Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice.

Metode de testare a sensibilităţii bactecteriilor la agenţi antimicrobieni

Antibiograma reprezintă metoda de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la

antibiotice a germenilor recoltaţi de la bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe
medii îmbogăţite, care să permită dezvoltarea optimă a microorganismului pentru care se
efectuează testarea (de exemplu pe agar Mueller-Hinton).
Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină
bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici
sunt:
a) Tehnicile calitative:
- antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)
- antibiograma difuzimetrică comparativă
- antibiograma difuzimetrică standardizată
- antibiogramele difuzimetrice rapide
b) Tehnicile cantitative:
- metoda diluţiilor în mediu lichid
- metoda diluţiilor în agar
- metoda microdiluţiilor în agar
- metoda „punctelor de ruptură”
- testul „E”
- metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.

7.1.1. Antibiograma difuzimetrică comună

Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid
(ex. agar Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu
prin „inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul
unui tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa
Petri se lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică
microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată.
Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice,
sau cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15
mm de marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul
de 9 cm).
Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru
care, cu ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm
plăcile peste noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de
multiplicare a microorganismului testat.
Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de
inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă.
Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil.
Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se
dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent.

1
Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt
numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor
foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată.

7.1.3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS)

Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este
standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care
permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite.
Elementele necesare standardizării sunt:
- mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare
nutritivă corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)
- există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor
microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa,
atunci când este testată sensibilitatea la aminoglicozide);
- se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
- există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor
microorganisme pretenţioase;
- grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
- inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să
aibă o turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland
(circa 108 unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
- timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de
2-3 plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
- concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea
microcomprimatelor (6 mm diametru);
- alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
- păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de
polietilenă, la +4°C);
- utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
- interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară
rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de
referinţă).
Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace
ale antibioticului la nivelul focarului infecţios.