● Tehnici combinate de extracţie

● Produşi ai metabolismului primar – proteine şi

compuşi înrudiţi
 Compoziţie
Compoziţie necunoscută Izolarea produşilor naturali
cunoscută
sau parţial - tehnici combinate de extracţie -
cunoscută

● Separare primară
Material brut ● Omogenizare, filtrare, separare
granulometrică
● Liofilizare

● Centrifugare / centrifugare fracţionată

● SPE / SPME
Separări specifice ● SFE
Extracţii specifice ● Separări din mediu acid / bazic, etc.
adaptate la compoziţie

● Extracţie cu solvenţi
În ordinea seriei eluotrope, ex:
n-alcan > cicloalcan > CCl4 > Solvent i
> h.aromatice > eter etilic > screening GC-MS / derivatizare /
Fracţie i d.probe / HPLC-MS / MALDI,etc.
> CH2Cl2 > cloroform > MEC >
> acetonă > pentanol > THF >
> MTBE > acetat de etil > Separare secundară Separări LC preparative
> acetonitril > butanol >
> alc.izopropilic > etanol >
> metanol > DMFA > apă
Fracţii i,j Studii spectrale avansate
 Produşi naturali
alegerea solvenţilor de extracţie
Produşi naturali
 Produşi ai metabolismului primar
proteine - caracteristici
Simple (conduc numai la aminoacizi prin hidroliză)

● Monomere (conţin un singur lanţ polipeptidic)

● Oligomere (conţin mai multe subunităţi – protomeri)

● fără legare covalentă încrucişată (pot fi separate în mediu acid, bazic sau cu săruri
concentrate)
● cu legare covalentă încrucişată prin punţi disulfurice (pot fi separate prin reducere,
urmată de obicei de alchilare, sau oxidare la acid cisteic)

Conjugate (conduc la aminoacizi şi alţi compuşi organici sau anorganici prin hidroliză –
sunt clasificate pe baza naturii chimice a grupării prostetice)

● Nucleoproteine
● Lipoproteine
● Fosfoproteine
● Metaloproteine
● Glicoproteine
Produşi ai metabolismului primar
proteine - caracteristici
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – importanţa interacţiei prin
legături slabe şi cu apa

5 molecule de apă prinse în structura citocromului f (moleculă

de tip “electron carrying” în procesul de fotosinteză), formează
un canal ce permite transferul de proton
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – importanţa interacţiei prin legături slabe şi cu apa
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – caracteristici

1.0 D-Alanine, 99+%

Propylamine
Propionic ac id
0.9

0.8

0.7

0.6
Absorbance

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

3500 3000 2500 2000 1500 1000

Wavenumbers (cm-1)
Produşi ai metabolismului primar
proteine – caracteristici
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – proprietăţi acido-bazice, punct izoelectric
Produşi ai metabolismului primar
proteine – proprietăţi acido-bazice
Produşi ai metabolismului primar
proteine – caracteristici
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – structură

Reprezentări ale triozofosfat izomerazei – figura finală arată suprafaţa accesibilă solventului – roşu-acid,
albastru-bazic, polar-verde, nepolar-alb
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – structură
Etapele analizei unei structuri proteice

● extracţie şi purificare
● pentru oligoproteine
● scindarea structurii cuaternare pentru proteinele conjugate

● pentru legare covalentă încrucişată

● reducerea punţilor disulfurice

● alchilarea grupărilor sulfhidril

● denaturarea în mediu acid, bazic sau cu săruri concentrate

(desfacerea lanţurilor oligomere şi modificarea structurii

terţiare)
● hidroliză totală pentru determinarea aminoacizilor (pentru fiecare
lanţ în cazul oligoproteinelor)
● identificarea capetelor N- şi C- terminale
● hidroliza chimică şi enzimatică în peptide mai mici (prin mai multe
metode complementare)
● separarea peptidelor şi determinarea secvenţei de aminoacizi
● asamblarea secvenţei de aminoacizi din datele fragmentărilor
complementare în peptide
● determinarea poziţiei punţilor disulfurice
● alternativ – secvenţierea ADN-ului
● modelarea structurii moleculare
● modelarea suprafeţei de interacţie cu solventul
● studiul interacţiei cu grupările prostetice
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – extracţie şi purificare
Metode de extracţie şi purificare

● Obţinerea extractului brut din materialul iniţial prin omogenizare, distrugerea ţesuturilor şi a
celulelor, centrufugare/centrufugare fracţionată, microfiltrare, uneori tratare cu (NH4)2SO4
pentru precipitarea unor proteine, dializă pentru eliminarea moleculelor mici, etc.
● Separare prin cromatografie pe coloană
● schimb ionic (cationit)

● excluziune sterică

● afinitate

● HPLC

● Electroforeză
● Centrifugare în gradient de densitate
● Precipitare izoelectrică / isoelectric focusing
● Salifiere (creşterea tăriei ionice – la o anumită valoare
proteina poate precipita complet)
● Fracţionare cu solvenţi
● Separare prin adsorbţie selectivă, etc.
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – extracţie şi purificare – schimb ionic
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – extracţie şi purificare – afinitate
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – extracţie şi purificare – excluziune sterică
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – extracţie şi purificare – electroforeza
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – extracţie şi purificare – isoelectric focusing
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – extracţie şi purificare – separări bidimensionale
Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii
scindarea punţilor -S-S-
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii
determinarea numărului de capete N- terminale
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii – secvenţierea
Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii –
utilizarea MS
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii – utilizarea MS
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii – utilizarea MS
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii – utilizarea MS
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii – utilizarea MS
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii – utilizarea MS
nomenclatura si probleme de rezolutie
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii – utilizarea MS
utilizarea MS n
Produşi ai metabolismului primar
proteine – elucidarea structurii –
sinteza peptidica
Produşi ai metabolismului primar
proteine – denaturare / renaturare
 Produşi ai metabolismului primar
proteine – “enzibiotice” (enzime cu efect antibiotic)

Enzime de interes potenţial

● Lizinele – determină liza celulei bacteriene în faza finală a interacţiei cu un bacteriofag

● Autolizinele – determină liza celulei bacteriene, fiind generate de propiile celule
● Bacteriocine – determină inhibiţia altor specii într-o cultură a unei specii
● ex. lizostaphin – generată de Staphylococcus simulans împotriva S.aureus

● Lizozine – sunt hidrolaze ce rup specific legături în peptidoglicani – au nu numai efect

antibacterian ci şi antiviral, antiinflamator, antitumoral şi imunomodulator

Elemente importante în utilizarea enzibioticelor

● Risc minor în apariţia rezistenţei

● Au fost identificate enzime capabile sa acţioneze şi asupra bacteriilor gram-negative