Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
La première étape est le choix d’un caractère que l’on veut introduire dans la plante, comme
par exemple des caractères de qualité nutritionnelle, la résistance à certains insectes, à
certaines maladies, à des herbicides, etc. Ensuite, il faut procéder à l’identification et au
clonage du ou des gènes à l’origine du caractère recherché. Ce gène d’intérêt peut provenir de
tout organisme vivant, plante, animal ou bactérie puisque le code génétique est universel.
Puis, il est intégré dans une construction génique associant souvent un gène marqueur. Ce
gène marqueur permet de sélectionner les cellules qui ont intégré le gène d’intérêt. La
construction est ensuite multipliée (clonée) afin de disposer d’une quantité suffisante d’ADN
pour son introduction dans les cellules végétales que l’on veut transformer.
soit une projection d’ADN (biolistique) dans les cellules de la plante par l’utilisation
d’un canon à particules qui projette dans les cellules des microparticules de métal (or
ou tungstène) enrobées des constructions géniques,
soit l’introduction d’ADN dans des protoplastes, par action d’un agent chimique ou
d’un champ électrique (électroporation).
Les cellules issues de différents types de tissus végétaux peuvent être soumises à la
transformation. Selon les espèces, ce seront des disques foliaires, des sections de tige, des
cotylédons, des embryons, des microspores ou des protoplastes. On utilise le plus
fréquemment des disques foliaires comme pour le tabac ou la tomate.
Après sélection des cellules transformées, il faut régénérer les nouvelles plantes
transgéniques. Les cellules transformées se développent d’abord en cals, larges amas de
cellules indifférenciées. Après quelques semaines, on observe le développement de pousses.
Elles sont alors placées dans un nouveau milieu de culture permettant le développement des
racines. Quand les racines sont suffisamment développées, les plantules sont repiquées en pot
et acclimatées en serre.
La régénération in vitro des cellules transformées est une étape difficile à maîtriser. Aussi, le
génotype, le type de tissus et les conditions de culture sont choisis en fonction de leur aptitude
à la régénération.
Les plantes transformées obtenues sont soumises à des croisements contrôlés pour étudier les
modalités de transmission du nouveau caractère à la descendance.
LA TRANSFORMATION BIOLOGIQUE
Cette technique utilise une bactérie du sol, Agrobacterium, qui a la propriété de réaliser
naturellement la transformation génétique d’une plante, afin de la parasiter.
Ainsi, une construction génique introduite dans la bactérie (rendue avirulente au préalable)
sera transférée dans la plante et intégrée à son génome. Cette technique est la plus
couramment utilisée.
Après la co-culture, les explants sont lavés pour éliminer les agrobactéries. Il faut ensuite
sélectionner les cellules qui sont effectivement transformées. Pour cela, on apporte dans la
culture des explants un agent sélectif approprié : herbicide, antibiotique… Seules les cellules
végétales transformées, possédant et exprimant le gène de sélection : résistance à un herbicide
ou à un antibiotique, pourront se développer sur ce milieu.
Applications
L’aptitude à la transformation
Pour effectuer des transformations biologiques en routine, il est nécessaire d’avoir une
méthode de transformation très efficace. Trois facteurs interviennent à ce niveau : la virulence
de la souche bactérienne, la sensibilité des cellules vis à vis de la bactérie, et le choix du
marqueur de sélection. La durée de la co-culture doit également être déterminée, un délai trop
long peut affecter la survie des tissus et l’aptitude à la régénération.
Le prétraitement de l’explant
L'UTILISATION D'AGROBACTERIUM
La bactérie du sol Agrobacterium tumefaciens provoque chez les plantes infectées une
tumeur, la galle du collet. Une autre espèce, Rhizobium (ex. Agrobacterium rhizogenes),
parasite également les plantes selon les mêmes mécanismes qu’A.tumefaciens. Elle provoque
le développement anarchique et très important du système racinaire appelé chevelu racinaire.
On a démontré que le parasitisme d’Agrobacterium repose sur le transfert d’une partie de son
plasmide dans les chromosomes de la plante. Cette partie qui est transmise au génome de la
plante est appelée ADN-T pour ADN Transféré.
Il s’agit d’une partie constante de l’ADN du plasmide de la bactérie qui est délimité par des
bordures, bordure gauche et bordure droite, constituées par des séquences de 25 nucléotides.
La région comprise entre ces frontières est transférée à la plante. Elle contient les gènes qui
confèrent à la plante des propriétés tumorales, c’est-à-dire qu’ils entraînent la prolifération
continue et incontrôlée des cellules végétales par production d’hormones de croissance.
Des gènes entraînant la synthèse d’opines sont également présents sur l’ADN-T. Les opines
sont des acides aminés spécifiques des bactéries qui ne sont pas habituellement présentes dans
les tissus végétaux sains. Les cellules végétales transformées synthétisent les opines qui
favorisent la multiplication des souches pathogènes en détournant une partie de l’activité
photosynthétique de la plante au profit des bactéries.
Sur le plasmide, en dehors de l’ADN-T, on trouve une région de virulence. Cette dernière
n’entraîne pas directement la formation de la maladie, mais est indispensable au transfert et à
l’intégration de l’ADN-T.
tumefaciens est la bactérie la plus employée. Le principe est de modifier son plasmide
Ti afin qu’il n’y ait pas de formation de la galle du collet, mais que le transfert et
l’intégration des gènes désirés dans le génome des plantes se fasse.
Des plasmides Ti désarmés sont construits. Pour ce faire, les gènes situés sur l’ADN-
T, et responsables du pouvoir pathogène de la bactérie, sont délétés. Il est toutefois
nécessaire, pour la réalisation du transfert de gènes, de garder intactes les deux
bordures gauche et droite de l’ADN-T, ainsi que les fonctions de virulence. Entre les
deux bordures de l’ADN-T est insérée la construction génique. Elle est ensuite
introduite dans le végétal.
Des constructions ont été réalisées pour diminuer la taille des plasmides et pour simplifier les
méthodes d’insertion de gènes dans l’ADN-T. Ainsi, l’information génétique, nécessaire au
transfert et à l’intégration dans le matériel végétal de la construction génique, a été répartie en
deux plasmides.
L’un est le plasmide d’Agrobacterium sans son ADN-T et possédant encore les gènes de
virulence. Il induit à distance le transfert de l’ADN-T recombiné de l’autre plasmide, on parle
d’action en trans. L’autre plasmide est un vecteur de petite taille qui porte l’ADN-T
recombiné, donc la construction génique. Ce vecteur, appelé vecteur binaire, possède la
capacité de se répliquer dans Agrobacterium mais aussi dans E. coli. C’est donc à la fois un
vecteur de transfert et un vecteur de clonage.
L'utilisation d'agrobacterium
Bacillus thuringiensis a été découvert et isolé par un bactériologiste japonais qui étudiait ses
propriétés létales sur le ver à soie. Cette bactérie est utilisée pour protéger des plantes depuis
1933. À partir de 1950, son utilisation a été étendue aux forêts et aux vignobles. Dans les
forêts, Bacillus thuringiensis permet de lutter contre les lépidoptères défoliateurs.
Depuis 1976, des formes de cette bactérie permettent de lutter contre les larves de moustiques,
de coléoptères et de simulies, moucherons piqueurs qui se nourrissent de sang et propagent
des maladies.
Bacillus thuringiensis (ou Bt) est donc l’insecticide le plus utilisé au monde en agriculture
biologique. Il représente 95% des biopesticides.
LE TRANSFERT DIRECT
Des méthodes dites de transfert direct utilisent des moyens physiques ou chimiques pour
permettre la pénétration d’ADN, généralement sous forme de plasmides dans une cellule
végétale.
soit une projection d’ADN (biolistique) dans les cellules de la plante par l’utilisation
d’un canon à particules qui projette dans les cellules des microparticules de métal (or
ou tungstène) enrobées des constructions géniques,
soit l’introduction d’ADN dans des protoplastes, par action d’un agent chimique ou
d’un champ électrique (électroporation).
La biolistique
Le principe consiste à projeter sur des tissus des microparticules de tungstène ou d’or de 1 à 3
µm (1 µm = 10-6 m) de diamètre enrobées d’ADN, à l’aide d’un canon à particules. La force
de propulsion est obtenue par détente d’un gaz sous pression (l’hélium le plus souvent).
Certaines des micro-particules pénètrent dans les cellules, transportant avec elles l’ADN.
Quand la bille atteint le noyau, elle permet à l’ADN qu’elle transporte de s’y intégrer.
Cette méthode est facile d’emploi et permet d’obtenir des plantes transgéniques, notamment
chez les monocotylédones, comme le maïs, le blé, le riz. C’est ainsi qu’a été obtenu le premier
maïs résistant à la pyrale.
Cette méthode peut parfois engendrer l’insertion de nombreuses copies du gène d’intérêt. Il
faut donc trier les plantules obtenues par analyse moléculaire.
L’utilisation de protoplastes
Ces deux méthodes sont relativement faciles à mettre en œuvre, mais supposent toutefois la
possibilité de régénérer des plantes à partir de protoplastes, ce qui limite leur emploi chez les
espèces récalcitrantes. Les techniques de transfert direct nécessitent également une étape de
sélection des cellules transformées.
Le transfert direct
LA RÉALISATION DE LA CONSTRUCTION
GÉNIQUE
Identifier et isoler le gène d’intérêt
Un gène d’intérêt est constitué d’un promoteur, d’une séquence codante et d’un terminateur.
Tous ces fragments de gènes d’origines différentes, promoteur, séquence codante, terminateur
et gènes de sélection, sont assemblés in vitro. On obtient ainsi la construction génique qui est
multipliée puis utilisée pour l’étape de transformation.
La réalisation de la construction génétique
LA MULTIPLICATION DE LA CONSTRUCTION
GÉNIQUE : LE CLONAGE
Les plasmides sont des molécules d’ADN circulaires présentes chez les bactéries, en plus de
leur unique chromosome. Ils sont utilisés pour héberger la construction génique, car il est
relativement facile de travailler sur cette petite molécule d’ADN circulaire, qui possède de
nombreux sites de restriction. C’est alors un plasmide recombiné.
Le plasmide recombiné est ensuite réintégré dans une bactérie hôte, Escherichia coli. Par
culture de cette bactérie, on obtient une multiplication rapide du plasmide. C’est l’étape de
clonage de la construction génique. Par cette méthode de nombreuses copies du plasmide
recombinant sont ainsi obtenues.
La multiplication de la construction génique : le clonage
https://www.gnis-pedagogie.org/sujet/biotechnologies-etapes-transgenese/
Objectifs
La molécule d'ADN est une molécule universelle tant du point de vue de sa structure que de
sa fonction. Le code génétique qui permet de décoder l'information portée par la molécule
d'ADN est lui aussi universel. Aussi, un organisme qui a reçu un gène provenant d'une autre
espèce est capable de produire une protéine qui lui est totalement étrangère.
Une fois introduit dans le génome de l'espèce receveuse, le transgène s'exprime, ce qui
conduit à la production d'une nouvelle protéine par l'organisme transgénique.
Il permet l'acquisition par l'espèce receveuse d'un nouveau caractère.
2. Principe de la transgenèse
a. La transgenèse bactérienne
La transgenèse bactérienne consiste en l'introduction d'un gène d'intérêt d'origine animale ou
végétale dans le matériel génétique d'une bactérie.
Par exemple, après introduction du gène de l'interleukine, une protéine humaine,
l'interleukine, va être sécrétée par des bactéries.
b. La transgenèse végétale
La transgenèse végétale consiste en l'introduction d'un gène d'intérêt dans le matériel
génétique d'une espèce végétale.
Le transfert du gène d'intérêt peut se faire selon deux procédés.
• Il peut être transféré directement dans la cellule végétale selon des procédés physico-
chimiques visant à déstabiliser la membrane plasmique de la cellule receveuse.
Dans l'exemple ci-dessous, il s'agit de plants de maïs génétiquement modifiés qui vont
produire une substance d'origine bactérienne. Cette substance est toxique pour la pyrale, un
insecte ravageur des cultures de maïs.
• Il peut être transféré indirectement selon des procédés faisant intervenir des vecteurs
biologiques telles que les agrobactéries qui ont la capacité de transférer un plasmide dans le
cytoplasme des cellules végétales qu'elles infectent.
c. La transgenèse animale
https://www.maxicours.com/se/cours/la-transgenese/
https://www.google.com/search?source=hp&ei=M7TvXfvwKY3kU_WDlagH&q=la+transg%C3%A9n
%C3%A8se+v%C3%A9g%C3%A9tale+expos%C3%A9&oq=la+transgenese+vegetale&gs_l=psy-
ab.1.1.0i22i30l5.15681.77013..97893...0.0..0.199.3239.0j24......0....1..gws-
wiz.....0..0j0i131j0i131i70i256.DFX1AF6CLeU
Pour modifier génétiquement un organisme, il faut avoir accès à son ADN. Car c’est
dans son ADN que l’on va trouver les gènes qui contiennent les informations sur les
caractères des organismes vivants (la couleur des yeux, des cheveux, la production
de racines, la production de molécules pour réaliser la photosynthèse, etc..).
Il faut cependant faire attention à ne pas confondre cette technique avec celle de
la mutagénèse, qui consiste à générer des mutations au sein d’un génome. Elle
modifie l’information génétique mais sans rajouter de gène(s), contrairement à la
transgénèse.
Pourquoi vouloir insérer des gènes étrangers dans le génome d’un organisme ? Pour
le rendre meilleur, plus performant. La transgénèse, c’est un petit peu comme
quand vous achetez une voiture et que le modèle de base ne vous satisfait pas.
Vous voulez rajouter des jantes pour protéger les roues ou ajouter la climatisation
pour être au frais l’été. Et bien la transgénèse c’est ça mais avec des gènes. Elle
permet aux organismes chez qui elle est appliquée d’obtenir des caractéristiques
qu’ils n’avaient pas à la base afin de les rendre « meilleurs » si je puis dire ainsi.
La culture transgénique s’est développée depuis les années 1980. Ce sont les Etats-
Unis qui ont mis sur le marché le premier organisme génétiquement modifié. Il
s’agissait d’une tomate, la tomate Flavr Savr, le but étant de ralentir
l’amollissement des tomates, qu’elles restent fermes plus longtemps. Mais ce
fut malheureusement un échec, cette variété de tomate ayant entraîné des surcoûts
au niveau de leur production et de leur transport.
Ce dernier aspect (la résistance aux herbicides) est intéressant dans le sens où pour
des cultures non transgéniques, un agriculteur doit diffuser plusieurs herbicides : un
premier qui est dit « total », afin d’éliminer toutes les mauvaises herbes avant
d’ensemencer puis un second une fois que les pousses ont commencé à pousser.
De plus, les herbicides à utiliser sont spécifiques aux cultures : un herbicide pour par
exemple les céréales, un autre pour le tournesol, un autre pour le colza…
Plusieurs cultures comme celles du riz et du maïs, ainsi que des plantes cultivées
(tournesol, le houblon ou aussi bien la pomme de terre) ont des risques élevés d’être
attaquées par une larve, la larve de Pyrale. Celle-ci s’installe au cœur de la tige de la
plante et la dévore de l’intérieur, ce qui aboutit à des destructions massives de
plantes et donc à des récoltes mauvaises.
La Pyrale du maïs
Il fallait donc trouver un moyen pour lutter contre cette larve, autre que les
insecticides, très onéreux. Pour cela, le point faible de la larve a été exploité : il
s’agit d’une bactérie produisant une toxine, Bacillus thuringiensis, (nommé toxine
Bt) qui a comme effet de tuer la larve.
Des chercheurs ont donc manipulé l’ADN de la bactérie de manière à isoler le gène
produisant la toxine. Une fois le gène repéré, ils l’ont intégré dans le génome des
plantes en culture. Celles-ci pouvaient dont produire la toxine pour lutter contre la
larve et résister à ses attaques.
Cependant, malgré les prouesses de génomique dont sont issus les OGM,
la technique elle-même ne fait pas l'unanimité.
Une autre crainte liée aux organismes génétiquement modifiés est celle
concernant les insectes contre qui ces OGM sont censés résister. Pourraient-ils un
jour devenir eux-aussi résistants ?
Les écologistes et les agriculteurs prônant une agriculture sans OGM reprochent un
manque de contrôle en ce qui concerne la dissémination des OGM, qui serait à
l’origine d’une contamination des autres cultures.
Des tentatives afin d’utiliser d’autres organismes génétiquement modifiés avaient été
essayées mais n’ont mené à rien.
Preuve que le débat sur les OGM ne se joue pas que dans les champs de coton,
mais également dans les hautes sphères européennes.
https://www.echosciences-grenoble.fr/communautes/le-magazine-des-sciences-de-rcf-
isere/articles/les-organismes-genetiquement-modifies-ogm