MODIFICAREA GENETICĂ A TOLERANŢEI LA STRESUL ABIOTIC

Importanţa caracterului vizat de MG

Stresul abiotic este unul dintre factorii de mediu care limitează producţia agricolă. Din
această cauză, unul dintre obiectivele majore ale ameliorării plantelor este obţinerea unor
cultivare tolerante la stress: temperaturi înalte, înregistrate pe fondul încălzirii globale, secetă,
datorată diminuării resurselor hidrice, aciditate şi/sau salinitatea excesivã a solului. Crearea şi
cultivarea unor plante tolerante la stress ar permite extinderea culturilor prin introducerea în
circuitul agricol a unor terenuri, în prezent, improprii pentru agricultură şi nu prin defrişarea
pădurilor, plămânii planetei şi habitatele a milioane de specii.
Constrângerile impuse de mediu plantelor asociază, cel mai adesea, mai multe tipuri de stres. De
exemplu, salinitatea provoacã un stres ionic (datorat toxicităţii ionilor de Na + şi Cl-) şi unul osmotic.
Seceta generează, concomitent, un stres termic şi unul hidric. Cel de al doilea antrenând şi
fenomene de stres ionic. Seceta, salinitatea, temperaturile ridicate şi cele scãzute determină un
deficit de apă în celule. În decursul evoluţiei lor, plantele au elaborat diferite mecanisme care le
protejazã de stresul abiotic generat de secetă, de salinitate, de temperaturile înalte sau de cele
scăzute Chiar de îngheţ.

Strategiile aplicate
Pentru a manipula genetic capacitatea plantelor cultivate de a tolera stresul abiotic, trebuie
parcurse câteva etape:
• elucidarea bazelor moleculare ale mecanismelor de toleranţă;
• izolarea genelor implicate;
• realizarea unor construcţii care asigură atât exprimarea la nivel înalt a acestor gene, cât şi
orientarea proteinelor pe care ele le codifică spre destinaţiile corecte.
1.Seceta, temperaturile scăzute şi mari, salinitatea, poluarea chimică perturbă homeostazia
osmotică şi ionică; afectează structural şi funcţional proteinele şi membranele.
2. Semnalele sunt receptate şi transmise.
3. Factorii de transcripţie activează genele care sunt implicate în mecanismele prin care plantele
reacţionează la stress: detoxificare (superoxid dismutazele), osmoprotecţie (glicin betaina,
prolina, zaharuri), transportul apei şi ionilor (pompe ionice).
4. Se restabileşte homeostazia la nivelul celular şi sunt protejate structurile şi funcţiile
proteinelor şi membranelor. Plantele devin tolerante sau rezistente la stres.

1
 1. MODIFICAREA TOLERANŢEI LA STRESUL OXIDATIV
1.1. Importanţa caracterului vizat de MG
Stresul oxidativ:
Stresul abiotic - seceta, salinitatea, temperatura extremă, lumina puternică, interacţiunea
radiaţiilor ionizante cu moleculele biologice - determină formarea unui exces de specii reactive de
oxygen: radicalul anion superoxid (–O2 – ), peroxidul de hidrogen (H 2O2), şi radicalii hidroxid (–OH),
care se formează prin reducerea incompletă a oxigenului şi sunt subproduse ale proceselor
metabolice normale din cellule. Aceste specii de oxigen au o viaţă relativ scurtă, dar fiind extrem
de reactive, reacţionează cu cea mai mare parte a constituenţilor celulari. Mai precis, cu acizii
nucleici, cu proteinele, cu lipidele din diferite membrane celulare, mai ales mitocondriale (expuse
direct anionilor superoxid produşi în cursul respiraţiei celulare) şi cu polizaharidele. De cele mai
multe ori, acţiunea lor induce modificãri ireversibile. De aceea plantele şi-au “creat” mecanisme de
eliminare a acestora. In prima linie de apărare faţă de stressul oxidativ se află enzimele
antioxidante, superoxid dismutazele (SOD) ascorbat peroxidazele (APX), peroxidazele (POD),
catalazele şi molecule antioxidante cu greutate moleculară mică (vitamina E, acidul ascorbic,
glutathionul).

2
Speciile reactive de oxigen sunt:
● molecule, cum este peroxidul de hidrogen (5);
● ioni, cum este ionul hipoclorit (6);
● radicali, cum este radicalul hidroxil (3); este diferit de ionul hidroxil (4);
● anionul superoxid (2), care este atît ion cât şi radical;
Un radical (denumit şi „radical liber”) este un grup de atomi dintre care unul conţine, pe ultima
orbită, un electron ne împerechat (arătat în roşu). Această configuraţie este extrem de instabilă,
radicalii reacţionând rapid cu alte molecule sau radicali pentru realizarea unei configuraţii stabile
de patru perechi de electroni pe ultima orbita (o pereche, pentru hidrogen).

La plante, enzimele SOD sunt localizate în diferite compartimente celulare. SOD care are cofactor
Mn este prezentă în mitocondrii şi peroxizomi. Fe-SOD se găseşte în cloroplaste, dar a fost
detectată şi în peroxizomi. CuZn-SOD a fost localizată în citosol, cloroplaste, peroxizomi şi
apoplast.
Superoxid dismutazele (SOD) convertesc 2 anioni superoxid într-o moleculă de peroxid de hidrogen.

3
1.2.Strategii aplicate:
● supraexpresia genelor care codifică enzimele/proteinele antioxidante;
● transferul, în nucleu şi/ sau în cloroplaste, şi expresia simultană a două sau trei gene care
codifică enzime antioxidante;
● supraexpresia unor gene mutante, care codifică enzime antioxidante, insensibile la reglarea
posttranscripţională prin intermediul ARN micro.

1.3. Exemple
Supraexpresia genelor de la mazăre, care codifică enzima superoxid dismutaza (Cu-ZnSOD)
ce converteşte radicalii superoxide foarte toxici în peroxid de hidrogen (H2O2) şi oxigen molecular,
a conferit plantelor transgenice de tutun toleranţă nu numai la stresul oxidativ ci şi la stressul
asociat temperaturilor scăzute şi luminii puternice.
Au fost obţinute plante transgenice de cartof dulce (Ipomoea batatas) cu toleranţă
crescută la factori multipli de stress de mediu, care exprimau în cloroplaste genele pentru CuZn
superoxid dismutaza (CuZnSOD) si ascorbat peroxidaza- APX (APX reduce peroxidul de hidrogen la
apă prin utilizarea ascorbatului ca donor de electroni) sub controlul promotorului SWPA2 indus de
stressul oxidativ. Rezultatele au aratat că sinteza simultană a trei enzime antioxidante în
cloroplaste a conferit plantelor transgenice o toleranţă mult mai mare la stresuri multiple decât
atunci când plantele au sintetizat câte 1 sau câte 2 enzime.
1.4. Stadiul actual: testare

2. MODIFICAREA TOLERANŢEI LA SALINITATE

2.1. Importanţa caracterului vizat de MG

4
Stresul salin
Salinitatea solului supune plantele atât unui stres ionic, cât şi unui stres osmotic. Pentru că reduce
capacitatea plantelor de a absorbi apa, determină o diminuare severă a ratei de creştere şi o serie
de alterări metabolice specifice stresului hidric. Răspunsul la stresul salin se manifestă atât la nivel
celular şi tisular, cât şi la nivelul întregii plante. Deoarece celulele se specializează în cursul
ontogeniei, mecanismele care determinã toleranţa la stresul salin sunt diferite. În plus,
mecanismele toleranţei la sare pot fi diferite chiar şi în cursul ontogeniei plantelor. La nivel celular,
toleranţa la sare este determinată de mecanisme prin care se restabileşte homeostazia ionilor, se
induce sinteza osmoprotectorilor, se asigurã captarea radicalilor toxici şi creşte conţinutul de acid
abscisic (ABA).
Restabilirea homeostaziei ionilor. Concentraţia mare a sării în soluţia din exteriorul celulelor are
mai multe consecinţe negative. În primul rând, perturbă homeostazia ionilor. Rezultă un exces de
ioni toxici de sodiu (Na+) în citoplasmă şi un deficit de ioni esenţiali ca, de exemplu, ionul de
potasiu (K+). În consecinţă, supravieţuirea şi creşterea plantei depind de adaptări care, restabilind
homeostazia ionilor, reduc durata expunerii celulelor la dezechilibrul ionic. Celulele plantelor
rãspund la acest dezechilibru prin creşterea efluxului ionilor de Na + la nivelul membranei
plasmatice şi acumularea lor în vacuolã. Proteinele implicate în aceste procese şi, implicit, genele
care le codifică pot fi deci considerate determinanţi ai toleranţei la concentraţiile mari de sare din
sol. Perturbarea preluării ionilor de K +, principalul cation anorganic pentru cele mai multe plante
terestre, în condiţiile unei concentraţii mari de Na + în exteriorul celulelor se datoreazã asemănării
dintre aceşti doi ioni. Prin urmare, şi sistemele de transport al ionilor care sunt mai selective faţă
de ionul K+ decât faţă de ionul Na+ pot fi considerate determinanţi ai toleranţei la concentraţiile
mari de sare din sol. Există mai mulţi transportori de ioni care controlează intrarea şi ieşirea ionilor
Na+ în/din celule, compartimentarea acestor ioni în vacuole şi importul selectiv al ionilor K+.
Sinteza osmoprotectorilor. Concentraţiile mari de sare induc un şoc osmotic printr-o diminuare a
activităţii chimice a apei ce determină pierderea turgescenţei. Acest efect negativ este similar celui
determinat de secetă. Plantele răspund la stresul osmotic prin sinteza şi acumularea în celule a
unor compuşi care, chiar în concentraţii foarte mari, nu sunt toxici. Compuşi numiţi osmoliţi,
osmoprotectori sau substanţe solubile compatibile.
Enzimele şi, implicit, genele care condiţionează sinteza compuşilor cu rol osmoprotector se
înscriu deci, şi ele, printre determinanţii toleranţei la sare.
Osmoprotectorii sunt:
• zaharurile (trehaloza, fructanul) şi zaharurile alcooli (manitolul, sorbitolul, pinitolul);
• aminoacizii (prolina) sau derivaţii unor aminoacizi (glicin betaina).

5
Toţi aceşti compuşi acţionează prin stabilizarea atât a membranelor, cât şi a structurilor
cuaternare ale enzimelor şi proteinelor complexe. În condiţii normale, proteinele sunt înconjurate
de molecule de apă, care le stabilizează structura şi împiedică interacţiunile cu soluţii polari. Când
însă în celule creşte concentraţia ionilor, proteinele sunt denaturate. Mai precis, ionii trec prin
stratul de apã şi interferează cu legăturile covalente care contribuie la stabilitatea proteinelor. Or,
concentraţii echivalente ale unor substanţe solubile compatibile menţin intact stratul de apă şi
împiedicã denaturarea proteinelor. În plus, datorită capacităţii lor de a capta radicalii liberi,
aceleaşi substanţe solubile compatibile previn şi efectele stresului oxidativ.
Supuse stresului osmotic, diversele specii sintetizează diferite substanţe solubile compatibile. De
exemplu, drojdiile acumuleazã în concentraţii mari trehaloza. Cu excepţia speciilor foarte
rezistente la deshidratare, plantele nu acumulează însă acest zahăr la cote detectabile. În condiţii
de stres salin, ţelina acumulează manitol, iar spanacul-glicin betaină. Dar există şi specii de plante
care, în aceleaşi condiţii de stres, nu sintetizeazã nici una dintre moleculele osmoprotectoare în
cantităţi semnificative.

2.2. Strategii aplicate

Expresia şi /sau supraexpresia genelor implicate în:

● sinteza substanţelor osmoprotectoare;
● restabilirea homeostaziei ionilor;
● sinteza factorilor de transcripţie a căror activitate este indusă de stresul salin.

2.3. Exemple

Sinteza osmoprotectorilor. Glicin betaina, compus cuaternar al amoniului care se acumulează în

multe plante ca raspuns la stress, protejează celulele prin menţinerea echilibrului osmotic şi prin
stabilizarea structurii cuaternare a complexelor proteice. Se găseste în mod natural în unele plante
cultivate – sfecla de zahar şi bumbacul -, ca şi în plante spontane tolerante la sare şi secetă,
inclusiv halofite. Multe plante de cultură nu conţin însă cantităţi semnificative de glicinbetaină sau
alţi ormoprotectori. Modificarea genetică a osmotoleranţei plantelor ar putea să fie obţinută prin
sinteza betainei în nonacumulatori. Supraexpresia genei ce codifică o enzimă implicată în sinteza
glicinbetainei, transferată în genomul cloroplastelor, a mărit semnificativ toleranţa plantelor la
sare. Liniile transgenice de morcov au crescut pe 400 mM NaCl, concentratie pe care numai
halofitele pot să o suporte.

6
Homeostazia Na+ în citosol este menţinută cu ajutorul pompelor, proteine localizate în membrana
vacuolelor. Pompele de protoni generează energia necesară „pompării” ionilor de Na + în vacuole,
de către pompele antiporter Na+/H+.

Modelul pompelor de H şi transportorilor din membranele vacuolare. A, H-ATPaze (1) şi

pirofosfataze (H-Ppaze) (2) transportă protoni (H) în vacuolă. Anionii organici şi anorganici (A)
intră în vacuole via canale (4) realizând electroneutralitatea şi generarea unui gradient de pH.
Acest gradient electrochimic de protoni (PEG) asigură acumularea secundară activă a cationilor
organici şi anorganici în vacuole via antiporterii H/cationi (3), acompaniată de intrarea apei prin
osmoză.

Plantele transgenice care supraexprimă genele ce codifică pompele antiporter Cation/H (3) în
membrana vacuolară vor pompa cantităţi mai mari de cationi prin utilizarea gradientului
electrochimic de protoni generat de pompele de protoni (1 şi 2).

Pirofosfataza vacuolară H+-PPase este o subunitate proteică localizată în membrana vacuolară,

care pompeaza H+ din citoplasmă în vacuolă cu activitatea de transport H + independentă de PP.
Teoretic, supraexpresia genelor ce codifică H +-PPase ar trebui să marească capacitatea de a forma
gradientul de pH dintre citoplasmă şi vacuole, rezultând o cantitate mai mare de energie ce poate
fi folosită de transportorii secundari (Na+/H+ antiporter, Ca2+/H+ antiporter). Acumularea
cationilor în vacuole ca, de exemplu, Na +, ar mari presiunea osmotică, reducându-se efectele toxice
ale acestor cationi.
Genele care codifică proteinele care pompează ionii de Na în vacuole, pompele antiporter
Na+/H+, au fost isolate la mai multe specii de plante, inclusiv la Arabidopsis thaliana, Oryza
sativa, Atriplex gmelili, Brassica napus, Beta vulgaris, Gossypium hirsutum, şi Hordeum vulgare.
Aceste proteine sunt omoloage şi au o funcţie similară.
Gena AtNHX1, care codifică pompa antiporter la Arabidopsis thaliana a fost supraexprimată la mai
multe specii de dicotiledonate (Arabidopsis, Lycopersion esculentum şi Brassica napus) şi de
monocotiledonate (grâu, porumb). Plantele transgenice au manifestat o mare toleranţă la sare,
crescând normal şi producând fructe şi seminţe în condiţii de salinitate crescută (200 mM NaCl).

7
 Plantele transgenice de Brassica juncea care supraexprimau gena ce codifică pompa
antiporter de la Pennisetum glaucum (PgNHX1) au înflorit şi fructificat normal atunci când au fost
crescute pe 300 mM NaCl.
Plantele transgenice de tomate care supraexprimau gena pentru pirofosfataza de la
Arabidopsis ((AVP1) au transportat mai mult Na + în vacuolele rădăcinilor, au avut un sistem
radicular mai dezvoltat, o capacitate mai mare de recuperare după o perioada de deficit hidric în
sol deoarece absoarbeau mai multă apă în timpul stresului hidric.
2.4 Stadiul actual: testare