UNIVERSIDAD DE CUENCA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA

CARRERA: LABORATORIO CLÍNICO

SEMESTRE: NOVENO

ROTACIÓN: BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

DOCENTES: DR. GABRIELE BIGONI

DRA. ELISA GUAMÁN

TEMA: DETECCIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL DEL GEN PML/RARα

TRASLOCACIÓN 15;17 EN LEUCEMIAS.

ALUMNOS: PAMELA TIMBE, DANIEL VALLADARES

DETECCIÓN DEL GEN PML/RARa TRASLOCACIÓN 15:17 EN LEUCEMIAS
POR PCR EN TIEMPO REAL:

RESUMEN:

Antecedentes: la leucemia se considera presencia de células inmaduras en la medula ósea

produciendo un tipo de cáncer como leucemia promielocitica aguda caracterizada por la
presencia de una translocación entre los cromosomas 15 y 17 que provoca la formación de
un gen fusión llamado PML/RARα. Métodos: mediante la extracción de sangre a pacientes
se obtiene ARN para el diagnóstico le leucemia promielocitica aguda con el método de RT-
PCR anidada detectando el gen de fusión PML/RARα

Resultados: el estudio se realizó en 18 pacientes con diagnóstico previo, de los cuales 5

casos fueron de Leucemia Promielocítica Aguda, de estos 5 pacientes en 3 se logró detectar
el gen de fusión PML/RAR, en los 2 pacientes restantes no se detectó el gen de fusión
mediante la técnica de RT-PCR; lo cual no era concordante con el diagnóstico. Sin
embargo, en uno de ellos se pudo detectar mediante la técnica de FISH.

Conclusiones: La técnica de PCR es de gran importancia en el diagnóstico de Leucemia

Promielocítica Aguda para la detección del gen de fusión PML/RAR, sin embargo, existen
poblaciones que no presentan dicho gen de fusión, por lo cual podrían representar un falso
negativo. Además de ello existen reordenamientos que implican únicamente al cromosoma
17 por lo cual es recomendado correlacionar los resultados de la técnica de RT-PCR con
otros estudios como la FISH.

Palabras clave: Leucemia promielocítica aguda; Fusión génica; Reacción en Cadena de la

polimerasa de transcriptasa inversa; Cáncer.

INTRODUCCIÓN:

Según la OMS el cáncer es considerada la segunda causa de muerte en el mundo, con

aproximadamente 8.8 millones de muertes en el 2015, la leucemia considerada un tipo de
cáncer en la sangre, que se caracteriza por la producción no controlada de células
hematopoyéticas en la medula ósea. En el año 2018, 437033 personas fueron
diagnosticadas con leucemia, 309 006 murieron a causa de esta enfermedad.(1)
En el Ecuador la leucemia está dentro de las 10 enfermedades con mayor prevalencia en el
país, con una incidencia de 1188 casos, registrándose 887 muertes al año y una prevalencia
de 3 301, en un periodo de 5 años.(2)

La leucemia se clasifica en leucemias agudas, constituida por células inmaduras, con una
evaluación rápida, y crónicas constituidas por células maduras, con una evolución de
periodo largo. Los tipos de leucemia son leucemia linfocítica aguda o crónica y leucemia
mieloides aguda o crónica.(3)

La leucemia promielocitica aguda (acumulación de promielocitos anormales, consecuencia

por la cual hay una insuficiencia en la producción de eritrocitos, trompositos y leucocitos)
un subtipo de leucemia mielocitica aguda, cuya característica principal el reordemanieto del
gen 15(puede ser la ruptura en intron 6, exón 6, intron 3) y 17(ruptura en el intron 2) para
dar origen al gen de fusión PML-RAR, el cual nos ayudara para el diagnóstico de esta
enfermedad mediante la técnica de RT-PCR, su diagnóstico se da entre 7 y 9 años de edad.
(4,5)

En Europa, se considera que el 32% de paciente con leucemia mieloide aguda corresponde
a pacientes con leucemia promielocitica aguda, en Peru un 22%, Mexiso 20%, Colombia
12%.(4)

GEN PML

El gen PML es un supresor tumoral que regula la inducción de apoptosis dependiente de

p53. Ante la presencia de radiación ionizante y mutaciones oncogénicas este gen suprime
el crecimiento y la senescencia de las células. Este gen de igual manera se lo denomina
como un complejo multiproteico ya que se encuentra junto a proteians como p53, pRB,
Daxx, CBP. Si este gen muta puede producir un exagerado almacenamiento de globulos
blancos inmaduros tanto en la sangre como en la medula ósea provocando una leucemia
promielocitica aguda.(5)

GEN RAR
Produce la proteína llamada receptor alfa del ácido retinoico, funciona como un factor de
transcripción que se enlaza a segmentos específicos de ADN y tiene un papel fundamental
en la diferenciación mieloide. Controla la actividad de algunos genes para la maduración de
los glóbulos blancos.(5)

GEN DE FUSIÓN PML/RAR

Alrededor del 95% de LPA son producidas por la traslocacion reciproca t (15;17)
(q24.1;q21.2). Se da una ruptura entre estos genes dando la fusión de estos dos genes. Hay
tres tipos de ruptura en el gen PML que se da en el cromosoma 15q que son intrón 6 (bcr1–
región de clúster de punto de interrupción 1), exón 6 (bcr-2 - punto de interrupción cluster
region 2) y intron 3 (bcr-3 - región de cluster de punto de interrupción 3).Los puntos de
ruptura en el gen 17q se da en el intron 2. (6) La fusión de estos dos genes origina una
desregulación apoptótica y epigenética que se nota en el estadio de los promielociticos.
RARA se comporta como represor transcripcional proporcionando el ensamblaje de los
nucleosomas y el silenciamiento de varios promotores. (5)

En américa latina la ruptura de este gen es la bcr1 aunque ahora se ha demostrado que
también esta presente bcr2, todo esto varia de la ubicación geográfica y la bcr3 son más
común en niños. Están asociados clínicamente a enfermedades como hiperleucocitosis,
coagulopatía hemorrágica. (5)

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

Se han utilizado varios métodos para el diagnóstico de la detección del gen de fusión
PML/RAR como son la citogenética convencional, hibridación in situ fluorescencia (FISH)
que se usan sondas para señalar a los cromosomas que emiten fluorescencia, (RT-PCR)
reacción de la cadena de polimerasa inversa que identifica el punto de ruptura del gen PML
e inmunofluorescencia con anticuerpos anti- PML (4)

PCR EN TIEMPO REAL

La técnica de PCR utiliza cebadores para amplificar fragmentos genéticos como es el gen
PML RARA. Este método sirve para localizar donde se dio el punto de ruptura del gen
PML. Convierte este método en una prueba confiable y valiosa para determinar el subtipo
molecular, presentando una sensibilidad y especificidad de 96-100%, tiene una duración de
tres a seis horas para proyectar el resultado.(4,7)

METODOS Y MATERIALES:

Pacientes:

En este estudio de corte transversal se recolectaron muestras de sangre periférica de

pacientes diagnosticados con leucemia mieloide aguda, para ajustar e implementar
mediante RT-PCR anidada, la detección de PML/RARa basados en un protocolo
previamente establecido. Los pacientes formaron parte del proyecto “Evaluación de
marcadores moleculares, proteómicos y epigenéticos” en pacientes con leucemia mieloide
aguda antes y después de tratamiento. Dentro de los criterios de la selección de estos se
tuvo en cuenta que fueran pacientes con diagnóstico de leucemia mieloide aguda de novo,
reciente, sin haber recibido tratamiento de inducción, no tener antecedentes de
enfermedades neoplásicas, ser mayores de 18 años y que no tuvieran un diagnóstico de
leucemia mieloide aguda secundaria a síndrome mielodisplásico. Todos los pacientes
firmaron consentimiento informado. Las historias clínicas de los pacientes incluidos fueron
revisadas para verificar algunas variables clínicas y paraclínicas.

Extracción de RNA y retrotranscripción:

A partir de una muestra de 6 ml de sangre venosa periférica se realizó la extracción de

ARN con el kit Trizol Ls (Thermo Fisher Scientific-US) de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. El ARN obtenido se cuantifico mediante Nanodrop 2000
(Thermo Fisher Scientific-US) a 260 nm y su calidad fue evaluada mediante análisis de la
relación 260/280 y 260/230. A partir de 500 ng de RNA se realizó la retrotranscripción
mediante la enzima ReverAid reverse transcriptase (Thermo Fisher Scientific-US) random
primers (Qiagen- US) y dNTPs (Thermo Fisher Scientific-us). En resumen, el programa de
PCR se configuro así: 10 minutos a 25°C, seguido de 60 minutos a 42°C y finalmente 10
minutos a 70°C. se almacenaron los DNA complementarios resultantes a -20°C para su
posterior uso.

PCR para detección del gen de fusión PML/RARa

Para el ensayo de RT-PCR anidada se utilizaron seis primers de los cuales cuatro se unen a
la porción del gen PML (PML-A1, PML A2, PML-C1, PML-C2) y los otros dos al gen
RARa (RARa-B y RARa-D). con estos se logra formar cuatro conjuntos de primers A1-B,
A2-B, C1-D y C2-D. la PCR A1-B/C1-D genera productos de 214 pb y 178 pb para bcr1 y
bcr2, respectivamente, mientras que A2-B/C2-D produce amplificados de 688 pb, 652 pb y
289 pb para bcr1, bcr2, bcr3, respectivamente. (8)

A partir de 2ul de ADN complementario con buffer 1x 25 mM de MgCl2, 0,2 uM de

dNTPs y 5 U/ul de Taq polimerasa para un volumen final de 25 ul, se realizó inicialmente
una PCR externa utilizando los primers A1 y A2 y el primer B, a una concentración de 0,4
uM. (8)

Luego se realizó la PCR interna a partir de 1 ul del producto resultante de la PCR externa
con los mismos reactivos y las mismas concentraciones mencionadas anteriormente y los
primers C1 o C2 y el primer. En todos los casos se incluyó un control negativo. El
protocolo de amplificación para ambas PCR se realizó con el BIO-RAD C1000 Touch
Thermal Cycler y se configuro así: 95°C por 30 segundos, seguido por 30 ciclos de 094°C
por 30 segundos, 66°C por 60 segundos, 72°C durante 60 segundos por 30 ciclos. (8)

Dentro del estudio hubo 12 mujeres y 6 hombres con edades entre los 18 y 67 años con un
promedio de 46 años. (8)
RESULTADOS:

El estudio realizado a pacientes con leucemia mieloide aguda presentaba ciertas

características clínicas al momento del diagnóstico. Se estudiaron a un total de 18 personas
de las cuales 12 eran mujeres y 6 eran varones con edades en un intervalo de 18 a 67 años
con una media de edad de 46 años.

Tabla 1:Datos demográficos y clínicos obtenidos de historias clínicas de pacientes en estudio.

De los pacientes intervenidos en el estudio se encuentran en mayor cantidad entre las

edades 60 y 65 años al momento del diagnóstico. Mientras que en cuanto al sexo se
presentan en mayor cantidad pacientes de sexo femenino representado por un porcentaje de
66,66%, mientras que el sexo masculino representa 33.33%. (8)
De los pacientes diagnosticados el 27,7% presenta Leucemia Promielocítica Aguda, 22,2%
fueron diagnosticados con M2, 16,6% con M1, 11,1% con M1 y M2, 5,5% fueron
diagnosticados con M4, 5,5% fueron diagnosticados con M0 y M1 y 5,5% fueron
diagnosticados con LMA con cambios mielodisplásicos. (8)

El ensayo de RT-PCR determino que en tres pacientes con previo diagnóstico de LPA se
pudo detectar el gen de fusión PML/RAR lo cual coincidió con el paciente numero 18 al
haberse realizado previamente la detección del gen de fusión por qPCR, mientras que en los
pacientes 2 y 3 no existían datos previos de detección. (8)

Del paciente 1 no se detectó el gen de fusión PML/RARa por PCR y tampoco por método
de hibridación in situ fluorescente (FISH), sin embargo, este fue diagnosticado con LPA.
En el paciente 10 no se pudo detectar el gen de fusión PML/RARa por PCR, sin embargo,
fue detectado por el método de FISH dando positivo para PML/RARa. (8)

DISCUSION:

La detección del gen de fusión PML/RARa por ensayo de RT-PCR anidada se obtuvo en
tres pacientes diagnosticados con LPA de un total de cinco casos, en un paciente
diagnosticado con LPA anteriormente no se obtuvo la presencia del gen de fusión por
ninguno de los dos métodos, sin embargo se menciona que en el ensayo de FISH se detecta
una señal verde del gen RARa lo cual indicaría que se trata de un re arreglo en el cual
únicamente ha sido intervenido el cromosoma 17, formando parte de menos del 1% de
casos no identificables de LPA, y lo que formaría parte de un falso negativo en el análisis
de dicha enfermedad. En el paciente 10 también se evidencia la presencia del gen de fusión
mediante la técnica de FISH, mientras que por la técnica de RT-PCR no existe una
concordancia lo cual podría deberse a la degradación de ARN o probablemente por algún
error realizado en el procedimiento. (9) (10)

Es probable que se obtengan resultados positivos mediante la técnica de FISH, mientras que
mediante la técnica de PCR no se obtenga el mismo resultado, lo que podría deberse los
reordenamientos en los cuales se involucra al cromosoma 17 por lo cual es de gran
importancia la correlación entre los resultados de dos técnicas distintas que detecten el
mismo gen, además de ello se debe tomar en cuenta que pueden existir limitaciones en las
técnicas realizadas, se señala que puede existir la falla del análisis citogenético debido a
una respuesta deficiente hacia la quimioterapia por ello es necesario complementarse con
método de PCR (11)

CONCLUSIÓN:

El gen de fusión PML/RARα es la causa del 95% de leucemia promielocítica aguda (LPA),
por lo cual en la mayoría de los casos debería detectarse la presencia del mismo, sin
embargo existe la posibilidad de que ciertos pacientes con hallazgos morfológicos de LPA
no presente el transcrito PML/RARα por la técnica de PCR, siendo detectado por otros
métodos como hibridación fluorescente in situ (FISH), esto puede ser posible debido a que
podría estar involucrado únicamente un cromosoma como en el caso de la existencia de una
trisomía. Es por ello de gran importancia tomar en cuenta las diversas alternativas en
técnicas de detección, además de ello es posible que en algunos pacientes con dicha
enfermedad no se detecte el gen por ninguna técnica, formando parte del 5% restante de la
población con leucemia promielocítica aguda la cual no tiene esta causa asociada.

BIBLIOGRAFIA

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