l’entretien des
espèces saprophytes du genre Aspergillus. Le sucre sert de source d’énergie, l’extrait de
levure fournit acides aminés essentiels, vitamines et autres nutriments essentiels. Le nitrate de
sodium sert comme source d’azote.

Ainsi, pour la préparation de ce milieu, 24,5 g de poudre de CYA sont pesés à l’aide
d’une spatule puis mélangés à 500 ml d’eau distillée dans un ballon de 1000 ml muni d’un
bouchon de coton. Le mélange est porté à ébullition dans un bain Marie pendant 30min.

Le bouillon de culture obtenu est ensuite réparti par 10ml dans des tubes de culture en
verre de 28 ml. Ces tubes à vis hermétiquement fermés, sont ensuite stérilisés à l’autoclave à
121°C pendant 20min. A la fin de la stérilisation ces tubes sont inclinés puis refroidis à et
ensuite conservés au frais à 4°C en attendant leur utilisation.

5.3. Préparation du milieu MEA

C’est un milieu de culture recommandé pour la détection, l’isolement et l’énumération

des levures et moisissures.

Pour la préparation du MEA, 22,5 g de poudre de malt dextrose agar sont pesés à l’aide
d’une spatule puis mélangés à 500 ml d’eau distillée dans un ballon de 1000 ml muni d’un
bouchon de coton. Le mélange est porté à ébullition dans un bain Marie pendant 30min.

5.4. Préparation du milieu SC

Pour sa préparation, la même méthode est utilisée précédemment. La gélose de

Sabouraud additionné au chloramphénicol constitue un milieu classique pour la culture,
l'isolement et l'identification des levures et des moisissures saprophytes ou pathogènes.

Il est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans les

prélèvements fortement chargés en bactéries, les contrôles de stérilité des produits
pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires et la culture des moisissures en vue de réaliser
leur identification.

224
 6. Préparation des boîtes de Petri.

Les milieux de cultures en tube de PDA, MEA, CYA préalablement préparés puis mis
au frais, sont fondus dans un bain Marie. 20 ml et 10 ml de chaque milieu de culture sont
coulés dans des boites de Petri stériles de 90 mm et 45 mm de diamètre respectivement en
fonction de l’usage dont-on veut en faire.

Les grandes boîtes de Petri servent à l’isolement des moisissures des grains. La petite
boîte quant à elle permet de repiquer chaque culture ayant été isolée. Au début des travaux, le
poste de sécurité microbiologique (PSM) est stérilisé aux UV avant, puis est soigneusement
désinfecté au méthanol 70% après les manipulations.

225
 ANNEXE 3- REGLEMENTATION SUR LES AFs ET L’OTA

Tableau 1 : Valeurs médianes et intervalles de variation des niveaux maximaux tolérés en 1987 ; 1995 et 2003 (μg/kg) de certaines aflatoxines
(groupes d'aflatoxines) et nombre de pays disposant de réglementations pertinentes

1987 1995 2003

Valeur intervalle Valeur intervalle Valeur intervalle

Ensemble aflatoxine / substrat médiane de variation Pays médiane de variation Pays médiane de variation Pays
(μg/kg) (μg/kg) (μg/kg) (μg/kg) (μg/kg) (μg/kg)

AFB1 dans les produits 4 0 - 50 29 5 1–20 61

4 0 – 30 30
d'alimentation humaine

AF(B1+B2+G1+G2) dans les 7 0 - 50 30 10 0–35 76

produits d'alimentation 8 0 – 50 48
humaine

0.05 0-1 13 0,05 0,05–15 60

afla M1 dans le lait 0.05 0–1 17

226
 Tableau 2 : Concentrations maximales admissibles d'aflatoxines ayant force de loi et directives
réglementaires concernant d'autres mycotoxines dans certains aliments pour les humains et les
animaux et les produits laitiers. (FAO, 1997)

Mycotoxines Produit Canada Produit É.-U

Produits de noix pour
Aflatoxines µg/kg
consommation 15 Tous les aliments 20
(ppb)
humaine
Aflatoxines µg/kg Aliments pour
20 Produits laitiers (AFM1) 0,5
(ppb) animaux
Aflatoxines µg/kg
Ingrédients alimentaires 20
(ppb)
Tourteau de coton destiné aux
Aflatoxines µg/kg bovins, aux porcs ou à la volaille
300
(ppb) adulte (peu importe l'âge ou l'état de
reproduction)
Produits de maïs et d'arachide
Aflatoxines µg/kg destinés aux bovins de boucherie de
100
(ppb) reproduction, aux porcs et à la
volaille adulte
Produits de maïs et d'arachide
Aflatoxines µg/kg
destinés aux porcs de finition de 200
(ppb)
100 lbs ou plus
Produits de maïs et d'arachide
Aflatoxines µg/kg
destinés aux bovins de boucherie de 300
(ppb)
finition

227
Tableau 3 : Niveaux d’aflatoxines total (µg/kg) admis pour les aliments et médicament dans
Union européenne (John, 2007).

AFB1 AFB1, B2, G1, G2

Alimentation Humaine
(µg/kg) (µg/kg)
Groundnuts, dried fruit and process
2 4
products thereof
Groundnuts subjected to
8 15
sorting or physic treating
As above but for nuts and dried fruits 5 10
Cereals (including maize) and
2 4
processed products thereof
Corn and peanut products for finishing beef cattle 300
Corn and peanut products for finishing swine 200
All products, except milk, designated for humans 20

228
Tableau 4 : Maximum permis (LMT) pour les aflatoxins au Brésil (Doll & Peto, 1981).

Maximum
Mycotoxins
Commodity limit tolerated
(µg/kg)
Cereals and cereal products, except corn and derivatives, including
5
malted barley
Beans 5
Chestnuts except Brazil-nut, including walnuts, pistachios, hazelnuts
and almonds
Dried and dehydrated fruits 10
Brazil-nut shell for direct consumption 20
Brazil-nut shelled for direct consumption 10
Brazil-nut shelled for further processing 15
Cereal-based foods for infant feeding (infants and toddlers) 1

AF(B1, B2, Infant formulas and follow-up formula for infants and toddlers 1

G1, G2) Cocoa beans 10

Cocoa and chocolate 5
Spices: Capsicum spp. (dried fruits, whole or ground, including
peppers, chili powder, cayenne and paprika), Piper spp. (the fruit,
including white pepper and black pepper) Myristica fragrans (nutmeg) 20
Zingiber officinale (ginger) Curcuma longa (turmeric). Spice mixtures
that containing one or more of the spices listed above.

Groundnut (in shell), (peeled, raw or roasted), peanut

20
butter or peanut butter
Corn, grain (whole, broken, crushed, ground), flour or
20
corn meal

229
 Tableau 5 : Réglementations pour l’OTA par pays et par produits (Textes officiels et
propositions) (Canet, 1999)

OTA
Pays Produit Réf
(µg/kg)
5 Autriche Blé, seigle CE., 2006
50 Brésil Riz, orge, haricots, maïs CE., 2006
5 Céréales USDA., 2010
Chine
5 Légumineuses
25 Danemark Rognons de porc CE., 2006
Danemark Céréales (produits) CE., 2006

5 La FDA n'a pas établi de limite ou de seuil USDA., 2010

États-Unis d'intervention visant l'ochratoxine A dans aucun
produit.
5 France Céréales CE., 2006
20 Grèce Café (grains) CE., 2006

Duarte et al.,
5 Iran Blé
2010

Duarte, S. C., et
50 Israël Céréales (produits) Légumineuses (produits)
al., 2010

Rép.
20 Tous les aliments CE., 2006
Tchèque
Rép.
5 Aliments pour enfants CE., 2006
Tchèque

1 Rép.
1 Aliments pour nourrissons CE., 2006
Tchèque

5 Roumanie Tous les aliments CE., 2006

230
 Tableau 6 : Réglementations pour l’OTA par pays et par produits (Textes officiels et
propositions) (Canet, 1999) (suite).

OTA (µg/kg) Pays Produit Réf

2 Suisse Céréales (produits) Duarte et al., 2010

5 Produits alimentaires Duarte et al., 2010

5 Grain cru CE., 2006

Turquie Duarte et al., 2010
3 Aliments faits à partir de grains

50 Uruguay Riz, orge, haricots, café, maïs CE., 2006

5 CEE Céréales CE., 2006
3 CEE Céréales (produits) CE., 2006
10 CEE Raisins secs CE., 2006

Tableau 7 : Limite maximum de l’OTA des certains aliments (CE) n° 1881/2006.

15 μg/kg

2.2.11. Épices, y compris séchées Piper spp. (les fruits qui en proviennent, y compris 30μg/kg
le poivre blanc et le poivre noir) Myristica fragrans (noix de muscade) Zingiber jusqu’au
officinale (gingembre) Curcuma longa (safran des Indes) Capsicum spp. (fruits 31.12.2014
séchés, entiers ou en poudre, y compris les piments, la poudre de piment, le poivre de 15μg/kg à
Cayenne et le paprika) Mélanges d’épices contenant une des épices susmentionnées compter du
1.7.2015
15 μg/kg

231
Tableau 8 : la dose journalière admissible (DJA), aussi appelée dose journalière tolérable (DJT) (CE,
2006)

Voir Règlement (CE) n° 1881/2006 de la DJT : (Dose Journalière

Mycotoxines
Commission du 19 décembre 2006 Tolérable)
0,1 µg/kg pc /semaine
En µg/kg par kg de poids corporel par jour OTA Soit: 14,3 ng/kg p.c./j (JEFCA)
et 5 ng/kg p.c./j (SCF) *
OTA: Les doses tolérables ont été exprimées en dose/semaine car l’OTA est une toxine qui s’accumule dans
l’organisme.

(*) Le Comité scientifique pour les aliments (SCF) de la Commission européenne a réexaminé sa position et a
conclu qu’il serait prudent de réduire dans toute la mesure du possible l’exposition à l’OTA, en s'assurant qu’elle
se situe dans la partie basse de la fourchette des doses journalières tolérables de 1,2 à 14 ng/kg de poids corporel
qui ont été estimées par d’autres organismes, et qu’elle soit par exemple inférieure à 5 ng/kg de poids corporel
(FAO, 2001).La Communauté Européenne a fixé une limite de 5 ng/kg d’OTA dans les céréales brutes et 3
ng/kg dans les aliments transformés ou destinés à la consommation directe humaine.

232
 ANNEXE 4- PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DES AFs ET
DE L’OTA

Tableau 9 : Points de fusion et données spectrales des aflatoxines (El Khoury, 2007)

Absorption UV
en Solution
Formule Masse molaire Coefficient
Aflatoxines Point de fusion d’éthanol)
moléculaire moléculaire
d’extinction ε
λ max (nm)

268-269
(décomposition)
B1 C17H12O6 312 25600 ; 13400 ;
(cristallisation dans le 223 ; 265 ; 362
21800
Chloroforme)

287-289
(décomposition) 222 ; 265 ; 36317
(cristallisation dans un 000 ;
B2 C17H14O6 314 -
mélange de 11 700 ; 23 400
chloroforme et de
pentane)
244-246
(décomposition)

G1 C17H12O7 328 (cristallisation dans un 243 ; 257 ; 264 ; 11500 ; 9900 ;

362 10000 ; 16100
mélange de
chloroforme et de
méthanol)
237-239
(décomposition)
28100 ; 11600 ;
G2 C17H14O7 330 (cristallisation en 214 ; 265 ; 363
21000
Solution d’acétate
d’éthyle)

299 (décomposition)
23100 ; 11600 ;
M1 C17H12O7 328 (cristallisation en 226 ; 265 ; 357
19000
solution de méthanol)

M2 C17H14O7 330 293 - -

B2A C17H14O7 330 240 - -

G2A C17H14O8 346 190 - -

233
Tableau 10 : Caractéristiques Spectrales de l’ochratoxine A (El Khoury, 2007 ; Hadjeba-
Medjdoub, 2012)

Ochratoxines Formule moléculaire Masse molaire moléculaire Coefficient

Absorbance UV (nm) d’extinction ε
OTA C20H18ClNO6 403,8 330 5500
OTB C20H19NO6 369,3 321 5490

Tableau 10 : Autres caractéristiques Spectrales de l’ochratoxine A (El Khoury, 2010)

References
Spectral Solvents Characteristics

Le spectre
d’absorption
λmax = 213nm (ε36.800) varie
UV-VIS EtOH (Miller, 1992)
λmax = 332nm (ε 6.400) avec le pH et la
polarité du
solvant

Fluorescence EtOH λmax = 467nm

96% (Miller, 1992)
λmax = 428nm
EtOH
/ABS.

IR CHCl3 3380; 2988; 1723; 1674; 1528;

1425; 1381; 1304; 1260; 1170; (Steyn, 1984)
1140; 1107; 827 cm-1

δ 12,70; δ 10,80; δ 8,55

(3H); δ 7,23; δ 7,15 (De Jesus et al.
NMR1 1980; Lillehoj,
CDCl3 (H Aromatic); δ 4,71; δ 5,07 1980)
H250-MHZ
(CH); δ 2,78; δ 3,2 (CH2); δ
1,55 (CH3)
m/z 239/241 Lillehoj and
- m/z 255/257 Goransson. 1980
MS -
molecular ion m/z 403

234
 Tableau 11 : Ochratoxine A, derive métabolique (El Khoury, 2010).

Nom R1 R2 R3 R4 R5
Natural ochratoxins
Cl
Ochratoxin A Phenylalanine H H H

Ochratoxin B Phenylalanine H H H H
Ochratoxin C Ethyl-ester, phenylalanine Cl H H H
Ochratoxin A Methyl-ester Methyl-ester, phenylalanine Cl H H H
Ochratoxin B Methyl-ester Methyl-ester, phenylalanine H H H H
Ethyl-ester Ethyl-ester, phenylalanine
Ochratoxin B H H H H

Ochratoxin α OH Cl H H H
Ochratoxin β OH H H H H
H
4-R-Hydroxyochratixn A Phenylalanine Cl H OH

4-s-Hydroxyochratoxin A Phenylalanine Cl OH H H
10-Hydroxyochratoxin A Phenylalanine Cl H H OH
Tyrosine analog of OTA Tyrosine Cl H H H
Serine analog of OTA Serine Cl H H H
Hydroxyproline analog of
OTA Hydroxyproline Cl H H H

Lysine analog of OTA Lysine Cl H H H

Synthetic ochratoxins

d-Ochratoxin A d-phenylalanine Cl H H H
Ochratoxin A Ethyl amid Ethyl amid, phenylalanine Cl H H H
Phenylalanine, OHCH3 on
O-methyl Ochratoxin A Cl H H H
C-8

235
 ANNEXE 5- BIOSYNTHÈSE DES AFLATOXINES ET DE
L’OCHRATOXINE.

Figure 1 : Voies de biosynthèses des aflatoxines (Sweeney et al., 1998).

Les enzymes impliqués sont : (a) synthétase d'acide gras, (b) synthétase de polycétide, (c) réductase d’acide norsolorininc, (d)
réductase d'acétate d'hémiacétal de versiconal, (e) estérase, (f) synthétase du versicolorin B, (f) cyclase de versiconyl, (g)
désaturase, (h) 1,2 O-methyltransferase (MT-II), (i) Omethyltransferase, (j) O-methyltransferase (MT-I) (Sweeney et al.,
1998)

236
 AcetylCoA + Malonate
Polyketide synthase

Polyketid

Mellein

Shikimik acid

Ochratoxin β

Ochratoxin α

Esterification

+
Peptide
synthase

Ochratoxin A ethylester
Esterase

Ochratoxin A
Figure 2 : Représentation scématique de la voie hypotétique de biosynthèse de l’OTA (Huff et Hamilton, 1979)

237
 ANNEXE 6- ALIMENTS, CONTAMINANTS FONGIQUES et
MOYENS DE LUTTE CONTRE LES MYCOTOXINES

Tableau 12 : Exemple de produits contaminés par des moisissures toxinogènes (Pfohl-

Leszkowicz, 1999).

Espèces toxinogènes
Denrées contaminantes Mycotoxines probables

Aspergillus flavus, A. ochraceus, Aflatoxines, ochratoxine,

A.versicolor, Penicillium citrinum, stérigmatocystine, acide
Blé, farine, pain,
P.citreoviiride, P.cyclopium, pénicillique, patuline,
maïs, chips
P.martensii, P.patulum, P.pubertum désoxynivalénol, zéaralénone,
Fusarium moniliforme. fumonisine.
Aflatoxines, ochratoxine,
A. flavus, A.ochraceus, A.vericolor
Arachide, noix stérigmatocystine, trichothécènes,
P.citrinum, P.cyclopium, P.expansum
cytochalasines, patuline.
Tourte à la viande,
Aflatoxines, stérigmatocystine,
viande cuite, A.flavus, P.viridicatum, P.roqueforti,
ochratoxine, patuline, acide
fromage, cacao, P.patulum, P.commune
pénicillique
houblon
Aflatoxines, ochratoxine,
Viandes, porc salé, A. flavus, A.ochraceus, A.versicolor,
stérigmatocystine, patuline, acide
P. viridicatum, P.cyclopium.
pénicillique, pénitrem
Poivre noir et
A. flavus, A.ochraceus Aflatoxines, ochratoxine
rouge, pâtes
A. flavus, A.ochraceus, A.versicolor, Aflatoxines, ochratoxine,
Fèves, orge, , Alternaria, F. moniliforme, P. stérigmatocystine, alternariol,
sorgho, soja cyclopium, P.viridicatum, P.citrinum, griséofulvine, acide pénicillique,
P.expansum,P. islandicum, P.urticae citrinine, patuline
A. flavus, A.versicolor, P. viridicatum, Aflatoxines, stérigmatocystine,
Pâtisserie
P.cyclopium, P.citrinum, P.martensii, ochratoxine, patuline,
réfrigérée ou
P.citreoviride, P.palitans, acide pénicillique, citrinine,
congelée
P.puberulum, P.roquefort, P.urticae penitrem
Denrée alimentaire Aflatoxine, acide kojique,
(stockage Penicillium, Aspergillus, F. oxysporum ochratoxine, pénitrem, patuline,
domestique) acide pénicillique, trichothécènes
Pomme et produits
P. expansum Patuline
dérivés de pomme

238
 Tableau 13 : Microorganismes capables de dégrader ochratoxine A

Microbes or enzymes. Références.

Rumen microbes (surtout la fraction protozoaire). Hult et al., 1976 ; Galtier etAlvinerie, 1976 ;
Kiessling et al., 1984; Akiyama, 1997.

Butyrivibrio fibrisolvens. Westlake et al., 1987.

Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium sp, Hwang et Draughon, 1994 ; Skrinjar et al.,

Acenetobacter calcoaceticus. 1996.

Phenylobacterium sp. Wegst and Lingens, 1983.

Aspergillus niger, A. fumigatus, A. japonicus. Varga al., 2000.

A. wentii, A. ochraceus, A. versicolor, A. niger. Abrunhosa et al., 2002

A. niger (lipase). Stander et al., 2000.

Pleurotus ostreatus. Engelhardt, 2002.

Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus sp, Böhm et al., 2000.

Bacillus subtilis, B. licheniformis.

Rhizopus sp. (plus de 65% en 16 jours) Varga et al., 2005.

R. stolonifer, R. microsporus, R. homothallicus,

R. oryzae.

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Piotrowska et Zakowska, 2000.

Lactobacillus sanfransisco, Saccharomyces

Cerevisiae.

Pseudotaphrina kochii (microflore d’un Shen et Dowd, 1991.

invertébré: colioptère).

Carboxypeptidase A. Deberghes et al., 1995 ; Stander et al., 2001.

239
 Tableau 14 : Microorganismes capables de biotransformer les Aflatoxines

Microbes or enzymes. Références.

bactéries du sol (Flavobacterium aurantiacum, Mycobacterium Wu et al., 2009

fluoranthenivorans)

microbiote du rumen (Eubacterium souche BBSH 797) Wu et al., 2009

le protozoaire Tetrahymena pyriformis Molnar et al., 2004

souches d’A. flavus non toxicogène Molnar et al., 2004

La levure Trichosporon mycotoxinivorans isolée de l’intestin de termite Molnar et al., 2004

Nocardia corynebacteroides Tejada-Castaneda et

al., 2008)

240
 ANNEXE 7- ÉTUDE RÉTROSPECTIVE (1992-2006) DES
CANCERS AU NIGER

Tableau 15 : Fréquence et pourcentage des cas de cancer et décès enregistrés au niveau du registre du cancer
du Niger (Garba, 2014).

Nombre Pourcentage Nombre de Pourcentage

de cas (%) Décès (%)
Cancer du sein 1161 16,5 104 11,6
Cancer du foie 797 11,3 293 32,6
Cancer du col de l’utérus 551 7,8 41 4,6
Cancer de la peau 394 5,6 16 1,8
Cancer de l’ovaire 351 5 40 4,4
Cancer des os 303 4,3 28 3,1
Cancer colorectal 274 3,9 27 3,0
LMNH* 272 3,9 17 1,9
Leucémie 244 3,5 33 3,7
Cancer de l’abdomen 221 3,1 61 6,8
Cancer de la vessie et de l’urètre 220 3,1 42 4,7
Cancer du corps utérin 214 3 18 2,0
Cancer de l’estomac 161 2,3 27 3
Cancer de la cavité buccale 148 2,1 2 0,2
Cancer de l’œil 142 2 4 0,4
Cancer des tissus mous 138 2 10 1,1
Cancer de la prostate 132 1,9 7 0,8
Cancer des membres sup*et inf.* 121 1,7 8 0,9
Cancer du rein et uretère 94 1, 3 14 1,6
Cancer de la thyroïde 93 1,3 2 1,1
Cancer de la tête de la face et du cou SAI* 92 1,3 5 0,
Cancer des sites primitifs inconnus 80 1,1 8
Cancer du pancréas 79 1,1 14
Autre LMNH : Lymphome de Burkitt 78 1,1 10
Cancer de l’anus 61 0,9 3

241
 Tableau 16 : Fréquence et pourcentage des cas de cancer et décès enregistrés au niveau du registre du
cancer du Niger (suit) (Garba, 2014)..

Nombre Pourcentage Nombre de Pourcentage

de cas (%) Décès (%)

Cancer du poumon 60 0,9 22

Lymphome de Hodgkin 59 0,8 1

Mélanome malin 57 0,8 0

Cancer des ganglions 57 0,8 4

Cancer de la vulve et du vagin 46 0,7 4

Cancer du larynx et glotte 44 0,6 2

Cancer du cerveau et du SN 43 0,6 9

Cancer du pénis et testicule 42 0,6 3

Cancer de l’œsophage 40 0,6 7

Cancer du nez, du sinus et oreille moyenne 32 0,5 0

Sarcome de kaposi 30 0,4 0

Cancer du nasopharynx et pharynx 26 0,4 1

Cancer de l’intestin grêle et tractus gastro-

24 0,3 5
intestinal

Cancer de la vésicule biliaire 15 0,2 3

Cancer du thorax 14 0,2 1

Cancer du placenta 6 0,1 1

Autre cancer 15 0,21 2

Total 7031 100 899

LMNH* : lymphomes malins non hodgkiniens

242
 ANNEXE 8- MÉTHODES D’ANALYSES

Tableau 17 : Méthodes d’analyses des aflatoxines (Dors et al., 2011)

Aflatoxines Matrice Preparation échantillon Clean-up Effet Matrice Detection LOQ R% References
(poids échantillon, type et
volume du solvent
d’extraction)
Aflatoxin totale Maïs 20 g Dilution de 10 à large- 5 µg kg-1 86-100 Acharya &
spécifique, non
AFB1, 100 mL MeOH:H2O Pour éliminer (LOD) Dhar, 2008
compétitif,
les interferents
AFB2, (70:30, v/v)
immunologique
matrice
AFG1,
AFG2

AFB1, Nourriture Formule Cereales nourisson - Colonne Nettoyer, UHPLC-ESI- 0.003 - 79 - 112 Beltrán et al.,
pour bébé et immunoaffinité éliminer l’effet
AFB2 5 g ; 20 mL ACN:H2O MS/MS 0.025 µg 2011
lait matrice.
AFG1, (80:20, v/v) kg-1
AFG2 Liquid samples - 8 g
AFM1 32 mL CAN
AFB1, Cereales 1g bain à ultrasons LC-APPI- 0.1 – 0.5 86-104 Capriotti et al.,
AFB2 Blé et 6 mL MS/MS µg kg-1 2010
échantillons
AFG1, CH3COCH3:H2O:CH3COOH
de maïs
AFG2 (80:19:1, v/v/v) bain à ultrasons
AFM1 (20 min)

243
 Tableau 18 : Méthodes d’analyses des aflatoxines (suite) (Dors et al., 2011)

Aflatoxines Matrice Preparation échantillon Clean-up Effet Matrice Detection LOQ R% References
(poids échantillon, type et
volume du solvent
d’extraction)
AFB1, Maïs, blé, QuEChERS - 5 g étape de addition LC-ESI-MS/MS 1.0 – 2.0 QuEChERS Desmarchelier
seigle, riz, dégraissage avec Standard
AFB2 10 mL ACN 0.5% CH3COOH µg kg-1 89-116 ASE et al., 2010
avoine, orge, n-hexane
AFG1, soja, et ASE - 5 g 67-107
AFG2 cereals pour ACN:H2O:CH3COOH
nourrisson
(80:19:0.5, v/v/v)
AFB1, Maize, noix, 5g UHPLC- Matrix-marched 0.03-3.5 µg 71.3-104-7 Frenich et al.,
Biscuits,
AFB2 10 mL ACN:H2O MS/MS Étalonnage kg-1 2009
Cereales pour
AFG1, petit déjeuner (80:20, v/v)
AFG2 Échantillon de biscuit - 20 mL
AFM1 ACN:H2O (80:20, v/v) -
AFB1, Arachides 25 g Colonne HPLC-UV-FLD 0.1-3.5 65-90 Gonçalez et al.,
immunoaffinité
AFB2 5 g NaCl ng mL-1 2008
AFG1, 125 mL MeOH:H20
AFG2 (7:3 v/v)

244
 Tableau 19 : Méthodes d’analyses des aflatoxines (suite) (Dors et al., 2011)

Aflatoxines Matrice Preparation échantillon Clean-up Effet Matrice Detection LOQ R% References
(poids échantillon, type et
volume du solvent d’extraction)
Aflatoxin totale Maïs, 25 g Colonne - UPLC-UV 0.63-1.07 83.4-94.7 Fu et al., 2008
mmunoafinnité
AFB1, arachides 80 mL ACN:H2O µg kg-1
AFB2, (84:16, v/v)
AFG1,
AFG2
AFB1, Sorgho, 10 g Colonne - HPLC-FLD 0.08-0.16 68.3-87.7 Ghali et al.,
mmunoafinnité
AFB2 Pistaches 40 mL MeOH: H2O µg kg-1 2009
AFG1, (80:20, v/v)
AFG2 1 g NaCl
AFM1 20 mL n-hexane
AFB1, Arachide, 5 g 10 mL MeOH:H20 Diluetion de 10 Adsorption 0.1-0.115 Hajian &
pour éviter les décapage
AFB2 (80:20, v/v) ng mL-1 Ensafi, 2009
interférences voltamétrie
(LOD)
5 mL hexane

245
 Tableau 18 : Méthodes d’analyses des aflatoxines (suite) (Dors et al., 2011)

Aflatoxines Matrice Preparation échantillon Clean-up Effet Matrice Detection LOQ R% References
(poids échantillon, type et
volume du solvent d’extraction)
AFB1, Farine de 50 g Colonne -LC- FLD 0.01 – >65% Zinedine et al.,
blé, farine immunoaffinité 0.01
AFB2 250 mL MeOH:H20 2007
de maïs,
µg kg-1
AFG1, aliments (80:20, v/v)

AFG2 de
devolailles

AFB1, Cereales MSPD (1 g C18) 1 g Matrix- LC-ESI- 1 µg kg-1 64-91 Rubert et al.,
MS/MS
AFB2 10 mL CAN matched 2010

AFG1, calibration

AFG2

246