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La PRUEBA BIOQUÍMICA son pruebas bastante simples que han sido desarrolladas para demostrar en forma clara una
determinada característica bioquímica de ese microorganismo que yo quiero identificar ya sea la presencia o la ausencia
de una determinada actividad enzimática o vía metabólica pero de ninguna manera estas pruebas bioquímicas van a
significar un estudio profundo del metabolismo microbiano porque para hacer ese tipo de estudios generalmente se
utilizan medios químicamente definidos de esa manera vamos a disminuir al máximo las interferencias y los posibles
errores que podamos tener al utilizar los medios complejos
En La mayoría de las pruebas bioquímicas los medios que vamos a utilizar son complejos queden peptona extracto de
carne de levadura
La identificación de los microorganismos es decir la asignación a un género y especie se hace a través de la
determinación de caracteres fenotipicos aquellos caracteres que son la expresión observable del genoma y eso se
complementa siempre caracteres genotipicos es decir el estudio de los ácidos nucleicos ADN y ARN. No se puede hacerle
identificación de un microorganismo sólo mediante caracteres fenotipicos sí o sí tiene que ir acompañada de caracteres
genotípicos.
Para hacer la identificación microbiana mediante caracteres fenotipicos se tiene en cuenta diferentes características
como, por ejemplo:
 las culturales cuando uno aisla un microorganimso se puede realizar una observación macroscópica de las
colonias teniendo en cuenta la formación de pigmentos la forma, textura etcétera por otro lado vamos a tener
carácter morfológico de la célula forma tamaño disposición y estructuras especiales
 Carácter fisiologico a qué temperatura a que PH crece y la tolerancia al cloruro de sodio qué son factores que
afectan el crecimiento de los microorganismos
 Tenemos otros caracteres como las nutricionales composición química pruebas de inhibición
 pruebas bioquímicas
En el laboratorio se van a elegir a una serie de pruebas bioquímicas que van a servir para identificar un determinado
microrganimo.
 Utilizan cultivos puro y fresco de decir que tengan un solo microorganismo y además que esa célula determina
metabólicamente activas
 Las siembras se realizan en condiciones de asepsia cerca de la llama del mechero o bien en una cabina de flujo
laminar
 Se van a utilizar microorganismo de referencia de los cuales yo ya se el resultado que me tiene que dar de esa
manera controlo la prueba bioquímica que yo estoy utilizando
En el laboratorio se va a trabajar con una serie de pruebas bioquímicas a nivel del género de bacilos gram negativos que
pertenecen al grupo de las enterobacterias dependiendo de microorganismo elijo una serie de pruebas bioquímicas que
me permitan su identificación; estas pruebas permiten estudiar el metabolismo del microorganismo el metabolismo de
hidratos de carbono como la prueba TSI, medios liquidos de fermentación el método para determinar por qué vía
fermenta la glucosa la utilización de la lactosa en medio leche utilización de ácido cítrico como única fuente de carbono
en medio de citrato de simmons pruebas que van a determinar el metabolismo de compuestos nitrogenados como por
ejemplo la degradación de la caseína de la leche la degradación de la gelatina producción de indol aparte del triptófano
hidrólisis de la urea todos estos son compuestos de nitrógeno orgánico
En el caso de nitrógeno inorgánico tengo la reducción de nitratos
Otra prueba me permite determinar el metabolismo del oxígeno la prueba de la catalasa también se puede estudiar la
presencia de estructuras qué van a permitir que los microorganismos sean móviles o no como la prueba en el Agar
blando osea dependiendo de microorganismo yo selecciono las pruebas bioquímicas en este cuadro son para el gram
negativo pertenecientes a la enterobacterias.
Para identificar otro microorganismo debo seleccionar otro tipo de prueba de pruebas bioquímicas
EL METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO MEDIO TSI qué es un medio SOLIDO de color rojo en la tabla se
encuentra la composición de este medio de cultivo en gramos por litro resaltado en negrita están aquellos componentes
cruciales de estos medios de cultivo aquellos componentes que permiten que ese medio de cultivo sea utilizado para
evidenciar una cierta característica del microorganismo medio TSI lo que nosotros vamos a evaluar es la fermentación de
3 azúcar lactosa sacarosa glucosa las dos primeras están en una concentración muchísimo mayor que la glucosa sulfato
de doble de hierro y amonio tiosulfato de sodio que no van a permitir evidenciar la producción de sulfuro de hidrógeno y
un indicador de pH qué es el rojo fenol qué es rojo a pH 8 con 5 y amarillo a pH 6,9 como el pH final del medio es 7
entonces lo vamos a ver de color rojo este medio de cultivo es un medio agarizado se lo va a solidificar en bisel en pico
de flauta y va a tener dos cámaras una CÁMARA AERÓBICA qué es la parte superior qué es la parte en vista el que está
en contacto con el oxígeno y una CÁMARA ANAERÓBICA qué es la parte inferior
Procedimiento de siembra tomamos una porción del cultivo con una aguja estéril en condiciones de asepsia primero
sembramos por punción sacó la aguja y directamente voy a sembrar en el bisel por estría es decir en un solo movimiento
hago la siembra hago la punción saco y luego en el bisel estrio ese medio se incuba 24 horas a 37 grados centígrados y
luego se realiza la lectura de los resultados
Posibles resultados
1. El primer tubo es el medio sin inocular
2. El segundo tubo se observa que se ha intensificado el color del medio el indicador de PH a virado a un color rojo
más intenso entonces vamos a tener un medio que tiene un pico y un fondo alcalino y eso indica que el
microorganismo no es fermentador de ninguna de las azúcares presentes en el medio tiene un metabolismo
aeróbico iba a crecer a expensas de la fuente nitrogenadas que es la peptona entonces a partir de ese
metabolismo se producen compuestos básicos qué van a incrementar el pH que van a hacer que vire el
indicador a un color rojizo
3. En el segundo tubo tenemos que sólo el fondo es color amarillo y el pico es alcalino entonces tenemos un pico
alcalino y un fondo acido en este caso el resultado se interpreta cómo fermentación de glucosa positiva y el
resto de las azúcares lactosa y sacarosa no han sido fermentadas y esto es porque a partir de la fermentación de
la glucosa se producen ácido qué van a llevar a un viraje del indicador a color amarillo como la concentración de
la glucosa es baja entonces la producción de ácido es suficiente sólo para por producir el viraje del indicador en
el fondo.
4. En los siguientes tubos tenemos el pico como el fondo ácidos además en el tubo hay un desplazamiento del
medio de cultivo Se observa que ha subido un poco para arriba en ambos casos se ha producido la fermentación
de glucosa qué puede ir acompañada por lactosa y/o sacarosa eso quiere decir que la fermentación de glucosa
está acompañada por la fermentación de una de estas azúcares o bien por las dos azúcares que están en mayor
concentración cuando se produce este tipo de fermentación se van a generar una mayor concentración de
productos ácidos que serían protones qué van a hacer que tanto el pico como el fondo del medio vire a color
amarillo y en el caso de que esa fermentación de los azúcares esté acompañada por la producción de gas
entonces vamos a ver desplazamiento del medio o bien lo vamos a ver al medio resquebrajado
5. En el último tengo tengo pico alcalino y fondo negro en este caso tenemos fermentación de glucosa positiva con
producción de sulfuro de hidrógeno y la dos azúcares restantes lactosa y sacarosa sin fermentar la observación
del sulfuro de hidrógeno se observa por la precipitación de hierro el sulfato ferroso que se lo evidencia por un
fondo de color negro me está indicando que la glucosa a sido fermentada por qué para que se produzca este
compuesto necesito un medio ligeramente ácido entonces el color negro del fondo esta enmascarados el color
amarillo de la fermentación de la glucosa entonces cuando yo veo al fondo de color negro seguro glucosa a sido
fermentada no va acompañado de la fermentación de las otras dos azúcares pero podría darse el caso en el que
haya fermentación de lactosa y sacarosa y el bisel también se amarillo
En este caso voy a decir fermentación de glucosa fermentación de lactosa y/ o sacarosa y fondo con producción de
sulfuro de hidrógeno
LA FERMENTACIÓN INDIVIDUAL DE HIDRATOS DE CARBONO EN MEDIO LÍQUIDO en el medio TSI nos quedaba la duda
cuando en el medio estaba todo de color amarillo si es que laglucosa había sido fermentada junto a la lactosa sacarosa o
junto con alguna de las dos azúcares para poder determinar cuál es la azúcar que se está fermentando junto con la
glucosa se recurre estos medios líquidos de fermentación.
Los componentes extracto de carne pluripeptona cloruro de sodio y tiene un azúcar qué puede ser glucosa lactosa
sacarosa y el indicador que púrpura bromo cresol que a pH 7 es violeta y a ph5 es amarillo como el medio se ajusta a pH
7 Se observa de color violeta
Este medio líquido además a tener una campana de Durham qué va a permitir la determinación de la producción de
dióxido de carbono si es que la fermentación del azúcar va acompañada de la producción de dióxido de carbono
Se siembran 3 tubos uno que tiene glucosa uno que tiene lactosa y otro con sacarosa y lo voy a sembrar a partir de un
cultivo puro de la enterobacteria a identificar con ansa voy a tomar una porción de cultivo con ansa estéril y
directamente voy a descargar el ansa en el medio líquido esos tres medios entonces van a incubarse a 24 horas a 37
grados centígrados y realizó la lectura de los resultados
A partir de la fermentación del azúcar se van a producir compuestos ácidos qué van a producir el viraje del indicador
 Que la bacteria no fermenta el azúcar RESULTADO NEGATIVO el resultado queda tal cual Violeta
 O bien que la bacteria fermente el azúcar por la producción de ácidos ósea se observa el viraje del indicador a
color amarillo esta fermentación puede ir acompañada de la producción de gas se van a observar burbujas en la
campana de Durham si hay producción de gas
La burbuja dentro de la campana de Durham tiene que ser mayor a un centímetro sino mide más de un centímetro no
indica la producción de dióxido de carbono puede ser que si es menor se haya producido por la manipulación del tubo
ya que puede entrar aire en la campana
Estos resultados deben concordar con los obtenidos en la prueba TSI si yo tuve una prueba TSI con el fondo con el fondo
solamente ACIDO en los medios líquidos de fermentación voy a esperar tener solo un resultado positivo en el tubo que
tiene glucosa y en el tubo que tengo LACTOSA Y SACAROSA voy a esperar tener un resultado negativo
Si eso no es así quiere decir que en algún paso nos equivocamos porque se tiene que haber una concordancia entre el
medio TSI con la fermentación de hidrato de carbono en medio líquido
Si yo tengo un medio TSI todo amarillo en los medios líquido de fermentación sí o sí voy a tener voy a tener un resultado
positivo para la fermentación de la glucosa y voy a poder tener un resultado positivo en lactosa y sacarosa o bien en
alguna de las azúcares pero un azúcar de mayor concentración lactosa sacarosa tiene que ser fermentada por el
microorganismo
También se puede estudiar si la FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA SE HACE POR LA FERMENTACIÓN ÁCIDO MIXTA O DE
LA FERMENTACIÓN BUTILENGLICOLICA DE GLUCOSA
Para eso utilizó un medio que se llama APGP medio líquido porque sólo tiene agua peptona fosfato y glucosa en este
medio el principal componente de la glucosa y no hay un indicador de PH, después de la incubación vamos a tener que
revelar el resultado no lo puedo ver directamente después de la incubación en el caso como era el caso de las dos
pruebas anteriores
Procedimiento de siembra cultivó puro enterobacterias identificar tomar una porción del cultivo con ansa estéril
siembro incubo 48 horas a 37 grados y realizó la primera prueba de revelado para determinar si el microorganismo a
fermentar la glucosa a partir de la vía butilenglicolica es decir a partir de la formación de compuestos neutros como el
acetona, el diacetilo etcétera para ello en condiciones de asepsia sacó mililitro de cultivo y hacer la reacción de VOGES
PROSKAUER con el alfa naftol hidróxido de potasio un RESULTADO POSITIVO va a estar dado por la aparición de un color
rojizo color rosado y si LA PRUEBA NEGATIVA no se observa ese color, si esa prueba negativa este medio de cultivo se
incuban por 72 horas a 37 grados centígrados y se realiza la segunda prueba de revelado para eso vamos a sacar un
mililitro del cultivo y vamos a hacer la PRUEBA DEL ROJO DE METILO ROJO DE METILO es un indicador de PH qué pH 6 es
color amarillo y a ph4,4 es de color rojo; resultado de la PRUEBA DE POSITIVA si tenemos un color rojo intenso y
NEGATIVA cuando no haya viraje del indicador
La prueba positiva porque si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía ácido mixta se produce una elevada
cantidad de ácido qué hace que disminuya el pH por debajo de 4,2 entonces al estar tan bajo el pH entonces el indicador
vira a color rojo
Hay microorganismo que tienen las dos vías pueden utilizar las dos vías para fermentar la glucosa y las condiciones
ambientales van a hacer que el microorganismo elija una u otra vía; si el microorganismo está en un medio de cultivo
cuyo pH está muy ácido no elegir la vía ácido mixta para fermentar la glucosa y seguir produciendo más ácido ya que
esto va a inhibir su crecimiento sino que va elegir la vía butilenglicolica con la cual va a fermentar la glucosa con la
liberación de compuestos neutros de esa manera no va modificar tanto pH del medio va a seguir creciendo
Hay microorganismo que tienen una vía
Otro medio que se puede utilizar para PARA VER LA UTILIZACIÓN DE LACTOSA EN MEDIO LECHE
Medio líquido que está constituido por leche descremada en polvo reconstituida y púrpura bromo cresol
Este medio de lecho lo siembro con ansa apartir de una cultivo puro y lo incubo por 24 a 5 días a 37 grados centígrados y
luego realizó la lectura de los resultados
La PRUEBA SON NEGATIVAS es decir que no se ha fermentado lactosa cuando el medio queda tal cual en un color medio
celeste no hay modificación en el medio entonces la bacteria no posee la beta galactosidasa qué es la enzima necesaria
para utilizar la lactosa
PRUEBA POSITIVA para la lactosa cuando se observe el viraje del indicador y si movemos el tubo se observa un coágulo
un coágulo que tiene ciertas características es un coágulo blando Y reversible viraje del indicador es a color amarillo y la
presencia del coágulo me está indicando que la bacteria posee la enzima beta galactosidasa
EL COAGULO reversible que se ha producido por la acidificación del medio si yo vuelvo a neutralizar agregando una
solución de hidróxido de potasio el coágulo se desarma
Si en el medio TSI me a dado todo el medio de color amarillo y en el medio líquido de fermentación medio de color
amarillo para glucosa y de color amarillo para lactosa; en este medio también se tienen que observar fermentación de la
lactosa y de esa manera las tres pruebas se relaciona
Con respecto al metabolismo de los ácidos orgánicos vamos a tener el CITRATO COMO ÚNICA FUENTE DE CARBONO
Vamos a tener un medio químicamente definido que el medio citrato Simmons todos los componentes tienen una
composición química conocida los componentes más importantes son el citrato de sodio fosfato de amonio y el azul de
bromo timol qué es amarillo pH 6,1 y azul a pH 7 como el pH final es 6,9 el medio se ve de color verde
El medio citrato de Simmóns es un medio sólido como yo tengo que evitar la contaminación de este medio con algún
azúcar que provenga del medio en el cual el microorganismo ha crecido entonces necesito sembrar con aguja en este
caso como yo no tengo que contaminar el medio citrato de simmons con ninguna otra fuente de carbono diferente al
citrato si yo tuviera un cultivo desarrollada en un medio líquido lo que tengo que hacer es lavar esa célula eliminar el
medio de cultivo en el cual han crecido lavarlas con agua destilada solución fisiológica y resuspender las en el mismo
diluyente y ahí recién tomó las células para la siembra que se realiza por estría en el bisel teniendo la precaución de no
contaminar con fuentes exógenas de carbono este cultivo va incubarse 7 días a 37 grados centígrados y luego se realiza
la lectura de los resultados
La PRUEBA SER NEGATIVA cuando no haya viraje del indicador en medio queda verde
La PRUEBA SER POSITIVA cuando se observe el viraje del indicador de PH lo cual me está indicando que microorganismo
posee el citrato permeasa y al resto de la enzima para la utilización de citrato como única fuente de carbono hay un
viraje del indicador a color azul porque al producirse la utilización del citrato el sodio que se libera va a reemplazar al
amonio de las sales de fosfato y ese amonio que queda libre en el medio se va a combinar con él agua iba a formar el
hidróxido de amonio que va a incrementar el pH entonces lo vamos a ver al medio de color azul
Con respecto al metabolismo de los compuestos nitrogenados se puede observar la DEGRADACIÓN DE CASEÍNA EN EL
MEDIO DE LECHE qué es exactamente el mismo medio en el cual yo puedo estudiar la fermentación de la lactosa
utilizamos el medio leche descremada en polvo más el indicador de púrpura bromocresol yo siembro el microorganismo
en este medio leche y con este medio de leche yo puedo determinar si el microorganismo fermenta la lactosa o tiene
actividad caseinolitica
Sembramos el medio leche incubamos se realiza la lectura de los resultados y el medio queda tal cual PRUEBA
NEGATIVA la bacteria no posee la enzima quimosina que degrada la caseína
Si LA PRUEBA ES POSITIVA yo voy a ver la formación de un coágulo sin viraje del indicador el medio queda como de
color púrpura Pero voy a ver la formación de un coágulo qué es diferente al coágulo que se forma por la acidez porque
este coágulo es firme cuando se mueve el tubo no se desarma se llama Coagulo enzimático este coagulo puede ser
degradado produciéndose un proceso de peptonizacion que se separa suero y está comenzando a degradarse el coagulo
enzimático
METABOLISMO DE COMPUESTOS NITROGENADOS
Para solidificar un medio se puede ir a utilizar Agar o gelatina, pero el problema con la gelatina es que había
microorganismos que tienen la capacidad de licuarla tiene la capacidad de hidrolizar
DEGRADACIÓN DE LA CASEÍNA EN EL MEDIO CALDO GELATINADO
En UN medio complejo que tienes extracto de carne pluripeptona cloruro de sodio gelatina bacteriológica el pH 6 con 7
A 20 grados centígrados este caldo gelatinado este caldo en realidad es un es un medio semisolido lo vamos a sembrar
por punción voy a tomar del cultivo puro de la enterobacterias sembramos por punción luego ese cultivo se incuba entre
48-72 horas a 37 grados centígrados se realiza la lectura de los resultados teniendo en cuenta que primero tengo que
refrigerar el tubo antes de observar el resultado
Si pasó del estado gel al sol significa que la PRUEBA ES POSITIVA Pero si yo luego de sacarlo de la heladera ese medio es
sólido quiere decir que la PRUEBA ES NEGATIVA y que el microorganismo tiene la capacidad de degradar la gelatina
Otra prueba para estudiar metabolismo de los compuestos nitrogenados en la PRODUCCIÓN DE INDOL A PARTIR DE
TRIPTÓFANO
El caldo de triptófano es un medio líquido en su composición tiene ese aminoácido lo sembramos con el ansa estéril lo
incubamos 24 horas a 37 grados centígrados y luego realizó el revelado de los resultados con GRACIN I Y II PRUEBA
POSITIVA la aparición de un anillo de color rosado en la parte superior es decir la producción de indol a partir de
triptófano entonces microorganismo tiene la enzima triptofanasa
Si no se observa el anillo LA PRUEBA NEGATIVA
HIDRÓLISIS DE LA UREA
Es decir si el microrganismo tiene la enzima ureasa tenemos el medio Agar urea de christensen qué tiene dos
componentes principales que son el la urea y el rojo fenol qué es el indicador a pH 8,5 es rojo y a pH 6,9 es amarillo
Es medio sólido que se lo hace solidificar en bisel en este caso hay que tener en cuenta que la urea es un compuesto
termolábil entonces todo el resto del medio se prepara se esteriliza por autoclave y luego la urea qué es esterilizada por
filtración se adiciona a ese medio en condiciones de asepsia y se lo deja solidificar bisel se lo siembra por estría en el
bisel se incuba 24 horas de 37 grados centígrados posibles resultados que no prueba negativa sin viraje del indicador
PRUEBA POSITIVA con viraje del indicador y el medio se torna de color rojizo el viraje del indicador me indica que la
bacteria posee la enzima ureasa
Con respecto al METABOLISMO DEL OXÍGENO
Los microorganismos aerobios resisten el oxígeno tienen encima que le permiten eliminar aquellos compuestos tóxicos
qué se producen de la reducción incompleta del oxígeno por ejemplo la catalasa la peroxidasa la superoxido dismutasa
en el caso de los aerobios obligados o facultativos tenía la catalasa y la superóxido dismutasa para poner en evidencia la
presencia de esa enzima los microorganismos se utiliza el peróxido de hidrógeno cuando se adiciona el peróxido de
hidrógeno si la enzima está presente Se observa el desprendimiento de oxígeno en la práctica lo que se hace es colocar
sobre un portaobjetos tres o cuatro gotas el peróxido de hidrógeno y luego se tomó una porción del cultivo de la
bacteria que estoy identificando y se la coloca sobre el agua oxigenada se homogeniza y se observa que la PRUEBA
POSITIVA cuando en un organismo tenga la enzima catalasa debido al desprendimiento de oxígeno se observan burbujas
Para estudiar la movilidad
Se utiliza la PRUEBA EN AGAR BLANDO
Tengo un medio con una concentración baja de Agar 0,3 a 0,5% de Agar o sea que es un medio semisolido se siembra
por punción a partir del cultivo del microorganismo identificar se incuba 48-72 horas a 37 grados centígrados se observa
que aquellos microorganismos que no tengan movilidad la prueba negativa el crecimiento se va a dar a lo largo del canal
de punción mientras que los microorganismos que tienen movilidad se ve que el crecimiento se desplaza hacia los lados
del canal de punción y eso va a ser una prueba positiva
La prueba en Agar blando depende del estado fisiológico de la célula si viene en una prueba que se utiliza para
identificar microorganismos no es una prueba determinante porque puede ser que dentro de un género ciertas especies
sean móviles y ciertas especies no