INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

MÉTODOS DE ANÁLISIS
5QM1

A. Generalidades de la cromatografía

a) Cromatografía
Es una técnica de separación en la que los componentes de una muestra se separan en
dos fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y una fase móvil.
B) Elución
Proceso por el que se separan sustancias absorbidas por un cuerpo por medio de un
lavado progresivo con un líquido apropiado.
Purificación de una substancia por el lavado de una materia a la que está adherida
c) Fase móvil
Fase que se está moviendo en una dirección determinada. Puede ser un líquido o gas. La
fase móvil se mueve a través de una columna que lleva la muestra a separar.
d) Fase estacionaria
Sustancia que se fija a la columna o en el panel, sobre cuya superficie se separan
las sustancias.
e) Constante de distribución
concentración de un compuesto en el intercambiador de iones (fase estacionaria), dividido
por su concentración en la disolución externa (fase móvil).
f) Factor de selectividad.
La retención relativa o el factor de selectividad depende de la naturaleza de las fases
estacionaria, móvil y la temperatura de operación de la columna. Al escoger un par de
fases para los solutos adyacentes más difíciles de separar se debe ser tan selectivo como
sea posible
g) Plato teórico
Es la unidad de la columna que tiene la misma eficacia en la separación que una
destilación simple y se expresa a menudo en cm de altura de la columna.
h) Tiempo de retención
Es el tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el sistema cromatográfico. Esta
retención se ejerce en función de las características moleculares de cada compuesto.
i) Volumen de elución
Se define como el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna.
j) Volumen vacío
En la cromatografía de filtración en gel es el espacio dentro de una partícula de gel en el
cual las moléculas grandes no se pueden difundir.
k) Tiempo muerto
Es el tiempo de retención del componente inerte o gas portador.
l) Resolución
Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema
cromatográfico para dos componentes dados

2. ¿Cuáles son los criterios de clasificación de la cromatografía?

Existen distintos criterios de clasificación:

 Por la naturaleza de las fases

I. Líquido – Líquido
II. Gas – Líquido
III. Líquido – Sólido
IV. Gas – Sólido

 Por el proceso fisicoquímico del proceso.

I. Adsorción
II. Reparto
III. Intercambio iónico
IV. Exclusión

 Por la naturaleza del soporte de la fase estacionaria.

Plana
I. Papel
II. Capa fina

Columna
 I. Gases
II. Líquida

3.- Haga un diagrama de la clasificación de la cromatografía, considere

todos los criterios.

Líquido - Líquido

Gas – Líquido
Naturaleza de
las fases
Líquido – Sólido

Gas – Sólido

Adsorción
Re
Reparto
pa
rto
Proceso Intercambio
Int iónico
Cromatografía fisicoquímico er
del proceso. Exclusión
ca
m
Afinidadbio
biológica
ión
Líquidosicosupercríticos
Ex
clu
sió En papel
n
Plana

Fase En capa fina

estacionaria
De gases

Columna

Líquida

4. Explique los principios de separación de los siguientes tipos

de cromatografía
a) Por reparto
Esta técnica se basa fundamentalmente en las diferencias de solubilidad de los
componentes de la muestra en la fase estacionaria o en las diferencias de solubilidad de
los componentes en la fase móvil y en la fase estacionaria.

b) Por adsorción
Se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los compuestos por el
sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi
exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más polar que la
fase móvil. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la
alúmina.

c) Por intercambio iónico

Se basa en la afinidad de los iones en solución por los sitios de polaridad opuesta que se
encuentran en la fase estacionaria. La fase estacionaria es una resina de intercambio
iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies
ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución
amortiguadora de pH.

d) Por exclusión molecular

Se basa fundamentalmente en efectos de exclusión, tales como diferencias en el tamaño
de las moléculas, en su forma o en su carga. La fase estacionaria es un material poroso
que retiene a las moléculas en función de su tamaño, también se le denomina
cromatografía de filtración sobre geles.

e) Por afinidad biológica

Se basa en la especificidad de algunas macromoléculas biológicas. Éstas se unen
específicamente a la fase estacionaria y para separar dicha macromolécula, bastará con
variar el pH una vez que la columna este limpia y sólo se encuentre de interés.

f) De líquidos supercríticos.
Esta técnica permite la separación y determinación de compuestos que no son
manipulados ni por la cromatografía de gases ni por la de líquidos: compuestos no
volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografía de gases es inaplicable y
compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las técnicas
espectroscópicas o electroquímicas empleadas en cromatografía de líquidos.

B. Cromatografía en capa plana o capa fina

a) ¿Cuáles son los soportes empleados en la cromatografía en cama plana?
Usualmente se utiliza una placa recubierta de una capa delgada de; Gel de sílice,
alúmina, poliamidas o celulosa.

b) Describa las formas de desarrollo en la cromatografía en cama plana

Para el desarrollo de la cromatografía

en capa fina, se debe introducir la placa
en una cubeta cromatográfica, dentro
de la cual contendrá la fase móvil, se
cerrará para aumentar la saturación de
los vapores de la fase móvil.
Se debe dejar la placa hasta que la
fase móvil haya llegado casi hasta el
final de la placa, posteriormente sacar
de la cubeta, marcar el frente, dejar
secar y revelar.

c) ¿Qué características deben tener los disolventes empleados cómo fase móvil
en las cromatografías por adsorción y por reparto? Emplee una tabla para
especificar en cada una, e indique ejemplos en cada caso

Cromatografía Fase móvil Fase Estacionaria

Adsorción Líquido o Gas que ayude a
arrastrar la muestra por la
fase estacionaria
Reparto Líquido o Gas que ayude a
arrastrar la muestra por la
fase estacionaria
Solido en que los compuestos
pueden ser adsorbidos.
Líquido soportado en un
sólido inerte.