Sunteți pe pagina 1din 10

DETERMINAREA ANTOCIANILOR

DIN AFINE PRIN METODA


HPLC

CUPRINS

1. INTRODUCERE...................................................................................................3
2. MATERIA PRIMA...............................................................................................4
3. GENERALITATI- HPLC....................................................................................6
4. METODE DE ANALIZA.....................................................................................7
5. REZULTATE SI DISCUTII.................................................................................8
6. BIBLIOGRAFIE...................................................................................................9

1. INTRODUCERE

Antocianii sunt coloranţi naturali, care au atras interesul nu doar datorită culorilor plăcute
regăsite ȋn fructele şi legume ci şi datorită faptului ca sunt molecule biologic active cu beneficii
pentru sănătate. Cele mai bogate surse de antociani sunt fructele de pădure, precum afinele, soc,
aronia, zmeură, legumele şi unele cereale.

Antocianii prezintă o serie de proprietăţi benefice, dintre care cea mai importantă constă
în efectul lor antioxidant. Datorită acestei proprietăţi, antocianii pot asigura organismului, în
primul rând, protecţie împotriva reacţiilor nocive intense şi a radicalilor liberi (Scalbert și
Williamson, 2000). Există multe studii ȋn literatură care au sugerat şi demonstrat că aceştia oferă
protecţie şi previn bolile degenerative (Jing și Giusti, 2011).

De asemenea, acestea pot fi utilizate în domeniul tehnologic, ca și coloranți naturali


(Ahmadiani, 2012, Socaciu, 2007). Antocianii au un rol foarte important în industria alimentară,
farmaceutică și cosmetică, ȋnsa sunt puţin folosiţi deoarece nu sunt foarte stabili şi se extrag din
material prima ȋntr-un procent redus. În prezent, majoritatea studiilor pe antociani au ca obiectiv
rezolvarea acestor probleme, precum și cele legate de purificare a extractului, și de evaluare a
efectului lor antioxidant pe culturi celulare (Castaneda-Ovando et al., 2009).

Antocianii aparțin clasei de metaboliți secundari vegetali, cunoscută sub denumirea de


flavonoide și sunt responsabili pentru culorile roșu, portocaliu sau albastru, conferite legumelor
și fructelor (Giusti și Wrolstad, 2003) (Fig. 2). În flori și plante ornamentale antocianii au o
structură chimică mult mai complexă decȃt cei din fructe și legume. Excepție de la aceasta regulă
fac afinele şi strugurii, deoarece conţin antociani ȋn număr mare cu structuri chimice complexe
(Cara et al., 2008). Solubilitatea şi stabilitatea lor ȋn mediu apos au dus la utilizarea acestora ȋn
industria alimentară, ca şi coloranţi (Castanelo Osvaldo et al, 2009; Socaciu, 2007; Pazmino-
Duran et al, 2001).
Fig. 1. Structura chimică a celor mai importanţi antociani (adaptată după Harborne,1998).

2. MATERIA PRIMA
Afinul (Vaccinium myrtillus) este un subarbust (arbust mic), stufos, rămuros, cu tulpina de
culoare verde, lungă de circa 30-60 cm, cu ramuri anguloase.Frunzele sunt scurt-pețiolate, mici, ovale,
denticulate (crestate pe margine), verzi pe ambele fețe.Florile sunt verzui roșietice, albe sau rozé cu
petalele unite sub formă de clopoțel, dispuse câte 1-2 la axila (subțioara) frunzelor. Înflorește în lunile
mai-iunie. Fructul este numit afină și reprezintă o baca de culoare albastru-închisă sau albastru-brumărie,
de formă rotundă, cu diametrul de 0,5 - 0,6 cm, zemoasă, cu suc violaceu, cu gust plăcut dulce acrișor.

Fructele de afin au în compoziţia lor substanţe antibacteriene şi antiseptice şi, foarte important, un
echivalent vegetal al insulinei. Sărurile de calciu, potasiu, sodiu, magneziu, vitaminele precum A, C, B1,
B2 şi proteinele conţinute în fructul gustos de afin (chiar şi după ce fructele sunt uscate) transformă acest
semiarbust într-un medicament natural miraculos pentru sănătatea ta.

Fructele de afin contin cca 86% apa. Continutul in protide este relativ redus (0,6%), iar acizii
organici sunt in proportie de cca 1%, dintre care acidul citric cca 0,9%, iar acidul benzoic, tartric si malic
intre 0,05-0,15%. Contin cca 13% hidrati de carbon, saruri de K (65 mg%), Ca (10 mg%), Na (l mg%), P
(10 mg%) si Fe (0,7%), taninuri, pectine si pectoze, o substanta coloranta, mirtilina si antocianozide, care
joaca rolul de vitamina P. Continutul in provitamina A este in jur de 20 mg%, in vitaminele Bl si B2 si in
niacina intre 0,02-0,04 mg% fiecare, iar vitamina C este clar repre-zentata (cca 15 mg%). Vitamina E
exista in cantitati mici. Ca saruri minerale, contin K (50 mg%), calciu (10 mg%), fosfor, sulf, magneziu,
mangan, fier (1 mg).
Puterea energetica a fructelor crude este de 60 kcal, din care se resorb 90%

FIG2. Afine
(Sursa: www.healthline,ro)

Beneficile afinelor:

Componentele antioxidante ale afinelor sunt cunoscute mai ales pentru protectia
sistemului cardiovascular. Potrivit diverselor cercetari în acest domeniu, consumul regulat de
afine (medie de 1-2 cani pe zi) pentru o perioada de 1 la 3 luni îmbunatateste echilibrul de
grasime din sange, reduce colesterolul rau, scade nivelul trigliceridelor si imbunatateste
colesterolul HDL. De asemenea s-a constatat ca consumul regulat al acestui fruct gustos ajuta la
mentinerea tensiunii arteriale. Prin urmare, este foarte benefic pentru persoanele care sufera de
probleme cardiovasculare sau hipertensiune arteriala.

Afinele sunt o mare sursa de mangan, care joaca un rol foarte important în cresterea,
rezistenta si puterea oaselor. O cercetare din 2010 a dovedit ca animalele care au fost hranite cu
ratii continand afine uscate si congelate au dezvoltat o masa osoasa mult mai sanatoasa si mai
puternica decat alte animale care au fost hranite cu ratii care nu contineau afine. Ele ajuta foarte
mult la dezvoltarea osoasa a copiilor si pentru a restabili puterea oaselor la adulti si persoanele in
varsta.

Consumul regulat de afine va mentine, de asemenea, o inima sanatoasa si va poate proteja


impotriva atacurilor de cord. Acestea contin anumiti compusi care largesc arterele si previn
blocarea acestora cu grasime. Potrivit studiilor, persoanele care mananca 3 – 4 portii de afine în
fiecare saptamana sunt cu 32% mai putin predispusi de a suferi un atac de cord.

Cercetatorii au descoperit ca afinele contin compusi fenolici care lucreaza impotriva


celulelor canceroase. O constatare importanta a cercetarii este aceea ca femeile care au avut in
dieta lor un aport ridicat de afine au fost cu 34% mai putin susceptibile de a dezvolta cancer
ovarian decat cele care au avut o dieta saraca sau fara afine.

3. GENERALITATI- HPLC

Separarea cromatografică are la bază interacţia diferenţiată a componenţilor unei probe


faţă de două faze, numite: faza staţionară şi faza mobilă (aflată în mişcare faţă de faza
staţionară). Procesul se petrece într-o coloană cromatografică, sau pe suprafaţa plană a unei plăci
pe care este depusă faza staţionară. Analiza cromatografică este un proces cuplat între separarea
cromatografică şi determinarea (detecţia) compuşilor separaţi (proces care se bazează pe
măsurarea unei proprietăţi fizice). Din această prezentare, rezultă că separările cromatografice
pot fi clasificate fie din punct de vedere al naturii celor două faze (staţionară şi mobilă), fie din
punct de vedere al mecanismului de separare, sau fie din punctul de vedere constructiv al
ansamblului de faze.
FIG. 3. Aparatura HPLC
(Sursa: www.indiamart.com)

Din punct de vedere al naturii celor două faze distingem următoarele clase de separări
cromatografice:
- cromatografie de gaze (GC) în care faza mobilă este un gaz inert; în funcţie de natura fazei
staţionare se disting următoarele tehnici gaz-cromatografice:
a) separarea gaz-lichid în care faza mobilă este un gaz inert, iar faza staţionară este un
„lichid”, depus pe un suport inert, sau pe peretele unei coloane cromatografice;
b) separare gaz-solid (SGC), în care faza mobilă este un gaz inert, iar faza staţionară este un
solid;
- separare prin cromatografia de lichide (LC), în care faza mobilă este un lichid, iar faza
staţionară este de regulă un solid;
- cromatografie în fluide supercritice (SFC), în care faza mobilă este un fluid supercritic.
Mecanismul care stă la baza de separării cromatografice se poate baza pe: adsorbţie; repartiţie;
schimb ionic; excluziune sterică, etc.
Adeseori, procesele cromatografice pot decurge printr-o combinaţie a acestor
mecanisme. In funcţie de mecanismul de separare cromatografia de lichide (în care polaritatea şi
hidrofobicitatea analiţilor, a fazei staţionare şi a fazei mobile joacă un rol determinant) se
împarte în trei variante:
i) cromatografia de lichide în faza normală (denumită aşa mai degrabă din punctul de vedere
istoric), în care faza staţionară este polară, iar faza mobilă este nepolară;
ii) cromatografia de lichide în faza inversă, în care faza staţionară este nepolară şi hidrofobă, iar
faza mobilă este polară.
iii) cromatografie de lichide prin mecanism de schimb ionic, în care faza staţionară este un
schimbător de ioni, iar faza mobilă este apoasă cu pH controlat.
Din punct de vedere constructiv se disting: cromatografia pe coloană şi cromatografia
planară (pe hârtie sau pe strat subţire). In prezent, cromatografia pe coloană, în una din clasele
menţionate anterior reprezintă una dintre cele mai importante tehnici de investigare a probelor
multicomponent în chimia analitică. După cum spune şi denumirea, rolul central în separarea
cromatografică îl are coloana cromatografică, în care se găseşte faza staţionară.
Cromatograma reprezintă dependenţa în timp a proprietăţii măsurate de detectorul
sistemul cromatografic. Intr-o cromatogramă întâlnim picuri cromatografice şi o linie de bază
(constantă sau variabilă).

4. METODE DE ANALIZA

Identificarea și cuantificarea antocianilor din extractele de afine s-au realizat prin tehnica
HPLC.

Extracția. Afinele s-au omogenizeazat cu metanol conținȃnd HCl (0,3%). Extractele au


fost ulterior concentrate la 350 C sub presiune redusă, apoi filtrate printr-un filtru de 0.45 µm
ȋnainte de a fi analizate.

Analiza cantitativă HPLC a antocianilor. Analizele HPLC s-au realizat cu ajutorul unui
system HPLC , echipat cu detecţie cu fotodiodă. Gradientul de eluare a constat ȋn: faza mobilă A
- acid formic (4.5%) în apă bidistilată și faza mobilă B - acetonitril.
Cuantificarea antocianilor totali. Conţinutul total de antociani a fost determinat printr-o
metodă bazată pe proprietatea antocianilor de a-și schimba culoarea ȋn funcție de pH. Conținutul
total de antociani monomerici (echivalenți cianidin 3-galactozid/100 mg fruct proaspăt) a fost
calculat astfel: conţinutul de antociani (mg/L) = (A x MW x DF x 1000)/ ε x L.

unde A = (A510 nm pH 1.0-A700 nm pH 1,0) - (A510 pH 4.5 nm - A700 nm pH 4,5),


Masa moleculară a cianidin 3-galactozidului (484.84); DF = factorul de diluție; ε =
absorbtivitatea molară a cianidin 3-galactozidului în metanol / HCl (34,300 M-1 cm -1 ); L =
drumul optic (1 cm) (Giusti și Wrolstad, 2001).

5. REZULTATE SI DISCUTII

Analiza cantitativă HPLC a antocianilor

Analiza calitativă se realizeaza prin compararea timpilor de retenție şi a spectrelor UV-


VIS a antocianilor din probe luate ȋn studiu cu cele ale standardelor (cianidin-3- galactozid,
cianidin-3-glucozid, delfinidin-3-ramnozid, pelargonidin-3-glucozid, delfinidina, peonidin-3-
glucozid, malvidin-3-glucozid, cianidin, malvidin), precum şi cu datele din literatură. Analiza
cantitativă se realizeaza cu ajutorul curbelor de calibrare obţinute pentru standardul cianidin-3
glucozid.
6. BIBLIOGRAFIE

1. GIUSTI M. M., RODRIGUEZ-SAONA L. E. and WROLSTAD R. E., 1999. Molar


absorptivity and color characteristics of acylated and non-acylated pelargonidinbased
anthocyanins. J Agr Food Chem, 47(11):4631-4637.
2. GIUSTI M.M., WROLSTAD R.E., 2003. Acylated anthocyanins from edible sources and
their applications in food systems. Biochemical Engineering Journal 14: 217-225
3. HE J. and GIUSTI M.M. 2010.Anthocyanins: natural colorants with health-promoting
properties. Food Sci. Tech. 1: 163-187.
4. SOCACIU C., 2007. Food colorants: chemical and functional properties. Boca Raton:
Taylor & Francis. 616-617
5. CASTANEDA-OVANDO A., PACHECO-HERNANDEZ M.D.L., PAEZ-HERNANDEZ
M.E., RODRIGUEZ J.A., and GALAN-VIDAL C.A., 2009. Chemical studies of
anthocyanins: A review. Food Chem; 113:859-871.
6. CARA R. WELCH, QINGLI WU and JAMES E. SIMON, 2008. Recent Advances in
Anthocyanin Analysis and Characterization, Curr Anal Chem, 4(2): 75–101.
7. WILLY K. , D. DUFOUR, 1997, Health Functionality of Blueberries, American Society for
Horticular Science, 216–221
8. G. MAZZA,COLIN D. Kay, T. COTTREL, B. J. HOLUB, 2002, J. Agric. Food Chem, 50, 26,
7731-7737