Química de Biomateriales Poliméricos Universidad Nacional de Colombia

SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS ANFIFÍLICAS DE POLI(γ-PGA-g-L-Phe) COMO

POSIBLES VEHÍCULOS DE LISOZIMA EN AGENTES ANTIMICROBIANOS
Presentado a: León Darío Pérez Pérez
Edwin Alexander Robayo1, Néstor Camilo Posada2
Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias
1
earobayo@unal.edu.co, 2nposada@unal.edu.co
junio de 2019

1. Introducción
La polimerización entre el ácido glutámico (γ-PGA) y la fenilalanina etíl éster (L-Phe) es un
proceso conocido como “injerto a” para formar bioconjugados en la que a través de una parte de la
molécula biológica L-Phe se enlaza covalentemente con uno o más sitios reactivos del polímero
sintético (γ-PGA)1. Los bioconjugados generalmente se obtienen entre polímeros sintéticos unidos
covalentemente a una biomolécula; la selección del tipo de conjugación es considerada según varios
factores como la estructura, tamaño, forma, superficie y sitio de conjugación, así como los grupos
funcionales disponibles y la estructura tridimensional de la biomolécula. Todo esto es posible
gracias al uso de iniciadores funcionales, agentes de transferencia funcionalizados y/o modificación
posterior al polímero sintetizado2.

EL presente trabajo desea emplear un bioconjugado de fenilalanina metil éster (L-Phme) más
conocido aspartamo un edulcorante comercial de baja solubilidad con γ-PGA hidrosoluble, para
formar una nanopartícula copolimérica de injerto anfifílico, cuya síntesis no ha sido reportada hasta
el momento, además, desea encapsular lisozima, una enzima con actividad antibacteriana de gran
utilidad en la industria alimentaria. Cabe resaltar que hay reportes sobre el estudio de la síntesis de
γ-PGA-g- L-Phe que serán de gran aporte en la síntesis del copolimero γ-PGA-g- L-Phme, y por
otro lado también hay estudios sobre varios métodos de encapsulación para lisozima empleando
varios sistemas copoliméricos excepto el propuesto, los cuales serán de gran utilidad y aporte en
nuestra propuesta de investigación.

2. Planteamiento del problema

Desde la última década y actualmente los agentes microbianos y patógenos han aumentado su
resistencia a fármacos con mecanismos eficientes. Los seres microscópicos como bacterias, hongos,
parásitos y los virus poseen mecanismos metabólicos que les permite su supervivencia en diferentes
medios bajo condiciones especiales3. Cuando se implementa un antimicrobiano y su periodo de
implementación no es completo, este microrganismo puede ejercer resistencia a dicha molécula que
ataca sectores específicos de la estructura microbiana; estas vías de resistencia se dan por
contaminación de los medios ambientes con sustancias a las cuales los microrganismos se adaptan
paulatinamente; este proceso inicia cuando se aplica ineficientemente el antimicrobiano y el
microorganismo más resistente del total de la población se preserva y es el cual se reproduce con la
modificación inducida por la resistencia a las moléculas usadas para su control. Los mecanismos
que usan los microrganismos son enzimas inactivantes de antibiótico, impermeabilidad de la
membrana, alteración de porinas y/o polisacárido, modificación del sitio blanco (diana donde actúa
el antibiótico), vías metabólicas alternativas y protección citoplasmática del sitio blanco 4.

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Para la FAO es evidente que el hecho de implementar una nueva molécula de control con el tiempo
generara resistencia en las cepas y los mecanismos intrínsecos de los microorganismos se
priorizaran sobre los ambientales; ejemplo las membranas Gram positivas y Gram negativas, hacen
que los antibióticos beta lactámicos no encuentren el receptor adecuado para fijarse y ejercer su
efecto en las últimas5. Los mecanismos que ejercen los microorganismos en términos de ADN y
efecto cromosómico se pueden evitar en primera medida si se lleva a cabo la destrucción de la
membrana que recubre las estructuras de los organismos 6. Las membranas de los organismos están
constituidas por peptidoglucano sintetizado en tres sectores que son el citoplasma, membrana y
periplasma e inhibidores del mismo que ejercen resistencia a los antimicrobianos. Las enzimas Mur
A, B, C, D, F y G son las precursoras de la formación dichas membranas y las cuales se organizan
en rutas diferentes para configurar y proteger al microrganismo y sus organelos. Al ser un pool de
enzimas multivariadas hace difícil su inhibición por algunas moléculas, pero existe una enzima
capaz de detener la acción de las MUR enzimas para generar una lisis membranal por absorción de
agua. Esta enzima corresponde a muramidasa (N-acetil muramidaglicano hidrolasa, E. C. 3. 2.1. 17)
que ejerce una función de consumo de peptidoglucano de las paredes externas e internas de los
microorganismos7.

El principal inconveniente de dichas enzimas es que se encuentran en las lágrimas, estómago y el

huevo de gallina donde ejercen el carácter antimicrobiano y antinflamatorio. Estos medios
totalmente acuosos son de protección de la enzima que una vez es purificada y extraída en medios
externos se desnaturaliza fácilmente ya sea acción lumínica, química o térmica 8. Es evidente que es
necesaria entonces una protección para esta enzima para que su acción antimicrobiana sea aplicable
en diferentes sectores de la medicina, siendo así una buena opción el encapsulamiento de lisozima
por nanopartículas de copolímeros anfifílicos.

Pregunta problema
Debido a la problemática descrita anteriormente y su posible resolución se plantea la siguiente
pregunta problema: ¿Es posible la encapsulación de lisozima mediante el copolímero de injerto
Poli(γ-PGA-g- L-Phme) para uso antibacteriano?
3. Hipótesis
Mediante el mecanismo de reacción de injerto a se podrá obtener un copolímero entre γ-PGA e
injerto de L-Phme con características anfifílicas, las cuales formarán nanopartículas para la
encapsulación y liberación controlada de lisozima con actividad antibacteriana

4. Estado del arte

4.1 Resistencia antimicrobiana.

En la actualidad se han estudiado los grupos y mecanismos que los microorganismos presentan para
generar resistencia a moléculas definidas para su control o eliminación acarreadas en fármacos y
demás medios de diseminación. En una revisión amplia de información en el 2017 sobre resistencia
antimicrobiana Quiñones argumenta que no solo es evidente que los microrganismos poseen
mecanismos para adaptarse a los cambios y hacerse resistentes a moléculas y antibióticos, sino que
las entidades gubernamentales e industrias productoras de antimicrobianos deben ser conscientes en
la producción desmedida de dichas sustancias 3. En una primera aproximación describe Quiñones el
mecanismo poblacional por el cual el microrganismo se hace resistente, de igual modo en el 2015

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Blair y colaboradores plantean los mecanismos moleculares por los cuales los cuales se hacen
resistentes dichos organismos, tales como reduccion de permeabildiad de la membrana, hidrolisis de
los antibioticos en las membranas y citoplsamas, inactivacion de las moleculas de control por
transferencia de grupos quimicos entre otros 4.

Las investigaciones argumentan que aunque son varios mecanismos de resistencia el primero que se
presenta es el de resistencia a las paredes membranales de los organismos, Nikolaidis y
colaboradores en el 2014 analizan que los efectos membranales de organización y estructuracion
son efectos de las enzimas Mur las cuales permiten sintesis, estructura, permeabildiad de moleculas
entre el exteriror y el citoplasma 6. Para contraponer estas características de los microrganismos
existen una serie de enzimas que actúan sobre estas membranas, tal como lo presenta Carrillo en el
2013 donde describe las lisozimas como potenciales antimicrobianos y anti-alergenos, debido al
consumo de peptidoglicano de la membrana induciendo al microrganismo a una apoptosis por
ingreso de agua al citoplasma7 así permitiendo el control de poblaciones de microrganismos.

4.2 Encapsulación de lisozima

El primer reporte en la encapsulación de lisozima fue realizado por Young y colaboradores en 1999
usando un copolímero biodegradable poli(ácido lático-co-ácido glicólico) cargando la enzima en
suspensión de una solución de diclorometano con el copolímero y precipitada después de cargada
con CO2, aunque la eficiencia de la encapsulación la referencian como significantiva, es muy
subjetiva al ser valuada solo por el hinchamiento de la misma 9. En el 2000 Bezemer y colaboradores
usaron copolímeros en bloque anfifílicos de poli(etilenglicol-b-butilén tereftalato) y emplearon una
doble emulsión para la encapsulación de lisozima, obteniendo rendimientos hasta del 100% de la
enzima10. En el 2004 Were y colaboradores utilizaron liposomas fosfolípídicos para encapsular
lisozima y evaluaron su actividad antimicrobiana con Listeria monocytogenes, en el cual
encontraron una fuerte relación de inhibición según el liposoma usado 11. Para el 2006 Deng y
ayudantes cargaron lisozima con nanopartículas de quitosan y tripolifosfato con eficiencias de
47.3%12.

En el 2009 Kluge y colaboradores encapsularon lisozima con un rendimiento de 48.5% al emplear

nano y micropartículas biocompatibles usando poli(ácido lático-co-ácido glicólico) con un nuevo
método de síntesis al emplear fluidos supercríticos 13. Ma y colaboradores en 2011 usaron α-
ciclodextrina y un copolímero en bloque soluble en agua poli(ε-caprolactona-b-etilenglicol)14. En el
2017 Ansary y colaboradores realizaron por doble emulsión una nanopartícula core-shell con núcleo
de glucosa y corteza de poli(ácido lático-co-ácido glicólico) para la encapsulación de 83% de
lisozima15. Para el 2018 Wu obtuvo hidrogeles copoliméricos de quitosan y alginato de sodio y su
encapsulación fue alrededor de un 88% 16. Se han realizado muchas más investigaciones de
copolímeros para la encapsulación de lisozima, sin embargo, muchos de ellos se han realizado con
sistemas inorgánicos y los mismos copolímeros con nuevos métodos de obtención.
4.3 Síntesis de nanopartículas
La síntesis del copolímero Poli(γ-PGA-g- L-Phme) debe tener diferentes aspectos en cuenta
referente a los mecanismos que permiten la polimerización, para ello se ha seguido los reportes
entre los monómeros de γ-PGA y L-Phe tal como lo se analiza el mecanismo de “injerto a” descrito
por Castró en el 2014 al polimerizar bioconjugados de Poli(ácido γ-glutámico) 1 con un oligómero
de feniletinileno (PGA-OP) y un segundo con manosa (PGA-M), acoplada en los extremos de las

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cadenas poliméricas de PGA, donde se permite generar la unión covalente entre una polímero
natural y una biomolécula, denominado así bioconjugado iniciado por precursores como 1-etil-3-(3
dimetilaminopropil) carbodiimida (WSC), tal como lo trabaja Akagi y colaboradores en 2005 e
Ikeda y colaboradores en el 2018 generando un biopolímeros a partir de poliácido glutámico y
fenilalanina etíl éster 17 encontrando que la relación entre iniciador y biomolécula genera un mayor
grado de hidrofobicidad y entrecruzamiento, tal como lo argumento de Akagi del 2006 donde usó el
método de precipitación y diálisis obteniendo nanopartículas las cuales analizó su estabilidad y
degradabilidad, encontrando que el pH influye de manera directa sobre las estructuras en soluciones
ácidas y alcalinas , además están sujetas a degradación enzimática como se argumentó con un pool
de 4 enzimas18,19. Matsusaki y colaboradores en el 2004 analizan bionanoparticulas estables y
dispersas en agua preparadas por polímeros anfipáticos de poli (ácido γ-glutámico hidrófilo) que
contienen aminoácidos hidrófobos como leucina y fenilalalnina generando un tamaño de particula
de 200 nm y una superficie quimica funcionalizada con grupos carboxilicos 20, ademas afirmando
que son excelentes vehiculos para liberacion de farmacos, vacunas, peptidos y enzimas.

El efecto mencionado anteriormente es también evaluado en polímeros de poliácido glutámico

donde Shima y colaboradores en el 2014 realizan las nanopartículas compuestas de poli (ácido γ-
glutámico) anfifílico y analizan el grado de degradabilidad sobre proteinas y vacunas encapsuladas,
encontrando que el comportamiento de liberación de las proteínas retenidas no se modifica por la
hidrofobicidad de las nanoparticulas, además sugiere que los comportamientos intracelulares de la
proteína encapsulada podrían controlarse por la hidrofobicidad de las nanoparticulas y podrían dar
lugar a la manipulación de las respuestas inmunitarias en el uso de antigenos 21.

5. Objetivos

5.1 General
Diseñar una estructura copolimérica de Poli(γ-PGA-g- L-Phme) mediante injerto a con potencial
aplicación en la encapsulación y liberación de lisozima.

5.2 Específicos

 Establecer condiciones de síntesis para un copolímero anfifílico de injerto de Poli(γ-

PGA-g- L-Phme).
 Relacionar la estructura de Poli(γ-PGA-g- L-Phme) con las propiedades físicas del
copolímero obtenido por injerto a.
 Evaluar la encapsulación y liberación de la lisozima en el Poli(γ-PGA-g- L-Phme).
 Evaluar el índice de exclusión microbiana a partir de la lisozima encapsulada en
nanopartículas de Poli(γ-PGA-g- L-Phme)

6. Metodología

6.1 Síntesis de Copolímero Poli(γ-PGA-g- L-Phme)

La obtención del polímero se lleva a cabo por la adición de Ácido glicólico (γ-PGA) y l-fenilalanina
metíl éster (L-Phme) con un iniciador de WSC (1-etil-3-(3 dimetilaminopropil) carbodiimida en una
solución de Bicarbonato de sodio al 50mM (50mL) en agitación constante un baño de hielo por 1 h

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y posterior agitación a temperatura ambiente por 24 horas 21. Para controlar el grado de
hidrofobicidad se evalúa el grado de injerto que se da por la cantidad de (L-Phme) añadida y la
relación con el iniciador WSC con los cuales se evaluara el efecto que se tiene sobre el tamaño de la
nanopartícula. Los valores de mezcla se dan en la siguiente tabla. Así mismo el mecanismo de
reacción se muestra en la figura siguiente: 20

Tabla 1. Relaciones molares de los monómeros en la reacción de injerto a.

Copolímero/monómero
γ-PGA L-Phme WSC
iniciador
0,8- 1,6 mmol 0,47, 9,3mmol
Poli(γ-PGA -g- L-Phme)
4.7mmol 4,7 – 11,7mmol Opt (4,7mmol)
Opt (9,4mmol)
WSC (EDC)
O
O
C NH2
HN
H2N N N
O

HO O

P(PAG) L-Phme

O O
HN HN
NH2 NH2
OH
O O
O
N NH2
C C NH
(Z)
N N

O O

O
O O
H
HN N C NH2
N N
H H

HO O HN O

Urea
O

P(PGA-graft-PL-Phme)

Figura 1. Mecanismo de reacción para la síntesis de Poli(γ-PGA-g-L-Phme).

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Una vez realizado el procedimiento anterior se procede a generar las nanopartículas de Poli(γ-PGA-
g-L-Phme) por precipitación y diálisis; para ello se usan 10mg mg de copolímero el cual es disuelto
en 1mL DMSO con una misma cantidad de agua (1 mL) hasta que la solución sea traslucida. Esta
solución se incorpora a un cartucho de celulosa con una exclusión de 50 KDa para extraer
moléculas con peso menor proveniente del (γ-PGA). Se coloca dicho cartucho cargado en agua
destilada por 72 horas a temperatura ambiente y se hace el cambio de agua cada 12 horas 20. Dichos
cambios son congelados y las nanopartículas en el cartucho son liofilizadas. Estas se ven
representadas en la siguiente imagen.
H-filo
(l-Phe)

(PAG) H-fobo

Figura 2. formación de nanopartículas de Poli(γ-PGA-g-L-Phme)

6.2 Nanopartículas- Poli(γ-PGA-g-L-Phme)- lisozima

La encapsulación de la lisozima por parte de las nanoparticulas del copolímero se lleva acabo frente
dos parámetros importantes, el primero es la activación del grupo acido del γ-PGA y dos el rango de
pH al cual se disuelve la lisozima y en el cual las nanopartículas son estables. Para el control de la
activación del grupo ácido y poder disolver el polímero se realiza con el Poli(γ-PGA -g- L-Phme)
(10mg) en DMSO (1 mL) o en WSC (0-100µg/mL) en un PBS a pH:5.8, esta solución se mantiene
en agitación a temperatura ambiente por 20min 18. las NPs son activadas y posteriormente
centrifugadas y separadas. La encapsulación se lleva a cabo con una solución de lisozima (1 mL;
800 µg a 1mg/mL) en PBS de 5.8 de pH, a la cual se le agregan 5mg de NPs activas, esta mezcla se
incuba cerca de 24 horas a unos 4°C. Posterior a esto se centrifugan las NPs- Poli(γ-PGA -g- L-
Phme) - lisozima y se lavan con una solución de PBS (pH 7.4) y a continuación se suspenden en
1mL de la misma solución a una relación de 10mg/mL 17. La enzima remanente puede ser evaluada
por metodología de fluorescencia antes de iniciar el lavado con PBS.

6.3 Evaluación de encapsulación de lisozima en las nanopartículas.

Respecto a la encapsulación de la lisozima se evalúa dicha cantidad disolviendo las NPs- Poli(γ-
PGA -g- L-Phme) - lisozima (5mg) de en una solución de dodecilsulfato de sodio SDS (4%, 1mL)21,
e igualmente se hace la cuantificación por el método de fluorescencia. Calculando así por diferencia
con la cantidad inicial de lisozima el porcentaje de encapsulación. La liberación se realizará durante
tres días bajo condiciones que simulen el medio celular a 37 ℃, pH 6.9 y 20 mM Cl−. El sistema
PGA-g-Phe cargado con lisozima será centrifugado y el sobrenadante usado para evaluar la
cantidad liberada por intensidad de fluorescencia.

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6.4 Caracterización NPs- Poli(γ-PGA-g-L-Phme)

6.4.1 Resonancia magnética nuclear
Se determinará el grado de injerto del Phme por 1H RMN dada la integración de las señales de los
grupos fenilo (rojo) y los picos de metileno del γ-PGA (azul). Para ello, se muestra en la figura 3 la
estructura copolimérica de la nanopartícula.
O

H
HN N O
 C 
H2 m n
O
O
O OH HN

HC CH

HC CH
C
H

Figura 3. Estructura copolimérica Poli(γ-PGA-g-L-Phme) de la nanopartícula.

6.4.2 Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)
FTIR se puede emplear en la identificación preliminar de la síntesis del copolímero. Por tanto, es
necesario una purificación del copolímero e identificar las bandas características, como por ejemplo
las bandas del grupo fenilo 3100-3000 cm -1 características de estiramiento (v) C-H en el plano y
2000-1650 cm-1 de flexión (δ), estiramiento de grupos carbonilo en 1730 cm -1 es debida a la tensión
(v) C=O.
6.4.3 Diámetro hidrodinámico
Para conocer el diámetro hidrodinámico de partícula se empleará dispersión dinámica de luz (DLS).
Para ello, se realizarán medidas por triplicado con 10 corridas por medición y será reportado como
el promedio de diámetro de partícula con su respectivo índice de dispersión (ID).
6.4.4 Morfología de las nanopartículas
Para conocer la morfología de las nanopartículas se empleará microscopia de transmisión
electrónica (TEM) y microscopia electrónica de barrido (SEM). Para esto, se realizará una dilución
al 0.05 % con agua desionizada y será depositado 20 microlitros en rejillas cubiertas con carbono
para el TEM y para el SEM serán depositadas en una lámina de aluminio para ser recubiertas con
oro, ambas serán secadas a temperatura ambiente.
6.4.5 Potencial zeta
La carga superficial de las nanopartículas será medida por potencial ζ y se estudiará el punto
isoeléctrico del material en un rango de pH entre 3-9. Las nanopartículas serán diluidas al 0.05 %
con agua desionizada y filtradas por membrana de 0.45 µm. La fuerza iónica se mantendrá
constante por la adición NaCl 40 mM y el pH controlado por la adición HCl y NaOH 0.05 M.

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6.4.6 Análisis térmico

La estabilidad térmica de las nanopartículas será evaluada por análisis termogravimétrico (TGA)
con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min, bajo flujo de nitrógeno en un rango de 30-400 °C
y flujo de aire en un rango de 400-600 °C.
Se determinará por calorimetría diferencial de barrido (DSC) las posibles transiciones vítreas (Tg),
puntos de fusión y cristalización de las nanopartículas a una velocidad de calentamiento de 10
°C/min y flujo de nitrógeno para un rango de -65-200 °C.
6.4.7 Determinación de peso molecular
Se empleará cromatografía de exclusión molecular (SEC) para conocer la distribución y el peso
molecular absoluto de Poli(γ-PGA-g-L-Phme). Para ello, se utilizará varios detectores como
ultravioleta (UV), índice de refracción (RI) y dispersión dinámica de luz multiángulo (MALS), ya
que, pueden ser útiles para obtener mayor información con relación en la composición química en
función del peso molecular. La separación será llevada por un flujo de 0.4 mL/min usando una
columna de gel (G2500 PWxL or G4000 PWxL) en un buffer fosfato salino (pH = 8.0) 20 mM y
etanol 1:1; la concentración de la solución a inyectar debe estar entre 3 o 1×10 −3 g/mL19.
6.4.8 Estabilidad de las NPs
Se estudiará la estabilidad de la partícula Poli(γ-PGA-g-L-Phme) por medio de la variación del
diámetro hidrodinámico en el tiempo, cuando es sometido en un rango de pH entre 4-8. Para ello, se
utilizará HCl y NaOH 0.05M y se dispondrá de un potenciómetro para medir el pH.
6.4.9 Viabilidad celular
Se realizará el estudio de viabilidad celular por la reducción de Bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-
2,5- difeniltetrazólico por la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa, dando lugar a un
producto coloreado (formazán), más conocido como método MTT. Se empleará debido a su rápida
respuesta, robustez y economía. Para ello, se incubará células dendríticas y macrófagos durante 24 h
a 37 ℃ en un medio de cultivo, posteriormente se añadirá 20 µL de MTT y se incubará durante 4
horas, las células se retirarán del medio y serán lavadas con solución de buffer fosfato salino y
luego se añadirá 100 µL DMSO, para medir por densidad óptica a 570 nm 22,23. El porcentaje de
viabilidad celular será determinado por la ecuación 1.
Absorbancia muestra
% viabilidad= ∗100 Ec. 1
absorbancia control
6.4.10 Encapsulación y liberación
El estudio de encapsulación y liberación se realizará mediante la encapsulación de una proteína
marcada como lisozima para lo cual se realizará una suspensión de 10 mg/mL de las nanopartículas
Poli(γ-PG -g-L-Phme) en DMSO, y a esta solución se añadirá 875 µg/mL de la proteína marcada, la
cual se dejará en agitación durante 1 hora. Para estimar la cantidad de encapsulación, las NPs se
purificarán por centrifugación y el sobrenadante será nuevamente dispersado en una solución de
buffer fosfato salino y la cantidad de encapsulación será determinada por fluorescencia 21. En la
ecuación 2 se empleará para estimar el porcentaje de encapsulación.
La liberación se realizará durante tres días bajo condiciones que simulen el medio celular a 37 ℃,
pH 6.9 y 20 mM Cl−. El sistema Poli(γ-PGA-g-L-Phme) cargado con DQ-OVAL será centrifugado
y el sobrenadante usado para evaluar la cantidad liberada por intensidad de fluorescencia 21.

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DQ OVA en NPs
% Encapsulaci ó n= ∗100 Ec. 2
DQ OVA total
7. Resultados esperados
La relación del Poli(γ-PG -g-L-Phme) y, por ende, el grado de injerto del Phme será establecido por
el espectro 1H RMN, el cual se determinará mediante la integración de las señales δ 7.15-7.30 ppm
para los grupos fenilo del Phme y 2.57 ppm para los grupos metileno del γ-PGA. Para ello, la figura
4 simula un espectro 1H RMN para la
estructura copolimérica PGA-g-Phe, la
cual, establecerá las asignaciones 1H.
O  PGLA-g-Phe

H  PGLA-g-Phe
HN N O
 C 
H2 m n 2.75 2.70 2.65 2.60 2.55

O  PGLA-g-Phe
O
O OH HN

7.3 7.2 7.1

HC CH

HC CH
C 8 7 6 5 4 3 2 1
H
ppm

Figura 4. Desplazamientos
característicos en 1H RMN para Poli(γ-PGA-g-L-Phme).
Para pronosticar las bandas esperadas en el copolímero Poli(γ-PGA-g-L-Phme), se simuló los
estiramientos y flexiones que presenta cada monómero. En la figura 5 se muestra las bandas FTIR
para el aspartamo y en la figura 6 para el ácido glutámico. En el espectro de aspartamo es evidente
la banda de estiramiento (v) C-NH2 en 3200-3400 cm-1 y C-H aromático 2000-1900 cm -1. En ambos
espectros se observan bandas de absorción en 2920 y 2850 cm -1 atribuidas a la tensión (v) C-H3 y C-
H2; bandas en 1460 y 1380 cm-1 atribuidas a la flexión (δ) C-H3 en el plano. La banda de gran
intensidad en 1730 cm-1 es debida a la tensión (v) C=O y en 1268, 1234 y 1143 cm -1 atribuidas a la
tensión (v) simétrica y asimétrica de O ̶ C=O.

Figura 5. Espectro FTIR para el aspartamo.

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Figura 6. Espectro FTIR para el ácido glutámico.

El diámetro hidrodinámico reportado por Shima y colaboradores, establece que se obtienen
nanopartículas alrededor de 200 nm, sin embargo, ellos regulan el diámetro con la adición de NaCl
0.08 a 0.6 M, haciendo un medio más rico en cargas para la comprensión de la doble capa eléctrica
de las nanopartículas21. En la figura 7 se evidencia la monodispersidad en diámetro con diferentes
grados de injerto del Phe.

Figura 7. Diámetro hidrodinámico para nanopartículas PGA-g-Phe con diferentes grados de injerto.
Se obtiene así, nanopartículas con morfología esférica evidenciadas por SEM (figura 8) y aunque no
hay reportes de análisis térmicos, se podría suponer por la figura SEM, que las nanopartículas PGA-
g-Phe presentan segmentos más flexibles, por lo que tienen una transición vítrea por debajo de la
temperatura ambiente y una temperatura de descomposición relativamente baja. Las cargas
superficiales serian negativas establecidas por la ionización de los grupos carboxilo del γ-PGA,
localizadas cerca en la superficie de la nanopartícula. El reporte sobre el potencial ζ de las
nanopartículas libres y cargadas con DQ-OVAL son cerca de −30 mV 21.

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Figura 8. Morfología esférica para las nanopartículas γ Poli(γ-PGA-g-L-Phe) por SEM.

La determinación del peso molecular (Mw) absoluto y relativo para un 50% de Phe como grado de
injerto, fue reportado por Ikeda y colaboradores usando un sistema de detección UV/RI/MALS, el
cual posee un Mw absoluto de 41 KDa con PdI de 1.4 y Mw relativo de 44 KDa con PdI de 1.6 19.
En la figura 9 se evidencia el cromatograma para el copolímero γ-PGA-g-Phe para dos lotes con la
misma distribución de Mw, lo cual indica la reproducibilidad del método de obtención, en el mismo
se evidencia la presencia de contaminantes en la síntesis, como son PA, U-1 y U-2.

Figura 9. Cromatograma para dos diferentes lotes de nanopartículas γ Poli(γ-PGA-g-L-Phe).

La estabilidad de las nanopartículas de γ-PGA-g-Phe fue evaluada a diferentes tiempos por Ikeda y
colaboradores, sometiendo las mismas a diferentes pH y temperaturas, donde se encontró que a una
temperatura de 40 ℃ y en pH de 4 las nanopartículas presentan un efecto de degradación hidrolítico
(ver figura 10), además es evidente la perdida de concentración del medio, en la cual se puede
observar en la figura 11 como la intensidad del pico disminuye con el tiempo a una temperatura de
40 ℃ y pH de 4. Por otra parte, en condiciones de temperatura ambiente o inferiores y un pH
cercano a 7 se encontró una gran estabilidad para la nanopartículas 19.

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Figura 10. Estabilidad evaluada en el tiempo de las nanopartículas γ Poli(γ-PGA-g-L-Phe) a

diferentes temperaturas y pH.

Figura 11. Cromatograma evaluando la estabilidad de las nanopartículas γ Poli(γ-PGA-g-L-Phe) en

el tiempo a diferentes temperaturas y pH.
La viabilidad celular ha sido reportada por citométria de flujo, encontrando que no son toxicas,
debido a que se emplearon bioconjugados provenientes de un aminoácido y un edulcorante que se
ha sido reportado que no es toxico 21. Sin embargo, el método MTT que se quiere emplear es
sencillo, económico y robusto, lo cual establece en un rango amplio de cultivo celular. Por otra
parte, la encapsulación estudiada Shima fue baja (ver figura 12) al emplear DQ OVA, ya que es una
proteína de un alto peso molecular alrededor de 42.7 KDa. Al usar la misma nanopartícula con
mayor área superficial y encapsular una enzima de menor peso molecular 14.4 KDa es posible
mejore el rendimiento de encapsulación.

Figura 12. Encapsulación de las nanopartículas γ-PGA-g-Phe empleando DQ OVA.

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