Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iaşi – 2011 – vol. 115, nr.

FARMACIE ARTICOLE ORIGINALE

VALIDAREA UNEI METODE HPLC PENTRU DETERMINAREA

OCHRATOXINEI A

Delia Bulea1, A. F. Şpac2 , V. Dorneanu 3

Universitatea de Medicină şi Farmacie Gr.T.Popa Iaşi
Facultatea de Farmacie
1. Disciplina Farmacodinamie
2. Disciplina Chimie-fizică
3. Disciplina Chimie analitică

VALIDATION OF A HPLC METHOD FOR OCHRATOXIN A DETERMINATION (Abs-

tract): Ochratoxin A is a mycotoxin produced by various species of Aspergillus and Penicil-
lium. Ochratoxin A has been detected in cereals and cereal products, coffee beans, beer,
wine, spices, pig‫ۥ‬s kidney and cow‫ۥ‬s milk. For ochratoxin A, a HPLC method was developed
and validated. Ochratoxin A was determined by RP-HPLC, using a liquid chromatograph
type HP 1090 Series II, equiped with a fluorescence detector. The analysis was performed
with a Phenomenex column, type Luna C18(2) 100A (150 x 4,6 mm; 5μm) with a mobile
phase consisting of a mixture of acetonitrile/water/acid acetic (99/99/2), a flow of 0,7
mL/min. For detection, the wavelenght of excitation was 228 nm and wavelenght of emision
was 423 nm. The calibration graph was linear in 6,25-50 ng/mL concentration range (r 2 =
0,9991). The detection limits was 1,6 ng/mL and the quantification limit was 4,9 ng/mL. The
method precision (RSD = 2,4975 %) and the accuracy (recovery was 100,1 %) were studied.
The HPLC method was applyed for ochratoxin A from food samples with good results. Key
words: OCHRATOXIN A, VALIDATION, HPLC

Ochratoxina A este o micotoxină elabo- MATERIAL ŞI METODĂ

rată de specii de Aspergillus în zonele calde
şi în cele tropicale şi de specii de Penicil-
lium în zonele cu climă temperată (1).
Ochratoxina A a fost detectată în cereale şi
derivate, cafea, bere, vin, condimente şi în
produse de origine animală - rinichi de porc
şi lapte de vacă. Pentru determinarea ochra-
toxinei A a fost dezvoltată şi validată o
metodă de analiză prin cromatografie de
lichide de înaltă performanţă (HPLC), me-
todă utilizată la determinarea ochratoxinei
A din probe de produse alimentare.
 Ochratoxina A from Aspergillus
ochraceus (Sigma);
 Metanol Chromasolv ® min 99,9%
(Sigma-Aldrich) ;
 Acetonitril R Chromasolv ® min
99,8% (Riedel-de Haën);
 Acid acetic glacial 100% (Sigma-
Aldrich);
 Apă purificată (rezistivitate 18,2 MΩ);
 Balanţă analitică Adam;
 Filtre Millipore 45 μm;
 Cromatograf de lichide de înaltă per-
formanţă de tipul HP 1090 Series II

595
 Delia Bulea et al.
prevăzut cu detector de fluorescenţă
tip HP 1046 A;
 Coloană cromatografică Phenome-
nex Luna C18(2) 100A (150 x 4,6
mm, 5μm);
 Soluţie etalon stoc (40 μg/mL): 1 mg
ochratoxină A se dizolvă în metanol
şi se completează în balon cotat la
25 mL cu acelaşi solvent. Concen-
traţia soluţiei a fost verificată spec-
trofotometric (coeficientul molar de
extincţie în metanol al ochratoxinei
este de 6640 cm -1 mol-1 ).
 Soluţie etalon de lucru: din soluţia
stoc s-a preparat soluţia etalon de
lucru de concentraţie 0,8 μg/mL în
metanol. Din soluţia de lucru s-au
preparat prin diluţie cu metanol so-
luţii cu concentraţii cuprinse între
6,25 ng/mL şi 800 ng/mL.
Mod de lucru
În literatura de specialitate există nume-
roase metode de determinare a ochratoxinei
A prin metoda HPLC (2, 3, 4, 5). În cele ce
urmează ne-am propus elaborarea unei
metode simple şi rapide.
Determinările s-au realizat folosind ca
faza staţionară coloana cromatografică
Phenomenex Luna C18(2) (150 x 4,6 mm,
5μm), iar ca fază mobilă amestecul format
din CH3CN-H2 O-CH3 COOH (99:99:2,
v/v/v), debitul fazei mobile fiind de 0,7
mL/min; temperatura în compartimentul
coloanei a fost stabilită la 25°C. Detecţia s-
a realizat în fluorescenţă cu λem = 228 nm
şi λex = 423 nm. În vederea analizei, din
soluţiile de lucru obţinute prin diluţie în
metanol (6,25- 800 ng/mL) se injectează un
volum de 20 μL. Timpul necesar unei ana-
lize este de aproximativ 16 min. ţinând
cont că timpul de retenţie a ochratoxinei A
este Tr = 13±5 % minute.
596
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Pentru validarea metodei de analiză (6,
7, 8, 9) ne-am propus urmărirea următorilor
parametri: selectivitatea, specificitatea
metodei, determinarea liniarităţii, a limitei
de detecţie, a limitei de cuantificare, a
preciziei (precizia sistemului şi precizia
metodei) şi a exactităţii.
Selectivitatea
Pentru determinarea selectivităţii me-
todei s-a procedat astfel: din analiza croma-
togramelor soluţiilor de probă nu apar alte
picuri la acelaşi timp retenţie, iar rezoluţia
faţă de picurile adiacente este suficient de
mare.
Specificitatea
Pentru determinarea specificităţii me-
todei a fost analizat solventul utilizat la
prepararea soluţiilor standard şi a probelor.
La timpul de retenţie corespunzător ochra-
toxinei A nu s-au obţinut picuri interferente.
Liniaritatea
Pentru determinarea liniarităţii au fost
preparate soluţii de ochratoxină A în meta-
nol în modul descris, pe intervalul 6,25 -
800 ng/mL. Pentru fiecare concentraţie s-au
efectuat un număr de 3 determinări şi s-a
calculat valoarea medie a ariei picului co-
respunzător ochratoxinei A. Datele experi-
mentale obţinute sunt prezentate în tabelul I.
Valorile medii ale ariei picurilor au fost
reprezentate grafic în funcţie de concen-
traţie şi s-a calculat ecuaţia dreptei de re-
gresie (fig. 1).
Pe intervalul de concentraţie 6,25 - 800
ng/mL, variaţia ariei picului ochratoxinei A
este liniară (r 2 = 0,9991, unde r2 = coefi-
cient de regăsire), dar, având în vedere
faptul că intenţia este de a determina con-
centraţii cât mai mici de ochratoxină A din
probe, am calculat ecuaţia curbei de cali-
brare pe intervalul 6,25 - 50 ng/ mL.
 Validarea unei metode hplc pentru determinarea ochratoxinei A

TABELUL I
Date experimentale pentru determinarea liniarităţii metodei de determinare a ochratoxinei A
prin metoda HPLC
Arie pic
Conc (ng/mL)
I II III Medie
6,25 10,10 10,40 10,30 10,27
12,50 14,00 14,90 15,92 14,94
20,00 19,22 19,10 19,66 19,32
25,00 23,30 22,80 22,90 23,00
30,00 26,38 25,88 25,26 25,84
40,00 32,26 31,30 32,41 31,99
50,00 38,90 37,70 38,23 38,28
100,00 68,70 68,90 66,97 68,19
150,00 100,50 96,90 96,10 97,83
200,00 135,23 136,74 131,03 134,33
400,00 256,24 259,21 258,90 258,12
600,00 386,14 385,03 380,50 383,89
800,00 504,40 497,30 500,80 500,83

600
Arie pic = 0,6219 x Concentraţia + 7,1842
500 R2 = 0,9998
400
Arie pic

300
200
100
0
0 200 400 600 800 1000
Concentraţie (ng/mL)
Fig. 1. Dreapta de regresie la determinarea ochratoxinei A prin metoda HPLC

Prin prelucrarea statistică se obţine TABELUL II

ecuaţia dreptei de calibrare Arie pic = Evaluarea statistică a linearităţii
0,6339 x Concentraţia + 6,7353 (r 2 = Coeficient de regăsire (r 2) 0,9991
0,9991), dar şi eroarea standard a dreptei de Eroare standard (SE) 0,3123
regresie (SE = 0,3123). Rezultatele obţi- Intercept 6,7353
nute sunt prezentate în tabelul II. Panta 0,6339

597
 Delia Bulea et al.

Limita de detecţie şi limita de cuanti- TABELUL III

ficare Date experimentale referitoare
S-a calculat limita de detecţie (LD) şi la precizia sistemului
limita de cuantificare(LQ) utilizând relaţiile: Nr. det. Arie pic
1 22,71
3,3  SE 3,3  0,3123 2 23,22
LD    1,6ng / mL 3 22,90
Panta 0,6339
10  SE 10  0,3123 4 22,84
LQ    4,9ng / mL 5 22,83
Panta 0,6339
6 22,73
7 22,74
unde SE este eroarea standard a regre-
8 23,19
siei.
Precizia sistemului şi a metodei 9 23,30
În cadrul preciziei au fost studiate pre- 10 22,84
cizia sistemului pentru concentraţii de 25 Medie 22,93
ng/mL (pentru un număr de 10 determinări) SD 0,2212
şi precizia metodei pe un interval de 20 % RSD % 0,9645
faţă de concentraţia de interes (pentru un
număr de 3 determinări la 3 nivele de con- După prelucrarea statistică a datelor
centraţie). Folosind ecuaţia dreptei de cali- obţinute se observă că deviaţia standard
brare se calculează concentraţia pentru fie- relativă (RSD) are valoarea 0,9645 %,
care probă în parte şi procentul de regăsire. faţă de maximul de 2 % prevăzut de nor-
Datele experimentale obţinute sunt pre- mele europene, deci sistemul este precis
zentate în tab. III şi tab. IV. (10).

TABELUL IV
Date experimentale referitoare la precizia metodei de determinare a ochratoxinei A
prin metoda HPLC
Nr. Concentraţie teoretică Concentraţie calculată Regăsire
Arie
det. (ng / mL) (ng / mL) (%)
1 19,22 19,69 98,5
2 20 19,10 19,50 97,5
3 19,66 20,38 101,9
4 23,30 26,13 104,5
5 25 22,80 25,34 101,4
6 22,90 25,50 102,0
7 26,38 30,98 103,3
8 30 25,88 30,20 100,7
9 25,26 29,21 97,4
Medie 100,8 %
Date statistice SD 2,5174
RSD 2,4975 %

598
 Validarea unei metode hplc pentru determinarea ochratoxinei A

Din datele experimentale obţinute se concentraţii diferite, de 3 ori fiecare. Pen-

observă că metoda este precisă, deviaţia
standard relativă fiind RSD = 2,4975 %,
faţă de maximul de 5 % prevăzut de nor-
mele europene (10).
Exactitatea metodei
Pentru determinarea exactităţii metodei
pe un interval ± 20% faţă de concentraţia
de interes, au fost analizate 3 soluţii de
tru fiecare analiză a fost determinată aria
picului corespunzător ochratoxinei A şi s-
a calculat concentraţia folosind ecuaţia
curbei de calibrare. S-a calculat regăsirea
pentru fiecare probă în parte, valoarea
medie şi intervalul de regăsire. Datele
experimentale obţinute sunt prezentate în
tabelul V.

TABELUL V
Date experimentale referitoare la exactitatea metodei de determinare a ochratoxinei A
prin metoda HPLC
Nr. Concentraţie teoretică Concentraţie calculată Regăsire
Arie
det. (ng / mL) (ng / mL) (%)
1 19,35 19,90 99,49
2 20 19,18 19,63 98,15
3 19,70 20,45 102,25
4 22,76 25,28 101,11
5 25 23,07 25,77 103,06
6 22,97 25,61 102,43
7 25,21 29,14 97,14
8 30 25,61 29,77 99,24
9 25,32 29,31 97,71
Media 100,1 %
Date statistice Min 97,1 %
Max 103,1 %

Din datele experimentale obţinute se debit 0,7 mL/min, cu detecţie în fluores-

observă că regăsirea medie este de 100,1 %
pe intervalul 97,1-103,1 %, comparativ cu
o limită de ± 10% prevăzută de normele
europene, de unde rezultă că metoda este
exactă (10).
CONCLUZII
A fost elaborată şi validată o metodă
HPLC pentru detectarea ochratoxinei A.
Astfel, determinările se efectuează pe o
coloană Luna C18(2) 100A (150 x 4,6 mm,
5μm), cu o fază mobilă formată din
CH3 CN-H2 O-CH3 COOH (99:99:2, v/v/v),
cenţă (λem = 228 nm, λex = 423 nm). Me-
toda este liniară pe domeniul de concen-
traţii ales (6,25-50 ng/mL), ecuaţia dreptei
de regresie fiind Arie pic = 0,6339 x Con-
centraţia + 6,7353 (r 2 = 0,9991). Au fost
calculate limitele de detecţie (1,6 ng/mL) şi
de cuantificare (4,9 ng/mL). S-a studiat
precizia sistemului (RSD = 0,9645 %),
precizia metodei (RSD = 2,4975 %) şi
exactitatea (regăsirea medie = 100,1 %) pe
intervalul 97,1 -103,1 %.
Metoda a fost aplicată cu rezultate bune
pe probe de produse alimentare.

599
 Delia Bulea et al.

BIBLIOGRAFIE

1. Varga J, Rigó K, Téren J, Mesterházy Á, Recent Advance in Ochratoxin A Research I. Production,

Detection and Occurence of Ochratoxins. Cereal Res Commun 2001; 29: 85-92.
2. Vega M,, Munoz K,, Sepulveda C, Aranda M, Campos V, Villegas R, Villarroel O. Solid-phase ex-
traction and HPLC determination of Ochratoxin A in cereals products on Chilean market. Food Con-
trol 2009; 20 (7): 631-634.
3. Ghali R, Hmaissia-Khlifa K, Ghorbel H, Maaroufi K, Hedili A. HPLC determination of ochratoxin A
in high consumption Tunisian foods. Food Control 2009; 20 (8): 716-720.
4. Gonzalez-Osnaya L, Soriano JM, Molto JC, Manes J. Simple liquid chromatography assay for analy-
zing ochratoxin A in bovine milk. Food Chemistry 2008; 108 (1): 272-276.
5. Juan C,, Molto JC,, Lino CM, Manes J. Determination of ochratoxin A in organic and non-organic
cereals and cereal products from Spain and Portugal. Food Chemistry 2008; 107 (1): 525-530.
6. Jaba E. Statistica, Bucureşti: Ed. Economică 1998.
7. Roman L, Bojiţă M, Săndulescu R, Muntean DL. Validarea metodelor analitice, Bucureşti: Ed. Me-
dicală, 2007.
8. * * * Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation, FDA, US, 1987.
9. Oprean R, Rozet E, Dewé W, Boulanger B, Hubert Ph. Ghid de validare a procedurilor analitice
cantitative, Cluj Napoca: Ed. Medicală Universitară Iuliu Haţieganu, 2007.
10. * * * Q 2B Validation of analytical procedures: Methodology, ICH, 1997.

600