Las técnicas morfológicas y moleculares para la identificación de

enfermedades fungosas
Recientemente se han puesto a disposición varios métodos o técnicas basados en
la morfología y las técnicas moleculares de acuerdo a un artículo publicado el 17
de Agosto del 2017 sobre los Valores diagnósticos y utilidad de los métodos
inmunológicos, morfológicos y moleculares para la detección en planta de
Phytophthora ramorum (Hongo Oomycetes que produce la infección denominada
muerte repentina del roble)
En entre las cuales hablan de las técnicas más utilizables y más confiables, asi
que se compararon seis métodos para la detección de Phytophthora ramorum en
planta utilizando material vegetal de rododendro infestado de forma natural. Los
métodos incluyeron dos métodos inmunológicos, uno un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el otro utilizando un formato de
flujo lateral (LFD). También se evaluaron tres pruebas moleculares basadas en
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la química TaqMan,
incluidos dos ensayos diseñados para la detección específica de P. ramorum
y uno diseñado para la detección a nivel de género de Phytophthora. El
aislamiento seguido de la identificación morfológica también se evaluó. Los
valores diagnósticos de cada uno de los métodos, evaluados en función de la
sensibilidad diagnóstica, la especificidad diagnóstica, el valor predictivo positivo y
el valor predictivo negativo, se calcularon en función de los resultados de las
pruebas de 148 muestras de campo. El "estándar de oro" utilizado para los
cálculos fue el diagnóstico final, que se basó en un resultado positivo de PCR
o en el aislamiento exitoso de P. ramorum . La Phytophthora spp. TaqMan
PCR, ELISA y LFD tuvieron sensibilidades más altas que el P. ramorum-
específicos, que los hacen útiles como métodos de preselección, donde los
resultados positivos deben confirmarse por PCR o aislamiento. El artículo analiza
las ventajas y desventajas prácticas de cada uno de los métodos y cómo son
valiosos en el proceso de diagnóstico, de acuerdo con las circunstancias de uso
(es decir, diagnóstico o vigilancia) y en relación con la prevalencia de infestación
por P. ramorum en la población para ser probado.

1). LFD. Kits de prueba de flujo lateral de diagnóstico de bolsillo, cada uno con a,
LFD para la detección de Phytophthora spp. y una botella con 5 ml de extracción
solución y cinco rodamientos de bolas de acero inoxidable, fueron adquiridos de
CSL. los los anticuerpos usados en el LFD fueron suministrados por Neogen
Corporation (Lansing, MI). La prueba se realizó de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Brevemente, Se colocaron piezas de plantas con una superficie total
de 3 cm 2 (90 mg) en el botella de extracción y la botella se agitó vigorosamente
durante 60 s para dar un Suspensión bien mezclada. Se pusieron dos gotas (100
µl) de esta suspensión sobre el LFD usando una pipeta y se dejó correr a lo largo
de la membrana. Los resultados fueron leídos 1 a 3 minutos después de la
aparición de la línea de control azul. La aparición de la la línea de prueba azul
indicó un resultado positivo y se consideró la muestra de prueba contener una
Phytophthora spp
2) ELISA Se realizó un sándwich de doble anticuerpo (DAS) -ELISA con reactivos
del kit Phytophthora PathoScreen de Agdia según el Instrucciones del fabricante.
Piezas de plantas con una superficie total de 1 cm 2 (30 mg) se colocaron en un
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con una tapa plana de ajuste seguro (tubos
Superlock; BIOzymTC) que contiene un cordón de acero inoxidable (3.97 mm de
diámetro) y 300 µl de tampón GEB2. El tubo se colocó en un molino de bolas
(Mixer Mill MM300; Retsch GmbH, Haan, Alemania) durante 1,5 min a 1.800
latidos / min. La mezcla se centrifugó durante 1 minuto a 14,000 × gy se usaron
100 µl del sobrenadante resultante. para el DAS-ELISA. Los controles positivos y
negativos fueron positivos liofilizados. control adquirido de Agdia y agua libre de
RNAsa y DNAse, respectivamente. Las absorbancias se midieron 1 h después de
la adición del sustrato utilizando una microplaca. lector (Modelo 680; Bio-Rad,
Veenendaal, Países Bajos). Lo negativo los controles deben leer entre 0 y 0.05; los
controles positivos deberían leer entre 0.5 y 2.0. Se consideraron muestras con
valores de absorbancia> 0.5 positivo
Phytophthora spp. Las técnicas moleculares
3) La cultura. Se colocaron cinco piezas de plantas (de 0,1 cm 2) en cada una de
las cuatro placas siguientes: un agar de agua (1,5% de agar no 1) (Oxoide,
Haarlem, Países Bajos), dos agar sintético pobre en nutrientes (SNA) (11) y un
cerezo centrifugando la columna durante 5 min a 4.000 g. La suspensión de ADN
se aplicó a una columna PVPP y se centrifugó durante 5 min a 4.000 g. fracción de
flujo a través se utilizó como entrada para los ensayos de TaqMan.

4) El aislamiento automatizado del ADN se realizó con el procesador de partículas magnéticas

KingFisher 96 (Thermo Electron Corporation, Breda, Países Bajos) utilizando el kit de ADN
QuickPick Plant de Bio-Nobile (Isogen Life Science, IJsselstein, Países Bajos) según un protocolo
desarrollado por el fabricante (K. Kontu, comunicación personal). Brevemente, se añadieron 5
sl de proteinasa K y 50 ol de tampón de lelisis a 75 ol de la savia vegetal descrita
anteriormente. Después de 30 minutos de incubación a 65oC, se añadieron 5 sl de Partículas
Magnéticas MagaZorb y 125 l de tampón de unión. El ADN ligado a partículas se lavó dos veces
con 200 ml de tampón de lavado y el ADN se eluía en 50 l de tampón de elución. El ADN fue
purificado utilizando una columna PVPP como se describió anteriormente.

Cada serie de extracciones de ADN incluía múltiples controles externos: un control negativo
(agua libre de DNAse y RNAse), una por cinco muestras, para monitorear falsos positivos
causados por la contaminación cruzada durante el aislamiento del ADN, y un control positivo
para comprobar la eficiencia del aislamiento de ácido nucleico. Los controles positivos fueron
alícuotas de un lote de savia del tejido vegetal infectado por P. ramorum conocido, preparado
de la misma manera que las muestras.

5) Ensayos TaqMan. Todos los ensayos TaqMan se basan en secuencias en la región del
separador transcrito interno ribosómico nuclear (ITS). Los oligonucleótidos que se usaron
como cebadores y sondas en la PCR se enumeran en la Tabla 2. Los cebadores se obtuvieron
de Isogen Life Science o Eurogentec (Seraing, Bélgica).

Las sondas de 6-carboxi-tetra-metil-rodamina (TAMRA) se obtuvieron de Applied Biosystems

(Nieuwerkerk aan de IJssel, Países Bajos). Se obtuvieron sondas de extinción no fluorescentes
de unión a surcos menores (MGB-NFQ) de Applied Biosystems. Todas las reacciones se
realizaron en placas de grado óptico de 0,2 ml (Applied Biosystems) en un ABI PRISM 7900HT o
7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems).

6) Clonación de secuencias ITS en pGEM-T Easy. Para proporcionar ADN exógeno para las
reacciones de amplificación con picos, el producto de PCR amplificado con los cebadores Phyto
1 y Phyto 4 (Tabla 2)

P. ramorum El aislado CBS 101330 (PD 98/5233) (21,40) se clonó en el vector pGEM-T Easy
(Promega) de acuerdo con los procedimientos estándar (32). El ADN plasmídico se aisló usando
el Mini Kit Qiagen Plasmid.

Ensayos de PCR convencionales. La mezcla de reacción de 50 µl se compuso de la siguiente

manera: 0.2 µM cada cebador Phyto 1 y Phyto 4
(Tabla 2) o cebadores fúngicos universales ITS1 e ITS4 (41) (Tabla

2), dNTP 200 µM (Promega), 0.5 unidades de ADN polimerasa HotStarTaq (Qiagen), tampón de
reacción (con MgCl 2 1.5 mM)

(Qiagen) y 5 µl de plantilla de ADN. La PCR se realizó en un pozo de 96 pocillos.

Termociclador de tipo Peltier (PTC-200; MJ Research: BIOzymTC) con los siguientes

parámetros: 15 min a 95 ° C; 35 ciclos de 15 sa 94 ° C, 60 sa 62 ° C y 45 sa 72 ° C; seguido de
una extensión final durante 10 minutos a 72 ° C y se enfrió rápidamente a temperatura
ambiente. Después de la amplificación, 5 µl de los productos de PCR se electroforizaron en un
gel de agarosa al 1,5% de acuerdo con métodos estándar (32) junto con una escalera de ADN
de 100 pb (GeneRuler escalera de ADN de 100 pb; Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania) )
para dimensionar fragmentos. Los productos de PCR fueron vistos y fotografiados bajo luz UV.

Secuenciación. Las reacciones de secuenciación se realizaron directamente con productos de

PCR purificados utilizando el kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems) con los cebadores
FITS_15Ph y RITS_279Ph (Tabla 2) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras de
secuenciación se analizaron en un analizador genético ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems).
Los productos de PCR se secuenciaron en ambas direcciones. El ensamblaje Contig, así como la
alineación final de las secuencias de consenso, se realizó utilizando los módulos SeqMan y
MegAlign del software Lasergene (DNAstar, Inc., Madison, WI).

Precauciones para prevenir la contaminación del ADN. La prevención de la contaminación se

logró mediante la separación física de los diferentes pasos en el procedimiento de PCR,
utilizando diferentes pipetas (con puntas de pipeta resistentes a los aerosoles)

(puntas de filtro autoadhesivas sin colapsar [SSNC], BIOzymTC), y usar capas y guantes
separados en cada uno de los tres laboratorios utilizados. Se usó un laboratorio para preparar
mezclas de reacción, uno para la extracción de ácido nucleico y otro para el análisis de
productos de PCR. El flujo de trabajo se organizó de manera que se minimizara el riesgo de
contaminación. La descontaminación química de superficies y equipos se realizó con
hipoclorito de sodio al 1% (29,31). [ CITATION Bro07 \l 1033 ]

Bibliografía
Brouwershaven, Vossenberg, V. d., Beld, V. d., Bonants, & Gruyter. (18 de Abril de 2007). Plant
Research International. Obtenido de Plant Research International:
https://www.apsnet.org/publications/phytopathology/2007/September/Pages/97_9_
1119.aspx. Consultado el 19 de Junio del 2020